G-Genetique Partie 2

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  • 24/10/2011 1

    Techniques et Stratgies en Biologie Molculaire

    Deuxime partie

    Octobre 2011

    Vincent Ecochard Didier Fournier Laurence Nieto

    Laurent Paquereau

    Biotechnologie

    Master Protines

    Recombinantes Master Professionnel

    Expression Gnique et Protines Recombinantes

    e-mail : dess.biotech@ipbs.fr / Tel : +33 (0) 5 61 17 58 59 http://www.m2p-egpr.ups-tlse.fr/

  • 24/10/2011 2

    ANALYSE DE LA FONCTION DUN GENE .................................................................................................................. 6 STRATEGIE BASEES SUR LHYBRIDATION DARN ............................................................................................................... 6

    Linterfrence dARN (RNAi) ......................................................................................................................................... 6 LE KNOCK-OUT OU LINVALIDATION DUN GENE PAR RECOMBINAISON HOMOLOGUE ...................................................... 10

    La recombinaison homologue : un mcanisme lorigine de la technologie de Knock-out ........................................ 10 Les souris KO ............................................................................................................................................................... 11 Les cellules ES ............................................................................................................................................................. 11 Fabrication de souris transgniques ............................................................................................................................ 12 Linterruption dun exon : knock-out de gne .............................................................................................................. 12 Cration de mutation ponctuelle .................................................................................................................................. 13 Le systme Cre/Lox ...................................................................................................................................................... 14 Exemple dapplication ................................................................................................................................................. 15 Mutation propre ........................................................................................................................................................... 15 Large dltion ou translocation ................................................................................................................................... 15 Les possibilits dinduction de la cre recombinase ...................................................................................................... 16 Le systme tet-on .......................................................................................................................................................... 16

    DETECTION DES MUTATIONS / POLYMORPHISMES ........................................................................................... 17 I) DETECTION DES MUTATIONS ......................................................................................................................................... 17

    Mthodes bases sur la squence ................................................................................................................................. 17 Mthodes bases sur lhybridation .............................................................................................................................. 19 Mthodes bases sur la PCR ........................................................................................................................................ 24 Ligation ........................................................................................................................................................................ 26 RFLP ............................................................................................................................................................................ 27 Mthodes bases sur la conformation de lADN .......................................................................................................... 28 Htroduplex sensibilit une coupure ....................................................................................................................... 29

    II ) ANALYSE DU POLYMORPHISME ................................................................................................................................... 32 Protines ...................................................................................................................................................................... 32 Analyse des fragments de restriction ........................................................................................................................... 32 Gnotypage et cartographie gntique ........................................................................................................................ 34 Les micro et minisatellites ............................................................................................................................................ 35 MAAP (Multiple Arbitrary Amplification profiling) .................................................................................................... 37

    III) DETECTION D'UNE SEQUENCE ..................................................................................................................................... 38 EXPRESSION DES PROTEINES RECOMBINANTES .............................................................................................. 39

    INTRODUCTION ................................................................................................................................................................. 39 RAPPELS SUR LA TRADUCTION .......................................................................................................................................... 39

    Les vnements de la traduction .................................................................................................................................. 39 Rgulation de la traduction .......................................................................................................................................... 44 Compartimentalisation et modifications post-traductionelles ..................................................................................... 48

    EXPRESSION TRANSITOIRE A PARTIR D'UN ARNM OU D'UN ARN IN VITRO (CRNA) ......................................................... 50 Obtention d'un cRNA. ................................................................................................................................................... 50 Traduction en milieu cellulaire. Lovocyte de Xnope ................................................................................................. 54

    EXPRESSION EN SYSTEME PROCARYOTE ........................................................................................................................... 55 I) Escherichia coli ........................................................................................................................................................ 55 II) Autres bactries utilises en production de protines ............................................................................................. 66

    EXPRESSION EN SYSTEME EUCARYOTE : LES CHAMPIGNONS ............................................................................................. 70 les levures ..................................................................................................................................................................... 70 Les champignons filamenteux ...................................................................................................................................... 76

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    Dictyostelium discoideum ............................................................................................................................................ 76 LES CELLULES VEGETALES ............................................................................................................................................... 78 LES CELLULES D'INSECTES ................................................................................................................................................ 80

    a) Baculovirus. ............................................................................................................................................................. 80 b) Cellules dinsecte ayant intgr le gne dintrt dans leur gnome ....................................................................... 85

    LES CELLULES DE VERTEBRES ........................................................................................................................................... 87 1) L'ovocyte de Xnope ................................................................................................................................................ 87 2) Cellules de mammifre ............................................................................................................................................. 87

    EXPRESSION DANS DES EUCARYOTES UNICELLULAIRES .................................................................................................. 103 LES CAUSES D'ECHECS DE LA PRODUCTION DE PROTEINES. ............................................................................................. 104

    1) Il ny a pas ou peu de protine ....................................................................................