55
1  Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR spectroscopy Peter Kroon, s1687735 18/03/2015    Abstract Drug development is a challenging process, which often fails. To ameliorate this, we attempted to develop an efficient methodology for fragmentbased drug design based on dynamic combinatorial chemistry and NMR spectroscopy. To this end, two libraries were designed based on crystallographic data from the group of Klebe for the model protein endothiapepsin using computer aided modelling. The designed compounds all feature an acylhdyrazone linker and at least one fluorine atom. The first library was discarded due to problems with the synthesis. The second library was analysed using quantitative 19 FNMR and 1 HSTDNMR spectroscopy, using trifluoroacetic acid as an internal reference for the fluorine NMR spectra. No binding compounds could be identified, even though one of the compounds was a known binder. It is hypothesised this is due to the trifluoroacetic acid since the 1 HSTDNMR spectrometry also produced no results. However, it could be concluded that 19 FNMR spectrometry provides better peak resolution with little loss of sensitivity compared to 1 HNMR spectrometry when analysing mixtures; and that STDNMR requires far less protein than regular NMR spectroscopy for analysing templated DCLs.   

Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

  • Upload
    others

  • View
    7

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

1  

Fragment‐based drug design facilitatedby dynamic combinatorial chemistryandNMRspectroscopy

Peter Kroon, s1687735 

18/03/2015 

 

 

 

AbstractDrug development  is a challenging process, which often  fails. To ameliorate  this, we attempted  to 

develop an efficient methodology for fragment‐based drug design based on dynamic combinatorial 

chemistry and NMR spectroscopy. To this end, two libraries were designed based on crystallographic 

data from the group of Klebe for the model protein endothiapepsin using computer aided modelling. 

The designed compounds all feature an acylhdyrazone linker and at least one fluorine atom. The first 

library was discarded due  to problems with  the  synthesis.  The  second  library was  analysed using 

quantitative  19F‐NMR  and  1H‐STD‐NMR  spectroscopy,  using  trifluoroacetic  acid  as  an  internal 

reference for the fluorine NMR spectra. No binding compounds could be identified, even though one 

of the compounds was a known binder. It is hypothesised this is due to the trifluoroacetic acid since 

the  1H‐STD‐NMR  spectrometry  also  produced  no  results.  However,  it  could  be  concluded  that 19F‐NMR  spectrometry  provides  better  peak  resolution with  little  loss  of  sensitivity  compared  to 1H‐NMR  spectrometry when  analysing mixtures;  and  that  STD‐NMR  requires  far  less protein  than 

regular NMR spectroscopy for analysing templated DCLs. 

   

Page 2: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 2 

 

TableofContentsAbstract ................................................................................................................................................... 1 

Table of Contents .................................................................................................................................... 2 

Introduction ............................................................................................................................................. 3 

Structure‐based drug design ............................................................................................................... 3 

Fragment‐based drug design ............................................................................................................... 4 

Dynamic combinatorial chemistry....................................................................................................... 5 

NMR techniques .................................................................................................................................. 7 

Quantitative NMR............................................................................................................................ 7 

Saturation‐transfer difference NMR ............................................................................................... 7 

Endothiapepsin .................................................................................................................................... 9 

Library design ........................................................................................................................................ 10 

Modelling ........................................................................................................................................... 14 

Discussion .............................................................................................................................................. 16 

Quantitative 19F‐NMR ........................................................................................................................ 16 

1H‐STD‐NMR ...................................................................................................................................... 16 

19F‐STD‐NMR ...................................................................................................................................... 16 

Conclusions ............................................................................................................................................ 17 

Acknowledgements ............................................................................................................................... 17 

Bibliography ........................................................................................................................................... 17 

Supporting Information ..........................................................................................................................S1 

Library A — Compounds 1 to 8 ..............................................................................................................S1 

Modelling methods ............................................................................................................................S1 

Modelling results ................................................................................................................................S2 

Synthesis .......................................................................................................................................... S11 

Library B — Compounds 10 to 18........................................................................................................ S27 

Modelling results ............................................................................................................................. S27 

NMR experiments ............................................................................................................................ S32 

Preparation of NMR samples ...................................................................................................... S32 

Quantitative 19F‐NMR .................................................................................................................. S32 

1H‐STD‐NMR ................................................................................................................................ S32 

Quantitative 19F‐NMR results ...................................................................................................... S33 

1H‐STD‐NMR spectrum ................................................................................................................ S36 

 

Page 3: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

IntrodDrug  de

number 

and  ana

dynamic

required

StructuDrug dev

enzymes

these en

selected

dimensio

consider

and opti

Figure 1: T

Medicina

the  enzy

started. 

heavily 

synthesi

enzyme,

crystal  s

inhibitor

found.[1,

intricate

consumi

ductionevelopment 

of compoun

alyse  each  o

c  combinato

d in synthesis

ure‐basedvelopment is

s  involved  in

nzymes kills o

 an inhibitor

onal  structu

red at this st

misation) an

The process fro

al chemistry

yme  is  obta

By using co

on  the  intu

sed,  and  its

,  it  is attemp

structure  is  t

r  that do no2]  This  mea

e)  compound

ing.  

nowadays  is

nds that nee

of  these  com

rial  chemist

s, and nuclea

ddrugdes a long and

n the disease

only the pat

r can be desi

ure  of  the 

age.[1] If a po

nd finally sub

m disease to ne

y is involved 

ained  (usual

mputer‐aide

uition  and  s

s  efficacy  is 

pted to obta

then used  in

t bind efficie

ns  that  bef

ds  have  to 

s  plagued  b

ed to be con

mpounds.[1,2

try  based  on

ar magnetic r

esign costly proce

e need to be

hogen (Targ

gned based 

enzyme.  C

otent inhibit

bmitted for c

ew drug. Figure

mainly in lea

ly  via  crysta

ed modelling

skill  of  the 

tested  in  v

ain a co‐cryst

n  silico  to  ide

ently. The p

ore  a  suffic

be  synthesi

y  long  deve

nsidered, and2]  We  hope 

n  already  kn

resonance (N

ess, progress

e  identified a

et identifica

on known in

Commonly,  a

tor is found, 

clinical trials

e taken from Jia

ad optimisat

allography), 

g techniques

medicinal  c

vitro.  If  it  is 

tal structure

entify empty

process  is  rep

ciently  poten

ised,  purifie

elopment  tim

d the amoun

to  ameliora

nown  inhibit

NMR) spectr

sing through

and  it has to

tion and vali

nhibitors, en

around  100

this lead is f

(Figure 1).[1,2

ang et al.[2]  

tion.[1] Once 

an  iterative

s, a potentia

chemist  invo

confirmed 

e of the enzy

y pockets  in

peated until

nt  inhibitor 

d  and  analy

mes,  stemm

nt of time re

ate  this  situ

tors  to  grea

oscopy to fa

h several disc

o be confirm

idation). Onc

zyme functio

0,000  separa

urther optim2] 

a three‐dim

e  cycle,  dep

l  inhibitor  is 

olved.[3]  This

that  the  com

yme with thi

  the enzyme

a sufficient

is  found  a 

ysed.  This  is

ing mainly  f

equired to sy

uation  by  e

atly  reduce 

cilitate analy

crete steps. 

ed that knoc

ce a target e

on, or ideally

ate  compou

mised (Lead d

mensional str

picted  in  Fig

s designed; t

s  compound

mpound  inh

is  inhibitor. 

e, or moietie

tly potent  in

multitude  o

s  usually  ve

 3 

from  the 

ynthesise 

mploying 

the  time 

ysis. 

First, the 

cking out 

enzyme is 

y a three‐

unds  are 

discovery 

 

ucture of 

ure  2,  is 

this relies 

d  is  then 

hibits  the 

This new 

es of  the 

hibitor  is 

of  (often 

ery  time‐

Page 4: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 4 

 

 

 

Figure 2: The process of structure‐based drug design. 

Fragment‐baseddrugdesignFragment‐based drug design  is a methodology  that  can be used  to  facilitate  structure‐based drug 

design,  and  in  particular  the  lead‐identification  and  optimisation  steps.  Classically,  many  large 

compounds  are  screened  against  a  target,  in  the  hope  one  or  more  will  bind  to  the  protein 

(high‐throughput  screening,  HTS).  However,  because  the  compounds  screened  are  usually  rather 

large, and enzymes bind compounds very selectively, many compounds often need to be screened to 

find  a  successful  candidate.[1]  Two  alternative  approaches  can  be  used when  applying  fragment‐

based drug design: fragment linking, and fragment growing. 

In  fragment  linking and growing,  smaller compounds are  screened  instead. These will usually bind 

the target enzyme only weakly, but chemical space can be sampled far more efficiently. If multiple, 

small compounds bind the protein in different pockets, these can be thought of as fragments of the 

ultimate inhibitor. In this case, if the binding modes of these fragments can be elucidated, it may be 

possible  to  link  the  fragments  together  in order  to obtain a highly potent  inhibitor  in an efficient 

manner. However, great care must be exercised: if there is too much strain in the linker between the 

fragments, or  if  it slightly too  long or too short, this will prevent the  inhibitor from binding  like the 

fragments, leading to a loss of potency. Because of this strict geometrical requirement on the linker, 

fragment  linking  is usually considered hard, but  there are examples  in which  this methodology has 

been successfully applied, resulting in very potent inhibitors.[4–6]  

If instead there is only binding information available for one fragment, this fragment may be "grown" 

in  order  to  make  more  beneficial  interactions  with  the  protein.  This  process  is  generally more 

elaborate than fragment linking, but it is easier. There are still pitfalls however. It is often very easy 

to  identify  empty  hydrophobic  pockets  in  a  three‐dimensional model  of  an  enzyme. Growing  the 

inhibitor  in  this  direction  would  probably  result  in  an  insoluble  compound  however.  This 

Compound synthesis and purification

Evaluation

Crystallography

Modelling and design

Page 5: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

methodo

Figure 3.

In practi

not unco

modellin

Figure 3: Flarge comsmall orgamanner. Bpocket in o

DynamDynamic

compou

template

accordin

of  chang

affinity;*

noted  th

template

change i

               * Some cato the cha

ology  has  a

.  

ice, the disti

ommon  to g

ng is used to 

Fragment‐basedpounds are scranic molecules Bottom panel: order to form a

miccombic  combinato

nds  is  form

e, and will in

ng to Le Chât

ge  in  conce*  this degree

hat  the amp

e, and the to

n concentra

                      are must be eanges in build

lso  been  us

inction betw

grow one  fra

facilitate the

d drug design. Teened against tbind  the  targeIf only one sma potent inhibit

inatorialcorial  chemist

med.[12–14]  Ne

n this way be

telier's princi

ntration  of 

e of  change 

lification  fac

otal concentr

tion, a lot of

                       exercised sinceding block con

ed  successf

ween fragme

agment  in o

e process.  

Top panel: the the target enzyet protein  thesall organic molor. Figure taken

chemistrytry  is  an  app

ext,  if  a  tem

e depleted fr

iple, making 

individual  li

in  concentr

ctor  is a  func

ration of bui

f template m

e it is possiblencentrations.

ully,  resultin

nt  linking an

rder  to mim

classical approyme, but only ase may be  linklecule binds thn from Erlanson

yproach  in w

mplate  is  ad

rom their eq

more of the

brary memb

ation  is  calle

ction of:  the

lding blocks.

may be requir

e that compou

ng  in  comm

nd fragment

mic a  second

oach to drug de few — if any —ked  together  toe protein, this n.[1] 

which  a  libra

dded,  some 

quilibrium. Th

e compounds

bers  can  be 

ed an ampli

e affinity of 

. This means

red.  

unds which do

ercially  avai

growing  is 

.[11]  In all  th

esign is high‐thr— will bind. Mido  form  a potenfragment may

ary  of  dynam

library  mem

he library wi

s that bind (F

used  as  a 

fication  fact

the binder, 

, that in orde

o not bind wil

ilable  drugs.

not so clear

hese cases, c

roughput screeddle panel: if twnt  inhibitor  in y be grown  into

mically  inter

mbers  can 

ill then re‐eq

Figure 4). Th

measure  for

tor.[12–14]  It  s

the concent

er to see a s

ll also be amp

 5 

.[7–10]  See 

‐cut.  It  is 

computer 

 

ning; many wo or more an  elegant o an empty 

rchanging 

bind  this 

quilibrate 

he degree 

r  binding 

hould be 

tration of 

ignificant 

plified due 

Page 6: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

DCC has

building 

efficient

significa

member

be desig

(few) dif

target pr

Because

there are

Figure 4: Aprotein be

Since th

connecti

forming 

Diels‐Ald

conditio

aqueous

stopped 

To these

can  rev

equilibra

nucleoph

of condit

s  the advant

blocks can b

 screening o

ntly accelera

r has to be sy

gned around

fferent ways 

rotein.  

 of this, dyn

e numerous 

A schematic reest, it is selected

e only requi

ions  can  be 

reactions  c

der  reaction

ns which  ca

s environme

at will by ch

e ends we h

versibly  com

ation  occurs

hilic catalyst

tions (Schem

tage  that  rel

be synthesise

of large libra

ates both the

ynthesised, 

d one or mo

the system 

amic combin

examples in

presentation od from the libra

irement for 

used  betwe

an  be  used,

,  etc.  The  o

an  be  tolera

nt that  is sli

hanging the r

ave opted fo

mbine  to  fo

  at  an  acidi

t such as ani

me 1). 

latively  few 

ed in paralle

ries with rel

e synthesis a

purified and 

re  fragment

will show wh

natorial chem

 which this t

of dynamic comary. Figure take

DCC  is that t

een  the  bui

,  such  as  im

only  prerequ

ted  by  the 

ghtly acidic 

reaction cond

or acylhydra

orm  an  acy

c  pH.  Addit

line,[20] allow

building blo

el, or may ev

atively little 

and analysis 

 analysed se

ts. For exam

hich linker ha

mistry is inc

technique ha

mbinatorial cheen from Mamid

the  library c

lding  blocks

mine  format

uisite  is  that 

template.[12

or basic. La

ditions, since

zones as  lin

ylhydrazone

tionally,  acyl

wing this rea

ocks need  to

ven be comm

effort,[12,14] 

of potential 

eparately; pa

mple,  if  two  f

as the best o

reasingly be

as been used

mistry. Since thyala and Finn.[1

constituents 

s.  In  principl

ion,  transac

the  reactio,14,19]  In  case

stly,  it  is des

e this facilita

king group. 

e.  Acylhydra

hydrazone  e

action to also

o be  synthes

mercially avai

which mean

inhibitors, si

rticularly if a

fragments  ca

orientation a

ing used in d

d successfully

he compound A13] 

can  intercha

e,  all  revers

ylation,  disu

on  runs  at  a

e  of  a  prote

sirable that t

ates analysis.

Here an alde

azones  are 

exchange  ca

o be used un

sised, and  th

ilable. This a

ns that this t

ince not eve

a dynamic lib

an  link  toge

and propertie

drug design,

y.[15–18] 

 

A2‐B3 binds th

ange, many 

sible,  covale

ulfide  forma

n  acceptabl

ein  this  is  u

the equilibri

.[12,14]  

ehyde and h

rather  sta

an  be  cataly

nder a broad

 6 

hat  these 

allows for 

echnique 

ry library 

brary can 

ether  in a 

es for the 

[12,14] and 

e template 

different 

nt  bond‐

tion,  the 

e  rate  in 

sually  an 

ia can be 

hydrazide 

ble,  and 

sed  by  a 

der range 

Page 7: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Scheme 1:

Classical

(LC‐MS).

be stopp

and a  lo

some of 

NMRte

QuantitNMR spe1H‐NMR 

sensitive

structura

abundan

Secondly

result in 

An  alter

addition

sensitive

from –20

solvents

referenc

In order 

so, two 

of  releva

spectra. 

required

SaturatAn altern

measure

(STD‐NM

which  is

been sat

the nucl

saturate

               * Note th

: The formation

ly,  DCLs  are

. These tech

ped, separat

ot of protein

these drawb

echnique

tativeNMRectroscopy  i

spectroscop

e nucleus, an

al informatio

nt, many solv

y, 1H‐NMR si

overlapping

rnative  to  1H

,  its gyroma

e  as  1H‐NMR

00 to 20 ppm

 do not cont

ce might be d

to analyse a

spectra are 

ant  peaks  a

Since the ch

d. 

tion‐transfenative to me

e  the  bindin

MR) was dev

s not of  inte

turated, this

ear Oberhau

ed, and no  lo

                      at all NMR sa

n of an acylhydr

e  analysed  u

niques have

tion may be 

  is required 

backs by usin

es

s a common

py.  There  ar

nd 1H atoms

on. Unfortun

vents also co

ignals span o

g signals. 

H‐NMR may 

gnetic ratio 

R.  Furthermo

m. This mean

tain 19F atom

desirable. 

a DCL with th

recorded, on

are  normalis

hange in equ

erdifferenceasuring the 

g  of  ligands

veloped. The

rest, and  th

s saturation c

user effect  (

onger give a 

                       mples must co

razone from an

using metho

e some draw

hard to ach

since  the eq

ng NMR spec

n analytical m

re  good  reas

 are abunda

nately, 1H‐NM

ontain them,

only a narrow

be  19F‐NMR

is 83% as  la

ore,  19F‐NM

ns that 19F sig

ms, no  isotop

hese techniq

ne with tem

ed  against  a

uilibrium is m

ceNMRchange in e

s  to  the  tem

e  template,  i

is  saturation

can transfer 

(NOE).[21] As 

signal  in NM

ontain at leas

n aldehyde and 

ods  such  as 

wbacks since 

ieve, all  libra

quilibrium  is

ctroscopy. 

method  in s

sons why  1H

ant  in most o

MR has some

, demanding

w spectral ra

R  spectrosco

arge as that 

R  signals  sp

gnals are oft

pically enric

ques, a chan

mplate and on

an  internal 

measured dir

quilibrium c

mplate.  To  th

in  this  case 

n  spreads  th

to a bound 

a  result,  inh

MR. This mea

st some deute

a hydrazide un

liquid  chro

they are de

ary member

s measured 

ynthetic org

H  is  so  popu

organic com

e drawbacks

g the use of (

ange: roughl

opy.  19F  is  1

of 1H. This m

pan  a much 

en well sepa

hed solvent 

ge in equilib

ne without, 

reference  a

rectly, large 

aused by ad

his  end,  sat

a protein,  i

hrough  the p

inhibitor by

hibitors  that

ans that whe

erium for locki

der influence o

matography

estructive, th

s need to ha

directly. We

ganic chemis

ular  in NMR 

pounds, wh

. Firstly, beca

(expensive) d

y from –2 to

00%  natura

means that 1

broader  spe

arated. Also, 

is needed;* 

brium is mea

after which 

nd  compare

amounts of 

dition of a te

uration‐tran

s  saturated 

protein. Onc

means of sp

 bind  to  the

en a regular 

ng and shimm

 

of catalytic anili

y mass  spec

he equilibriu

ave a differe

e hope  to cir

stry, and  in p

since  it  is  t

ich results  in

ause 1H atom

deuterated s

o 12 ppm, w

lly  abundan19F‐NMR  is a

ectral  range

since many 

although an

asured direct

the signal  in

ed  between 

template ar

emplate is to

sfer  differen

in  a  spectra

ce  the active

pin diffusion

e protein wi1H‐NMR spe

ming. 

 7 

ne. 

ctrometry 

m has to 

ent mass, 

rcumvent 

particular 

the most 

n a  lot of 

ms are so 

solvents.* 

hich may 

t,  and  in 

almost as 

:  roughly 

common 

n  internal 

tly. To do 

ntensities 

the  two 

re usually 

o directly 

nce NMR 

al  region, 

e  site has 

n through 

ll also be 

ectrum  is 

Page 8: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

compare

decrease

Because

many lig

methods

analysed

problem

Figure 5: aprotein  tomultiple lig

Unfortun

spectros

circumve

saturate

the  1H  c

explicitly

using an

capable 

Of cours

least one

ed to one wh

e in intensity

 of  the dyna

gand molecu

s. For this to

d.[19]  Also,  ra

m. 

a schematic depo  ligands  that gand molecule

nately,  1H‐S

scopy:  a  sm

ent these hu

ed as before,

channel,  it 

y  transferrin

n  INEPT‐like 

of measurin

se, when ana

e 19F atom. 

here the prot

y; compound

amic binding

les, meaning

o work howe

apid  ligand  e

piction of STD‐bind.  Due  to  ds. 

TD‐NMR  sp

all  spectral 

urdles, the te

, and  the sa

is  decouple

ng  the  satura

sequence.[22

g 19F  whilst 

alysing a DCL

tein was satu

ds that do no

g and unbind

g that this te

ever, extensi

exchange  is 

NMR spectroscdynamic  bindin

ectroscopy

range  and 

echnique has

turation  is  t

d,  and  19F  i

ation  from  h2] This  techn

saturating 1H

L using any 19

urated, the s

ot bind the te

ding of com

echnique req

ive measure

required,[21

copy. Saturationng  and  unbind

suffers  from

the  require

s been modif

transferred  t

is  observed

hydrogens  n

nique howev

H.  

9F‐NMR tech

signals corre

emplate will 

pounds, one

quires far les

ement times ]  but  for we

n is depicted ining,  one  prote

m  the  same

ment  for  is

fied to 19F‐ST

to  the  ligand

.  Additional 

nuclei  in  the

ver, does  req

hnique all lib

sponding to 

not be affec

e protein mo

ss protein th

are required

eak  binders 

 blue. Saturatioein molecule  ca

e  problems 

otopically  e

TD‐NMR, in w

d. However, 

sensitivity 

e  inhibitor  to

quire an NM

rary membe

 bound inhib

cted (Figure 5

olecule may 

an quantitat

d when mixt

this  is  usua

on is transferrean  transfer  sat

as  normal 

nriched  solv

which the te

instead of o

can  be  obt

o  the  fluorin

MR  instrumen

ers need to c

 8 

bitors will 

5).[21]   

saturate 

tive NMR 

tures are 

ally  not  a 

 

ed from the turation  to 

1H‐NMR 

vents.  To 

mplate is 

observing 

ained  by 

ne  nuclei 

nt  that  is 

ontain at 

Page 9: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

EndothIn  order

attempt 

fungus E

This clas

several s

bonds,[23

catalytic

These as

Some  of

binding.[

Figure  6: cartoon. Tblue). The 

As  a mo

research

complex

which is 

chemistr

this enzy

hiapepsinr  to  demons

to design an

Endothia par

ss of enzyme

serious disea3–25]  and  the

c  dyad:  two 

spartic acids

f  the  know[19] 

  X‐ray  crystal The catalytic dya water molecul

odel  enzyme

h  group  of  K

x with  a  seri

beneficial fo

ry  is compat

yme.[19]  

nstrate  the  a

n inhibitor fo

asitica, and 

es is widespr

ases such as

e  inhibitors 

aspartic  aci

s are tightly 

n  inhibitors 

structure  of  ead (aspartic acile closely bound

e,  endothiap

Klebe  et  al.[2

ies of  fragm

or acylhydraz

tible with en

advantages  D

or the enzym

it is a model 

ead, and has

s malaria and

known  toda

id  residues 

bound to a w

displace  th

ndothiapepsind residues 32 ad to the catalyt

pepsin  is  re28]  has  previ

ents;  its me

zone exchan

ndothiapepsi

DCC  can  off

me endothia

enzyme for 

s varied biol

d AIDS.[23–25]

ay  block  the

(Asp‐32  and

water molec

his  catalytic 

(PDB  code:  1Eand 215) is deptic dyad is show

eadily  availab

iously  publis

echanism  is 

ge;[23,26] it ha

n;[19] and  las

fer  in  fragm

pepsin. This 

aspartic pro

ogical functi

  Its function

e  active  site

d  Asp‐215)  o

cule through

water  mole

ER8[27]).  The  pricted as a stick 

wn as a red sphe

ble  and  crys

shed  co‐crys

fully elucida

as been show

stly, our grou

ment‐based  d

protein is o

teases.[23]  

ions and play

n  in nature  is

.[23,26]  This  a

of which  one

h hydrogen b

ecule,  but  o

rotein  backbonmodel (Colour ere. 

stallises  eas

stal  structure

ated;[23,25]  its

wn in the pas

up  is current

drug  design,

originally fou

ys a causativ

s to hydroly

active  site  fe

e  is  protona

bonds (Figur

others  requi

ne  is  depicted r code: C: green

sily.  Addition

es  of  this  en

s pH optimu

st that acylhy

tly also wor

 9 

,  we  will 

nd in the 

ve role in 

se amide 

eatures  a 

ated.[23,25] 

e 6).[23,25] 

ire  it  for 

 

as  a  green n, O: red, N: 

nally,  the 

nzyme  in 

m  is 4.5, 

ydrazone 

king with 

Page 10: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Based on

analysis 

designed

developm

LibrarA library

by  the g

their  ori

structure

order to

Fragmen

substitut

Since  it 

would  h

acylhydr

construc

(Scheme

Predicte

found in

Figure 7: TColour codsurface is water mol

 

S4

S2 

n the require

and  contai

d  a  library  o

ment can be

rydesigny of compou

group of G. K

iginal  paper

es  in Schem

o accommod

nt  F284 was

ted with an e

is hard to de

have  to  be  o

razone  moie

cted by syste

e 3). 

d  binding m

 the support

The binding mde: O: red, N: bdepicted in grelecule bound to

 S1

 

ements that

n  at  least 

of  compoun

e greatly acce

nnds was des

Klebe.[28] The

r.  The  bindin

e 2. Since th

ate an acylh

s  reduced  to

ethylamine m

esign the  ide

oriented,  a  t

ety,  and  fo

ematically inc

modes  for  al

ting informat

odes of  the  twblue, F: pale cyaey. It can be seeo the active site

 all potentia

one  acylhyd

ds  based  on

elerated usin

signed based

e  fragments 

ng modes  o

he fragments

hydrazone  lin

o  a  fluoroph

moiety to pre

eal  linker an

total  of  eigh

our  featurin

cluding meth

l  these  com

tion. 

wo  fragments  can, Caspartic dyad:en that the frage upon binding 

  S2'

al inhibitors s

drazone  mo

n  computer 

ng DCC and S

d on fragmen

 used will b

of  these  frag

s overlap wh

nker, whilst 

henyl moiety

event interfe

d predict ex

ht  inhibitors

ng  a  "backw

hylene space

mpounds,  alo

co‐crystallised wgreen, CF109: te

gments bind in d(translucent re

 

'

S3

S1

should conta

iety  to  ena

models  in  o

STD‐NMR spe

nts in comple

e  referred  t

gments  are 

hen binding,

preserving k

y,  and  the  h

erence with 

xactly  in wha

 were  desig

ward"  acylh

ers at either 

ong with  cal

 

with endothiapeal, CF284: hot pdifferent pocked sphere). 

ain at least o

ble  the  dyn

order  to  de

ectroscopy.

ex with endo

o as F109 an

depicted  in

 they had to

key  interactio

hydrazide  in 

the acylhydr

at way the a

gned:  four  fe

hydrazone  m

end of the a

culated  bind

pepsin  (PDB  copink. Endothiapets, and that fra

one fluorine 

namic  excha

monstrate  t

othiapepsin 

nd F284,  in 

n  Figure  7  a

o be made s

ons with the

  fragment  F

razone excha

acylhydrazon

eaturing  a  "

moiety.  The

acylhydrazon

ding  energie

odes: 3PBZ andpepsin's solventagment F109 di

 10 

atom for 

ange,  we 

that  drug 

reported 

line with 

and  their 

smaller  in 

e protein. 

F109 was 

ange.  

e moiety 

forward" 

ese  were 

ne moiety 

es  can  be 

 3PMU).[28] t‐accessible splaces the 

Page 11: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Scheme  2acylhydrazmoiety. 

Scheme  3"forward" of the acyl

Due to p

second l

The  R' 

endothia

and F284

the  pos

substitue

These ni

crystal  s

accelera

done  fo

enabling

2:  After  obtainzone  linker;  red

3:  The  designed(1–4) or "backlhydrazone mo

problems wi

ibrary was d

fragment  w

apepsin  in u

4, a new libr

sition  of  the

ents were al

ine building 

structures of

te  the  drug

r many  com

g non‐destru

ing  binding  mducing F284  to

d  inhibitors.  Thkward" (5–8) aciety, and is dep

th the synth

esigned, this

was  replace

npublished 

rary was des

e  fluorine  w

so designed 

blocks were

f endothiape

g‐developme

mpounds  in 

ctive analysi

 

modes  for  fragmo a  fluoropheny

hey were  formcylhydrazone mpicted in red. 

hesis of the 

s time consis

ed  for  imid

work by M. 

signed. Since

was  varied 

(Figure 8 an

e obtained c

epsin  in orde

nt  process  s

one  experim

s of the DCL

ments  F109  anyl moiety, and

med  from  fragmmoiety. A methy

R' fragment 

sting of comm

dazole  alde

Mondal, N.

e there was a

(10–15),  a

nd Scheme 4,

commercially

er  to demon

since  both  t

ment.  The  a

L.  

nd  F284,  they  exchanging  th

ments  F109  anylene spacer w

in Scheme 3

mercially ava

hyde  (9),  w

Radeva, A.

ample space

nd  some  co

, 16–18). 

y and used  t

nstrate  that 

the  synthesi

nalysis was 

were  modifiehe hydrazide of

d  F284  (Schemwas systematica

3  (see Suppo

ailable comp

which  was 

Hirsch and G

e around F28

ompounds  w

to construct

the use of D

s  and  biolog

done  using

ed  to  make  rof F109  for an 

me  2)  by  addinally included at 

orting  Inform

pounds.  

co‐crystallis

G. Klebe. Ba

84 inside the

with  trifluo

t a DCL base

DCC  can  sig

gical  analysi

g  NMR  spect

 11 

oom  for  an ethylamine 

 

ng  either  a either end 

mation) a 

sed  with 

ased on 9 

e protein, 

romethyl 

ed on co‐

nificantly 

s  can  be 

troscopy, 

Page 12: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Figure 8: Ccyan, Caspagrey. It casite via hy

 

               * Work of

 S

Co‐crystal struc

artic  dyad: green, n be seen that drogen bonds (

                      f M. Mondal, 

S

S4 

S2 

ctures of F284 Cimidazol  aldehyde:imidazole alde(dashed yellow

                       N. Radeva, A.

 S1'

(PDB code: 3PM: orange, CF284:ehyde requires lines).  

Hirsch and G

 

MU)[28] and imi: hot pink. Enda water molecu

. Klebe. To be

S2'

dazole aldehydothiapepsin's  sule (red sphere

e published. 

  

S1

 

de.* Colour codsolvent‐accessibe) in order to bi

de: O: red, N: bble  surface  is dind to the prot

 12 

lue, F: pale depicted  in ein's active 

Page 13: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

 

Scheme 4:F284 was hydrazides

 

: The building bvaried,  and  ps 19–27. 

blocks used. Theotentially  subs

e compounds astituted  for  a  t

are based on F2trifluoromethyl

284 and 9, but tl  group  in  ord

he position of ter  to  yield  acy

the fluorine subylhydrazones  1

 13 

 

bstituent in 10–18  from 

Page 14: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

ModelThe  des

inhibitor

Modellin

acylhydr

stationa

acylhydr

Accordin

mediate

der Waa

15  are 

Supporti

Each  acy

suite.[30] 

isomeris

visually i

Figure 9: Tyellow  linewater mol

 

S

S2 

llingigned  librari

rs and would

ng  was  perf

razone  insid

ry. Water m

razone. 

ng to Moloc,

d by a wate

als interactio

shown  in  F

ing Informat

ylhydrazone 

Aspartic aci

sm was cons

inspected.  

The predicted bes.  Favourablelecule bound cl

ies were  firs

d bind to the 

formed  usin

e  the  prote

olecules we

, all acylhydr

r molecule; 

ons were gen

igure  9  and

tion. 

was docked

id residue 21

idered. The 3

binding mode o Van der Waaosely to the cat

 S1' 

st  studied  in

enzyme like

g  the  softw

ein,  and  the

re reset to t

razones sho

and occasion

nerally very f

d  10,  respec

d  inside  the 

19 was proto

30 poses wh

of 13. Colour cols  interactions talytic dyad is s

n  silico,  to  s

e the fragme

ware  program

en  optimisin

their position

uld bind  to 

nally form a

favourable. A

ctively.  Bind

enzyme us

onated and 

hich were mo

ode: O: red, F: involving  fluorshown as a red 

S2'

see  if  the  de

nts upon wh

m  Moloc[29]

ng  its  posit

ns according

the catalytic

dditional hy

As an examp

ding  modes 

ing  the  Flex

key water m

ost promising

pale cyan, Cprotrine  atoms aresphere. 

esigned  com

ich they wer

by  first  gen

ion  whilst  k

 to the cryst

c dyad throu

drogen bond

ple, the bind

for  10–18 

X docking m

molecules we

g according t

tein: green, C13: depicted  as d

 

S1

mpounds we

re based. 

nerating  the

keeping  the

tal structure

ugh a hydrog

ds. Furtherm

ding modes o

are  provide

module  in  th

ere unrestra

to the softw

purple, H‐bonddashed,  salmon

 14 

re  viable 

e  desired 

  enzyme 

 for each 

gen bond 

more, Van 

of 13 and 

ed  in  the 

he  LeadIT 

ined; E/Z 

ware were 

 

ds: dashed, n  lines.  The 

Page 15: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Figure 10: yellow  linewater mol

Unfortun

was bou

FlexX  re

scored b

more im

To  furth

poses in

yet,  it  is

bound to

 

 

S

S2 

The predicted es.  Favourablelecule bound cl

nately, FlexX

und  to  the  c

sults were d

by Hyde[30] d

mportantly, th

er analyse  t

 which the li

s unknown w

o the catalyt

S4 

binding mode  Van der Waaosely to the cat

X produced n

catalytic dya

discarded. So

directly; how

he ligand wa

this anomaly

igand was bo

why  the  soft

tic dyad. 

 S1' 

of 15. Colour cls  interactions talytic dyad is s

no poses for 

d with  a hy

ome  ligands,

wever, the re

s not bound 

y, 9 was doc

ound to the 

tware would

code: O: red, F: involving  fluorshown as a red 

any of the a

drogen bon

, which wer

esulting calcu

 to the cataly

cked using F

catalytic dya

d not produ

S2

pale cyan, Cprorine  atoms aresphere. 

cylhydrazon

d  via a wate

e most prom

ulated energ

ytic dyad. 

FlexX.  In  this

ad as indicat

ce poses  in 

'

tein: green, C15: depicted  as d

es in which t

er molecule.

mising accor

gy of binding

s case,  the  s

ted by the cr

which  the  a

 

S

purple, H‐bonddashed,  salmon

the imidazol

.  For  this  re

rding  to Mol

g was very p

software did

rystal structu

acylhydrazon

S1 

 15 

 

ds: dashed, n  lines.  The 

le moiety 

eason  the 

loc, were 

poor, and 

produce 

ure. As of 

nes were 

Page 16: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 16 

 

Discussion

Quantitative19F‐NMRTwo  spectra  were  recorded,  one  of  a  sample  containing  a  high  protein  concentration,  and  one 

without protein (experimental details can be found in the Supporting Information). Peaks were well 

separated, although less so for trifluoromethylated compounds. The integrals of the peaks from the 

library  members  were  normalised  against  the  integral  of  peak  from  trifluoroacetic  acid  and 

compared.  Since  sum  of  the  concentration  of  acylhydrazone  and  the  concentration  the 

corresponding hydrazide should be constant, their respective peak areas were summed to 100%. The 

result  is  plotted  in  Figure  11.  Unfortunately,  upon  addition  of  protein,  no  significant  change  in 

concentrations is observed. This means that none of the compounds bind to the protein according to 

these data. The raw data and spectra are provided in the Supporting Information. 

 

Figure 11:The difference  in peak area for separate  library members between a sample containing protein (plus), and one without (minus).  

1H‐STD‐NMRNo signal could be observed from the 1H‐STD‐NMR spectrum, not even one originating from 9 (the 

spectrum is provided in the Supporting Information). Since 9 is a known inhibitor this could indicate a 

problem with library, and it is hypothesised that the trifluoroacetic acid interferes with the binding of 

library members to the protein by either denaturing the protein, blocking the active site, or stopping 

the acylhydrazone exchange. Therefore, these experiments should be repeated with either a  lower 

concentration  of  trifluoroacetic  acid,  a  different  reference  compound,  or with  a  library  of  known 

binders in order to validate the methodology. 

19F‐STD‐NMRDespite our best efforts, no  19F‐STD‐NMR  spectrum could be  recorded on  the NMR  spectrometers 

available. No machine was available with a probe that could be tuned to 19F and 1H simultaneously. 

Tuning a probe to 19F and saturating 1H at −1.2 ppm by directly specifying the  frequency produced 

too many artefacts to yield a useful spectrum.  

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Hydrazide

Acylhydrazone

Page 17: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 17 

 

ConclusionsIn  conclusion, DCC  can play a  significant  role  in both  fragment  linking and  fragment growing, and 

should be part of every medicinal  chemist’s  toolkit. However, analysis of  the  resulting mixtures  is 

often  challenging, but here  a  variety of NMR  techniques  can help, providing  a way  to  analyse  an 

equilibrating  library  in a non‐destructive manner. STD‐NMR  is particularly  interesting  in  this sense, 

since it requires very little protein. 

As demonstrated, 19F‐NMR could extend these techniques further, granting  less background signals 

and excellent peak separation. The only additional requirement is that all relevant compounds must 

contain at least one 19F atom. 

Modelling and the NMR studies are in agreement, and no inhibitor was found in this study. It would 

be worthwhile to repeat this methodology with a library of known inhibitors, as well as repeating it 

with  a  different  reference  compound  to  make  sure  trifluoroacetic  acid  does  not  influence  the 

measurements.  Once  it  is  conclusively  proven  that  19F‐STD‐NMR  and  quantitative  19F‐NMR  are 

suitable for analysing DCLs,  it should be explored how  little protein  is required as a function of the 

free energy of binding of the library members. 

AcknowledgementsI would  like  to  particularly  thank  Pieter  van  der Meulen  for  his  extensive  help with  all  the NMR 

measurements, as well as his  limitless patience and perseverance  in  trying  to get  19F‐STD‐NMR  to 

work on a machine that  is not designed to do so. Furthermore, I would  like to thank Milon Mondal 

for  his  daily  supervision  and  help with  the  syntheses;  and  I would  like  to  thank  Anna Hirsch  for 

supervising this research project in her group.

Bibliography

1.  Erlanson, D. A. Introduction to fragment‐based drug discovery. Top. Curr. Chem. 317, 1–32 (2012). 

2.  Ou‐Yang, S.‐S. et al. Computational drug discovery. Acta Pharmacol. Sin. 33, 1131–1140 (2012). 

3.  Kutchukian, P. S. et al. Inside the mind of a medicinal chemist: the role of human bias in compound prioritization during drug discovery. PLoS One. 7, e48476 (2012). 

4.  Hajduk, P. J. et al. NMR‐based modification of matrix metalloproteinase inhibitors with improved bioavailability. J. Med. Chem. 45, 5628–5639 (2002). 

5.  Park, C. M. et al. Discovery of an orally bioavailable small molecule inhibitor of prosurvival B‐cell lymphoma 2 proteins. J. Med. Chem. 51, 6902–6915 (2008). 

6.  Wada, C. K. The evolution of the matrix metalloproteinase inhibitor drug discovery program at abbott laboratories. Curr. Top. Med. Chem. 4, 1255–1267 (2004). 

Page 18: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 18 

 

7.  Flaherty, K. T. et al. Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma. N. Engl. J. Med. 363, 809–819 (2010). 

8.  Bollag, G. et al. Clinical efficacy of a RAF inhibitor needs broad target blockade in BRAF‐mutant melanoma. Nature. 467, 596–599 (2010). 

9.  Wyatt, P. G. et al. Identification of N‐(4‐piperidinyl)‐4‐(2,6‐dichlorobenzoylamino)‐1H‐ pyrazole‐3‐carboxamide (AT7519), a novel cyclin dependent kinase inhibitor using fragment‐based X‐ray crystallography and structure based drug design. J. Med. Chem. 51, 4986–4999 (2008). 

10.  Artis, D. R. et al. Scaffold‐based discovery of indeglitazar, a PPAR pan‐active anti‐diabetic agent. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 262–267 (2009). 

11.  Sandanayaka, V. et al. Discovery of 4‐[(2S)‐2‐{[4‐(4‐Chlorophenoxy)phenoxy]methyl}‐1‐pyrrolidinyl] butanoic acid (DG‐051) as a novel leukotriene A4 hydrolase inhibitor of leukotriene B4 biosynthesis. J. Med. Chem. 53, 573–585 (2010). 

12.  Ramström, O. & Lehn, J.‐M. Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. Nat. Rev. Drug Discov. 1, 26–36 (2002). 

13.  Mamidyala, S. K. & Finn, M. G. In situ click chemistry: probing the binding landscapes of biological molecules. Chem. Soc. Rev. 39, 1252–1261 (2010). 

14.  Mondal, M. & Hirsch, A. K. H. Dynamic combinatorial chemistry: a tool to facilitate the identification of inhibitors for protein targets. Chem. Soc. Rev. 44, 2455–2488 (2015). 

15.  Erlanson, D. A. et al. In situ assembly of enzyme inhibitors using extended tethering. Nat. Biotechnol. 21, 308–314 (2003). 

16.  Maly, D. J., Choong, I. C. & Ellman, J. A. Combinatorial target‐guided ligand assembly: identification of potent subtype‐selective c‐Src inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 2419–2424 (2000). 

17.  Huc, I. & Lehn, J. M. Virtual combinatorial libraries: dynamic generation of molecular and supramolecular diversity by self‐assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 2106–2110 (1997). 

18.  Bunyapaiboonsri, T. et al. Dynamic deconvolution of a pre‐equilibrated dynamic combinatorial library of acetylcholinesterase inhibitors. Chembiochem. 2, 438–444 (2001). 

19.  Mondal, M. et al. Structure‐based design of inhibitors of the aspartic protease endothiapepsin by exploiting dynamic combinatorial chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53, 3259–3263 (2014). 

20.  Bhat, V. T. et al. Nucleophilic catalysis of acylhydrazone equilibration for protein‐directed dynamic covalent chemistry. Nat. Chem. 2, 490–497 (2010). 

21.  Viegas, A., Manso, J., Nobrega, F. L. & Cabrita, E. J. Saturation‐Transfer Difference (STD) NMR: A Simple and Fast Method for Ligand Screening and Characterization of Protein Binding. J. Chem. Educ. 88, 990–994 (2011). 

Page 19: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 19 

 

22.  Diercks, T. et al. Fluorinated carbohydrates as lectin ligands: versatile sensors in 19F‐detected saturation transfer difference NMR spectroscopy. Chemistry. 15, 5666–5668 (2009). 

23.  Coates, L. et al. The catalytic mechanism of an aspartic proteinase explored with neutron and X‐ray diffraction. J. Am. Chem. Soc. 130, 7235–7237 (2008). 

24.  Davies, D. R. The structure and function of the aspartic proteinases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 189–215 (1990). 

25.  Coates, L., Erskine, P. T., Wood, S. P., Myles, D. A. A. & Cooper, J. B. A neutron laue diffraction study of endothiapepsin: Implications for the aspartic proteinase mechanism. Biochemistry. 40, 13149–13157 (2001). 

26.  Coates, L., Erskine, P. T., Crump, M. P., Wood, S. P. & Cooper, J. B. Five Atomic Resolution Structures of Endothiapepsin Inhibitor Complexes: Implications for the Aspartic Proteinase Mechanism. J. Mol. Biol. 318, 1405–1415 (2002). 

27.  Pearl, L. & Blundell, T. The active site of aspartic proteinases. FEBS Lett. 174, 96–101 (1984). 

28.  Köster, H. et al. A small nonrule of 3 compatible fragment library provides high hit rate of endothiapepsin crystal structures with various fragment chemotypes. J. Med. Chem. 54, 7784–7796 (2011). 

29.  Gerber, P. R. & Müller, K. MAB, a generally applicable molecular force field for structure modelling in medicinal chemistry. J. Comput. Aided. Mol. Des. 9, 251–268 (1995). 

30.  Augustin, B. G. S. LeadIT 2.1.3. at <http://www.biosolveit.de> 

31.  Schrödinger LLC. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7.2. (2010). at <http://www.pymol.org> 

32.  McDonald, C. et al. The N‐iodosuccinimide‐mediated conversion of aldehydes to methyl esters. J. Org. Chem. 54, 1213–1215 (1989). 

33.  Sharma, A. K., Subramani, A. V. & Gorman, C. B. Efficient synthesis of halo indanones via chlorosulfonic acid mediated Friedel–Crafts cyclization of aryl propionic acids and their use in alkylation reactions. Tetrahedron. 63, 389–395 (2007). 

34.  Zhou, D. et al. 2‐(Pyrrolidin‐1‐yl)ethyl‐3,4‐dihydroisoquinolin‐1(2H)‐one derivatives as potent and selective histamine‐3 receptor antagonists. J. Med. Chem. 55, 2452–2468 (2012). 

35.  Surry, D. S. & Buchwald, S. L. Dialkylbiaryl Phosphines in Pd‐Catalyzed Amination: A User’s Guide. Chem. Sci. 2, 27–50 (2011).  

Page 20: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 S1  

SupportingInformationAll figures in this work featuring endothiapepin are generated using PyMOL.[31] 

LibraryA—Compounds1to8

ModellingmethodsThe target compounds were first designed inside the protein using Moloc,[29] and their position was 

optimised whilst keeping the protein stationary. Each acylhydrazone was docked  inside the enzyme 

using the FlexX docking module in the LeadIT suite.[30] Aspartic acid residue 219 was protonated and 

key water molecules were  unrestrained;  E/Z  isomerism was  considered.  30  poses were  kept  per 

ligand.  

The  resulting poses were  visually  inspected  to  ensure  they  bound  to  the protein  like  the  original 

fragments, and were otherwise discarded. The most promising pose was used for Hyde scoring[30] in 

order to obtain a predicted free energy of binding (ΔGHyde).  

Colour code for the figures: O: red, N: blue, F: pale cyan, Cprotein: green, Cligand: orange. The solvent‐

accessible  surface of  the  protein  is  shown  in  grey. Hydrogen bonds  are  shown  as dashed,  yellow 

lines. 

   

Page 21: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 S2  

ModellingresultsTable S1 depicts the binding energies as predicted by Hyde. 

Compound  ΔGHyde (kJ/mol) 

1  −30 

2  −39 

3  −21 

4  −30 

5  −32 

6  −39 

7  −19 

8  −17 Table S1: The binding energies for compounds 1–8, predicted by Hyde. 

 

Page 22: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

1:(E)‐N

ΔGHyde = 

 

 

N'‐(2‐(2‐Ami

−30 kJ/mol 

 

S4 

S2 

noethyl)‐5‐

 

 S1' 

 

(diethylami

 

ino)benzyliddene)‐2‐fluo

 S

orobenzohyd

S2' 

S

drazide

  

S1 

 S3 

 

Page 23: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

2:(E)‐N'

ΔGHyde = 

 

 

S

'‐(2‐(2‐Amin

−39 kJ/mol 

 

S4 

S2 

noethyl)‐5‐(

 

 S1' 

 

(diethylamin

  

no)benzyliddene)‐2‐(2‐fl

 S2

luorophenyl

2' 

S3

l)acetohydr

  

S1 

 S4 

razide

 

Page 24: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

3:(E)‐N

ΔGHyde = 

 

 

 S2

N'‐(2‐(2‐(2‐A

−21 kJ/mol 

S4 

 

Aminoethyl)

  

 

S1' 

 

‐5‐(diethylaamino)phen

 

nyl)ethyliden

S2'

ne)‐2‐fluoro

  

S3

S

obenzohydra

S1 

 S5 

azide

 

Page 25: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

4:(E)‐Ndrazide

ΔGHyde = 

 

 

S

N'‐(2‐(2‐(2‐A

−30 kJ/mol 

 

S4 

S2 

Aminoethyl)

 

 

 S1' 

 

‐5‐(diethyla

 

amino)phennyl)ethyliden

 S2

ne)‐2‐(2‐fluo

2'

S3

orophenyl)a

  

S1 

 S6 

acetohy

 

Page 26: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

5:(E)‐2

ΔGHyde = 

 

 

‐(2‐Aminoe

−32 kJ/mol 

 

S4 

S2 

thyl)‐5‐(die

  

 

 S1' 

 

ethylamino)‐‐N'‐(2‐fluorobenzyliden

 S

ne)benzohyd

S2' 

S

drazide

  

S3 

S1 

 S7 

 

Page 27: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

6:(E)‐2

ΔGHyde = 

 

 

‐(2‐Aminoe

−39 kJ/mol 

 

S4 

S2 

thyl)‐5‐(die

 

 S1'

 

ethylamino)‐

  

 

‐N'‐(2‐(2‐fluuorophenyl)

 

)ethylidene)

S2' 

S

)benzohydra

  

S3 

S1 

 S8 

azide

 

Page 28: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

7:(E)‐2

ΔGHyde = 

 

 

S

‐(2‐(2‐Amin

−19 kJ/mol 

 

S4 

S2 

noethyl)‐5‐(

 

 S1' 

diethylamin

  

no)phenyl)‐NN'‐(2‐fluoro

 S2

obenzylidene

'

S3 

e)acetohydr

  

S1 

 S9 

razide

 

Page 29: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

8:(E)‐2drazide

ΔGHyde = 

 

S

‐(2‐(2‐Amin

−17 kJ/mol 

 

S4 

S2 

noethyl)‐5‐(

 

 S1' 

diethylamin

  

no)phenyl)‐NN'‐(2‐(2‐flu

 S2

orophenyl)e

S3 

ethylidene)a

  

S1 

 S10 

acetohy

 

Page 30: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

SyntheThe plan

obtained

and S2).

Library d

Scheme S1with a boxnight; rt: r

 

esisnned and att

d starting ma

 Since not a

design). 

1: The used synx; target comporoom temperat

tempted  syn

aterials are s

all desired co

nthetic routes founds are  in bure; quant.: qu

nthetic  route

surrounded w

ompounds c

or the fluorophlue; failed reacantitative. 

es are depic

with a box, a

could be obt

henyl compounctions are show

cted  in  the  f

and target co

tained, a dif

ds. Commerciawn with a red, c

ollowing  sch

ompounds ar

ferent  librar

lly obtained cocrossed arrow. 

hemes. Com

re in blue (Sc

ry was desig

ompounds are s Abbreviations

 S11 

mercially 

cheme S1 

gned  (see 

 

surrounded : o.n.: over 

Page 31: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Scheme S2obtained  ccrossed ar

 

2: The used syncompounds arerrow. Abbreviat

nthetic routes fe  surrounded wtions: o.n.: over

for the 2‐(2‐amwith a box;  tarr night; rt: room

minoethyl)‐5‐(dirget  compoundm temperature.

ethylamino)beds are  in blue; . 

nzohydrazide cfailed  reaction

compounds. Cons are  shown w

 S12 

 

mmercially with a  red, 

Page 32: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Methyl2N‐Iodosu

in dry m

stirred  i

heptane

mixture 

saturate

solvent i

7.94 (td,

δ= −109.

2‐fluorobenuccinimide (1

methanol  (25

n  the  dark 

e). Upon com

was  extrac

ed  aqueous 

in vacuo yiel

, 1H), 7.56 – 

.50 – −109.7

nzoate(29)[3

1.4 g, 6.22 m

5 mL), and 2

for  2.5  h,  a

mpletion, wat

cted  with  50

NaCl  solutio

ded 29 as a 

7.46 (m, 1H

4 (m, 1F). 

32]mmol, 2.4 eq

28  (0.41 mL, 

and  the  rea

ter (16 mL) a

0%  ether  in

on,  dried  ov

yellow liquid

), 7.20 (td, 1

) and dried K

 0.32 g, 2.5

action  was  f

and sodium 

n  pentane  (4

ver magnesiu

d (0.44 g, 2.8

H), 7.14 (ddd

K2CO3 (1 g, 7

6 mmol, 1 e

followed  by 

thiosulfate (

4  ×).  The  o

um  sulfate  a

85 mmol, 75

d, 1H), 3.93 

.24 mmol, 2.

eq) was adde

TLC  (SiO2; 

(1.6 g) were 

rganic  phas

and  filtered.

5%). 1H‐NMR

(s, 3H). 19F‐N

.8 eq) were 

ed. The mix

20%  ethylac

added. The 

se  was  wash

.  Evaporatio

R(400 MHz, C

NMR(376 MH

 

 

 S13 

dissolved 

xture was 

cetate  in 

resulting 

hed  with 

on  of  the 

CDCl3): δ= 

Hz, CDCl3) 

Page 33: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

2‐Fluoro29 (0.4 g

Upon ad

the reac

(aq) wer

and  the

filtration

2.13 mm

6.84 (td,

obenzohydrg, 2.60 mmo

ddition of hyd

ction with TL

re added and

e  resulting  m

n, and  the  s

mol, 82.5%) a

, 1H), 6.79 – 

razide(30)[1

l, 1 eq) was d

drazine the s

LC (SiO2; 30%

d the metha

mixture  was

olvent was 

as a bright or

6.69 (m, 1H)

19]dissolved in 

solution disc

% ethylacetat

nol was rem

s  sonicated. 

removed  fro

range solid. 1

), 2.12 (p, 2H

methanol (1

colored. The 

te in heptan

moved in vac

Compound

om  the  resu1H‐NMR(400

H). 19F‐NMR(3

1.7 mL) and N

solution was

e). Upon co

cuo. 1.25 M e

ds  that  did 

lting  solutio

0MHz, CDCl3)

376 MHz, CD

N2H4∙H2O (1.0

s refluxed fo

mpletion a f

ethanolic HC

not  dissolve

n  in  vacuo  y

): δ= 7.39 (td

DCl3): δ= −106

05 g, 21 mm

or 6 h whilst f

few drops of

Cl (15 mL) w

e  were  rem

yielding 30 

d, 1H), 7.12 (

6.54 (p, 1F). 

 

 

 S14 

mol, 8 eq). 

following 

f 2 M HCl 

as added 

moved  by 

(329 mg, 

(tdd, 1H), 

Page 34: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Methyl231 (1 g, 

with a se

left  to  s

heptane

amount 

3H),  3.5

121.56, 

2‐(2‐fluorop6.49 mmol, 

eptum and a

stir overnigh

e).  Upon  com

of pure 32. 

8  (s,  2H).  13

121.40, 115.

phenyl)aceta1 eq) was d

acetyl chlorid

t  after whic

mpletion  th1H‐NMR(40

3C‐NMR(101

.64, 115.43, 5

ate(32)*dissolved  in d

de (2.5 mL, 

ch  the  conve

e  solvent  w

0 MHz, CDC

 MHz,  CDCl

52.31, 34.44

dry methano

35.16 mmol

ersion was  c

was  evapora

Cl3): δ= 7.21 

l3):  δ=  171.2

4. 19F‐NMR(3

ol (30 mL)  in

, 5.4 eq) wa

checked with

ated  in  vacu

– 7.12  (m, 2

28,  162.41,

76 MHz, CDC

n a round‐bo

s added slow

h  TLC  (SiO2; 

uo  which  yie

2H), 7.05 – 6

159.96,  131

Cl3): δ= −117

ottom flask e

wly. The mix

20%  ethyla

elded  a  qua

6.90  (m, 2H)

1.57,  129.22

7.21 – −117.4

 

 

 S15 

equipped 

xture was 

cetate  in 

antitative 

), 3.61  (s, 

,  124.26, 

46 (m). 

Page 35: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

 

 

 S16 

Page 36: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

2‐(2‐Flu32 (0.7 g

8 eq). Th

ethylace

methano

mixture 

was rem

white so

(s, 2H), 2

uorophenyl)g, 4.16 mmo

he resulting m

etate  in  hep

ol  was  remo

was sonicate

moved  from t

olid. 1H‐NMR

2.08 (s, 1H). 1

acetohydral, 1 eq) was 

mixture was

ptane).  Upon

oved  in  vac

ed. Compou

the resulting

R(400 MHz, D19F‐NMR(376

zide(33)*dissolved in 

 refluxed ov

n  completio

uo.  1.25 M 

nds that did

g solution  in

DMSO‐d6): δ=

6 MHz, DMSO

 ethanol (1 m

ernight. The

n  a  few  dr

ethanolic  H

 not dissolve

n vacuo yield

= 11.11 (s), 7

O‐d6): δ= −1

mL) and N2H

 conversion 

ops  of  2  M

HCl  (23.3 m

e were remo

ding 30  (454 

7.42 – 7.29 (

17.06 (q, 1F)

4∙H2O (1.61 

was checked

  HCl  (aq)  w

L)  was  adde

oved by filtra

mg, 2.70 m

m, 2H), 7.22

). 

mL, 1.66 g, 3

d with TLC (S

were  added 

ed  and  the 

ation, and th

mmol, 65%) a

2 – 7.14 (m, 

 

 

 S17 

33 mmol, 

SiO2; 30% 

and  the 

resulting 

e solvent 

as an off‐

2H), 3.65 

Page 37: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

2‐(2‐Flu31 (0.2 g

trimethy

after wh

The resu

instead, 

34  could

correspo

31 (771 

triperflu

nitrogen

followed

mixture 

magnesi

column c

5‐BromoTo 35 (5

solution 

and extr

dried ov

15.3 mm

1H), 3.10

               * Reaction

uorophenyl)g, 297 mmol,

ylamine (181

hich  it was co

ulting mixtur

only aromat

d  not  be  syn

onding alcoh

mg, 5 mmo

orophenylbo

n  line. After 

d by 1 M HCl

was  extrac

um sulfate, 

chromatogra

o‐2,3‐dihyd.27 g, 23 mm

was stirred 

racted with D

ver sodium s

mol, 68%) as 

0 (t, 2H), 2.7

                      n performed b

acetaldehyd, 1 eq) was d

1 µL, 131 mg,

ooled to −78

re was stirred

tic hydrogen

nthesised  by

ol was obser

l, 1 eq); ben

orane  (2.56 

1.3 h  the  c

l (aq, 20 mL)

cted  three  t

filtered and

aphy (SiO2; 2

ro‐1H‐indenmol, 1 eq) wa

for 1 h at 0°

DCM. The or

sulfate,  filter

white needl

7 – 2.69 (m, 

                       by Milon Mon

de(34)*dissolved in D

, 297 mmol, 

8°C followed

d for 30 min

 atoms are o

y  reducing  3

rved. 

zene (3 mL);

mg, 5 µmol,

rude  reactio

 whilst stirri

times  with  e

 the solvent

2% ethylaceta

n‐1‐one(36as added chlo

C after whic

rganic layer w

red and  the 

les. 1H‐NMR

2H). 

ndal. 

DCM (2 mL). 

1 eq) were a

d by the add

. No formati

observed. 

32 with DIBA

; triethylsila

, 0.001 eq) w

on mixture w

ng vigorousl

ether.  The 

t was remov

ate in penta

6)[33]orosulfonic a

h the reactio

was washed

solvent was

(400 MHz, C

TMSCl (165 

added at 0°C

ition of 1.2 

ion of aldehy

AL‐H  in  tolu

ne (1.84 mL,

were added 

was dried  in

ly for 3 h at 

organic  laye

ved  in vacuo

ne). No prod

acid (40 mL, 

on was quen

 with concen

s removed  in

CDCl3): δ= 7.8

µL, 141 mg, 

C. The mixtur

M DIBAL‐H  i

yde 34 was o

uene  at  −78°

, 1.34 g, 11.5

to a dried fl

vacuo.  THF

room tempe

ers  were  co

. The produc

duct formatio

70.1 g, 602 m

ched with ic

ntrated sodiu

n vacuo, whi

88 (d, 1H), 7

297 mmol, 1

re was stirre

in toluene (1

observed by 

°C.  Reductio

5 mmol, 2.3

lask equippe

F  (20 mL) wa

erature. The 

ombined,  dr

ct was purif

on was obse

mmol, 26 eq

ce‐cold wate

um bicarbon

ich yielded 3

7.69 (dd, 1H)

 S18 

1 eq) and 

d for 1 h; 

1.08 mL). 1H‐NMR, 

on  to  the 

 eq); and 

ed with a 

as  added 

resulting 

ried  over 

ied using 

rved.

) and the 

r (70 mL) 

nate (aq), 

36  (3.2 g, 

, 7.37 (d, 

Page 38: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

6‐BromoTo a sol

sodium 

warm  to

1 M  sod

organic l

sodium 

ethylace1H‐NMR

2H). 

 

o‐3,4‐dihydution of 36 

azide  (1.39 g

o  room  temp

dium  hydrox

layers were 

sulfate,  filte

etate or DCM

(400 MHz, C

roisoquinol(3 g, 14.2 m

g, 21.32 mm

perature and

xide  (aq,  50 

washed sequ

ered,  and  c

M. Four batch

CDCl3): δ= 8.4

in‐1(2H)‐onmmol, 1 eq)  i

mol, 1.5 eq) w

d stirred ove

mL).  The  a

uentially wit

oncentrated

hes yielded a

46 (s, 1H), 7

ne(37)[34]in DCM  (84 

was added s

ernight. The 

aqueous  laye

th water and

d  in  vacuo. 

a total of 2.1

7.11 (dd, 1H)

mL) and me

slowly. The r

mixture wa

er  was  extra

d saturated a

The  resultin

16 g of 37 (9.

), 7.05 – 6.9

ethansulfonic

resulting mix

s partitioned

acted  with  D

queous NaC

ng  solid  was

55 mmol, 68

4 (m, 2H), 2

c acid  (42 m

xture was al

d between D

DCM.  The  c

Cl solution, d

s  recrystallis

8%) as white

2.93 (t, 2H), 

 S19 

mL) at 0°C 

lowed to 

DCM and 

combined 

ried over 

sed  from 

e crystals. 

2.64 (dd, 

 

Page 39: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

6‐(DiethAn oven

(900  m

2‐dicyclo

was plac

8.748 m

a syringe

(SiO2; 50

with  eth

2.1 mmo1H‐NMR

2H), 2.37

 

hylamino)‐3‐dried Schle

mg,  3.98  m

ohexylphosp

ced under a

L, 8.75 mmo

e. The solutio

0% ethylacet

hylacetate, 

ol,  53%)  as

(400 MHz, D

7 (t, 2H), 1.0

3,4‐dihydroink flask equi

mmol,  1  eq

hino‐2′,6′‐di

n Argon atm

ol, 2.2 eq) an

on was heat

tate  in penta

washed  wit

s  an  orang

DMSO‐d6): δ=

5 (t, 6H). 

soquinolin‐ipped with a

q),  palladiu

isopropoxyb

mosphere, a

d diethylam

ed to 50°C a

ane). After c

th  water,  a

ge  solid.  T

= 9.74 (s, 1H

1(2H)‐one(a magnetic st

um(II)  aceta

biphenyl (RuP

nd 1 M  lith

ine (0.453 m

and stirred fo

cooling  the m

nd  concent

he  product

H), 6.90 (d, 1

(38)[35]tirring bar an

ate  (45  m

Phos, 185.4 

ium bis(trim

mL, 17.77 g, 2

or 24 h whils

mixture  to  r

rated  in  va

t  was  used

H), 6.28 – 6

nd a septum 

g,  0.2  mm

µg, 0.42 mm

methylsilyl)am

243 mmol, 6

st following t

room  tempe

cuo.  This  y

d  without 

.12 (m, 2H), 

was charged

mol,  0.05 

mol, 0.1 eq). 

mide  in THF 

1 eq) were a

the reaction 

erature  it wa

yielded  38  (

further  pur

3.25 (q, 4H)

 S20 

d with 37 

eq)  and 

The flask 

(LHMDS, 

added via 

with TLC 

as diluted 

(458  mg, 

rification. 

), 2.70 (t, 

 

Page 40: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

N,N‐Diet38  (358 

(35 mL) 

Water  (3

(10.8 mL

yielded 3

1H), 3.29

 

               * Reaction

thyl‐1,2,3,4‐mg, 1.62 m

over the cou

3.6 mL) was

L).  The  prec

39 (270 mg, 

9 – 3.19 (m, 

                      n performed b

‐tetrahydromol, 1 eq) w

urse of 30 m

s  added dro

ipitate was 

1.32 mmol, 

4H), 2.67 (t, 

                       by Milon Mon

isoquinolin‐was added to

min. The mixt

pwise,  follow

removed  an

80%). 1H‐NM

2H), 1.97 – 1

ndal. 

‐6‐amine(3o a solution

ture was gen

wed by 4 M

nd washed w

MR(400 MHz

1.85 (m, 2H)

9)* of LiAlH4  (6

ntly refluxed 

M  sodium hy

with  THF.  Th

z, CDCl3): δ= 

, 1.12 (t, 6H)

650 mg, 4.86

overnight, c

droxide  (aq,

he  filtrate w

6.80 (d, 1H),

). 

6 mmol, 3 eq

cooled in an 

, 3.6 mL),  an

was  evapora

, 6.07 (d, 1H

 S21 

q)  in THF 

ice bath. 

nd water 

ted.  This 

), 5.84 (s, 

Page 41: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

N,N‐Diet39  (10 

0.054 m

tempera

mixture 

(aq, 131

extracte

over ma

accordin

A mixtur

stirred  a

yielded o

To  a  fla

dissolved

solution 

1.05 eq) 

then hea

1.1 eq) w

tempera

bicarbon

layer  wa

sulfate, f

44  (50 m

ethylbro

mixture 

This yiel

1H), 3.74

thyl‐3,4‐dihmg,  0.049  m

mol,  1.1  eq

ature.  To  thi

was stirred v

1 µL). The ac

d with DCM

agnesium  su

ng to 1H‐NMR

re of 39 (50 

at  room  tem

over‐oxidised

me‐dried  fla

d  in dry DCL

was  cooled

was added 

ated  to 0°C 

was added d

ature  and  st

nate (aq, 0.2 

as  extracted

filtered, and 

mg,  0.342 m

omide (149 m

was  diluted

ded 10% of 

4 (t, 2H), 3.1

hydroisoquinmmol,  1  eq

q)  was  add

is mixture  3

vigorously fo

cidic extract

M. The organ

lfate and  filt

R.  

mg, 0.245 m

mperature  fo

d product. N

ask  equipped

L  (0.8 mL). 2

d  to  −78°C  a

dropwise via

and  stirred 

ropwise and

tirred  for  5 

mL) and dilu

d  with  DCM 

the solvent 

mmol,  1  eq)

mg, 1.369 m

d with  conce

40. 1H‐NMR

7 (q, 4H), 2.6

nolin‐6‐amin)  was  disso

ded  and  the

30% NaOH  (a

or 1 h. The or

s were mad

ic  layers we

tered. The  s

mmol, 1 eq) a

or  40 h.  The

No improvem

d with  a  sep

2‐Fluoropyrid

and  stirred  f

a a syringe a

for an addit

 the mixture

h.  The  rea

uted with DC

(2  ×).  The 

was remove

),  tertbutyla

mol, 4 eq) w

entrated  sod

(400 MHz, C

63 (t, 2H), 1.2

ne(40)*lved  in  DCM

e  reaction 

aq,  33  µL,  5

rganic layer 

de alkaline  to

ere washed w

solvent was 

and MnO2 (5

e mixture wa

ment was obs

ptum  38  (44

dine  (19 µL, 

for  10 min. 

and the reac

tional 10 m

e was stirred 

action  was  q

CM (0.8 mL).

organic  laye

ed in vacuo. N

mmonium  c

were added 

dium  bicarbo

CDCl3): δ= 9.0

26 (t, 6H). 

M  (100  µL). 

mixture  wa

5  eq) was  a

was washed

o pH 10 by 

with  saturat

removed  in

53 mg, 0.61 m

as  filtered,  a

served with s

4 mg,  0.2 m

21 mg, 0.22

Triflic  anhyd

tion was stir

in. Triethylsi

for 10 min. 

quenched  by

 The layers w

ers  were  co

No product w

chloride  (35

to a flask an

onate  (aq)  a

01 (s, 1H), 8

N‐Bromosu

s  stirred  fo

dded  and  th

 with water 

addition of 

ed aqueous 

vacuo. No 

mmol, 2.5 eq

and  the  filtra

shorter react

mmol,  1  eq) 

2 mmol, 1.1 

dride  (35 µL

rred for 10 m

ilane  (35 µL,

The solution

y  addition  o

were separat

ombined  and

was observed

0 mg,  1.26 

nd stirred at

and  extracte

.29 (d, 1H), 

uccinimide  (

or  30  min 

he  resulting 

(131 µL) and

1 M NaOH 

 NaCl  soluti

product was

q) in DCM (5

ate  evapora

tion times. 

was  added 

 eq) was ad

L,  59 mg,  0.2

min. The mix

L, 26 mg, 0.2

n was heated

of  saturated

ted, and the

d  dried  ove

d by DART‐M

mmol,  3.7 

t 75°C overn

ed with  ethy

7.64 (d, 1H)

 S22 

19.6  mg, 

at  room 

biphasic 

d 1 M HCl 

(aq) and 

on, dried 

s  formed 

5 mL) was 

ated.  This 

and was 

ded. The 

21 mmol, 

xture was 

22 mmol, 

d to room 

d  sodium 

aqueous 

r  sodium 

MS. 

eq),  and 

ight. The 

ylacetate. 

, 7.49 (d, 

Page 42: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

3,4‐Dihy41  (5 g, 

1.1 eq) w

NaOH (a

organic 

alkaline 

were wa

solvent 

(SiO2; 6.

(m, 2H), 

 

               * Reaction

ydroisoquin37.5 mmol,

was added sl

aq, 25 mL) wa

layer was w

to pH 10 by 

ashed with s

was  remove

25% methan

7.17 (d, 1H)

                      n performed b

noline(42)* 1 eq) was d

lowly and th

as added an

washed with

addition of 1

aturated aq

ed  in  vacuo, 

nol in DCM).

, 3.83 – 3.74

                       by Milon Mon

dissolved  in 

e resulting m

d the resulti

 water  and 

1 M NaOH (a

ueous NaCl 

and  the pr1H‐NMR(40

4 (m, 2H), 2.7

ndal. 

DCM  (75 m

mixture was 

ng biphasic 

1 M HCl  (a

aq) and extra

solution, dri

oduct was p

00 MHz, CDC

76 (q, 2H). 

L). N‐Bromo

stirred for 3

mixture was

aq,  100 mL).

acted with D

ed over mag

purified usin

Cl3): δ= 8.35 (

osuccinimide

0 min at roo

stirred vigor

  The  acidic 

CM. The com

gnesium sulf

ng  flash  colu

(s, 1H), 7.37 

e  (7.5 g, 41.2

om temperat

rously overn

extracts we

mbined organ

fate and filte

umn  chroma

 (td, 1H), 7.3

 S23 

25 mmol, 

ture. 30% 

night. The 

ere made 

nic layers 

ered. The 

tography 

34 – 7.25 

Page 43: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

6‐Nitro‐Oven dr

mixture 

to room

which  th

DCM. Th

sulfate  a

chromat

product.

3.91 – 3.

 

‐3,4‐dihydroied KNO3 (2.

42 (2.6 g, 19

 temperatur

he mixture w

he organic la

and  filtered.

tography  (SiO

.  1H‐NMR(40

.82 (m, 2H), 

oisoquinolin.02 g, 29.6 m

9.82 mmol, 1

re over 2 h. 

was made a

ayers were w

.  The  solven

O2; 50% eth

00 MHz, CDC

2.87 (t, 2H). 

ne(43)*mmol, 1.5 eq

1 eq) was ad

It was then 

lkaline  to pH

washed with 

nt was  remo

ylacetate  in

Cl3): δ= 8.43

q) was disso

dded at 0°C a

immersed  i

H 10 by add

saturated aq

oved  in  vacu

 hexane). Th

  (t, 1H), 8.2

lved  in 1 M 

and the resu

n a preheat

dition of 3 M

queous NaC

uo.  The  pro

his  yielded 6

7 – 8.19  (m

sulfuric acid

lting mixture

ed oil bath a

M NaOH  (aq

l solution, dr

duct was  pu

67% product

, 1H), 8.14  (

d (aq, 20 mL

e was slowly

at 60°C for 4

) and extrac

ried over ma

urified  using

t, and 33% 

(d, 1H), 7.35

 S24 

L). To this 

y warmed 

4 h, after 

cted with 

agnesium 

g  column 

hydrated 

5  (d, 1H), 

 

Page 44: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

3,4‐Dihy43 (0.1 g

treated w

2 mL) an

ice‐cold 

residue. 

chromat

oil. 1H‐N

2H), 3.67

117.68, 

               * Reaction

ydroisoquing, 0.56 mmo

with a soluti

nd heated to

water (17 m

The residue

tography (SiO

MR(400 MH

7 (s, 2H), 2.6

113.95, 48.2

                      n perfomed b

noline‐6‐amiol, 1 eq) was

ion of tin(II) 

o 60°C for 1 

mL) and made

e was extract

O2; 0.5% am

Hz, CDCl3): δ=

63 (t, 2H). 13

20, 24.37. 

                       by Milon Mond

ine(44)*s dissolved  in

chloride deh

h. After coo

e alkaline to 

ted into DCM

monia and 4

= 8.23 (t, 1H)

C‐NMR(101 

dal. 

n ethanol (2

hydrate (0.5 

oling to room

pH 9 with p

M and dried i

4.5% methan

), 6.95 (d, 1H

MHz, CDCl3)

5 mL) and h

g, 2.28 mmo

m temperatu

potassium hy

in vacuo. The

nol in DCM).

H), 6.69 (dd, 

): δ= 160.59,

eated to 60°

ol, 4 eq) in c

ure the mixtu

ydroxide pell

e product wa

 This yielded

1H), 6.62 (d,

, 145.52, 129

0°C. This solu

concentrated

ure was pou

ets, liberatin

as purified b

d 44 as a da

, 1H), 3.77 –

9.27, 128.29

 S25 

ution was 

d HCl (aq, 

ured onto 

ng an oily 

y column 

rk yellow 

– 3.69 (m, 

9, 126.39, 

Page 45: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 S26  

N'‐(4‐Amino‐2‐(2‐aminoethyl)benzylidene)‐2‐fluorobenzohydrazide(45)*44 (50 mg, 0.324 mmol, 1 eq) and 30 (71 mg, 0.389 mmol, 1.2 eq) were dissolved in sodium acetate 

buffer  (0.6 mL, 0.1 M, pH 4.6). The mixture was heated  in a microwave, but no product  formation 

was observed. 

 

 

 

Page 46: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

Librar

ModelColour  c

solvent‐a

yellow li

10:(E)‐

 

S2

ryB—Co

llingresulcode  for  th

accessible  su

nes. The wat

N'‐((1H‐Imi

 

S4 

ompound

ltshe  figures:  O

urface of  th

ter molecule

idazol‐2‐yl)m

 

 S1' 

ds10to1

O:  red,  N: 

e protein  is 

e bound to th

methylene)‐

18

blue,  F:  pa

shown  in g

he catalytic d

‐2‐fluoroben

S

ale  cyan,  Cp

grey. Hydrog

dyad is show

nzohydrazid

S2'

rotein:  green,

en bonds  ar

wn as a red sp

de

 

,  Cligand:  pur

re  shown as

phere. 

 

S1 

 S27 

rple.  The 

s dashed, 

 

Page 47: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

11:(E)‐

12:(E)‐

 

 

S

S2 

 

S4

S2 

N'‐((1H‐Imi

N'‐((1H‐Imi

S4 

idazol‐2‐yl)m

idazol‐2‐yl)m

 

 S1' 

 S1'

methylene)‐

methylene)‐

‐3‐fluoroben

‐4‐fluoroben

S2'

S2'

nzohydrazid

nzohydrazid

de

de

 

S1

 

S1 

 S28 

 

 

Page 48: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

13:(E)‐

14:(E)‐

 

 

S4

S2 

S2 

N'‐((1H‐Imi

N'‐((1H‐Imi

 

S4 

idazol‐2‐yl)m

idazol‐2‐yl)m

 

 S1' 

 S1' 

methylene)‐

methylene)‐

‐2,4‐difluoro

‐2,5‐difluoro

S2'

S2

obenzohydr

obenzohydr

2'

razide

razide

 

S1

  

S

S1 

 S29 

 

 

Page 49: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

15:(E)‐

16:(E)‐

 

S2 

 

S

S2 

N'‐((1H‐Imi

N'‐((1H‐Imi

 

S4 

S4 

idazol‐2‐yl)m

idazol‐2‐yl)m

 

 S1' 

 S1' 

methylene)‐

methylene)‐

‐2,6‐difluoro

‐3‐(trifluoro

 S2

 S2

obenzohydr

omethyl)ben

2'

2'

razide

nzohydrazid

  

S

 

S

de

S1 

S1 

 S30 

 

 

Page 50: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

17:(E)‐

18:(E)‐

 

 

S

S2 

S

N'‐((1H‐Imi

N'‐((1H‐Imi

 

S4 

S2 

idazol‐2‐yl)m

idazol‐2‐yl)m

 

 S1' 

 S1' 

methylene)‐

methylene)‐

‐4‐(trifluoro

‐3,5‐bis(trif

S2'

omethyl)ben

fluoromethy

S2' 

nzohydrazid

yl)benzohyd

 

S1

de

drazide

  

S1 

 S31 

 

Page 51: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 S32  

NMRexperiments

PreparationofNMRsamples

HighproteinconcentrationAn NMR sample was prepared such that the solution contained each hydrazide (200 µM); imidazole 

aldehyde  (400 µM); protein  (100 µM);  and DMSO  (5%  (v/v))  in deuterated  sodium  acetate buffer 

(0.1 M,  pH  4.6).  Trifluoroacetic  acid  (0.17%  (v/v))  was  added  as  a  reference.  The  sample  was 

equilibrated overnight by mild shaking at room temperature. 

LowproteinconcentrationAn NMR sample was prepared such that the solution contained each hydrazide (400 µM); imidazole 

aldehyde  (800  µM);  protein  (4  µM);  and  DMSO  (5%  (v/v))  in  deuterated  sodium  acetate  buffer 

(0.1 M,  pH  4.6).  Trifluoroacetic  acid  (0.17%  (v/v))  was  added  as  a  reference.  The  sample  was 

equilibrated overnight by mild shaking at room temperature. 

BackgroundAn NMR sample was prepared such that the solution contained each hydrazide (400 µM); imidazole 

aldehyde  (800  µM);  and  DMSO  (5%  (v/v))  in  deuterated  sodium  acetate  buffer  (0.1 M,  pH  4.6). 

Trifluoroacetic acid  (0.17%  (v/v)) was added as a reference. The sample was equilibrated overnight 

by mild shaking at room temperature. 

ReferencesamplesAn NMR sample was prepared such that the solution contained one hydrazide (400 µM);  imidazole 

aldehyde  (1600 µM);  and DMSO  (5%  (v/v))  in  deuterated  sodium  acetate  buffer  (0.1 M,  pH  4.6). 

Trifluoroacetic acid  (0.17%  (v/v)) was added as a reference. The sample was equilibrated overnight 

by mild shaking at room temperature. 

Quantitative19F‐NMRThe spectra for quantitative 19F‐NMR were recorded on a 500 MHz Varian Inova NMR spectrometer 

equipped  with  an  ID  probe  at  415  MHz;  acquiring  2048  scans  with  a  pulse  width  of  60°  and 

referenced against trifluoroacetic acid at −76.5 ppm. The integral of the trifluoroace c acid peak was 

set  to  1000,  and  peaks  of  the  library members were  assigned  using  spectra  from  the  reference 

samples.  

1H‐STD‐NMRThe  1H‐STD‐NMR spectrum was recorded on a 600 MHz Varian  Inova NMR spectrometer equipped 

with a HCN  triple  resonance probe; suppressing solvent peaks  from water and DMSO using a WET 

pulse sequence. 

 

Page 52: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 S33  

Quantitative19F‐NMRresults  Hydrazide  Acylhydrazone

10‐minus  4.02  0.7 

10‐plus  3.37  0.35 

11‐minus  6.16  1.34 

11‐plus  6.92  1.55 

12‐minus  5.85  1.77 

12‐plus  5.88  1.65 

13‐F1‐minus  5.75  1.02 

13‐F1‐plus  5.54  0.89 

13‐F2‐minus  6.55  0.98 

13‐F2‐plus  6.24  0.72 

14‐F1‐minus  5.75  0.62 

14‐F1‐plus  4.37  0.38 

14‐F2‐minus  6.04  0.68 

14‐F2‐plus  4.58  0.42 

15‐minus  10.35  0.78 

15‐plus  9.28  0.75 

16‐minus  21.21  3.62 

16‐plus  10.3  2.38 

17‐minus  15.56  0.39 

17‐plus  17.83  0.31 

18‐minus  26.32  2.84 

18‐plus  29.08  0.39 Table S2: Peak areas of all  library members compared  to  trifluoroacetic acid at 1000. X‐minus depict compound X  in  the sample without protein, X‐plus depicts compound X in the sample with protein. 

   

Page 53: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

   

 S34 

Page 54: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

   

 S35 

Page 55: Fragment‐based drug design facilitated by dynamic combinatorial chemistry and NMR ...fse.studenttheses.ub.rug.nl/12656/1/Thesis_final.pdf · 2018-02-15 · and NMR spectroscopy

 

1H‐STD‐NMRspecttrum

 S36