Folding e misfolding delle proteine - liceojoyce.gov.it didattici/Ariccia 2015... · ATCGATCGATCG… DNA UAGCUAGCUAGC… RNA Trascrizione Il folding delle proteine è la “seconda

Prof. Niccolò TaddeiUniversità degli Studi di Firenze

Folding e misfolding delle proteine

15 Aprile 2015, Liceo Scientifico “James Joyce” Ariccia (RM)

ATCGATCGATCG… DNA

UAGCUAGCUAGC… RNA

Trascrizione

Il folding delle proteine è la “seconda metà” del codice genetico

LE PROTEINE – Folding

UAGCUAGCUAGC… RNA

AlaProLeuGlu… Proteina

Traduzione

Proteina

funzionale

Folding


Premessa: la denaturazione di una proteina

Denaturazione indotta da agenti:• Fisici – Elevata temperatura, elevata pressione, forze di torsione e stiramento

• Chimici – Valori estremi di pH, tensioattivi, agenti caotropici, sali, solventi


Il percorso del folding

Denaturato Nativo

Meccanismi proposti per il folding


native

ribosoma

partially

unfolded

unfolded

Le possibili conformazioni di una

proteinaLE PROTEINE – Folding

native

ribosoma

partially

unfolded

unfolded

Legame del ligando

o modificazioni covalenti


Fibre

funzionali

Oligomeri

funzionali

native

ribosoma

partially

unfolded

unfolded

Legame del ligando



native

ribosoma

partially

unfolded

unfolded

Fibre

funzionali

Oligomeri

funzionali

Legame del ligando



Frammenti

degradati

native

Aggregati

disordinati

ribosome

partially

unfolded

unfolded

Fibre

funzionali

Oligomeri

funzionali

Legame del ligando



Aggregati

Native-like

Aggregati

disordinati

Frammenti

degradati

native

Aggregati

disordinati

ribosome

partially

unfolded

unfolded

Fibre

funzionali

Oligomeri

funzionali

Legame del ligando



Aggregati

native-like

Aggregati

disordinati

Aggregati con struttura ββββ(es. protofibrille)

Fibrille

amiloidi

Frammenti

degradati

Lo stato conformazionale esistente negli aggregati

proteici strutturati (fibrille amiloidi o loro precursori)

è il più stabile per una catena polipeptidica.LE PROTEINE – Folding

Lo stato conformazionale esistente negli aggregati

proteici strutturati (fibrille amiloidi o loro precursori)

è il più stabile per una catena polipeptidica.

Le fibrille amiloidi sono

il buco nero dell’universo proteico


native

Aggregati

disordinati

ribosome

partially

unfolded

unfolded

Fibre

funzionali

Oligomeri

funzionali

Legame del ligando



Aggregati

native-like

Aggregati

disordinati


Fibrille

amiloidi

Frammenti

degradati

ribosome

NAC?

Hsp70/40

PFD Hsp70/40

PFD

Hsp70/40

PFD/TriC

Hsp90

Hsp

104Hsp

104

proteasoma

Fibre

funzionali

Oligomeri

funzionali

Legame del ligando


Hsp90

Hsp90

Hsp70/40

PFD/TriC

Hsp90

sHSP

Hsp70/40

PFD/TriC

Hsp90

sHSP

proteasoma


Aggregati

native-like

Aggregati

disordinati


Fibrille

amiloidi

proteasoma

Frammenti

degradati

Malattie da Misfolding proteico

Malattie dovute all’impossibilità di una proteina specifica o di un peptide ad adottare una struttura nativa stabile

1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di “folding” di una proteina e in

LE PROTEINE – Misfolding

1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di “folding” di una proteina e in cui quindi il paziente non beneficia di una quantità sufficiente di proteina funzionale Esempio: fibrosi cistica

2. Malattie in cui si ha un folding “scorretto” di una data proteina con conseguente difficoltà della proteina stessa a raggiungere il tessuto bersaglioEsempio: enfisema precoce

3. Malattie dovute alla conversione di una data proteina o peptide dalla sua forma solubile in aggregati fibrillari insolubili.Esempio: malattia di Alzheimer


1. Malattie in cui si ha una diminuita efficienza di “folding” di una proteina e in cui quindi il paziente non beneficia di una quantità sufficiente di proteina funzionale Esempio: fibrosi cistica

CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

∆∆∆∆F508 = 70% dei casi di FC


protease in the elastic tissues of the lungs (neutrophil elastase)

Alpha1 antitrypsin

2. Malattie in cui si ha un folding “scorretto” di una data proteina con conseguente difficoltà della proteina stessa a raggiungere il tessuto bersaglioEsempio: enfisema precoce

Forma attiva

reactive loop

neutrophil elastase

Alpha1 antitrypsin

Forma latente (+ stabile)


3. Malattie dovute alla conversione di una data proteina o peptide dalla sua forma solubile in aggregati fibrillari insolubili (tossici).Esempio: Malattia di Alzheimer

proteina

nativa

aggregati

fibrillari

insolubili


Alcuni esempi:

- Patologie neurodegenerative proteina che aggregaMalattia di Alzheimer peptide Aβ (1-40, 1-42)

Circa 40 patologie umane sono associate alla formazione di fibrille amiloidi

extracellulari o inclusioni intracellulari con caratteristiche amiloidi

Malattia di Alzheimer peptide Aβ (1-40, 1-42)

Encefalopatie spongiformi prione (intero o frammenti)

- Amiloidosi sistemiche proteina che aggregaAmiloidosi da catene leggere catene leggere delle immunoglobuline

Amiloidosi sistemica senile transtiretina

- Amiloidosi localizzate proteina che aggregaDiabete di tipo II amilina (IAPP)

Medullary carcinoma of the thyroid calcitonina


1. Morfologia fibrillare osservabile con microscopio elettronico a trasmissione

2. Struttura “cross-β” monitorabile con diffrazione a raggi X

Le tre caratteristiche peculiari delle fibrille amiloidi

2. Struttura “cross-β” monitorabile con diffrazione a raggi X

3. Birifrangenza verde in presenza di Rosso Congo in luce polarizzata


Prima caratteristica:

Morfologia fibrillare osservabile con microscopio elettronico

Amyloid fibrils of the Aβ1-40 peptide

by transmission electron microscopy

(Walsh et al. 1999. J. Biol. Chem. 274, 25945)

Amyloid fibrils of Aβ1-42 peptide

by atomic force microscopy(Harper et al. 1997, Chem. Biol. 4, 119)

200 nm200 nm

100 nm


4.8 Å 4.8 Å

Seconda caratteristica:

Struttura “cross-β” monitorabile con diffrazione a raggi X

X-ray diffraction of Aββββ fibrils

Serpell, 2000, Bioch. Biophys. Acta 1502, 16-30

10-11 Å 10-11 Å


Terza caratteristica:

Birifrangenza verde in presenza di Rosso Congo in luce polarizzata

Fibrillar deposits of ββββ2-microglobulinIvanova et al., 2003, Biochemistry 42, 13536-13540


- Le fibrille amiloidi sono formate da

protofilamenti (diametro di 2-5 nm) che

si avvolgono o si associano lateralmente

a formare fibrille di diametro maggiore

(generalmente 7-13 nm o maggiore)(generalmente 7-13 nm o maggiore)

- Nei protofilamenti è presente una

struttura a foglietto ββββ. I singoli

filamenti ββββ sono paralleli tra di loro e

perpendicolari all’asse maggiore della

fibrilla.

Malattia di Alzheimer

Segni e sintomi clinici

- Perdita della memoria

- Decadimento cognitivo

- Instabilità comportamentale


Istologia

- Riduzione delle sinapsi nel cervello

- Morte neuronale nel cervello (neurodegenerazione)

- Presenza di placche senili (amiloide extracellulare)

- Presenza di grovigli neurofibrillari (intracellulari)

Biochemistry

- Fibrille amiloidi extracellulari di peptide ββββ-amiloide

- Filamenti elicoidali appaiati intraneuronali di proteina tau

Malattia di Alzheimer



Encefalopatie spongiformi trasmissibili

Segni e sintomi clinici

- Disfunzione neurologica che conduce a morte in tempi brevi

Forme cliniche:

- Malattia di Creutzfeld-Jacob (nell’uomo); morbo della mucca pazza; scrapie - Malattia di Creutzfeld-Jacob (nell’uomo); morbo della mucca pazza; scrapie

(nelle pecore)

Istologia:

- Formazione di depositi amiloidi extracellulari nel tessuto nervoso. Formazione di

vaste aree cave (spongiformi) nel cervello.

Biochimica

- Depositi amiloidi extracellulariformati da proteina prionica


Encefalopatie spongiformi trasmissibili

PrPc PrPsc


functional

fibres

functional

oligomersdisordered

aggregates

disordered

aggregates

native

disordered

aggregates

degraded

fragments

ribosome

partially

unfolded

unfolded

toxic!

Le possibili conformazioni di una catena polipeptidica

native-like

aggregates

disordered

aggregates

β-structured aggregates

(e.g. protofibrils)

Amyloid

fibrils

toxic! toxic!

toxic!


Le cause della tossicità

Immagini al microscopioconfocale di cellule in coltura

alla presenza di aggregati proteici

Gli esperimenti mostrano che gli

aggregati possono inserirsi nelle

membrane cellulari

[Bucciantini et al., Nature 416, 507-511 (2002)]


L’analisi in criomicrosciopiaelettronica di aggregati iniziali

di peptide Aββββ e αααα-sinucleina mostra chequesti assumono una forma a ciambella

Le cause della tossicità

Queste immagini sonomolto simili alle strutture generateda tossine batteriche che creano pori sulle membrane delle cellule


Fibrille di dominio SH3 di IP-3K

Le fibrille hanno tutte le caratteristiche proprie delle fibrille amiloidi


Fibrille di mioglobina

Le fibrille si formano rapidamente a seguito di riscaldamento della proteina in presenza di condizioni parzialmente denaturanti

[Fandrich et al., Nature 410, 165-166 (2001)]


Numerose proteine non associate a patologie note sono state convertite in

fibrille amiloidi in vitro

Ecco alcuni esempi:

SH3 domain from PI3 kinase (Bovine)Betabellin 15D (human)Fibronectin type III module (Mouse)GAGA factor (D. melanogaster)Muscle acylphosphatase (Human)Tailspike protein (Bacteriophage P22)

B1 Ig-binding domain of protein G (Human)Amphoterin (Human)Curlin CgsA subunit (E. coli)αααα-lactalbumin (Human)V(L) domain of antibody F11 (Mouse)Prothymosin αααα (mammalian)Tailspike protein (Bacteriophage P22)

Cold shock protein A (human)Monellin (D. camminsii )Phosphoglycerate kinase (Yeast)Apolipoprotein C-II (Human)Glycoprotein B fragment (Herpes S. virus)Fiber protein (Adenovirus)ADA2h (Human)Met aminopeptidase (P. furiosus)HypF N-terminal domain (E. coli)Lysozyme (Hen)Apocytochrome c (H. thermophilus)Apomyoglobin (Horse)

Prothymosin αααα (mammalian)Acidic fibroblast growth factor (N. viridescens)Stefin B (Human)ββββ-lactoglobulin (Human)Endostatin (Human)Barstar (Bacillus amyloliquefaciens)Chaplins (S. coelicolor)fragment of Pmel17 (Human)acylphosphatase (Sulfolobus solfataricus)S6 (Thermus thermophilus)histones (Human)αααα-chymotrypsin (Human)AcPDro-2 (Drosophila melanogaster)


Le proteine sono polimeri “evoluti”

Una fibrilla amiloide rappresenta la struttura “primordiale” di una proteina che è determinata dalle proprietà intrinseche della catena principale del

polipeptide

Le proteina naturali possiedono sequenze altamente selezionate in cui le interazioni fra catene laterali sono tali da impedire lo sviluppo delle

preferenze conformazionali della catena principale e determinanola struttura nativa della proteina stessa

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