Fenotypizácia B lymfocytov a klasifikácia CVID

M. Bobovčák (bobovcak@npolianka.sk)Klinické laboratórim – Vysokošpecializovaný ústav pľúcnych chorôb

VVZ. a.s. Nová Polianka – Vysoké Tatry, Slovensko

PID - Primary Immunodeficiency – humorálne PID

- viac ako 250 definovaných PID, v každom veku, > 60% je prevažne humorálnych(nediagnostikovaných PID ?, 1:1200)

- včasná diagnostika a liečba

Edukácia a spolupráca : napr. www.esid.org

Ťažký kombinovaný imunodeficit (SCID) 1:50-100 000

X-viazaná agamaglobulinémia (XLA) 1:100 000

Hyper IgM syndróm 1:100 000

CVID (najzávažnejší v dospelosti) 1:35 000 menej / viac?

Selektívny deficit IgA 1:150 menej?

Deficit podtried IgG 1:2500

Selektívny deficit IgM ?

Selektívny deficit IgG (postvakcinačne <) IgG, IgGx normálne, výskyt ?

Povaha deficitu a Klinika

T-bunkový

Závažný priebeh infekcie „benignými“ vírusmi (CMV, VZV)Kožná alebo systémová KandidózaInfekcie oportunitnými mikroorganizmamiSystémové reakcie na vakcináciuLeukocyty menej ako 1.5Nález (tetánia, erytrodermia, alopécia, poruchy rastu...)

B-bunkový

Recidivujúce infekcie (sinusitídy, otitídy, pneumónie)streptokokoky, stafylokokoky, hemofilyLymfoidná hyperplázia (LU,, slezina, pečeň,tenké črevo,)Autoimunita

Kombinovaný (T a B) Recidivujúce infekcie, Lymfoidná hyperplázia, Autoimunita Nález: Ataxia teleangiektázia, trombocytopénia, ekzém.

Funkcie leukocytovStafylokokové abscesy, kožné, orgánové (Hyper IgE sy)Abscesy , osteomyelitída, fistuly LU, granulómy

Dr. Gürtler: Imunodeficity existujú, ale...

(klinický, laboratórny, skutočný, fiktívny, primárny, sekundárny)

S-IgAD primárny, 1:150, cc IgA < 0.05 g/l u parciálneho IgA < 0.07 g/l (RH –2SD podľa veku

sekundárny (infekcie, lieky, tonzilektómia, adenotómia, splenektómia, transfúzie)

80-85 % asymptomatický priebeh

symptomatický – infekcie (DC, GIT), autoimunita, IgG2,3 deficit , alergie,

malignity, možná progresia do CVID, dramatické transfúzne reakcie.

Selektívny deficit IgA (S-IgAD)

Diagnostika CVID (Bežný variabilný imunodeficit)

Heterogenná skupina ochorení, vyznačujúca sa porušenou schopnosťou tvorbyprotilátok produkovaných B lymfocytmi: znížené hladiny sérového IgG (sub),

IgA (sub), (IgE), hladina IgM bývá variabilná ( podobný klinický obraz )

Patogenéza CVID až na niektoré výnimky nebola objasnená (deficit CD19, ICOS, BAFF-R, TACI)

Popísané B i T lymfocytárne defekty vedúce k neschopnosti kooperácie medzi B a T lymfocytmi ( napr. CD40L) ⇒ porucha v tvorbe protilátok

Laboratórne zmeny v hladinách protilátok

Zvýšenie koncentrácie: polyklonálne, monoklonálne, izolované, kombinované

Zníženie koncentrácie (deficit, CVID): izolované, kombinované (izotyp, potrieda)

závislévek / pohlavie

IgM IgG IgA IgD IgE

cc g/l 0,3 – 4,0 (6%) 7.0 - 16.0 ( 80%) 0.4 – 4,0 (13%) 0.03 0-100 IU/mlPolčas dní 5 - 6 18 - 22 5 - 7 2.8 2.3

CVID < 0.025 (80%)

3 - 5.0(vakcinačné špec. Ig?)

typicky < 3.0mean 2,5

< 0.05 (70 %)

Diagnostika CVID – diagnóza „per exclusionem“

Klinika - Anamnéza vek > 2r. (20r - 50r.- senia)6 ESID pravidiel pre PID – varovné symptómy www. esid.org rekurentné, chronické infekty...respiračné a intestinálne prejavy...autoimunita ...

Diagnostické kritéria CVIDPacient s poklesom s. IgG (2SD pod priemer pre daný vek) spolu s výnamným poklesom IgM a / alebo IgA a spĺňa nasledovné kritéria:1. Nástup príznakov až po 2 roku života často oneskorenie v diagnostike (7 rokov)2. Chýbanie izohemaglutinínov a/alebo protilátkovej odpovede pri vakcinácii

resp. postinfekčne (špecifické Ig)3. Vylúčenie iných známych protilátkových deficiencií (PID) a sekundárnych ID

(liekmi indukované, genetické poruchy,infekcie HIV, CMV, EBV..., malignita,systémové ochorenia )

Najčastejšie klinické prejavy u CVID

Infekčné závažné alebo recidivujúce infekcie 80-98%DC (sinusitídy, otitídy, bronchitídy, pneumónie)

pneumokoky, hemofily, streptokoky,, stafylokoky,,mykoplazmy, ureaplazmy, pseudomonas, vírusy (Entero, Coxsackie...),

GIT - 15%´H. pylori, Campylobacter, Giardia, SalmonellaChronické ochorenie pľúc (30%)Pyodermie, abscesy

NeinfekčnéAutoimunita - 22% (hematologická (AIHA, AITP..., reumatologická SLE, RA..., kožné, GIT celiakia....)Malignita 15%(lymfoproliferácia (benígny priebeh 30%), lymfadenopatia, hyperplázia,-megálie,iné: adenoCa žalúdok..Granulómy -15%, črevo, slezina, pečeňGIT prejavy -15% (CVID kolitída, gastritída...)

Sekundárne humorálne imunodeficiencie

Sekundárne imunodeficity sú najčastejšiebývajú najmä kombinované, ovplyvňujú (Celulárne, Komplement, Funkcie fago...)zvyčajne reverzibilné a menej závažné

Solídne tumoryLymfómyLeukémieCMV, EBV SLE, RA, AIHSplenektómiaNefrotický syndrómPopáleniny ++Imunosupresíva liekyDiabetes mellitusUrémia, dialýzaVysoký, nízky vek

Varovné príznaky (Baxter)

Diagnostika CVID – laboratórna diagnostika - imunostatus

1.FW (N), KO (Leu n/ / ) , Ig G ( ), IgA (n ) ,IgM ( )

2.IgG1-4, , Ab anti isohemaglutininy, špec. Ab – tetanus, difteria.. (skin testy)Prietoková cytometria:Imunokompetentné subpopulácie Leu, Th,Tc, B, NK, abs. a rel. počtySubpopulácie B lymfocytov ( + vylúčenie deficitu ICOS, CD19, BAFFR,)Subpopulácie T lymfocytov (CD4, CD45RO, CD45RA, T reg)

3. Funkčné testy – produkcia Ig a Cytokínov in vitro, Th1, Th2, TregDeficit niektorých ďalších molekúl – CD40L, agama včítane XLA....odlíšenie od iných PID

4. Genetické testy – preukázanie mutácie. (TACI Gény kodujúce dôležité faktory, receptory)

Stemcell

early pro-B

late pro-B

Largepre-B

Smallpre-B

immat.B

Pre-BCRKostná dreň(Ag nezávislé)

DH to JH VH to DJH VL to JL

BCR

Diferenciácia B Lymfocytov – súčasný pohľad

CD34+ CD22+ CD10+19+20- CD10+19+20+21- sIgM+CD10+19+20+21-

µ

KRV

TransitionalB bunky

T1

SlezinaL. uzlina

T2 FO Folikul

Germinálnecentrum

mem B

Plazmacell

Plazmablast

Plazmablast

mem B

MZ

FO

matureB

MZ

IgM++IgD+CD21- /intCD38++CD10+

IgMhigh

IgD+CD21+CD23+BAFFR+

IgM++IgD+ /intCD21+CD38-CD27+

IgM int /+IgD+CD21+CD38+CD27-

IgM-IgD-

CD21+CD38+CD27+

mIgG+/IgA+

CD19lowCD21lowCD38+++CD27++

Antigén Class switch, SHM

10-20%

10-20%

ThNaivní

F1CXCL13

KRV

T1 mem BPlazma

blast

FOMZ

IgM++IgD++CD21- /intCD38++CD10+

IgM++IgD+ /intCD21+CD38-CD27+

IgM int /+IgD+CD21+CD38+CD27-

IgM-IgD-CD21+CD38+CD27+mIgG+/IgA+

CD19lowCD21lowCD38+++CD27++

Subpopulácie B Lymfocytov v periférnej krvi

7 - 30%včasná odpoveď

Pneu PS like antigény - BCRPokles – slabá vakcinácia

hlavne T nezávislá IO

Naivné B

40- 80%Proteíny - BCR

Pokles – slabá vakcináciahlavne T závislá IO

diferenciácia:-dlho žijúce pamäťové bunky

-plazmatické bunky

MZ BTransitional B Pamäťové Bclass svitch

6 - 30%Post germinálne Ag stimulované B bunky

U defektu CD40L, ICOStáto populácia chýba.

(Bunky IgM+IgD-CD27+veľmi nízky počet)

Pod 2%dlho žijúcich0.6-3,4%

dlho žijúcich

Po úspešnej aktivácii fB bunky a kooperácii s fTh sa tvorí germinálne centrum, fázy MB1 až MB5 , od naivnej bunky MB1-2

až po postgerminálne BM5 pamäťové Ag špecifické klony – prítomné aj v cirkulácii.Vplyvom IL10, IL21 – časť buniek v GR – alternatívna diferenciácia – Plazmatické b.

NK like funkcia,osteoklasty

Prečo je potrebná B fenotypizácia ?CVID –hetoregénna skupina pacientov s protilátkovým deficitom

defekt – môže byť na odlišnej úrovni v B a T diferenciácii, kooperácii

bonus - detekcia deficitu CD19, BAFFR, ICOS (nie TACI)

Snaha o klasifikáciu skupín pacientov s podobným pozadím deficitu CVID

klinický priebeh ochorenia

prognóza

terapia

Freiburgská klasifikácia (Warnatz a spol. 2002)

Parížska klasifikácia (Piqueras a spol. 2003)

EUROclass klasifikácia (kombinácia oboch + nové kritéria 2008)

Freiburgská a Parížska klasifikácia CVID

Založená na memory B lymfo

Ia < 0.4% mem B: CD19+27+IgD-IgM-> 20% nezrelých B:CD19+21- (21% pc)

Ib < 0.4% mem B: CD19+27+IgD-IgM->= 20% nezrelých B:CD19+21- (56% pc)

II >= 0.4% mem B: CD19+27+IgD-IgM- (23% pc)

Založená na memory B lymfo a izotyp. „switch“

MB0 < 11% mem B: CD19+27+IgD+-splenomegália, granulomatóza

MB1 < 8% mem B: CD19+27+IgD-

MB2 < 8% mem B: CD19+27+IgD-

switch = IgD-memory = CD27+

Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008

EUROclass klasifikácia CVID

Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008

Prietoková cytometria fenotypizácia subpopulácií B

Cytometria klasických populácií lymfocytov: T, B, NK – absolútne a relatívne počty

B fenotypizácia kombinácia protilátok:

Panel B1 anti-CD19 /anti- CD27/anti-IgD/anti-IgM

Panel B2 anti-CD19 /anti- CD38/anti-CD21/anti-IgM

CD19 - líniový znak B lymfocytov (CD20, CD22)CD27 – memory markerIgD – znak izotypového prešmyku

Panel B1 – rozoznávané populácie :Naivné B bunky: CD19+ 27- IgM+ IgD+B bunky Marginálnej Zóny (like): CD19+ 27+IgM++IgD+Pamäťové (memory) class switched B bunky: CD19+ 27+IgM- IgD-Pamäťové (memory) non switched B bunky: CD19+ 27+IgM++IgD-

Panel B2 – dodatočné populácie :Transitional B: CD19+ CD21int CD38++ IgM++ (CD27 -)Plazmablasty: CD19low CD21int CD38+++ IgM-(+) (CD27 ++)CD21low B: (neprítomné v zdraví) CD19++ CD21low CD38low IgM+ (CD27 -)

FC Fenotypizácia subpopulácií B ly zdravý darca

LyB Ly

CD19+ B Ly

Panel B1CD19 / CD27/IgD/IgM /

Panel B2CD19 / CD38/CD21/IgM /

Naive FO

MZone

Switch MEM MEM

IgMPl.Blasty

Trans.B

Pl.Blasty

CD21/38 low

Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008

Pamäťové B lymfocyty

T2

IgMhigh

IgDlow

CD21-

CD23-

IgMl low

IgD high

CD21+

CD23+

IgMhigh

IgDlow

CD21high

CD23-

IgG, IgA, IgE

IgMhigh

IgD+

CD21+

CD23+

(Modifikované podľa C. Schiff)

Transitional B cells

B lymfocyty v perifernej krvi

IgG ,IgA, IgE

CD27

IgD

CD21lowCD38low

IgM

CD38 CD38

CD21

T1 FO

MZ

mem B

Plazmacell

CD 27 CD 27

IgD IgD

Naivné B lymf: 60,5% Naivní B lymf.: 93%

B lymf. marginal zóny: 15,3% B lymf. marginal zóny : 5,6%

Izotypovo prepnuté pamäťové B lymf.: 21,3%

Izotypovo prepnuté

pamäťové B lymf.0,1%

Zdravý dárca CVID

CD19+ 45+ Lymfocyty

Marcela Vlková, Znojmo 2009

IgD-,CD27-

nekonvenčné memory B, SHM

krátko žijúce IgG+IgD-27-

CVID1

CD 27

IgD IgM

CD 38

CD19+ 45+ Lymfocyty

Marcela Vlková, Znojmo 2009

CD 27

IgD

CD 38

IgM

CD19+ 45+ Lymfocyty

Marcela Vlková, Znojmo 2009

CVID2

CD21

CD 38CD 27

IgD

Marcela Vlková, Znojmo 2009

CVID3CD19+ 45+ Lymfocyty

Interpretácia deregulovanej B homeostázy

90% CVID pacientov skoro normálne počty B v periférnej krvi5-10% pacientov - veľmi nízke počty – menej ako 1% -(defekt vývoja v kostnej dreni, defekt faktorov v periférii, negatívne regulátory)

Switchované pamäťové B – marker správnej funkcie Germinálneho centra nízke počty u typu I, MB1/MB0, smB-(defekt v prípade deficitu CD40L, ICOS)u dostatočného počtu typ – II, MB2, smB+ pátrať po sprievodných ochoreniach (myotonická dystrofia DM2, u skupiny II – defektná postgerminálna diferenciácia na Plazm. bunky)

Selektívna redukcia IgM+pamäťových buniek - problém diferenciácie v marginálnej zóne (včasná odpoveď, defektná odpoveď na antigény typu PnPS, vakcinácia)

Expanzia cirkulujúcich CD21 low – CD21 – receptor pre C3d, expresia CD21(spolu s CD19) – zvyšuje účinnosť prenosu signálu z antigénu viazaného na BCR a C3d manifestácia pri chronických ochorenia prevažne typu Th1 asociácia so splenomegáliou a granulomatóznymi ochoreniami

Expanzia Transitional B buniek asociácia s lymfadenopatiou, popísaná aj u Pokles zrelých B buniek a významý nárast Tr. B buniek u BAFF-R defektu

Expanzia IgA+B – zvýšené riziko infúznej reakcie pri Ig terapii, u kompletne IgA deficitných CVID

CD21 – (C3d receptor) súčasť BCR signálového komplexu CD19/CD21/CD81/...

Pri fenotypizácii 19/27/IgD sa nachádzajú CD21low, v oblasti naivných buniek

vysoká expresia CD19, IgMnízka expresia znakov germinálneho centra CD38, CD10 a CD77, neprítomnosť CD39 spolu so zvýšenou hladinou CXCR6 usídlenie týchto B lymfocytov mimo lymfatické uzliny (Wehr et al., 2004).

zvýšené percento týchto buniek u pacientov (autoimunita)s CVID, RA, SLE, Sjögrenovým syndromem (Wehr et al., 2004)

u pacientov so SLE prevažne fenotyp IgD-charakterizované ako IgD-CD38- memory B lymfocyty (Culton et al., 2007)

považované za pre-plazma B lymfocyty zodpovedné za produkciu autoprotilátok (Nicholas et al., 2008).

alebo

nezrelé B lymfocyty, pred ďalšou diferenciáciou (Warnatz et al., 2002).

CD21lowCD38low B lymfocyty

Warnatz-Schlesier, Cytometry 2008

Prietoková cytometria fenotypizácia subpopulácií T u CVID

Popísané: - redukcia u niektorých CVID pacientov:total CD3+4, a naivných CD3+4+RA+pacienti s chronickou Th1 (TNFa) stimuláciou, MonoMf - stimuláciou =B lymfopénia a hypogamaglobulinémia

- CD3+4+RA+ pod 15%redukcia výstupu CD3+4+ z thymuexpanzia CD21lowredukcia switch memory Bsplenomegália, granulomatóza

-redukcia Treg buniek u CVID pac.splenomegália, chron. inflamáciau typu smB- CD21low

-pacienti ICOS deficitnývýznamná redukcia CXCR5+CD3+4+

Pozn. B lymfo u CVID spojených s T funkčným deficitom sú in vitro aktivovateľné.

Prietoková cytometria u genetických defektov spojených s CVID

ICOS deficit

CD19 deficit

BAFFR deficit

TACI deficit

BAFF-R – B cell activation factor - TNF receptor family vysoko exprimovaný na všetkých periférnych B bunkách. Receptor pre BAFF – kľúčový regulátor periférnej B bunkovej homeostázy. Deficit ústi k ťažkému poklesu periférnych zrelých B buniek a zýšenej prítomnosti Transitional buniek. Blok diferenciácie T1-T2 (popísaný 1 pacient)

CD19 – expresia medzi pre B bunkou a Plazmatickou bunkou, súčasť B cell kostimulačného komplexu, ľahká detekcia expresiou iných B líniových znakov ako, CD21, IgM ... (popísaných 5 pacientov)

Inducible costimulator – CD28 receptor family na aktivovaných T bunkách, Kooperácia s ICOSR na B bunkách – pri deficite ICOS porušené formovanie GC a tvorba pamäťových klonov B (Class switched memory B deficiencia), ale aj MZB-nevysvetlenéT CD4, RO, RA neovplyvnené – okrem redukcie CXCR5+CD3+4+. Strata upregulácie ICOS u PHA (CD3,CD28) stimulácie T buniek. V skupine smB- by mala byť ICOS deficiencia testovaná (rodinná história), 10 prípadov

(transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophilin ligand interactor)TACI – TNF receptor family prevažne exprimovaný na pamäťových CD27+ B bunkách, neovpyvňuje T a B homeostázu – bodová mutácia, ťažko detegovateľný prietokovou cytometriou. Najčastejší deficit u CVID (až 8%)

Genetické defekty spojené s CVID

Referenčné hodnoty periférnych B subpopulácii lymfcytov

Warnatz - Schlesier, Cytometry Part B, 74B: 261-271, 2008

Záver

1 Fenotypizácia B subpopulácií buniek (čiastočne T) prietokovou cytometriouby sa mala stať súčasťou štandartnej diagnostiky u CVID pacientov. Dokáže klasifikovať heterogénnu skupinu pacientov s touto diagnózou. Fenotypizácia dokáže identifikovať pacientov s: ťažkými defktmi vývoja pamäťových B buniek v germinálnom centrevčasné defekty v periférnej diferenciácii B buniekmožné zápalové zmenyporuchu v kooperácii s T bunkami

2 Funkčné testy lymfocytárnej aktivácie (zatiaľ vo výskume)by mali v budúcnosti priniesť nové prístupy k diagnostike týchto pacientov objasniť patogenézu u CVID a stanoviť nové prediktívne markery. Pri ESID – skupina „Immune phenotyping in immunodeficiency“ (IPID) - web