Farmacogenética em TransplantaçãoFarmacogenética em Transplantação

de Órgãos Sólidosde Órgãos Sólidos

João F. P. Mendes

Centro de Histocompatibilidade do CentroCentro de Histocompatibilidade do Centro

Universidade da Beira InteriorUniversidade da Beira Interior

Aspectos gerais em transplantação

Compatibilidade do sistema HLA

Mecanismos de alo-reconhecimeto

Imunosupressão

Apresentação antigénica

Fig. 1 – Apresentação antigénica (Adaptado de www.medscape.com).

Acção Imunosupressora

Fig. 2 – Modo de acção dos diferentes imunosupressores através da inibição do sinal 1, sinal 2 e sinal 3. (Adaptado de, Post D.J. et al, “Immunossupression in Liver Transplantation”, Liver Transplantation, Vol.11, no.11, (2005))

Corticosteroides

• Inibem a produção de:

IL-1

IL-2

IL-3

IL-6

• Alteram a expressão de moléculas de adesão

•Provocam uma linfocitopenia genérica

Antimetabolitos: Azotiopurina e Micofenolato mofetil

• A Azotiopurina é um análogo purínico que impede a progressão do ciclo celular pela inibição da síntese de ácidos nucleicos.

•A Azotiopurina inibe todas as linhagens hematopoieticas.

• O Micofenolato mofetil é um inibidor da enzima inosinato monofosfato desidrogenase (IMPDH), que catalisa a síntese “de novo” do DNA.

• A maior especificidade do MMF deve-se ao facto dos Linfócitos T e B dependerem da síntese “de novo” para a progressão do seu ciclo celular

Azotiopurina:Azotiopurina:

Micofenolato Moftil:Micofenolato Moftil:

Inibidores da calcineurina: Ciclosporina e Tacrolimus

• A ciclosporina e o tacrolimus, inibem a desfosforilação do factor nuclear NFAT pela calcineurina.

•A calcineurina é uma serina trionina fosfatase activada pela calmudolina presente nos linfócitos T.

• A CsA e o FK506 inibem a prodção de:

IL- 2, IL-3, IL-4, IL5, INF-γ

Ligando do CD40

• A CsA e o FK506 inibem a proliferação dos linfócitos T.

Inibidores do alvo terapêutico da rampamicina: mTOR

O Sirolimus e Everolimus: Inibidores do sina III

• mTOR (mammalian target of rapamycin) é uma proteina de 250KDa com actividade de quinase que ao associar-se com duas outras proteinas a FKBP-12 e a Rampamicina controlam a progressão do ciclo celular entre a fase G1 e S.

• O Sirolilimus e Everolimus inibem a proliferação de Linfócitos T pela a inibição do complexo mTOR.

Anticorpos monoclonais:

• O primeiro a ser desenvolvido foi o OKT3, dirigido parar a molécula de CD3, inibindo assim o sinal I.

• O OKT3 inibe todas as linhagens linfocitárias e é conhecido o seu efeito de provocar uma libertação massiva de citocinas.

• De aplicação mais recente são o Daclizumab e o Basiliximab.

• Anticorpos dirigidos para a molécula acessória CD-25, do receptor da IL-2.

• Inibem apenas a proliferação de Linfócitos T, CD25+.

Acção Imunosupressora

Fig. 3 – Modo de acção dos diferentes imunosupressores através da inibição do sinal 1, sinal 2 e sinal 3. (Adaptado de, Post D.J. et al, “Immunossupression in Liver Transplantation”, Liver Transplantation, Vol.11, no.11, (2005))

Imunossupressão

ImunosupressãoImunosupressão

Especifica

Inespecifica Corticosteroides

Inibidores da Calcineurina(CsA)

Antimetabolitos(6-MP)

Inibidores da Rampamicina (mTOR)

Anticorpos mono- e policlonais

Farmacodinâmica e biodisponibilidade de Fármacos

Absorção

Enzimas metabolizadoras

Célula alvo

Transporteactivo

DifusãoSimples

DifusãoFacilitada

Enzimas Transportadoras

Poliglicoproteína-PPoliglicoproteína-P

Citocromo P450Citocromo P450

Monoaminooxidase

Aldeido Desidrogenase

Distribuição

Reacções deFase I

Reacções de Fase II

UDP-Glucoronosiltransferase

Glutationa S-Transferase

N-Acetiltransferase

Excreção

Farmacogenética

Pretende caracterizar genes que envolvam pontos chave na metabolização de fármacos.

Farmacogenética: Citocromo P450

• Existem aproximadamente 55 genes diferentes que codificam enzimas citocromo P450.

•Estes genes classificam-se em diferentes famílias e sub-famílias consoante a sua homologia.

• De entre esta grande diversidade, a família CYP3A é a mais relevante, em transplantação, dado os imunosupressores serem os seus principais substratos.

Fig. 4 – Estrutura molecular do citocromo P450 (www.kms.ac.jp)

Citocromo P450

• Os quatro genes CYP3A, localizam-se numa região de 218 Kb no cromossoma 7q22.1, pela seguinte ordem: CYP3A5, CYP3A7, CYP3A4 e CYP3A43.

•Diversas variações pontuais, ou SNPs, foram identificadas para a família CYP3A. No entanto, a mais significativa é uma inserção de uma guanina ou adenosina na posição 22893, no exão 3 (referência GeneBank, AC005020) que resulta num codão stop prematuro, originando uma proteína CYP3A truncada.

Citocromo P450

Fig. 5 - Organização do gene CYP3A5 (www.atlasgeneticsoncology.org)

Citocromo P450

• Diversos estudos efectuados (Zheng et. al., 2003) suportam a tese de que a dose óptima de FK506 a administrar, está relacionada com este polimorfismo presente no gene CYP3A5.

Farmacogenética: Poligicoproteína-P

• A poligicoproteína-P é codificada pelo gene MDR-1 (sigla inglesa para “multidrug resistance-1”).

FIG. 5 - Estrutura molecular de Poligicoproteina-P (www.csc.mrc.ac.uk )

Farmacogenética: Poligicoproteína-P

• O gene MDR-1 localiza-se no cromossoma 7q21, contendo 28 exões.

• Cerca de 15 mutações e 28 SNPs já foram identificados para o gene MDR-1.

Poligicoproteína-P

• De entre os SNPs mais bem estudados, destacam-se dois de maior relevância:

• No exão 21, uma substituição na posição G2677T.

•No exão 12, uma substituição na posição C1236T.

• Houfroid et. al. (2004) demonstraram que a dose de FK506 era em 40% mais alta em indivíduos homozigoticos para o SNP G2677T do que um indivíduos Wild Type.

• Diversos autores sugerem um desequilibro de ligação entre os SNPs no exão 21 e no exão 12.

Objectivos

• Sequênciação:

• Sequenciar o exão 3B do gene CYP3A5

•Sequenciar o exão 21 e 12 do gene MDR1

• Desenvolver uma estratégia de PCR-SSP para avaliar as diferentes mutações.

• Concretizar o estudo das frequências das diferentes mutações no gene MDR1 e CYP3A5.

• Relacionar estes dados com as doses de Tacrolimus e Ciclosporina administradas aos diferentes doentes

Material e métodos: Doentes

Tabela 1 – Grupo de doentes a estudar.

As amostras de DNA foram obtidas através de 200 μL sangue periférico recorrendo a ao kit:

MagAttract® DNA Blood MIDI M48 Kit (Quiagem®)

3030Tranplantados Renais

Terapêutica imunosupressora com

Tacrolimus

Terapêutica imunosupressora com

Ciclosporina

Material e métodos: Primers

-Primers liofilizados (Invitrogen ®)Primers liofilizados (Invitrogen ®)

. Centrifugação spin curto (1min. a ~12300 rpm);

. Diluição para 100pmol/µl (H2O estéril);

. Homogeneização (vórtex);

. Incubação (24h);

. Frigorífico a ~ 5ºC.

-Teste aos primersTeste aos primers

. 5µl primer

. 5µl tampão TAE (tina)

. 1,5µl loading buffer

. Electroforese gel agarose (2%) – 15´a 150 200 volts

Material e métodos: Sequenciação

Tabela 2 – Primers de sequênciação.

1:103´ - GCT GAT CAC CGC AGT CTA GCT CGC – 5´12pGP C1236T(R)

1:103´- TCC TGT GTC TGT GAA TTG CCT TG – 5´12pGP C1236T(F)

1:103´- AAC AGC CGG GTG GTG TCA – 5´21pGP G2677T(R)

1:103´-GCA GGC TAT AGG TTC CAG GCT -5´21pGP G2677T(F)

1:20´3´- ACA CCC AGG AAG CCA GAC – 5´3BCYP3A5(R)

1:203´- CTT AAC GAA TGC TCT ACT GTC – 5´3BCYP3A5(F)

Diluição optima

SequênciaExão

Material e métodos: PCR de Amplificação

-Condições reaccionais para a PCR de amplificação:

10 μL Tampão de PCR 5X (Promega®)

3 μL ΜgCl2 25mM (Promega®)

2,5 μL dNTPs (GE Healthcare)

5 μL Primer (F)

5 μL Primer (R)

0,35 μL DNA Taq Polimerase (Promega®)

5 μL DNA (amostra)

19,5 μL de dd H2O

Vt = 50 μL

Material e métodos: PCR de Amplificação

-4ºC

42072ºC

6072ºC

6055ºC

3096ºC15

6060ºC

3096ºC10

6065ºC

3096ºC10

30096 ºC1

Tempo (seg)

Temperatura (ºC)

Numero de ciclos

Programa de PCR:

Para a reacção de amplificação optou-se por um programa de TouchDown PCR.

Material e métodos: Purificação Pós-PCR

-Purificação dos produtos de PCR:

3 μL de ExoSAP

20 μL de produto dePCR

Fig. 6 – Purifiação dos produtos de PCR com ExoSAP-IT. (www.usbweb.com)

Material e métodos: Sequencição

Condições reaccionais para a reacção de sequênciação:

3 μL de produto de amplificação (DNA)

4 μL de terminadores (BigDye® Terminator V1.1)

1 μL de primer

12 μL de dd H2O

Material e métodos: Sequenciação

Programa de sequênciação:

Após a reacção de sequênciação,os produtos foram purificados com resina Sephadex G-50 (GE Healthcare)

-4ºC

3072ºC

5061ºC

1094ºC 25

Tempo(seg)

Temperatur(ºC)

Numero de ciclos

Material e métodos: PCR-SSP

P(F)

Local da mutação (SNP)

CGA CCC TTC CAC TCA GTT (Wt)G

TAGA CCC TTC CAC TCA GTT (M1)

P(R)

• Elaboração do Miss Match: PCR-SSP

Material e métodos: PCR-SSP

PoçoWt Mt Wt WtMt Mt

Banda de amplificação

Banda de Primer

Individuo Wild TypeIndividuo Wild type Individuo hetrozigotico

• Interpretação da PCR-SSP

Material e métodos: PCR-SSP

1:203´ - GCT GAT CAC CGC AGT CTA GCT CGC – 5´12P-gp C1236T(R)

1:203´- TCC TGG TAG ATC TTG AAG GGT – 5´.12P-gp C1236T(F) Mt

1:203´- TCC TGG TAG ATC TTG AAG GGC – 5´12P-gp C1236T(F)Wt

1:203´ -AGT TTG ACT CAC CTT CCC AGT – 5´.21P-gp G2677T(F)Mt(A)

1:203´- AGT TTG ACT CAC CTT CCC AGA – 5´,21P-gp G2677T(R)Mt(T)

1:203´- AGT TTG ACT CAC CTT CCC AGC – 5´21P-gp G2677T(R)Wt

1:203´-GCA GGC TAT AGG TTC CAG GCT -5´21P-gp G2677T(F)

Diluição optima

SequênciaExão

Tbela 3 – Primers para PCR-SSP

Resultados

Resultados: Sequenciação

Fig 7 – Electroferograma da reacção da sequênciação do exão 21 da poliglicoproteina-P, evidenciando a substituição G2677T,A (em que K= G ou T)

Fig. 6 – Produtos da PCR de amplificação. Estes produtos foram posteriormente diluídos a 1:10 e purificados para a reacção de sequênciação.

65%(n=20)25%(n=20)10% (n=20)tctttcaGtatctctctttcatatctcCYP3ACYP3A5*3

9,1%(n=22)31,82%(n=22)59,1%(n=22)aggtT/ActggaggtGctggMDR1G2677T,A

3,7%(n=27)40,74%(n=27)55,56%(n=27)agggTctgaagggCctgaMDR1C1236T

Mt/MtWt/MtWt/WtMutante(Mt)Wild Type(Wt)

GenotipoSequência de NucleotidosGeneMutação

Tabela 1 – Estudo das frequências das mutações estudadas para os indivíduos a recorrer a CsA.

Resultados: Sequenciação

78,26%(n=23)21,74%(n=23)0%(n=23)tctttcaGtatctctctttcatatctcCYP3ACYP3A5*3

5,56%(n=18)38,89%(n=18)55,6%(n=18)aggtT/ActggaggtGctggMDR1G2677T,A

8,7%(n=23)34,78%(n=23)56,52%(n=23)agggTctgaagggCctgaMDR1C1236T

Mt/MtWt/MtWt/WtMutante(Mt)Wild Type(Wt)

GenotipoSequência de NucleotidosGeneMutação

Tabela 2 – Estudo das frequências das mutações estudadas para os indivíduos a recorrer a FK506.

Resultados: Sequenciação

Fig. 4 – Correlação entre o SNP C1236T do exão 12 do gene MDR1 (A) e do SNP G2677T,A do exão 21 do gene MDR1 com os respectivos valores de concentração plasmática de FK506 medidos após a primeira toma do imunosupressor, após o transplante. Os gráficos indicam a distribuição dos valores plasmáticos de FK506, agrupados de acordo com a variação alélica. Wt, genótipo “wild type”; Mt, genótipo mutante.

Resultados: Sequenciação

A

[FK506] ng/mL [FK506] ng/mL

BC1236T p < 0,05, teste One way Anova

G2677T,A p < 0,05, teste One way Anova

Resultados: PCR-SSP

Fig. 5- PCR-SSP para pesquisa da mutação C1236T. As amostras encontram-se agrupadas duas a duas, sendo a primeira correspondente ao primer “wild type” ea segunda corresponde ao primer que reconhece a mutação.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 131 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1 e 2 – Amostra com um perfil “Wild Type”.

3 e 4 – Amostra com um perfil heterozigótico.

5 e 6 – Amostra com um perfil mutante.

Fig. 6- PCR-SSP para pesquisa da mutação G2677T. As amostras encontram-se agrupadas duas a duas, sendo a primeira correspondente ao primer “wild type” e a segunda corresponde ao primer que reconhece a mutação

Resultados: PCR-SSP

82 3 4 5 6 71 9 10 11 12 13 14 15 16

1 e 2 – Amostra com um perfil mutante.

3 e 4 – Amostra com um perfil heterozigótico.

5 e 6 – Amostra com um perfil “Wild Type”.

Conclusões

• Os indivíduos que possuem a mutação C1236T e G2677T/A, no gene MDR1, podem classificar-se de maus metabolizadores, no que diz respeito ao uso do FK506.

• A PCR-SSP, representa uma técnica mais rápida e menos dispendiosa para a pesquisa de uma determinada mutação, no entanto, requer uma optimização cuidada e demorada.

• Não existe relação entre as mutações estudadas e as concentrações plasmáticas de CsA

• Não existe relação entre mutação estudada para o gene CYP3A e a concentração plasmática de FK506.

Perspectivas futuras

• Pesquisar novos SNPs nas regiões estudadas, bem como novas regiões de interesse, e sua relação com a terapêutica imusupressora realizada.

• Estudar novos genes que de alguma forma se relacionem com o metabolismo dos fármacos imunosupressores.

• Tentar reunir num teste, o estudo de um conjunto de genes que permita traçar um perfil genético da capacidade metabolizadora de um individuo

Questões ?