FALSIFICAREA SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE_Curs 4_Curs 5 [Compatibility Mode].pdf

8/16/2019 FALSIFICAREA SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE_Curs 4_Curs 5 [Compatibility Mode].pdf

1/34

FEA

PRODUSELOR ALIMENTARE

Prof.dr. Eugenia Eftimie Totu


2/34

TEHNICA ENZIMELOR CA INDICATORI AI CALITATII

ALIMENTELOR

Enzime ce degradeaza materiile prime alimentare:- Polifenoloxidaza

- Clorofilaza- Lipoxigenaza

- Lipaza schimba culoarea si aroma (gust si miros)- Esteraza- Proteaze

-

-Celulazelemodifica structura tesuturilor vegetale

-Hemicelulazele

-Tiaminaza-Acid ascorbic oxidaza degradeaza vitamine si acizi grasi esentiali- Oxidoreductaze indicatori


3/34

Enzime termostabile: peroxidaza, fosfataza alcalina

testare eficacitate a blansarii, pasteurizarii

produse f.b. blansate daca activitatea peroxidazei a ramas:

TEHNICA ENZIMELOR CA INDICATORI AI CALITATIIALIMENTELOR

Maare !erde "#"$%&

Fa'o(e !erde )$*#%$+&

Cono,ida +$-#$+&

LIPOXIGENAZA

– miros nedorit si culoare modificata legume verzi si porumb

Monitorizare: folosire benzi de hartie de filtru impregnate cu clorofila sol. carese decoloreaza in prezenta de lipoxigenaza reziduala (1-2%)

POLIFENOLOXIDAZA – culoarea bruna-neagra la piersici, caise, mere

/ara de 0ru1e((e' *$2#33$2&


4/34


5/34

TEHNICA CU BIOSENZORI

o enima un anti4or,BIOSENZOR

o 5a4terie

cuplat cu un traductor

E(e4tro46imi4

7 e(e4trod

Ma'a

7 Cri'ta(e,ieoe(e4tri4e

7 Di',oiti!e de

unde a4u'ti4e

O,ti4

7 o,trod

Termi4

7 termi'tori

Determinare 4om,u' ',e4ifi4


6/34

UREAZA 8 imo5i(iata ,e un e(e4trod 'en'i5i( (a 4ationi

# e(e4trodu( 'en'i5i( ra',unde (a NH9:

# 4om,ortament Nern'tian intr#un domeniu de

4on4entratii a(e ana(itu(ui 3)#9 8 3)#3 M

# fo(o'it in (a5oratoare de ana(ia 'i 4ontro( a( 4a(itatii


7/34

Substrat Enzima/co-factor Produsi

;(u4oa ;(u4oa o1idaa A4id g(u4oni4

A4id uri4 Uri4aa A(antoina

A4id (a4ti4 La4ta o1idaa Piru!at

Etano( A(4oo( o1idaa A4eta(de6ida

E'teri 4o(e4tero(i4i Co(e'tero( e'teraa Co(e'tenona

ELECTROZI ENZIMATICI

: 4o(e'tero( o1idaaA4id ,iru!i4 Piru!at o1idaa$

A4id fo'fori4$ FAD$

,irofo'fat tiamini4$

Mg+:

A4eti( ,o'fat : CO+

Ma(toa Ma(taa$ ;(u4oa

o1idaa

A4id g(u4oni4


8/34

ELECTROD

Enima

0rate ',atia(e


9/34

Mem5rana ,oroa'a

SCHEME SCHEME SCHEME SCHEME DE DE DE DE IMOBILIZARE IMOBILIZARE IMOBILIZARE IMOBILIZARE ALE ALE ALE ALE ENZIMELOR ENZIMELOR ENZIMELOR ENZIMELOR

ELECTROD

Enima imo5i(iata

>on 5ead'?

Imo5i(iare 4o!a(enta 'au

5(o4are ENTRAPMENT?= 8

de e1. Intr#un ,o(imer

4ondu4ti! ,re4um

,o(iani(ina 'au ,o(i,iro(u(


10/34

CINETICA REACTIILOR ENZIMATICE


11/34

1.1.1.1.1.1.1.1. RASPUNSUL RASPUNSUL RASPUNSUL RASPUNSUL RASPUNSUL RASPUNSUL RASPUNSUL RASPUNSUL BIOSENZORULUIBIOSENZORULUIBIOSENZORULUIBIOSENZORULUIBIOSENZORULUIBIOSENZORULUIBIOSENZORULUIBIOSENZORULUI

EIS@0io'enoru( ra',unde (a ',e4ia de intere' 4onform

e4uatiei (ui NERNST

i

i

ii aF z

RT E E ln0 +=

Potentia(u( 4e(u(ei 'uma ,otentia(e(or din 'i'tem

Toate ,otentia(e(e mentionate de,ind de 4on4entratia

ana(itu(ui$ a'tfe( 4aB

M LJ ii E E E E ++= 0

ia E E lg16,590

+=


12/34

ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST ECUATIA NERNST

Emas Const! ±±±± S "o# $a% &

undeB S ' R T / z% () "n *+Con't. 4ontine termeni ,re4um ,otentia(u( on4tiunii

(i46ide 'i ,otentia(u( e(e4trodu(ui intern de referinta.

T +-$32 ,anta idea(aB 2-$3" m/@ ,IG : +-.2m/ @ ,IG::

∆∆∆∆E 'RT/z() "n'a,/a,,) # ec. Nernst pentru dif. de potential transmembranar

# ,otentia( de mem5ranaB

EM φφφφr - φφφφs EB'r) E. EB's)

E0


13/34

ECUATIA NICOLSKYECUATIA NICOLSKY – – EISENMANN EISENMANN

E E) : S (og ai : i a i@ G

S


14/34

LIMITA DE DETECTIE

DefinitiaDefinitia IUPACIUPAC

a4ti!itatea


15/34

TIMPUL DE RASPUNS

DefinitiaDefinitia IUPACIUPAC

Timpul scurs intre momentul in care un electrod ion-selectiv si un elecrod dereferinta (o celula electrochimica) sunt pusi in contact cu o solutie de electrolit(sau la care este schimbata activitatea ionului primar in solutie) si primulmoment la care valoarea pantei potentialpotential // timptimp ((∆∆E/ E/ ∆∆t)t) devine egal cu ovaloare limita selectata pe baza conditiilor experimentale si a precizieinecesare.

In cazul determinarilor cu o precizie ridicata, valoarea limita este de 0,6 mV/min.0,6 mV/min.


16/34

METODE DE CALIBRARE A EIS / BIOSENZORILORMETODE DE CALIBRARE A EIS / BIOSENZORILOR

I.I. MetodeMetode Simple deSimple de ImersareImersare

A.A. MetodaMetoda ClasicaClasica

Calibrarile preliminare ale EIS se efectueaza in solutii avand 10-6 –10-1 mol/L.Pentru solutii cu tarie ionica ridicata nu este necesara agitarea.Este rapida – elimina un electrod nefunctional.Se aplica in special pentru electrozii cu un timp de raspuns lent.

B.B. TehnicaTehnica AdaosuluiAdaosului StandardStandard

Elimina dificultatile ce apar ca urmare a diferentelor intre matricea probei si

cea a solutiei etalon.Un volum cunoscut de proba se adauga unui standard, sau invers,inregistrandu-se modificarea corespunzatoare a diferentei de potential.Aplicarea sa implica cunoasterea raspunsului Nernstian al electrodului.


17/34

II.II. MetodeMetode dede CurgereCurgere

Esential este ca viteza de curgere sa fie reproductibila pompa peristaltica

Mem5rana in 4onta4t,ermanent 4u 'o(utia

A!antae

ana(ie(orautomatiate

on#(ine?=

E. Referinta ,(a'at in f(u1 du,a EIS$ori4e 4om,u' e(iminat din E.Ref. nu

interfera 4u EIS

La 'u,raf.mem5ranei'e formeaa un 'taratde difuie tim,tim, dede

ra',un'ra',un' ra,idra,id


18/34

Diametru(interiortu5

Tim, dera',un'

tu5u(aturii tu5u(aturii


19/34

A.A. MetodaMetoda curgerecurgere continuacontinua conventionalaconventionala

B.B. TehnicaTehnica dede curgerecurgere nesegmentatanesegmentata (Flow Injection Analysis(Flow Injection Analysis – – FIA)FIA)

Utilizata in analizaoarele chimice folosind un flux de aer purtator.

Se introduce un volum exact intr-un flux purtator nesegmentat – in

sistem nu sunt bule de aer, fiind astfel posibila o viteza ridicata deanaliza (100 – 300 h-1) si un timp de raspuns imbunatatit.

F(u1 de 4urgere,u 'ant

E1i'tenta 5u(e(or de

aer

Ne4e'ara e(iminarea

5u(e(or de aer din 'o(utie


20/34

METODA DILUTIEI LA VOLUM CONSTANT (CVD) METODA DILUTIEI LA VOLUM CONSTANT (CVD)

1976- Horvai si colab.• Metoda des utilizata• Metoda simpla, in care se determina concentratia, cc, a unui ion, ii,,

a carui solutie curge prin celula CVDCVD in timpul, tt, intr-un volum constant,

sub agitare

ecc V

t W

r =

⋅−

0

dilutiedevasuluivolumulV

dilutieiinceperealadetimpult

diluaredesolutieiacurgeredevitezaW

solutieiainitialaiaconcentrat cunde

r =

=

=

=0

:


21/34

TEHNICA CU BIOSENZORI

E(e4troi enimati4iImuno'enori

Termi'tori enimati4i

Car5o6idrati

Determinare de 4ontaminanti

F(uorina

Aminoa4ii

/itamina CEtano(u(

La4tatu(

Parametri ai ,ro',etimii ,e'te(ui

7 E(e4trodu( ANTINOIDAZA

7 det. IMP 8inoin monofo'fat

7 ra,. antina@6i,o1antina

7 Amine 5iogene

7 0i'enor g(utamat#o1idaa

7 L#g(utamat7 L#(a4tat


22/34

TEHNICI IMUNOCHIMICE

- Se bazeaza pe reactia dintre un anticorp si un antigen specific

- Kit-uri pentru decelarea micotoxinelor, pesticidelor, subst. toxice din alimente (solanina), proteine (gluten, alergeni, enterotoxine

stafilococice sau ale patogenilor Salmonella si Listeria)

- ANTICORPI Monoclonali = MAb autentificare de specie

decelare falsificare modificare proteine la procesare

K-cazeina din lapte se foloseste ca antigen pt reactia cu anticorpul MAb

in analiza prod.lactate si det proteinelor din soia in lapte.

Anticorpii MAb – indirect in testele ELISA (Enzyme LinkedImmunosorbent Assays)

- pentru identificarea ovalbuminei denaturate termic;

- decelarea alftoxinei B1

in porumb si arahide prajite


23/34

Imagini a(e unor mi4ro#me4ani'me a4o,erite 4u 4om,u'i a4ti!i

www.nanowerk.com


24/34

TEHNICI BAZATE PE ADN

In functie de mecanismul implicat:

- Tehnici bazate pe PCR = Polymerase Chain Reaction

- Tehnici bazate pe secventierea ADN-ului

- Tehnici bazate pe hibridizarea ADN-ului

- ETAPE

- Incubarea probei cu hexadeciltrimetilbromura de amoniu(DTAB) + extractie cu cloroform + precipitare ADN in izopropanol

- tratare cu proteinaza K + dodecil sulfat amoniu (SDS) + rasina

cu silice pentru purificarea ADN-ului eliberat.


25/34

TEHNICI BAZATE PE ADN – METODA PCR CONEVTIONALA

Secventa cunoscuta de ADNeste amplificata cu 2 initiatori:

- Unul actioneaza la capatul

5’al secventei A, care esteapoi extins cu Taq polimerazacu capatul 3’ al initatorului

A

0

http://www.universe-review.ca/DNAsequencing

- Al 2-lea initiator actioneaza

la capatul 3’ al secventeilantului pe care il extinde cucapatul 5’ al initiatorului

Metoda PCR se aplica pt conc


26/34

Metoda PCR se aplica pt conc.mai mari de 102CFU/g de specii:- Brochothrix din probe de carne

- Patogene:- Shigella sonei- S. flexneri- S. hoydii

- S. dysenteriae- Salmonella paratyphi- Aeromonas Hydrophila- Sta h lococcus aureus

- Clostridium perfringens

JJJ.'er4.4ar(eton.edu

Permite detectia falsificarii siautentificarea materiilor prime si aproduselor.

Avantaje: simplitate, specificitate,sensibilitate, timp relativ scurt deprocesare, cost scazut.

Se folosesc:- secvente de ADN de min.200 bp inlungime pt a fi detectati pe gel de

agaroza;-1,5-2,0 cicluri logaritmice.


27/34

Tehnici derivate din PCR:

-Tehnica SCAR = Simple Characterized Amplified Region

- Tehnica ARMS = Amplification Refractory Mutation System- Tehnica SSR = Simple Sequence Repet

- =

www. oceanexplorer.noaa.gov

-Tehnica DAF = DNA-Amplification Finger Printing

- Tehnica ISSR = Inter Simple Sequence Repeat

- Tehnica AP-PCR = Arbitrary Prime – PCR

- Tehnica QC-PCR = Quantitative Competitive - PCR


28/34

TEHNICI BAZATE PE ADN

Metoda PCR in timp real (REAL – TIME PCR)

- Detectarea tintei PCR-amplificare ADN – ampliconi

- Se aplica mai multe cicluri de amplificare (5-6 cicluri)

- Se foloseste o secventa scurta de ADN (50-60 bp)

- Se foloseste 10-20 µL proba

- Se masoara un semnal de fluorescenta indus de radiatii UV, a caruiintensitate este proportionala cu cant. de ADN obtinuta

- Se foloseste pentru:- Det. specii de cereale

- Diferentierea graului dur de cel comun

- Det. falsificarii cerealelor

- Det. de alergeni in condimente

JJJ. genengneJ'.4om

ALTE TEHNICI BAZATE PE ADN


29/34

ALTE TEHNICI BAZATE PE ADN

- Tehnica ADN-RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA

- Initiatorul are 10 nucleotide pentru a recunoaste secventa tinta- se foloseste la identificarea clonelor identice din bacterii patogene implicate in

toxiinfectii alimentare

- Metoda AFLP = Amplified Fragment Lenght Polymorphism

- implica restrictia initiala a ADN-ului genomic + lergarea unor adaptori

complementari in locurile restrictionate + amplificarea selectiva a PCR

- ampliconii finali sunt denaturati termic si separati prin electroforeza pe

gel folosind gel de poliacrilamida 10% denaturat cu uree si formamida.

- e n ca - = es r c on ragmen o ymorp sm

- permite diferentierea speciilor prin analiza produselor de scindare a ADN-ului

cu o nucleaza de restrictie (endonucleaza)

- ampliconii sunt scindati si fragmentele sunt

supuse electroforezei pe gel de agaroza

cu vizualizarea benzilor de ADN.-Tehnica PCR-SSCP = Single Strand Polymorphism – PCR

- implica amplificarea PCR a unei secvente dintr-o gena (mitocondriala) +

denaturare + electroforeza unui singur lant – ssADN, pe gel de poliacrilamida

nedenaturat + vizualizarea unui nr. limitat de benzi ADN de pe gel.JJJ.'4ie(o.5r


30/34


31/34

O C R V R


32/34

METODE DE AUTENTIFICARE - EVALUARE

Analiza microscopica

- se foloseste in cazul mierii de albine:

- se det. granulele de polen si amidon

- decelarea falsificarii mierii cu diferite probe de origine vegetala

Analiza microscopica electronica cu scanare (SEM)

- evidentiaza structura diferitelor tesuturi utilizate la falsificarea

produselor alimentare

JJJ.food'afetKneJ'.4om

Metoda HPLC – aplicata pentru determinari de:

-Flavonoide si acizi organici din diferite sucuri de fructe- Pigmenti fenolici din ceai, fructe si sucuri de fructe- Izomerii pirolinei si aminoacizii din vin- Pigmentii antocianici din vin, sucuri de fructe, gemuri

- Analiza constituentilor produselor alimentare- Decelarea falsurilor din produsele alimentare


33/34


34/34

Documents

FALSIFICAREA SI EXPERTIZA PRODUSELOR ALIMENTARE_Curs 4_Curs 5 [Compatibility Mode].pdf