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“Fagocitose ao microscópio”

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I. Observando células vivas

É possível visualizar o processo da fagocitose em células

vivas de um organismo animal. Uma forma é retirar as células

que realizam a fagocitose do animal e colocá-las em condições

adequadas para que permaneçam vivas e ativas. A seguir você

verá macrófagos vivos realizando a fagocitose.

NUEPE UFPR Biologia Celular

www.nuepe.ufpr.br

Coordenação Geral Ruth Janice Guse Schadeck

Márcia Helena Mendonça

Cultivo celular e experimentação

Carolina Camargo de Oliveria Dorly de Freitas Buchi

Redatora

Ana Clara Sans Salomão

Didática Jordana Dinorá de Lima

Bruno Reuis Martins Isadora de Lourdes Signorini

Souza Rafael de Oliveira Fratoni

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Por que macrófagos?

O macrófago é um tipo de célula capaz de fazer fagocitose, denominado,

portanto, de fagócito profissional. Nos vertebrados estão presentes nos tecidos

conectivos, no fígado, no baço, nos nódulos linfáticos, nos espaços sinusóides, nos

fluidos peritoneal, pleural ou sinovial, no colostro e nos espaço alveolares, dentre

outros. Estas células podem sobreviver por meses no tecido, patrulhando-os e

estabelecendo contato com os micro-organismos invasores. Em certas regiões, os

macrófagos recebem nomes especiais como, por exemplo: células de Kupfer, no

fígado; microglia, no sistema nervos central; células de Langerhans, na pele; e

osteoclastos, no tecido ósseo.

Os macrófagos mostrados a seguir foram retirados da cavidade peritoneal de

camundongos e cultivados em meio artificial. Cultivo celular é um procedimento muito

utilizado no estudo das células. É um método no qual as células são colocadas em um

meio que contém todos os nutrientes e mantidas em uma estufa em temperatura e

concentrações adequadas de 02 e C02, que simulam as condições do organismo

animal. Após o cultivo de 48 horas os macrófagos foram colocados junto com

leveduras do fermento do pão (Sccharomyces cerevisiae) e filmados através de

microscópios. Veja uma animação que descreve este processo no vídeo referenciado

abaixo.

Fagocitose – Licença para matar :

https://www.youtube.com/watch?v=2xA2OY3y4x4

Como o macrófago reconhece o material que deve ser fagocitado?

O macrófago possui em sua membrana plasmática proteínas, denominadas

receptores. Estes receptores reconhecem compostos químicos da superfície dos

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Figura 1 – Adesão das leveduras ao macrófago. Observe em A a levedura (seta)

aderida ao macrófago (asterisco). Essa interação acontece através dos receptores de

membrana do macrófago que se ligam as moléculas da parede celular da levedura,

como representado através de recursos gráficos em B.

microorganismos e das células (ou restos de células) do próprio organismo que devem

ser fagocitadas, conforme representado na figura 1.

Após a adesão seguem-se eventos complexos que culminam com a digestão do

material endocitado. Observe na figura 2 células nas quais estão ocorrendo eventos

subsequentes a adesão.

A estrutura fagocitada é internalizada em um compartimento chamado fagossomo. Como este compartimento adquire a habilidade de matar e destruir?

Através de uma série de fusões com vesículas do sistema lisossomal (fig. 5),

forma-se o fagolisossomo, compartimento de pH ácido contendo enzimas que efetuam

a digestão do material fagocitado. A maturação do fagossomo evolui até a completa

digestão das moléculas e o material resultante é utilizado pela célula.

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Figura 2 – Maturação do fagossomo. Observe a esquerda uma imagem em

DIC mostrando a levedura dentro do fagossomo (seta fina) e o acúmulo de

granulações citoplasmáticas (seta grossa) em sua periferia. Estas

granulações podem ser vesículas do sistema endossomo/lisossomo/ corpos

lipídicos e outras organelas citoplasmáticas que se fundem aos fagossomos.

Na figura da esquerda está esquematizada a sequência de fusões de

vesículas do sistema endossomo/lisossomo.

Os endossomos, um tipo de vesícula com pH ácido e que faz parte da via de

degradação de material endocitado nas células (“companheiros dos lisossomos”) , são

os primeiros a se fundirem ao fagossomo e somente após a isso, os lisossomos se

fundem. Com estas fusões há o descarregamento de enzimas digestivas no lúmen do

fagossomo, bem como a inserção de enzimas que produzem compostos tóxicos ao

patógeno, como os radicais livres. Veja na figura 3 vários macrófagos em diferentes

fases da fagocitose.

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Figura 3 - Diferentes fases da fagocitose. Inicialmente a levedura adere ao

macrófago (setas 1). Segue-se e internalização (seta 2), formando um

compartimento contendo a levedura internalizada denominado fagossomo

(seta 3). O fagossomo funde-se com lisossomos, formando o fagolisossomo,

no qual acontece a digestão material englobado e que pode aparecer

somente com alguns resíduos no sue interior (seta 4). Observe o grande

número de leveduras que os macrófagos são capazes de englobar

(asteriscos).

A observação de células vivas nos mostra fatos muito importantes. Mas

podemos observar outros aspectos através de outras metodologias, como serão

descritas a seguir.

O fagossomo este torna-se cada vez mais ácido”. Como o pH ácido é formado e mantido?

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Figura 4 – Bomba de prótons V-ATPase. Observe que a V-ATPase realiza

transporte ativo, utilizando a energia do ATP (convertido em ADP+fosfato ), para

bombear prótons (H+) para o interior dos compartimento tornando-o ácido

Nos processos de fusões com lisossomos o fagossomo adquire uma bomba de

prótons chamada de V- ATPase (ATPase vacuolar), que joga prótons para o seu

interior. O lúmen do fagossomo torna-se fortemente acidificado, chegando até pH 4.5.

Como este é um transporte do lado menos concentrado (o citosol apresenta pH

neutro, portanto, menor concentração de H+) para o lado mais concentrado (o lúmen

do compartimento apresenta pH ácido, portanto com maior concentração de H+) é um

transporte ativo que acontece as custas da hidrólise do ATP (Figura 4 ).

Veja como isso acontece no vídeo referenciado abaixo:

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Figura 5 – Acidificação dos fagossomos observada através vermelho

neutro. Observe em A vesículas vermelhas (endossomos e lisossomos) (setas),

justapostas aos fagossomos não corados (asteriscos), portanto neutro. Note em

B diferentes graus de acidificação: fagossomo 1 ainda está neutro, o 2 está com

uma coloração vermelha mais suave e o 3 encontra-se bem corado, Em C todos

os fagossomos (*) estão ácidos.

Organelas ácidas

http://youtu.be/BvCxAjNXj9s

A molécula de vermelho neutro acumula-se no interior dos compartimentos ácidos em

células vivas, corando-os de vermelho. Dessa forma, com a coloração vermelho-

neutro pode-se diferenciar nas células vivas os compartimentos ácidos, vermelhos,

dos compartimentos com pH neutro e básico, incolores. Observe a acidificação na

figura 5.

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II. Observando células fixadas coradas com Giemsa

A coloração com Giemsa é realizada em células fixadas. Neste

caso as células vivas são submetidas a compostos químicos, que

embora matem as células, reagem com compostos químicos celulares insolubilizando-

os, em um processo denominado de fixação. Com esta coloração torna-se possível a

diferenciação entre as leveduras recém englobadas pelos macrófagos e as que já

sofreram a ação das enzimas, já que mostra com clareza alterações morfológicas nas

leveduras fixadas e coradas. A morfologia arredondada e a cor intensa, características

das leveduras íntegras, são observadas na figura 6A, em leveduras ainda não

internalizadas, e permanecem presentes durante os primeiros estágios da

internalização (Figs. 6 A-D). Nos estágios avançados, verificam-se grandes alterações

de formato e de cor (Fig. 6E), o que sugere a digestão.

Observe a figura 6. As estruturas apontadas pelas setas da na coluna da

esquerda estão ampliadas e editadas na coluna da direita. Observe na figura A a

levedura aderida ao macrófago, representativa do estágio de adesão. Isto ocorre, pois,

como podemos notar pelo detalhe ao lado de A, receptores do macrófago reconhecem

moléculas na superfície da levedura, ligando-se a elas. Em B, na etapa seguinte, a

levedura começa a ser internalizada devido aos receptores dos macrófagos que, um a

um, ligam-se a moléculas de superfície da levedura, o que conhecemos como “modo

zíper”. Em C, a levedura encontra-se completamente internalizada, sendo acomodada

dentro de um compartimento chamado de fagossomo. Em D observa-se o fagossomo

fundido-se com lisossomos. Dessa maneira o seu pH fica ácido ele recebe enzimas

hidrolíticas capazes de digerir a levedura, observado em E.

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Figura 6 – Estágios da fagocitose.

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Veja o processo de digestão no vídeo “ Digestão celular” referenciado abaixo.:

Digestão celular

http://youtu.be/JvqJLoIp-4U

Qual é a composição do fagolisossomo?

O fagolisossomo - compartimento resultante da fusão do fagossomo com

lisossomos dentro do qual acontece a morte e a digestão do material internalizado -

apesar de sua morfologia simples, do ponto de vista de organização molecular é muito

complexo. Apresenta uma variedade de proteínas de membrana tais como enzimas

envolvidas na produção de radicais livres, proteínas envolvidas na apresentação de

antígeno, próton ATPases para manter o pH ácido do compartimento, proteínas

associadas aos filamentos do citoesqueleto, proteínas estruturais e transportadores de

membrana para importação de moléculas do citoplasma e exportação dos monômeros

oriundos da digestão. No lúmen do fagolisossomo estão presentes dezenas de tipos

diferentes de enzimas hidrolíticas, como proteases, lípases, glicosidades, nucleases e

fosfatases, capazes de digerir a maior parte dos compostos orgânicos. Veja a

representação de um fagolisossomo na figura 7.

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Figura 7 – Composição do fagolisossomo. A imagem enfatiza a presença de proteínas de membrana compondo a bicamada lipídica do fagolisossomo, tais como enzimas, proteínas estruturais, transportadores de membrana para importação de moléculas do citoplasma e exportação dos monômeros oriundos da digestão, além da próton ATPase. No lúmen do fagolisossomo, mais externamente observe dezenas de enzimas hidrolíticas como proteases, lípases, glicosidades, nucleases e fosfatases. Enquanto que, mais internamente note leveduras sendo submetidas ao processo de digestão pela ação das enzimas hidrolíticas.

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III. Curiosidades

A fagocitose é eficaz para todos os tipos de patógenos?

Alguns patógenos intracelulares desenvolveram estruturas e mecanismos que os

permitem sobreviver à fagocitose e que podem ser agrupados segundo as categorias:

I. patógenos que rompem a membrana do fagossomo durante a sua maturação e

escapam para o citoplasma, o que os protege contra os agentes dos

lisossomos e os permite metabolizar nutrientes citoplasmáticos (L.

monocytogenes, Shigella flexneri, Francisella tularensis and Rickettsia spp.).

II. patógenos que paralisam a maturação do fagossomo em estágios pré-

fagolisossomo e assim não se encontram com os agentes lisossomais. (M.

tuberculosis, micobactéria que secreta fosfatases para defosforilar o

fosfoinositol-3-fosfato e assim paralisar a maturação do fagossomo.

III. patógenos que redirecionam a maturação do fagossomo e são acondicionados

em vacúolos sem caráter endocítico que muitas vezes são liberados pela via

de secreção celular (os vacúolos contendo Legionella pneumophila interseptam

vesículas secretórias vindas do retículo endoplasmático e se desenvolvem em

compartimentos que apresentam muitas características do retículo

endoplasmático rugoso, inclusive a presença de ribossomos).

O que acontece nas alterações do reconhecimento?

O reconhecimento do que é inerente ao organismo e o que é invasor é

essencial para a defesa do organismo. Alterações neste reconhecimento podem

desencadear doenças graves, como, por exemplo, a esclerose múltipla, doença

autoimmune do sistema nervosa central. Esta doença ocorre devido a degeneração da

bainha de mielina que envolve os axônios neurais, realizada pelo próprio sistema

imnulógico do indivíduo, quando os macrófagos ativados expressando receptores

scavenger classe A (SRA) fagocitam a mielina que recobria o neurônio.

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Figura 7 – Esclerose múltipla. A ilustração representa as diferenças entre um

neurônio sadio, com a bainha de mielina íntegra, e um neurônio afetado pela patologia

esclerose múltipla, que apresenta bainha de mielina danificada, prejudicando a

transmissão do impulso elétrico através do axônio.

Bibliografia

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