Inducción del metabolismoParte I. Regulación genética en el operon lac

• Facultad de química, UNAM

• Laboratorio de bioquímica experimental

• Grupo:

• Profesoras: Sobeida Sánchez NietoLilian González Segura

Fernando Esteban Hernández Huerta

La adaptabilidad de las bacterias y otros procariontes depende en grado considerable de su capacidad de encender y apagar la expresión de series especificas de genes en respuesta a demandas del ambiente.

ADAPTACION

Regulación de genes

La expresión de estos genes se lleva a cabo solamente cuando el microorganismos necesita las proteínas necesarias ligadas a los nutrimentos del ambiente.

Para producir estas proteínas se necesita un alto grado de energía.

Galletasa

FIN: Crecer y dejar descendencia

Genes Constitutivos:

Los que codifican para proteínas independientemente de las condiciones ambientales.

Ejemplos:

Genes para:

• RNA ribosómicos• Proteínas

ribosómicas• RNA de

transferencia• RNA polimerasa

Regulación de la expresión génica:

TranscripciónTratamiento de mRNA

TraducciónFunción enzimática

1) El de rápido encendido y apagado de la expresión de genes en respuesta a cambios ambientales.

2)Circuitos pre programados de expresión de genes

¿Cómo aprovechan los nutrientes?

Las bacterias mejor adaptadas han sido capaces de crecer utilizando diferentes hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa, arabinosa, galactosa)como fuente de energía. Glucosa Otros

carbohidratosLactosa

Glucolisis

b-lactamasa

InducciónExpresión de

genesque codifican

paradegradar la

lactosa.

Genes para la uso de la lactosa como fuente de carbono• b-galactosidasa : hidroliza a la lactosa para formar glucosa y galactosa. 4 subunidades idénticas de 1021 aminoácidos.

• b-galactosido permeasa: transporte de azucares. Bombea b-galactósidos al interior de la célula. 275 aminoácidos

• b-galactosido transacetilasa: acetila la glucosa transfiere un grupo acetilo desde el acetil-CoA a los b-galactosidos. 275 aminoácidos.

La expresión de los genes requiere un alto grado de energía. AT

PGTP

Es por ello que las bacterias han desarrollado mecanismo por los cuales la síntesis de estas enzimas que cataboliza la lactosa se enciende en presencia de esta y se apaga en ausencia de la misma.

INDUCCIÓN: mecanismo por el cual la expresión de los genes se enciende por acción de una sustancia presente en el ambiente. (como la lactosa).

Esas sustancias se llaman INDUCTORES y a los genes que cuya

expresión se regula de este modo se llaman GENES INDUCIBLES. Las enzimas que intervienen en las vías catabólicas, en el caso de carbohidratos como la lactosa, galactosa y arabinosa son inducibles de manera característica:

a nivel de transcripción.

Las bacterias posen la capacidad metabólica de sintetizar la mayoría de las moleculas orgánicas(aminoácidos, purinas ,vitaminas etc.) que requieren para crecer.

Triptófano E. Coli tiene 5 genes que codifican para síntesis de triptófano

¿y si hay nutrientes en el medio?

Si hay nutrientes en el medio se “apagan” los genes que sintetizan el

triptófano, a este proceso se llama REPRESIÓN.

Un gen cuya expresión se ha apagado de esta forma se dice que se ha

REPRIMIDO y cuando se enciende se ha DESREPRIMIDO.

Modelo del operón

En 1965 F. Jacob y J. Monod se les otorgo el premio nobel por proponer el modelo del operón para explicar la regulación de genes que codifican a las enzimas para el catabolismo de la lactosa en E. coli.

Operón: la unidad contigua completa incluyendo los genes estructurales, el

operador y el promotor.

Operón Numero de proteínas enzimáticas

Función

Lac 3 Hidrólisis y transporte de b-galactosidos.

His 9 Síntesis de histidina

Leu 4 Conversión del a-oxoisovaleriano a leucina

ara 4 Transporte y utilización de la arabinosa

Datos importantes sobre el operon lac1. El operon lac de E. coli es un operón

inducible

2. El gen regulador del operón de la lactosa, es lacI que codifica para la proteína represora, gen i.

3. La forma activa del represor lac, es un tetrámero que contiene cuatro copias del producto génico i.

4. Algunas pocas moléculas de los productos génicos de los genes del operón lac, se sintetizan en el estado no inducida proporcionando un nivel muy bajo de actividad enzimática

5. El inductor del operón realmente es la alolactosa

O

O

H

HH

OH

H

OH

H OH

OH

O

H

HH

H

OH

H OH

OH

OHLactosa

+H2O

O

OH

HH

H

OH

OH

H OH

H

OH

+

O

OH

HH

OH

H

OH

H OH

H

OH

glucosa

galactosa

galactosidasa

OO

H

HH

OH

H

OH

H OH

OH

O

H

HH

OH

H OH

OH

Alolactosa

¿Cuánto miden?

1045 pb

80 pb 35 pb 3510 pb 780 pb 825 pb

Operón

Control positivo del operón lac por CAP Y AMP cíclico

Cuando hay glucosa y lactosa en el medio, E. coli solo ocupa la glucosa.

¿Qué le pasa al operón lac?

Represión por catabolito (efecto glucosa)

Centro de entrada de la

ARN Pol

Sitio de unión

CAP-cAMP

cAMP

CAPProteína activadora por catabolito

Niveles altos de glucosa, producen niveles bajos de cAMP

NIVELES ALTOS DE GLUCOSA

ARN Pol

Cuando existe gran cantidad de glucosa, la concentración de cAMP es muy baja y el complejo CAP-cAMP no se forma. Ello impide que la ARN Pol se una a su centro de entrada.

cAMP CAP

NIVELES BAJOS DE GLUCOSA

Niveles bajos de glucosa, producen niveles altos de cAMP

ARN Pol

cAMP CAPCuando no hay glucosa disponible, se forma un complejo entre la CAP y el cAMP, que se enlaza a su sitio de unión en el promotor y permite que la ARN Pol se una a su sitio de entrada y hay transcripción de genes.

Practica de laboratorioObjetivos

- Comprender la importancia de la regulación genética como mecanismo paracontrolar los niveles de enzimas en la célula.

- Conocer los elementos que integran el operón de la lactosa.

- Entender el funcionamiento del operón de la lactosa en presencia y ausenciade este carbohidrato.

- Conocer el concepto de represión catabólica y cómo se lleva a cabo.

Reactivos− 1 tubo con medio M9-glicerol estéril− Solución de glucosa al 2% estéril− Solución de lactosa al 2% estéril− Solución de glucosa 2% + lactosa 2% estéril− Amortiguador Z (Na2HPO4-7H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10 mM,MgSO4-7H2O 1mM, β-mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0).− Reactivo ONPG (Orto-Nitrofenil Galactosa). El reactivo es incoloro y debe prepararse justo antes de usarse para mejores resultados.− SDS al 0.1%− Na2CO3 1M− Cloroformo

Material biológicoCultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol.

ONPG (o-nitrophenyl galactoside)Sustrato de la -galactosidasaSi existe enzima en el medio, el ONP es utilizado

Incoloro Amarillo

Análisis de la técnica:

Explica que es lo que hace cada reactivo. En

dónde se encuentran las enzimas que son

inducidas por la lactosa, en donde vamos a añadir el reactivo que nos dice

que las enzimas se sinterizaron?

¿ que resultados se esperan?

• Tubo A: Coloración amarilla débil ya que no hay lactosa en el medio (BASAL).

• Tubo B: Color amarillo mas intenso debido a que la lactosa es la única fuente de carbono (ENTONCES EL OPERÓN LAC SE ENCUENTRA INDUCIDO).

• Tubo C: Coloración amarilla intermedia debido a que primero se ocupo la glucosa y posteriormente la lactosa.

• Tubo D: Coloración amarilla intermedia debido a la represión catabólica por la glucosa, pero la posterior inducción por la presencia de lactosa,

siempre y cuando la glucosa se acabe

• Tubo E: Sin Coloracion ya que no hay células en el medio.

+Lactosa

Fuentes

Lehninger Albert L., Principios de bioquímica, Editorial: ediciones omega, S.A., Barcelona, pp. 910-910

Gardner Eldon Jonh, Principios de genética, editorial Limusa Wiley, Mexico, 4ª edición, pp. 390-400

Devlin, Thomas M., Bioquímica, libro fe texto con aplicaciones clínicas, Editorial Reverte S.A., Mexico, 4ª edición.

Alberts, Bray, Lewis et all, Biología molecular de la célula, Editorial ediciones Omega S.A. Barcelona, 2ª edición.