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FABIANA CRISTINA ANDRADE CORBI
SISTEMAS MAGNÉTICOS MULTICOMPONENTES NANOESTRUTURADOS
HIERARQUICAMENTE COM PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E LUMINESCENTES.
CAMPINAS
2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
FABIANA CRISTINA ANDRADE CORBI
SISTEMAS MAGNÉTICOS MULTICOMPONENTES NANOESTRUTURADOS
HIERARQUICAMENTE COM PROPRIEDADES BIOLÓGICAS E LUMINESCENTES.
ORIENTADOR: PROF. DR. ITALO ODONE MAZALI
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO
INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM
CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR FABIANA CRISTINA ANDRADE CORBI, E ORIENTADA PELO PROF. DR. ITALO ODONE MAZALI.
______________________
Assinatura do Orientador
CAMPINAS
2014
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Esta Tese é dedicada aos meus filhos amadosEsta Tese é dedicada aos meus filhos amadosEsta Tese é dedicada aos meus filhos amadosEsta Tese é dedicada aos meus filhos amados Maria EduMaria EduMaria EduMaria Eduarda e João Pedroarda e João Pedroarda e João Pedroarda e João Pedro,,,, e e e e ao meu grande amor Pedro. ao meu grande amor Pedro. ao meu grande amor Pedro. ao meu grande amor Pedro.
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AGRADECIMENTOS A Deus pela oportunidade de recomeçar em cada amanhecer...
Um agradecimento especial a Marlene Aparecida Ittner (ou seria Malene, ou ainda
Manene!?), a quem entregava minha vida todos os dias para poder realizar este
trabalho. Marlene, obrigada por cuidar dos meus filhos com tanto amor e carinho.
Ao Professor Italo Odone Mazali pela oportunidade de trabalho, aprendizado, amizade,
compreensão e, sobretudo, por não ter me deixado desistir no meio do caminho.
Obrigada por tudo Professor!
Ao Professor Fernando Aparecido Sigoli pelas ideias, discussões valiosas e amizade.
Muito obrigada!
Aos professores Yoshitaka Gushiken, Daniela Zanchet e Maria do Carmo Gonçalves
pelas importantes contribuições em meu exame de qualificação. Obrigada!
Aos professores componentes da banca de defesa deste trabalho de Tese, Wilton
Rogério Lustri, Patrícia Pommé Confessori Sartoratto, Daniela Zanchet e Ana Flávia
Nogueira, pelas valiosas sugestões. Muito Obrigada!
Ao meu marido Pedro por seu companheirismo, amor, dedicação e incentivo. Pedro, se
não fosse a sua força, eu não teria chegado até aqui. Te amo!
A minha filha Maria Eduarda que com sua alegria faz os nossos dias mais felizes e, ao
meu filho João Pedro que, depois de tantos anos, me ensinou o verdadeiro sentido da
vida. Amo vocês!
Ao meu Pai e grande incentivador Flávio, por acreditar em mim, até mais do que eu
mesma, e por sua admiração. Te amo Pai! Sou sua fã!
x
A minha Mãe Mara, que apesar da distância, sempre esteve ao meu lado me ajudando
no que podia. Mãe obrigada por tudo, principalmente pelas orações! Te amo!
Ao meu Irmão Junior, por existir em minha vida.... Simples assim! Te amo demais Juba!
A D. Isabel e Sr. Pedro por todo carinho e velinhas acesas nos momentos difíceis.
Obrigada de coração!
Aos colegas do LMF: Natiara, Laura, Gabi, Emille, Cris, Bia, Carol, Carla, Lidiane,
Larissa, Elias, João Paulo, Jorge, Murilo, Diogo, Felipe, Lanousse, Wilian, Isaias, Elias,
Rafael Carlos, por toda a ajuda no dia-dia. Obrigada, e muito sucesso pra vocês! E
pelos que por lá passaram e deixaram sua amizade: Mathias, Luiz, Camila, Ernesto,
Renata e Rafael, valeu!
A grande amiga Ana Lúcia, gostaria de deixar registrado meu agradecimento por sua
amizade e minha admiração por sua luta. Ana, que Deus a tenha em um lugarzinho
muito especial pertinho Dele!
Aos colegas do LQBM e LQC, em especial ao Raphael Enoque, Fernando, Irlene,
Marcos, Helen por toda atenção de sempre!
Aos funcionários do IQ, em especial a Claudinha, Milene, Sônia, Márcia, Fabi, Daniel,
Raquel e Renata pelo apoio na caracterização das amostras.
Aos colegas do Quimmera – UNIARA, Prof. Wilton Rogério Lustri, Prof. André C.
Amaral, Silmara e Renata pelos ensaios microbiológicos e principalmente pela preciosa
amizade. Obrigada!
A Profa. Fanny Bèron, do IFGW-UNICAMP, pela disponibilidade na realização das
medidas de VSM e pelas valiosas discussões e ao Dr. Carlos Sato, do LNLS, pela
atenção na realização das medidas de hipertermia magnética.
A Dra. Luciana Maria de Hollanda, do IB-UNICAMP, pelos ensaios de citotoxicidade.
Ao CNPq pela bolsa concedida.
xi
Fabiana Cristina Andrade Corbi
Curriculum Vitae _________________________________________________________________________________ Dados pessoais
Nome Fabiana Cristina Andrade Corbi
Filiação Flávio Tadeu Ferreira de Andrade e Mara Sueli Martins de Andrade
Data de Nascimento: 09/05/1977
Naturalidade: São Paulo – SP
Nacionalidade: Brasileira
___________________________________________________________________
Formação acadêmica/titulação
2010 - 2014
Doutorado em Química.
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP, Campinas-SP.
Título: Sistemas magnéticos multicomponentes nanoestruturados
hierarquicamente com propriedades biológicas e luminescentes.
Orientador: Prof. Dr. Italo Odone Mazali
Bolsista: CNPq-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico.
1999 - 2001 Mestrado em Química.
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP,
Araraquara-SP.
Título: Oxissulfetos e óxidos de ítrio dopados com Eu(III), Tb(III) e
Tm(III) morfologicamente controlados: síntese e propriedades
luminescentes.
Orientadora: Profª. Drª. Elizabeth Berwerth Stucchi
Bolsista: CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior.
xii
1995 - 1998 Graduação em Bacharelado em Química.
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP,
Araraquara-SP.
Bolsista: CAPES/PET-Programa Especial de Treinamento
___________________________________________________________________
Artigos completos publicados em periódicos
1. De Carvalho, M. A., Andrade, P. F., Corbi, F. C. A., Gonçalves, M. C., Formiga, A. L.
B., Mazali, I. O., Bonacin, J. A., Corbi, P. P. A simple method to synthesize fluorescent
modified gold nanoparticles using tryptamine as the reducing and capping agent.
Synthetic Met., 2013, 185-186, 61-65.
2. Bergamini, F. R. G., Ferreira, M. A., De Paiva, R. E. F., Gomes, A. F., Gozzo, F. C.,
Formiga, A. L. B., Corbi, F. C. A., Mazali, I. O., Alves, D. A., Lancelotti, M., Corbi, P. P. A
binuclear silver complex with l-buthionine sulfoximine: synthesis, spectroscopic
characterization, DFT studies and antibacterial assays. RSC Advances, 2012, 2, 10372-
10379.
3. Antonio, S. G., Paiva-Santos, C. O., Corbi, P. P., Massabni, A. C., Andrade, F. C.
Powder X-ray characterization of lithium thiazolidine-4-carboxylate. Powder Diffr., 2009,
24, 44-47.
4. Corbi, P. P., Andrade, F. C., Massabni, A. C., Heinrich, T., Souza, P. P. C., Costa-
Neto, C. M. Lithium thiazolidine-4-carboxylate: Synthesis, spectroscopic characterization
and preliminary in vitro cytotoxic studies in human HeLa cells. Spectrochim. Acta A,
2008, 71, 929-931.
5. Legendre, A. O., Andrade, F. C., Ananias, S. R., Mauro, A. E., Netto, A. V. G.,
Santos, R. H. A., Ferreira, J. G., Martins, F. R. 3D Hydrogen-bonded network built from
copper(II) complexes of 1,3-propanediamine. J. Brazil. Chem. Soc., 2006, 17(8), 1683-
1688.
________________________________________________________________
Participação em eventos científicos com apresentação de trabalho
1. Andrade, F. C., Sigoli, F. A., Mazali, I. O. Magnetic particles coated with porous silica:
synthesis and magnetic properties. XII Brazilian MRS Meeting, Campos do Jordão-SP,
2013.
xiii
2. Corbi, F. C. A., Sigoli, F. A., Beron, F., Pirota, K. R., Mazali, I. O. Multifunctional
core@shell nanostructures based in superparamagnetic particles. 7th International
Symposium on Advanced Materials and Nanostructures, Sorocaba-SP, 2012.
3. Corbi, F. C. A., Carneiro, N. M., Sigoli, F. A., Mazali, I. O. A influência do solvente na
síntese hidrotérmica de nanopartículas magnéticas de óxido de ferro. 22ª Reunião
Anual de Usuários do LNLS, Campinas-SP, 2012.
4. Corbi, F. C. A., Beron, F., Pirota, K. R., Sigoli, F. A., Mazali, I. O. Sistemas
magnéticos nanoestruturados multifuncionais do tipo Fe3O4@SiO2. 35ª Reunião Anual
da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia-SP, 2012.
5. Corbi, F. C. A., Sigoli, F. A., Mazali, I. O. Influência do contra-íon na obtenção de
nanopartículas magnéticas. 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química,
Florianópolis-SC, 2011.
6. Andrade, F. C., Stucchi, E. B., Pires, A. M., Davolos, M. R. Monodispersed Eu(III),
Tb(III) e Tm(III) doped Y2O3 as precursor of luminescent thin films. Rare earths’,
Campos do Jordão-SP, 2001.
7. Andrade, F. C., Davolos, M. R., Vila, L. D., Stucchi, E. B., Pires, A. M. Oxissulfatos de
ítrio monodispersos dopados com Eu(III), Tb(III) e Tm(III) obtidos a partir de
decomposição térmica de hidroxicarbonatos. 24ª Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Química, Poços de Caldas-SP, 2001.
8. Andrade, F. C., Stucchi, E. B., Vila, L. D., Pires, A. M., Davolos, M. R. Monodispersed
europium(III) doped ytrium oxysulfide as base of luminescent thin films. XII Symposium
on Non-Oxide Glasses and Advanced Materials, Florianópolis-SC, 2000.
9. Mauro, A. E., Martins, F. R., Santos, R. H. A., Andrade, F. C. Síntese e
caracterização estrutural do di-µ-cianato-bis[{cianato(1,3-propanodiamina)}cobre(II)].
23ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas-SP, 2000.
10. Andrade, F. C., Vila, L. D., Stucchi, E. B., Pires, A. M., Davolos, M. R. Obtenção de
Filmes Luminescentes a partir de suspensões de oxissulfetos de ítrio dopados com
európio(III). 12º Encontro da Sociedade Regional de Química, Ribeirão Preto-SP, 1999.
11. Andrade, F. C., Vila, L. D., Stucchi, E. B., Pires, A. M., Davolos, M. R. Obtenção de
Filmes Luminescentes a partir de suspensões de oxissulfetos de ítrio dopados com
európio(III). 29ª Semana da Química / 1ª Jornada da Pós-Graduação e Pesquisa do IQ-
Unesp, Araraquara-SP, 1999.
xiv
_________________________________________________________________
Prêmios e Títulos
1. Certificado de Honra ao Mérito do Instituto de Química da Unesp/Araraquara e
Prêmio Lavoisier do Conselho Regional de Química/CRQ-IV como Melhor Aluna do
Curso de Química (Bacharelado) da Turma de 1998.
xv
RESUMO
Sistemas magnéticos multicomponentes nanoestruturados
hierarquicamente com propriedades biológicas e luminescentes.
Na busca de um material multifuncional, esta Tese propõe a síntese de uma
nanoestrutura hierárquica caroço@casca, sendo o caroço de magnetita e a casca de
sílica mesoporosa. Desta combinação surge uma plataforma magneto-porosa que, além
das propriedades magnéticas, pode apresentar outras propriedades de acordo com a
espécie incorporada na camada de sílica. As partículas do caroço magnético foram
obtidas via síntese solvotérmica a partir de cloreto de ferro(III) controlando-se a fase
cristalina e a morfologia. A casca de sílica mesoporosa foi obtida via método sol-gel a
partir do tetraetilortossilicato (TEOS), sendo o brometo de cetiltrimetilamônio o agente
direcionador na formação dos poros. A fase cristalina foi caracterizada por medidas de
difração de raios X (XRD), espectroscopia no infravermelho (IR) e Raman, e
termogravimetria (TGA/DTA). A morfologia e a nanoestruturação do sistema foram
analisadas por microscopia eletrônica de varredura (SEM), enquanto que as
propriedades magnéticas foram determinadas por magnetometria de amostra vibrante
(VSM), SQUID e hipertermia magnética. Em um primeiro momento, investigou-se a
potencialidade do sistema no carregamento e liberação de fármacos utilizando-se um
fármaco antibacteriano, a levofloxacina. Para a plataforma carregada com levofloxacina
foram realizados ensaios de atividade antibacteriana, os quais demonstraram que o
sistema apresenta atividade contra cepas Gram-positivas e Gram-negativas. Ensaios de
citotoxicidade mostraram que tanto as partículas de magnetita quanto a plataforma
magneto-porosa não são citotóxicas para células saudáveis (NIH/3T3) o que viabiliza
sua ap l icação b io lóg ica. O comp lexo lum inescente
diaquatris(tenoiltrifluoroacetonato)európio(III) foi incorporado à plataforma e o
monitoramento do tempo de vida da emissão do complexo em função da temperatura
revelou que o sistema funciona como uma sonda de temperatura, considerando-se que
foi obtida uma variação linear de temperatura na faixa de interesse biológico (entre 36-
xvi
45 °C). Nas medidas de hipertermia magnética a plataforma magneto-porosa elevou a
temperatura da água em 8 °C. Aliando a este resultado à propriedade de sonda de
temperatura, teríamos um termômetro que poderia ser utilizado in situ em
procedimentos de terapia do câncer por aquecimento. Portanto, o conjunto de
resultados obtidos revela que foi possível obter uma plataforma magneto-porosa
multifuncional, e que diferentes ensaios podem ser realizados com o sistema visando
diversas aplicações.
Palavras-chave: magnetita, sílica mesoporosa, caroço@casca, magnetismo, liberação
controlada, citotoxicidade, luminescência, hipertermia.
xvii
ABSTRACT
Multicomponent hierarquically nanostructured magnetic system with
biological and luminescents properties.
Due to the high versatility, the core@shell nanostructures represent a class of
materials in the interface between chemistry and different areas, in which they find
applications. Among them, the biomedical and pharmaceutical, catalysis and
photoluminescence applications can be emphasized. Searching for a multifunctional
material, this Thesis proposes the synthesis of a hierarchical nanostructure core@shell,
being the core of magnetite and the shell of mesoporous silica. From this arrangement a
magneto-porous platform is obtained, in which besides the magnetic property other
properties can be achieved according to the species incorporated into the silica layer.
The magnetic core was obtained by solvothermal synthesis from iron(III) chloride by
controlling the crystalline phase and morphology. The shell of mesoporous silica was
obtained by the sol-gel method from tetraethylorthosilicate (TEOS), being the
cetyltrimethylammonium bromide the directing agent in the formation of pores. The
crystalline phase was characterized by X-ray diffraction (XRD) measurements, infrared
(IR) and Raman spectroscopies and thermogravimetry (TGA/DTA). The morphology and
the nanostructure of the system were analyzed by scanning electron microscopy (SEM),
while the magnetic properties were determined by vibrating magnetometry sample (VSM),
SQUID and magnetic hyperthermia. At first, we investigated the potential of the system in
the loading and releasing of drugs using the antibiotic levofloxacin. Antibacterial assays
have demonstrated that the system is active against Gram-positive and Gram-negative
bacterial strains. Cytotoxicity assays showed that the particles of magnetite and the
magneto-porous platform are not cytotoxic to healthy cells (NIH/3T3), which enables its
biological application. The diaquatris(tenoyltrifluoroacetonate)europium(III) luminescent
complex was incorporated into the platform and studies of monitoring lifetime of the
emission of the complex as a function of temperature revealed that the system operates
as a temperature probe, since a linear variation was observed in the temperature range
of biological interest (between 36-45 °C). In magnetic hyperthermia measurements, in
xviii
the presence of the magneto-porous platform the water temperature was elevated by
8 ° C. Combining this result to the property of temperature probe, we could have a
thermometer that may possibly be used in situ in cancer therapy procedures by heating.
Therefore, the set of results show that it is possible to obtain a magneto-porous
multifunctional platform and different assays may be performed with the system aiming
for diverse applications.
Keywords: magnetite, mesoporous silica, core@shell, magnetism, drug delivery,
cytotoxicity, luminescence, hyperthermia.
xix
SUMÁRIO
LISTA DE SÍMBOLOS xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS xxv
LISTA DE TABELAS xxvii
LISTA DE FIGURAS xxix
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO 1
1.1. Sistemas magnéticos multicomponentes 3
1.2. O comportamento magnético das NPM de Magnetita 8
1.3. Síntese de partículas magnéticas nanoestruturadas 15
1.3.1. Método da auto-organização induzida por evaporação 15
1.3.2. Síntese solvotérmica 16
1.4. Síntese de partículas magnéticas do tipo Fe3O4@SiO2 19
1.5. Aplicações dos sistemas magnéticos do tipo Fe3O4@SiO2 exploradas neste trabalho 21
1.5.1. Liberação controlada de fármacos (drug delivery) 22
1.5.2. Hipertermia Magnética 25
1.5.3. Sistemas Magneto-Luminescentes 28
CAPÍTULO 2
OBJETIVOS 33
2.1. Objetivo geral 33
2.2. Objetivos específicos 33
xx
CAPÍTULO 3
PARTE EXPERIMENTAL 35
3.1. Reagentes Utilizados 35
3.2. Síntese da plataforma magneto-porosa do tipo Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 36
3.2.1. Síntese das partículas magnéticas constituintes do caroço da plataforma magneto-porosa 36
3.2.2. Deposição da sílica densa (dSiO2) 36
3.2.3. Deposição das camadas de sílica mesoporosa (mSiO2) 37
3.2.4. Remoção do CTAB das amostras Fe3O4@dSiO2@1mSiO2-CTAB e
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2-CTAB 37
3.3. Funcionalização da plataforma magneto-porosa 38
3.3.1. Carregamento da levofloxacina na plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 38
3.3.2. Incorporação do complexo [Eu(tta)3(H2O)2] à plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 38
3.4. Caracterização 39
3.4.1. Difratometria de raios X (XRD) 39
3.4.2. Espectroscopia vibracional de absorção no infravermelho (IR) 39
3.4.3. Análise termogravimétrica (TGA/DTA) 39
3.4.4. Espectroscopia Raman 40
3.4.5. Microscopia eletrônica de varredura (SEM) 40
3.4.6. Isotermas de adsorção e dessorção de N2 40
3.4.7. Caracterização magnética 40
3.4.8. Espectroscopia eletrônica de absorção no UV-Vis (UV-Vis) 42
3.4.9. Espectroscopia de luminescência (LE) 42
3.4.10. Estudos de cinética de liberação da LEVO 43
3.4.11. Ensaios microbiológicos 44
xxi
3.4.12. Ensaios de Citotoxicidade 46
CAPÍTULO 4
RESULTADOS E DISCUSSÕES 49
4.1. Caracterização química, estrutural e morfológica das partículas magnéticas do caroço 49
4.2. Caracterização química, estrutural e morfológica da plataforma magneto-porosa caroço@casca do tipo Fe3O4@dSiO2@mSiO2 64
4.3. Comportamento magnético das amostras do caroço e da plataforma magneto-porosa 76
4.3.1. Caracterização por VSM 76
4.3.2. Caracterização por SQUID 80
4.3.3. Hipertermia magnética 84
4.4. Caracterização das amostras contendo LEVO 87
4.4.1. Estudos de Cinética de Liberação da LEVO 90
4.4.2. Análises Microbiológicas 91
4.5. Caracterização das amostras contendo Eutta 94
4.6. Ensaios de citotoxicidade 101
CAPÍTULO 5
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS 105
CAPÍTULO 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 107
xxii
xxiii
LISTA DE SÍMBOLOS
λ Comprimento de onda
ν Estiramento de uma ligação química
δ Deformação angular de uma ligação química
φ Diâmetro de poro
λem Comprimento de onda de emissão
λexc Comprimento de onda de excitação
λFO Fator de ocupação
∆T Variação de temperatura
∆t Variação do tempo
a, c Parâmetros de rede
B0 Campo magnético aplicado
Bm Largura a meia altura do pico de difração mais intenso da amostra
Bs Largura a meia altura do pico de difração mais intenso do padrão de
silício
cfc Sistema cristalino cúbico de face centrada
d Orbital
d Camada densa de sílica
D Diâmetro de cristalito
Dc Diâmetro crítico
dhkl Distância interplanar
f Frequência
h, k, l Índices de Miller
Hc Coercividade
k Constante de forma
K Constante anisotrópica
kb Constante de Boltzmann
M Magnetização
m Camada mesoporosa de sílica
xxiv
ma Massa de amostra magnética
Mr Magnetização remanente
Ms Magnetização de saturação
Q+ Forma protonada da molécula de levofloxacina
Q± Forma zwiteriônica da molécula de levofloxacina
TB Temperatura de bloqueio
Tirr Temperatura de irreversibilidade
V Volume da esfera
xxv
LISTA DE ABREVIATURAS
A549 Células de câncer pulmonar
AMF Campo magnético alternado, do inglês Alterning Magnetic Field
APTEOS Aminopropiltrietoxissilano
ATCC American Type Culture Collection
BET Braunauer-Emmet-Teller
BHI Brain Heart Infusion
BJH Barret-Joyner-Halenda
CID Ciclos de impregnação e decomposição
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CPQBA Centro Pluridiscipilnar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
da Unicamp
CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio
DBM Dibenzoilmetanato
EDTA Ácido etilenodiamonotetraacético
EG Etilenoglicol
FC Field Cooling
FCM Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp
IB Instituto de Biologia da Unicamp
IFGW Instituto de Física Gleb Wataghin - Unicamp
IR Espectroscopia de absorção no infravermelho
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
JCPDS Joint Committe on Powder Diffaction Standards
LE Espectroscopia de luminescência
LEVO Levofloxacina
LMBT Laboratório de Materiais a Baixas Temperaturas do IFGW da Unicamp
LMEOA Laboratório Multiusuário de Espectroscopia Óptica Avançada do IQ da
Unicamp
LMF Laboratório de Materiais Funcionais do IQ da Unicamp
MCM Mobil Composition of Matter
xxvi
MCSP Suprapartículas magnéticas, do inglês Magnetic Colloidal Supraparticle
MH Ágar Müller-Hinton
MTT (3-brometo de [4,5-dimetil-2-tiazolil]-2,5-difenil-tetrazólio)
NG97 Células de câncer cerebral
NIH/3T3 Células de fibroblastos de rato
NP Nanopartículas
NPM Nanopartículas magnéticas
PANC-1 Células de câncer de pâncreas
PDMS polidimetilssiloxano
PEG polietilenoglicol
PGA Ácido poliglicólico
PVC Cloreto polivinílico
PVG Vidro poroso Vycor, do inglês Porous Vycor Glass
RM Ressonância magnética
RMI Ressonância magnética por imagem
RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium
SAR Taxa de Absorção Específica, do inglês Specific Absorption Rate
SEM Microscopia eletrônica de varredura, do inglês Scanning Electron
Microscopy
SFB Soro Fetal Bovino
SQUID Superconducting Quantum Interference Device
TEM Microscopia eletrônica de transmissão, do inglês Transmission Electron
Microscopy
TEOS Tetraetilortossilicato
TGA/DTA Análise termogravimétrica / Análise Térmica Diferencial
tta Tenoiltrifluoroacetonato
UFF Universal Field Force
UV-Vis Espectroscopia de absorção no UV-Vis
VSM Magnetometria de amostra vibrante, do inglês Vibrating Sample
Magnetometry
XRD Difratometria de raios X
ZFC Zero Field Cooling
xxvii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fórmula química, procedência e grau de pureza dos reagentes utilizados
neste trabalho. .......................................................................................................... 35
Tabela 2. Atribuições dos principais modos vibracionais observados para as amostras
Fe_Cl e Fe_NO3.87,89,90 ............................................................................................. 55
Tabela 3. Diferentes fases cristalinas de óxido de ferro e os respectivos modos
vibracionais observados no espectro Raman.91 ....................................................... 55
Tabela 4. Valores calculados do diâmetro médio das partículas do caroço de Fe3O4 e
recobertas com uma e duas camadas de sílica. Estimativa da espessura da casca
obtida em cada etapa de recobrimento. ................................................................... 69
Tabela 5. Valores de área superficial específica, diâmetro e volume de poros para as
amostras do caroço de magnetita e da plataforma. .................................................. 75
Tabela 6. Magnetização de saturação (Ms), magnetização remanente (Mr), coercividade
(Hc) e % de Fe3O4 das amostras do caroço e das amostras recobertas com sílica. 79
Tabela 7. Resultados obtidos das leituras dos halos de inibição gerados pelas amostras
de LEVO livre (L), da plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 sem a levo (P) e da
plataforma carregada com a LEVO Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO (PL), nos ensaio
realizado com ímã e com laser nas placas contendo S. aureus. Na última coluna são
apresentados os resultados obtidos na ausência do ímã e do laser (controle). ....... 93
Tabela 8. Resultados obtidos das leituras dos halos de inibição gerados pelas amostras
de LEVO livre (L), da plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 sem a levo (P) e da
plataforma carregada com a LEVO Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO (PL), nos ensaio
realizado com ímã e com laser nas placas contendo P. aeruginosa. Na última coluna
são apresentados os resultados obtidos na ausência do ímã e do laser (controle). 94
Tabela 9. Valores de tempo de vida obtidos para as amostras nas temperaturas de 20
°C – 60 °C. ............................................................................................................... 99
xxviii
xxix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática das NPM de Fe3O4@Au [Adaptado da referência
25] .............................................................................................................................. 5
Figura 2. (a) e (b) Micrografias TEM das amostras Fe3O4 e Fe3O4@ZrO2,
respectivamente, sintetizadas por Peng et al.26; (c) e (d) Comportamento da amostra
Fe3O4@ZrO2 na ausência e na presença de campo magnético, respectivamente.
[Retirado da referência 26].. ....................................................................................... 6
Figura 3. Micrografias SEM das amostras: (a) Fe3O4; (b) Fe3O4@SiO2; sintetizadas por
Wang et al.27 (c) e (d) Micrografias de TEM da amostra Fe3O4@SiO2.[Retirado da
referência 27] .............................................................................................................. 7
Figura 4. (a) Ilustração da metodologia de síntese das microesferas magnéticas ocas
de sílica. Micrografias SEM das amostras: (a) Dextrano; (b) Dextrano/Fe3O4; (c)
Fe3O4@SiO2. [Adaptado da referência 28] ................................................................. 8
Figura 5. Ilustração da estrutura do tipo espinélio inverso da magnetita, destacando os
sítios tetraédricos, ocupados por íons Fe(III), e octaédricos ocupados por íons Fe(II) e
Fe(III). [Adaptado da referência 29] 9
Figura 6. Curvas de magnetização em função do campo aplicado para um material: (a)
paramagnético; (b) ferromagnético e (c) superparamagnético. [Adaptado da referência
31] ............................................................................................................................ 11
Figura 7. Curva ZFC-FC de nanopartículas superparamagnéticas de ferritas de cobalto.
[Adaptado da referência 34]. .................................................................................... 13
Figura 8. Partículas de magnetita obtidas por Wang e Jiang45 a partir da síntese
solvotérmica variando-se a concentração de PEG: (a) 2 mmol L-1 e
(b) 6 mmol L-1.[Retirado da referência 45] ............................................................... 17
Figura 9. Micrografias SEM das amostras sintetizadas por Jean, et al.46 variando-se a
concentração do ferro(III): (a) e (b) [Fe3+] = 0,3 mmol L-1 e (c) e (d) [Fe3+] =
0,8 mmol L-1.[Retirado da referência 46]. ................................................................ 18
Figura 10. (a) e (b) Micrografias SEM das amostra de Fe3O4, obtidas a partir do nitrato
de ferro(IIII).[Retirado da referência 47] ................................................................... 19
Figura 11. Aplicações biomédicas das NPM.[Retiradoda referência 55] ................. 22
xxx
Figura 12. Molécula de levofloxacina utilizada na funcionalização da platafoagneto-
porosa para estudos de carregamento e liberação de fármacos. ............................. 25
Figura 13. Mecanismos de geração de calor em sistemas: (a) Ferro e ferrimagnéticos;
(b) Superparamagnéticos [Adaptado da referência 63]. .......................................... 26
Figura 14. Variação da SAR em função do diâmetro e da Hc de partículas de Fe3O4,
valores obtidos sob campo de 32,5 kA m-1 e freqüência de 80 kHz.[Retirado da
referência 68] ............................................................................................................ 28
Figura 15. Complexo diaquatris(tenoiltrifluoroacetonato)európio(III), utilizado nos
estudos de sensoriamento de temperatura. ............................................................. 31
Figura 16. (a) Equipamento de indução magnética; (b) Compartimento que contém a
amostra. Em destaque: (i) a bobina de 8 voltas; (ii) o porta-amostras de isopor e (iii) o
termômetro acoplado ao frasco contendo a amostra. .............................................. 42
Figura 17. Balança agitadora utilizada nos ensaios de liberação da LEVO. ............ 43
Figura 18. Esquema de montagem dos ensaios microbiológicos realizados na presença
de um campo magnético externo (ímã). ................................................................... 45
Figura 19. Esquema de montagem dos ensaios microbiológicos realizados na presença
de um campo eletromagnético externo (laser). ........................................................ 45
Figura 20. Difratograma de raios X da amostra Fe_Cl, destacando os planos de
difração e o padrão da magnetita (JCPDS 19-0629). ............................................... 49
Figura 21. Difratograma de raios X da amostra Fe_NO3 destacando as diferentes fases
presentes na amostra e os padrões utilizados na indexação. (Magnetita - JCPDS 19-
629; Hematita - JCPDS 33-664; Oxo-hidroxo acetato de ferro(III) hidratado - JCPDS 50-
290). ......................................................................................................................... 51
Figura 22. Espectros no infravermelho referente ao estiramento da ligação Fe-O nos
diferentes óxidos de ferro: hematita, magnetita e maguemita. [Adaptado da referência
86] ............................................................................................................................ 52
Figura 23. Espectro de absorção no infravermelho da amostra Fe_Cl. ................... 53
Figura 24. Espectros de absorção no infravermelho da amostra Fe_NO3. .............. 54
Figura 25. Interconversão entre as diferentes fases do óxido de ferro magnetita,
maguemita e hematita, destacando a: (a)Temperatura e (b) Equações químicas. .. 55
xxxi
Figura 26. Espectros Raman das amostras Fe_Cl com diferentes potências de laser e
da amostra Fe_NO3. ................................................................................................. 56
Figura 27. Curvas TGA/DTA das amostras: (a) Fe_Cl e (b) Fe_NO3. ..................... 58
Figura 28. (a), (b) e (c) Micrografias SEM da amostra Fe_Cl. ................................. 61
Figura 29. Histograma da distribuição do diâmetro dos nanogrãos e do diâmetro de
partícula para a amostra Fe_Cl. ............................................................................... 62
Figura 30. Ilustração do processo de formação das microesferas magnéticas obtidas a
partir do cloreto de ferro(III). [Adaptado da referência 45] ........................................ 63
Figura 31. (a) e (b) Micrografias SEM da amostra Fe_NO3. .................................... 63
Figura 32. Ilustração do procedimento de recobrimento das partículas de Fe3O4 com
sílica. ........................................................................................................................ 64
Figura 33. Difratogramas de raios X do Fe3O4 e das plataformas magneto-porosas.66
Figura 34. Espectros de absorção no infravermelho das amostras Fe3O4 e das
plataformas magneto-porosas.. ................................................................................ 66
Figura 35. Micrografias de SEM das amostras: (a) e (b) Fe3O4@dSiO2@1mSiO2; (c) e
(d) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. ..................................................................................... 68
Figura 36. Histogramas da distribuição da espessura da casca de sílica (esquerda), do
diâmetro do caroço de Fe3O4 (centro) e do diâmetro da partículas recobertas (esquerda)
para as amostras: (a) Fe3O4@dSiO2@1mSiO2; e (b) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. ...... 69
Figura 37. Classificação das isotermas de adsorção/dessorção segundo a IUPAC.10170
Figura 38. Isotermas de adsroção/dessorção de N2 das amostras: a) Fe3O4; b)
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 e c) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. (Regiões destacas nas
isotermas: 1 = microporos, 2 = força de tensão e 3 = porosidade secundária) ........ 72
Figura 39. Classificação dos ciclos de histerese em materiais mesoporosos segundo a
IUPAC.101.................................................................................................................. 73
Figura 40. Comportamento das partículas do caroço de Fe3O4 suspensas em água
deionizada: (a) Na ausência do campo magnético; (b) Na presença do campo
magnético. ................................................................................................................ 76
Figura 41. (a) Curvas de magnetização das amostras Fe3O4, Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 e
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, obtidas à temperatura ambiente; (b) Ampliação das curvas de
magnetização para observação dos ciclos de histerese. ........................................... 77
xxxii
Figura 42. Curvas ZFC-FC para a amostra (a) Fe3O4 e (b) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2,
com campo aplicado igual a 50 Oe. ......................................................................... 81
Figura 43. Curva de magnetização das amostras Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
medidas a 5 K. .......................................................................................................... 83
Figura 44. Curvas de variação da temperatura em função do tempo das amostras: (a)
Fe3O4 e (b) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. ....................................................................... 85
Figura 45. Curvas de SAR em função do campo para as amostras: (a) Fe3O4 e (b)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. .......................................................................................... 86
Figura 46. a) Espectros de excitação das amostras Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO e
LEVO pura; em destaque o espectro de excitação da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2; (b) Espectros de emissão das amostras
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO e LEVO pura; em destaque o espectro de emissão da
amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. ........................................................................... 89
Figura 47. Curva de liberação da LEVO em água obtida à temperatura ambiente. . 90
Figura 48. Halos de inibição de crescimento da bactéria S. aureus nos ensaios
realizados: (a) na presença do campo magnético constante (ímã); (b) na presença do
laser e (c) controle, obtido na ausência do ímã e do laser (d). Identificação das
amostras: LEVO = levofloxacina pura, P = Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 e P_LEVO =
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO................................................................................ 92
Figura 49. Halos de inibição de crescimento da bactéria P. aeruginosa nos ensaios
realizados: (a) na presença do campo magnético constante (ímã); (b) na presença do
laser e (c) controle, obtido na ausência do ímã e do laser. Identificação das amostras:
LEVO = levofloxacina pura, P = Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 e P_LEVO =
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO................................................................................ 93
Figura 50. Espectros: (a) excitação (λλλλem = 611 nm); (b) emissão (λλλλexc = 367 nm), do
complexo Eutta. ........................................................................................................ 95
Figura 51. Espectros da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta, antes do e após
aquecimento a 60 °C: (a) excitação (λem = 615 nm) e (b) emissão (λexc = 340 nm) . 96
Figura 52. (a) Curvas de decaimento radiativo da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta em diferentes temperaturas; (b) Variação do tempo de
vida do nível 5D0 com a temperatura. ....................................................................... 98
xxxiii
Figura 53. Espectro da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta: excitação (λλλλem =
615 nm) e (b) (λλλλ exc = 346 nm). *Sinal referente a harmônico. ............................ 100
Figura 54. (a) Curvas de decaimento radiativo da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta; (b) Variação do tempo de vida da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta com a temperatura. ....................................... 101
Figura 55. Resultados obtidos dos ensaios de citotoxicidade por MTT, das amostras
Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 para células NIH/3T3. ........................................ 102
Figura 56. Resultados obtidos dos ensaios de citotoxicidade por MTT, das amostras
Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 para diferentes culturas de células: (a) A549; (b) NG97
e (c) PANC-1. ......................................................................................................... 103
xxxiv
1
Capítulo 1
INTRODUÇÃO
A concepção da utilização dos materiais em escala nanométrica e suas
propriedades na construção de sistemas miniaturizados inseriu uma nova variável
dentro da Química do Estado Sólido: o efeito de confinamento quântico por tamanho,
ou seja, abaixo de um raio crítico as propriedades de um determinado material podem
se tornar dependentes do tamanho1. Desde então, surgem duas novas importantes
variáveis dentro da Química dos Materiais que são: a morfologia e a estruturação
hierárquica. Desta forma, os projetos de pesquisa desenvolvidos no Laboratório de
Materiais Funcionais (LMF) da UNICAMP, baseiam-se na investigação da relação entre
o tamanho, a morfologia e a estruturação hierárquica com as diferentes propriedades
apresentadas pelos materiais obtidos.
Com relação ao controle da morfologia e tamanho de nanopartículas, o LMF
desenvolveu uma metodologia baseada em ciclos de impregnação-decomposição (CID)
de compostos metalorgânicos em matrizes vítreas porosas, que leva a formação de
nanopartículas in situ confinadas nos poros da matriz. Diferentes sistemas contendo
nanopartículas de óxidos semicondutores, como TiO2, CeO2, MoO3, WO3 e ZnO em
matrizes do tipo PVG (vidro poroso Vycor, do inglês Porous Vycor Glass) foram
estudados mostrando que o confinamento das nanopartículas permite o controle do
tamanho e, consequentemente, a modulação de suas propriedades2,3,4,5. As principais
técnicas utilizadas na caracterização desses materiais foram a espectroscopia na região
do UV-Vis e Raman.
Os estudos das estruturas caroço@casca surgiram dos resultados dos trabalhos
apresentados acima que mostraram que a metodologia proposta poderia levar a
formação de estruturas multicomponentes a partir da alternância dos compostos
metalorgânicos nos CID. Neste contexto, diferentes sistemas multicomponentes do tipo
caroço@casca de óxidos semicondutores em matrizes vítreas foram investigados6,7,8.
2
Sistemas químicos magnéticos baseados em óxidos de ferro e níquel também
foram obtidos a partir da mesma metodologia. No caso da maguemita, γ-Fe2O3, o
confinamento das partículas magnéticas nos poros da matriz vítrea possibilitou a
obtenção de nanopartículas superparamagnéticas seguindo um modelo bem
estabelecido para partículas que não exibem interação inter-partícula9.
Neste contexto, este trabalho propõe a síntese e caracterização de uma
nanoestrutura caroço@casca magnética, tendo a magnetita como caroço e a sílica
mesoporosa como casca. A escolha da propriedade magnética surge da proposta de se
construir uma partícula multifuncional que possa atuar na liberação de fármacos, gerar
calor por hipertermia magnética e, além disso, ser capaz de quantificar o calor liberado
in situ, atuando como sonda de temperatura.
Assim, inicialmente nesta introdução serão apresentados diferentes sistemas
magnéticos caroço@casca e suas potencialidades de aplicações. Em seguida serão
discutidas as propriedades da magnetita nanoestruturada que justificam a escolha desta
fase para a constituição do caroço da plataforma magneto-porosa proposta nesta Tese.
Diferentes metodologias de síntese são descritas na literatura para a síntese de
magnetita nanoestruturada. A síntese solvotérmica recebe destaque uma vez que foi a
metodologia utilizada neste trabalho. A obtenção dos sistemas caroço@casca é
descrita a partir da metodologia sol-gel que envolve a hidrólise-condensação de um
precursor alcóxido para formação da casca de sílica.
Dentre as diversas aplicações encontradas para os sistemas magnéticos do tipo
magnetita-sílica, esta introdução contempla àquelas estudadas para o sistema
proposto: liberação de fármacos, hipertermia magnética e sonda óptica de temperatura.
Os demais capítulos apresentam os objetivos deste trabalho (Capítulo 2), as
metodologias adotadas na síntese e funcionalização da plataforma magneto-porosa
(Capítulo 3), a discussão dos resultados (Capítulo 4) e as considerações finais e
perspectivas (Capítulo 5).
3
1.1. Sistemas magnéticos multicomponentes
No início da década de 80 do século passado, alguns trabalhos de pesquisas em
semicondutores mostraram que partículas multicomponentes e/ou compósitos
apresentavam melhora na eficiência do material quando comparadas às
correspondentes partículas únicas e, em alguns casos, diferentes propriedades surgiam
dessa nova estruturação10,11,12. Já na década de 90, pesquisadores sintetizaram
semicondutores organizados em multicamadas concêntricas com o objetivo de melhorar
suas propriedades. Tais materiais receberam a terminologia caroço@casca (do inglês,
core@shell)12,13,14,15. Devido à demanda da tecnologia moderna, existe um aumento
gradual no número de trabalhos envolvendo estruturas multicomponentes e,
simultaneamente a este crescimento, o avanço nas técnicas de caracterização tem
auxiliado na investigação e no desenvolvimento de diferentes estruturas caroço@casca.
Uma grande vantagem das estruturas caroço@casca é que sua síntese pode ser
planejada de acordo com a aplicação que se busca para o material final. A estrutura, o
tamanho e a composição dessas partículas podem ser direcionados hierarquicamente
durante o procedimento de síntese resultando em sistemas que podem apresentar
propriedades magnéticas, ópticas, catalíticas ou biológicas16 e, sobretudo, uma
combinação de duas ou mais propriedades. Devido a sua versatilidade, as
nanoestruturas caroço@casca representam uma classe de materiais de fronteira entre
a química e as diferentes áreas em que encontram aplicações, com destaque para
aquelas em biomedicina, farmácia, catálise, fotoluminescência, dentre outras17. A
literatura descreve também outra importante aplicação das estruturas caroço@casca
como precursores na síntese de partículas ocas, a partir da remoção do caroço por
dissolução ou calcinação18,19,20,21.
Na grande maioria dos sistemas multicomponentes baseados em nanoestruturas
do tipo caroço@casca, o caroço apresenta uma propriedade relevante (semicondutora,
metálica, magnética) enquanto que a casca pode servir para estabilizar o caroço, criar
compatibilidade entre o caroço e o meio em que a partícula será empregada, por
exemplo, biocompatibilidade em sistemas biológicos, ou ainda modificar a carga
superficial, funcionalidade ou reatividade da nanoestrutura22. A construção desses
4
sistemas pode acontecer em uma única etapa ou, mais comumente, a partir da
modificação da superfície das partículas do caroço previamente sintetizado. A
modificação da superfície do caroço para formação da casca pode acontecer através de
reações químicas, adsorção de moléculas ou pequenas partículas ou ainda por
processos de auto-organização (self-assembly) e ligações cruzadas (crosslinking) de
macromoléculas23.
Nanopartículas (NP) de magnetita (Fe3O4) e maguemita (γ-Fe2O3) têm sido
largamente utilizadas como caroço na construção de sistemas magnéticos
multicomponentes do tipo caroço@casca. A combinação entre um caroço e uma casca,
sendo um deles magnético, confere multifuncionalidade à partícula obtida. Enquanto
sistemas monofuncionais provêm uma simples função – um quantum dot pode exibir
alta fluorescência, mas não pode ser removido de uma matriz por ação de um campo
magnético – sistemas multifuncionais são capazes de reunir diferentes propriedades em
uma única partícula, surgindo deste comportamento novas potencialidades de aplicação
na área biomédica como carregadores de fármacos, agentes de contraste em imagens
por ressonância magnética nuclear, hipertermia, biosseparação e biodetecção22,23,24.
Para os sistemas caroço@casca magnéticos, o recobrimento das partículas
magnéticas é uma estratégia adotada para proteger a sua superfície de reações de
oxidação e biodegradação e impedir a agregação das partículas, preservando assim
suas propriedades magnéticas. Dependendo da aplicação que se busca para o sistema,
o recobrimento pode ser constituído por moléculas orgânicas, como polímeros e
biomoléculas, ou por camadas inorgânicas de sílica, metais, óxidos ou sulfetos
metálicos22.
Nanopartículas magnéticas (NPM) recobertas com uma casca metálica podem
ser encontradas no trabalho de Wang et al.25 que relata a síntese do sistema
Fe3O4@Au. A multifuncionalidade da nanoestrutura é conferida pela casca de ouro
associada ao caroço magnético. A cobertura de Au confere estabilidade às NP do
caroço contra oxidação em condições biológicas além de atuar como uma superfície
atrativa para posterior funcionalização com biomoléculas. Tais características
associadas às propriedades plasmônicas do Au em nanoescala torna o sistema
Fe3O4@Au extremamente interessante para aplicações magnéticas, ópticas e
5
biomédicas. As NP do caroço e a casca de Au metálico foram obtidos a partir da
decomposição térmica do acetilacetonato de ferro(III) e do acetato de ouro(III),
respectivamente, na presença de ácido oleico e oleilamina. A decomposição ocorre sob
refluxo tendo como solvente um poliol que atua também como agente redutor. Uma
imagem de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e a ilustração esquemática da
NP Fe3O4@Au é mostrada na Figura 1.
Figura 1. Representação esquemática das NPM de Fe3O4@Au [Adaptado da referência
25].
No trabalho desenvolvido por Peng et al.26, a síntese sonoquímica foi utilizada
para a formação da casca no sistema Fe3O4@ZrO2, desenvolvido para aplicação como
biossensor na absorção de mioglobina. As NP de Fe3O4 foram inicialmente obtidas pelo
método da coprecipitação. Os dados de TEM, apresentados na Figura 2(a), revelam
que as NP de Fe3O4 foram obtidas na forma esférica com diâmetro entre 6-10 nm. Após
o recobrimento com ZrO2, Figura 2(b), a morfologia é mantida e observa-se um
aumento de tamanho para 40-50 nm. A espessura da casca de ZrO2 determinada foi de
∼ 19 nm. As Figuras 2(c) e 2(d) mostram o comportamento das NPM na ausência e na
presença de um campo magnético externo, respectivamente.
Fe3O4
Au
Oleilamina
6
Figura 2. (a) e (b) Micrografias TEM das amostras Fe3O4 e Fe3O4@ZrO2,
respectivamente, sintetizadas por Peng et al.26; (c) e (d) Comportamento da amostra
Fe3O4@ZrO2 na ausência e na presença de campo magnético, respectivamente.
[Retirado da referência 26]
Wang et al.27, descreveram a síntese de um sistema caroço@casca para
detecção, adsorção e remoção de íons mercúrio de soluções aquosas. O caroço é
constituído por NP de Fe3O4 de 10 nm e, após a deposição da sílica, as partículas
atingem diâmetro entre 50 e 60 nm. As partículas foram funcionalizadas com rodamina
B para atuar como uma sonda seletiva e sensível de íons Hg(II) (limite de detecção de
10 ppb). A propriedade magnética do caroço facilita a remoção das partículas após
adsorção do Hg(II) por aplicação de um campo magnético externo. Desta forma, as
microesferas combinam as funções dos três componentes: molécula orgânica, casca
mesoporosa e caroço magnético. A síntese do caroço foi realizada através do processo
poliol e a formação da casca de sílica porosa ocorreu através da hidrólise-condensação
do tetraetilortossilicato (TEOS). As micrografias de microscopia eletrônica de varredura
(SEM) das amostras do caroço e do sistema multicamadas são apresentadas na Figura
3.
(a) (b) (c) (d)
7
Figura 3. Micrografias SEM das amostras: (a) Fe3O4; (b) Fe3O4@SiO2, sintetizadas por
Wang et al.27 (c) e (d) Micrografias de TEM da amostra Fe3O4@SiO2. [Retirado da
referência 27]
Um trabalho que ilustra claramente o processo de síntese de partículas
multicomponentes hierarquicamente organizadas foi desenvolvido por Grumezescu et
al.28. Os autores descrevem a síntese de microesferas magnéticas ocas de sílica.
Inicialmente as NPM de Fe3O4 foram obtidas a partir do método da coprecipitação na
presença de microesferas de dextrano comercial (Fluka, diâmetro de partícula de ~50
µm). O sistema dextrano@Fe3O4 foi recoberto com uma casca de sílica que foi obtida a
partir do silicato de sódio. Após o tratamento térmico da amostra para remoção do
caroço de dextrano, foram obtidas esferas magnéticas ocas de sílica conforme
procedimento ilustrado na Figura 4(a). As Figuras 4(b-d) apresentam as micrografias de
SEM das partículas de dextrano, dextrano@Fe3O4 e Fe3O4@SiO2, respectivamente. As
propriedades de carregador de fármacos do material foram exploradas a partir da
investigação da atividade antimicrobiana de diferentes antibióticos utilizados no
carregamento das partículas.
8
Figura 4. (a) Ilustração da metodologia de síntese das microesferas magnéticas ocas
de sílica. Micrografias SEM das amostras: (a) Dextrano; (b) Dextrano/Fe3O4; (c)
Fe3O4@SiO2. [Adaptado da referência 28]
Os diferentes sistemas citados acima apresentam multifuncionalidade decorrente
do comportamento magnético do caroço de magnetita utilizado na construção das
estruturas caroço@casca. As nano e microesferas de magnetita, assim como de
maguemita, apresentam propriedades superparamagnéticas que justificam os inúmeros
trabalhos descritos na literatura envolvendo sua síntese, caracterização e utilização na
construção de sistemas multicomponentes para diferentes aplicações. Essa
propriedade magnética será apresentada para a magnetita uma vez que foi este o
caroço proposto para a obtenção dos sistemas multicomponentes desenvolvidos nesta
Tese.
1.2. O comportamento magnético das NPM de Magnetita
A magnetita é uma ferrita constituída por íons Fe(III) e Fe(II). Sua fórmula
química é FeO·Fe2O3, mas usualmente escrita como Fe3O4.
Como representado na Figura 5, a magnetita apresenta uma estrutura cristalina
cúbica do tipo espinélio inverso, formada por sítios tetraédricos, ocupados por íons
Fe(III), e sítios octaédricos ocupados por íons Fe(II) e Fe(III).
(a)
(c)
(b) (b) (c) (d)
dextrano dextrano@Fe3O4 dextrano@Fe3O4@SiO2 Fe3O4@SiO2
9
A estrutura cúbica do tipo espinélio é constituída por oito células unitárias AB2O4,
onde A representa os sítios tetraédricos e B os sítios octaédricos. No total existem trinta
e dois íons oxigênio em arranjo cúbico de face centrada (cfc), disponibilizando oito sítios
tetraédricos e 16 sítios octaédricos. A magnetita é denominada espinélio inverso, pois,
ao contrário do que ocorre na estrutura de espinélio normal (por exemplo MgAl2O4), os
sítios tetraédricos são ocupados por íons Fe(III), que ocupam também metade dos
sítios octaédricos, enquanto a outra metade é ocupada por íons Fe(II).
aa
a
Sítio Tetraédrico - Fe(III)
Sítio Octaédrico – Fe(II) e Fe(III)
Oxigênio
Figura 5. Ilustração da estrutura do tipo espinélio inverso da magnetita, destacando os
sítios tetraédricos, ocupados por íons Fe(III), e octaédricos ocupados por íons Fe(II) e
Fe(III). [Adaptado da referência 29]
O fato de muitos espinélios de metal d apresentarem estrutura do tipo espinélio
inverso tem sido relacionado ao efeito das energias de estabilização do campo ligante
no sítio de preferência dos íons. O fator de ocupação ( λFO) de um espinélio é definido
como a fração de átomos X nos sítios tetraédricos. Assim, λFO = 0 para um espinélio
normal e λFO = 0,5 para um espinélio inverso, XYXO4. De acordo com a literatura,
quando os íons X e Y são d0, a estrutura normal é preferida (λFO = 0), conforme previsto
com base em considerações eletrostáticas. Quando o íon Y(II) é d6, d7, d8 ou d9 e o íon
X(III) é o Fe(III), geralmente tem-se a estrutura invertida (λFO = 0,5). Esta preferência
pode ser relacionada a energia de estabilização do campo ligante nesta condição ser
nula para os íons Fe(III) d5 (spin alto) nos sítios octaédricos e tetraédricos e à
estabilização dos outros íons dn no sítio octaédrico30.
10
Na magnetita os íons ferro dos diferentes sítios apresentam momentos de dipolo
permanentes que interagem entre si, causando alinhamento antiparalelo dos spins.
Apesar do alinhamento antiparalelo, os momentos dipolares não se anulam uma vez
que são originados de sítios diferentes apresentando, portanto, módulos diferentes. Na
presença de um campo magnético externo, os momentos dipolares resultantes alinham-
se na direção e sentido de campo, resultando em valores elevados e positivos de
susceptibilidade magnética. Essas propriedades são comuns em materiais
ferrimagnéticos.
A resposta dos materiais sob ação de um campo magnético externo pode ser de
origem atrativa ou repulsiva. A natureza dessas forças pode ser descrita em termos da
formação de dipolos magnéticos (como barras magnéticas que possuem pólos
opostos). Os materiais que, na ausência de um campo externo, não possuem dipolos
magnéticos, são ditos diamagnéticos. A magnetização de um material diamagnético
ocorre em direção oposta à do campo aplicado, resultando assim numa força repulsiva
fraca. São exemplos de materiais diamagnéticos a água e a maioria dos polímeros
orgânicos. Os materiais paramagnéticos apresentam dipolos magnéticos orientados
aleatoriamente que, na presença de um campo magnético externo, alinham-se na
direção do campo. A susceptibilidade magnética dos paramagnetos diminui com o
aumento da temperatura, como previsto pela lei de Curie. A curva de magnetização de
um material paramagnético é apresentada na Figura 6(a). Dentre os materiais
paramagnéticos encontram-se os metais alcalinos, alcalinos-terrosos e de transição,
como a platina31.
Tanto para um material ferrimagnético quanto para um material ferromagnético,
os dipolos magnéticos existem mesmo na ausência de um campo magnético externo e
exercem um efeito de longo alcance, exibindo um momento magnético permanente. Na
curva de magnetização típica desses materiais (Figura 6(b)), a magnetização encontra-
se sempre defasada do campo magnético aplicado, o que origina um ciclo de histerese,
devido à presença de domínios magnéticos no material. O que classifica um material
como ferro ou ferrimagnético é a origem dos momentos magnéticos permanentes
existentes no material. Nos materiais ferromagnéticos o alinhamento dos momentos
magnéticos atômicos acontece paralelamente enquanto que, nos materiais
11
ferrimagnéticos, este alinhamento é anti-paralelo, porém não nulo. Da curva de
magnetização dos ferro ou ferrimagnetos é possível obter os valores de magnetização
de saturação (Ms), caracterizado como o máximo da magnetização (M), a magnetização
remanente (Mr), atribuída a magnetização residual na ausência de campo, a
coercividade Hc, que representa o valor do campo externo necessário para
desmagnetizar o material (M = 0). Fe, Co e Ni são exemplos de ferromagnetos,
enquanto os óxidos de ferro Fe3O4 e γ-Fe2O3 e as ferritas de Co, Ni e Mn são materiais
ferrimagnéticos32.
Figura 6. Curvas de magnetização em função do campo aplicado para um material: (a)
paramagnético; (b) ferromagnético e (c) superparamagnético. [Adaptado da referência
31]
As propriedades magnéticas das NP ferromagnéticas tornam-se dependentes do
tamanho quando o diâmetro das partículas é da ordem de 20 nm. Este diâmetro é
denominado diâmetro crítico (Dc) e, nesta escala de tamanho, cada uma das NPM
(a)
(b)
(c)
12
comporta-se como um monodomínio magnético. Em um modelo ideal de monodomínios
todos os spins atômicos são paralelos. Logo, as NPM reais são mais complexas e a
interpretação das suas propriedades magnéticas deve considerar diferentes aspectos
relacionados com o tamanho reduzido das partículas. Os spins atômicos localizados na
superfície das partículas apresentam um comportamento diferente daqueles que se
encontram no seu interior (bulk) com relação ao momento magnético, anisotropia e/ou
inclinação (spin canting). Desta forma, ainda que seja considerada um monodomínio,
dentro de uma única partícula são encontrados comportamentos magnéticos diferentes
para os spins que irão refletir na resposta final do material32.
Por suas peculiaridades com relação ao comportamento magnético, as NPM que
se enquadram no regime de monodomínio são classificadas como
superparamagnéticas. Isso acontece porque abaixo de Dc, o material passa a ter
comportamento paramagnético, ou seja, sua magnetização aumenta com o aumento do
campo externo aplicado e, reduz-se a zero na ausência do campo. Este fenômeno pode
ser compreendido considerando-se que, não existindo interação entre os momentos
magnéticos individuais de cada partícula monodomínio, para partículas menores que
Dc, o momento magnético torna-se muito influenciado pela agitação térmica que afeta
diretamente o tempo de relaxação dos momentos magnéticos presentes32. Nesta escala
de tamanho, as partículas superparamagnéticas podem ser saturadas (Ms) sob
aplicação de um campo externo, mas na ausência do campo (H = 0), seus momentos
magnéticos são distribuídos aleatoriamente até M = 0 pela agitação térmica do sistema.
Sendo assim, a curva de magnetização característica de nanopartículas
superparamagnéticas não apresenta histerese, pode-se determinar uma magnetização
de saturação (Ms) e a energia coerciva do sistema é igual a zero (Hc = 0). A Figura 6(c)
ilustra uma curva de magnetização típica de um material superparamagnético31.
Logo, a curva de magnetização em função do campo aplicado é rica em
informações sobre o comportamento magnético dos materiais e pode ser obtida a partir
da análise da amostra por uma técnica denominada magnetometria de amostra vibrante
(VSM, do inglês Vibrating Sample Magnetometry). Uma técnica complementar utilizada
na investigação de compostos superparamagnéticos é a obtenção da curva ZFC-FC (do
inglês, Zero Field Cooling – Field Cooling) (Figura 7) em um equipamento do tipo
13
SQUID (do inglês, Superconducting Quantum Interference Device). Em uma primeira
etapa, ZFC, a amostra é resfriada a uma determinada temperatura na ausência de
campo externo, em seguida um pequeno campo é aplicado e a magnetização é medida.
O campo aplicado é mantido constante durante todo o restante da medida. A segunda
etapa consiste em aumentar a temperatura em pequenos intervalos e medir a
magnetização. Depois de atingida uma determinada temperatura inicia-se a segunda
etapa, FC, que consiste no resfriamento do sistema até a temperatura inicial, medindo-
se a magnetização.
Figura 7. Curva ZFC-FC de nanopartículas superparamagnéticas de ferritas de cobalto.
[Adaptado da referência 33]
Das curvas ZFC-FC (Figura 7) é possível extrair a temperatura de bloqueio (TB)
da amostra. Abaixo da TB as partículas são ferromagnéticas ou ferrimagnéticas e
apresentam comportamento irreversível caracterizado por coercividade e remanência,
enquanto que acima da TB o comportamento é reversível. O ponto onde as duas curvas
se separam é o início da irreversibilidade do sistema. Acima da temperatura de
irreversibilidade (Tirr) as partículas encontram-se desbloqueadas, ou seja, em regime
superparamagnético34.
Ma
gn
eti
zaçã
o (
Ma
gn
eti
zaçã
o (
Ma
gn
eti
zaçã
o (
Ma
gn
eti
zaçã
o (
em
ue
mu
em
ue
mu
gg gg-- -- 11 11
)) ))
Temperatura (K)Temperatura (K)Temperatura (K)Temperatura (K)
TB
Tirr
14
As propriedades magnéticas das NPM como a elevada Ms e Hc = 0, aliadas a
baixa toxicidade e elevada estabilidade química em meio fisiológico, permitem que elas
sejam utilizadas em diferentes aplicações biomédicas, pertencentes a um ou mais dos
grupos citados a seguir: (i) como agentes de contraste na obtenção de imagens por
ressonância magnética; (ii) como agentes de hipertermia, onde as partículas
magnéticas são aquecidas pela aplicação de um campo magnético de alta frequência;
(iii) como vetores magnéticos que podem ser conduzidos a um alvo específico a partir
da aplicação de campo externo atuando em um mecanismo de carregamento-liberação
do fármaco e, (iv) como agentes de separação magnética em procedimentos de catálise
e biosseparação35.
Uma aplicação biomédica para as NPM de Fe3O4 pode ser encontrada no
trabalho de Xiao et al.36 que investigaram a sua utilização em ensaios de imageamento
por ressonância magnética. Neste trabalho foram obtidas NPM de Fe3O4 de 5 nm, com
Ms igual a 47 emu g-1. As NPMs foram obtidas por síntese hidrotérmica e recobertas
com vitamina C. Ensaios de citotoxicidade com células humanas confirmaram a não
toxicidade das partículas.
Shao et al.37 reportaram uma rota sintética para o preparo de uma matriz
magnética baseada em NPM de Fe3O4 recobertas com sílica e hidróxido de alumínio.
As NPM de Fe3O4 foram obtidas via síntese solvotérmica e o diâmetro das partículas foi
estimado em 300 nm. A Ms observada para a magnetita foi igual a 80,7 emu g-1.
É interessante verificar nos dois sistemas citados acima os valores de MS para a
magnetita. No trabalho de Xiao et al.36, foi observada uma Ms de 47 emu g-1, para
partículas da ordem de 5 nm. Shao et al.37 encontraram Ms = 80,7 emu g-1, para
partículas da ordem de 300 nm. O valor de Ms observado no último trabalho citado37
encontra-se muito próximo do valor esperado para a magnetita bulk que é de
90 emu g-1 38. Este comportamento é decorrente principalmente dos efeitos de
superfície que afetam as propriedades magnéticas das NP diminuindo a Ms, como
discutido anteriormente, sendo mais pronunciados nas partículas de 5 nm.
Desta forma, é possível verificar que existe um compromisso entre o diâmetro da
partícula e sua resposta magnética. Sendo assim essas propriedades podem ser
moduladas durante o procedimento de síntese dependendo da aplicação que se busca
15
para o material. No nosso trabalho, como a proposta é a investigação do sistema no
carreamento de fármacos e geração de calor para o tratamento de doenças, mais
importante do que o tamanho reduzido da NPM, o ideal é que o material apresente
elevada Ms, considerando que após o recobrimento com a sílica, a Ms tende a diminuir
devido a menor porcentagem de magnetita na amostra. Assim, a obtenção de
microesferas de Fe3O4 com elevada Ms surgiu como primeiro desafio do projeto.
1.3. Síntese de partículas magnéticas nanoestruturadas
Com o objetivo de aumentar a resposta magnética do material de uma maneira
controlada e preservando suas características superparamagnéticas, na literatura têm-
se desenvolvido metodologias que levam a auto-organização (self-assembly) das NPM
gerando sistemas submicrométricos (entre 100 e 1000 nm). Desta auto-organização
surgem as partículas magnéticas nanoestruturadas, ou seja, formadas por um conjunto
de nanopartículas (ou nanogrãos) gerando uma estrutura secundária denominada na
literatura de partículas magnéticas submicrométricas, ou suprapartículas magnéticas
(MCSP, do inglês Magnetic Colloidal Supraparticles)35. Para os sistemas construídos a
partir das MCSP, observa-se que as propriedades superparamagnéticas das NPM
individuais são conservadas, porém, com uma maior Ms.
Diferentes estratégias podem ser utilizadas na obtenção das MCSP. A síntese
pode acontecer em duas etapas como no método da evaporação induzida ou, em uma
única etapa, como a partir da síntese solvotérmica.
1.3.1. Método da auto-organização induzida por evaporação
Os primeiros resultados desta metodologia foram relatados em 1993 por
Bibette39. Montagme et al.40 também publicaram importantes resultados neste período
inicial das pesquisas relacionadas à auto-organização induzida por evaporação41,42. O
procedimento clássico de preparação pode ser descrito pelas seguintes etapas: (i)
obtenção de um ferrofluido, ou seja, uma dispersão estável de NPM em um solvente
orgânico; (ii) a partir do ferrofluido, gerar gotas magnéticas submicrométricas a partir da
mistura com um surfactante e (iii) evaporação do solvente37-40.
16
1.3.2. Síntese solvotérmica
Para o nosso trabalho foi escolhida a síntese solvotérmica para a obtenção das
partículas magnéticas. A síntese solvotérmica baseia-se nos mesmos princípios da
síntese hidrotérmica e pode ser definida como uma reação química heterogênea que
ocorre na presença de um solvente (aquoso ou não aquoso) em um sistema fechado
(autoclave), sob pressão e temperatura elevadas.
As principais características dos materiais magnéticos obtidos por esta
metodologia incluem: (i) excelente resposta magnética, permitindo sua condução por
campos magnéticos externos; (ii) controle do tamanho da partícula na escala
submicrométrica e (iii) baixo custo da síntese e elevados rendimentos, viabilizando sua
produção em larga escala35.
O primeiro trabalho na literatura sobre a síntese solvotérmica de MCSP foi
descrito por Deng et al.43. Para a síntese utilizou-se como reagentes o cloreto de
ferro(III) hexahidratado, acetato de sódio, polietilenoglicol (PEG) e etilenoglicol (EG)
como solvente-agente redutor. Em um procedimento clássico, a mistura contendo os
reagentes é agitada em temperatura ambiente por 30 min e após este tempo é mantida
em autoclave a 200 °C, por períodos de 8 a 72 h. Neste trabalho foram obtidas
partículas esféricas de magnetita com 200 nm de diâmetro e magnetização de
saturação igual a 81,9 emu g-1.
O EG é um dos solventes orgânicos mais utilizados na síntese solvotérmica por
apresentar elevada constante dielétrica, sendo capaz de dissolver diferentes compostos
inorgânicos, elevado ponto de ebulição, auxiliando assim na obtenção de óxidos em
fases cristalinas puras e a propriedade de se oxidar a temperaturas elevadas. Para o
controle morfológico das partículas os agentes mais utilizados são o acetato de sódio,
que atua na estabilização eletrostática das partículas, e o PEG, que estabiliza as
partículas por efeito estérico43.
A síntese solvotérmica representa uma metodologia versátil que permite modular
as propriedades químicas e morfológicas das partículas considerando que a partir da
alteração dos reagentes ou de parâmetros de reação, como temperatura e tempo de
17
autoclave, o que justifica o elevado número de trabalhos na literatura envolvendo esta
metodologia.
No trabalho de Li et al.44, a síntese de microesferas ocas de magnetita foi
alcançada utilizando-se uma mistura de acetato de sódio e acetato de amônio. A
explicação para a obtenção de esferas ocas consiste no fato de que durante o
tratamento solvotérmico o acetato de amônio gera ácido acético e amônia gasosa. A
eliminação da amônia gasosa seria a responsável pela obtenção da estrutura oca. A
estrutura oca favorece o carreamento de fármacos. A posterior utilização do ácido
poliglicólico (PGA) na síntese contendo acetato de amônio levou a formação de um
sistema mesoporoso devido aos canais criados no polímero provocado pela eliminação
do gás amônia. A área superficial e o diâmetro de poro podem ser controlados pela
concentração de PGA.
Wang e Jiang45 investigaram a influência da concentração de PEG no diâmetro
das partículas de Fe3O4 obtidas a partir da síntese solvotérmica. Os resultados obtidos
mostraram que o diâmetro das partículas é proporcional a concentração de PEG
utilizado na síntese. Para uma concentração de PEG igual a 2 mmol L-1 foram obtidas
NPM de Fe3O4 de 8 nm. Mantendo-se todas as condições de síntese, elevou-se a
concentração para 6 mmol L-1 de PEG. Para esta concentração, as NPM se agregaram
dando origem a MCSP com diâmetro da ordem de 200 nm e Ms = 56,4 emu g-1. A
Figura 8 contém imagens de TEM que ilustram as partículas obtidas.
.
Figura 8. Partículas de magnetita obtidas por Wang e Jiang45 a partir da síntese
solvotérmica variando-se a concentração de PEG: (a) 2 mmol L-1 e (b) 6 mmol L-1.
[Retirado da referência 45]
(a) (b)
18
Jean et al.46 estudaram a influência da concentração de Fe(III) na morfologia e
diâmetro das partículas de magnetita obtidas por síntese solvotérmica. Quando a
concentração de Fe(III) está entre 0,1 – 0,3 mol L-1 são obtidas microesferas
policristalinas nanoestruturadas que surgem da aglomeração de nanopartículas.
Quando a concentração de ferro é igual a 0,8 mol L-1 ou maior, são obtidas esferas
compactas de diâmetro entre 100 – 250 nm. As micrografias de SEM das amostras
variando-se a concentração de ferro são mostradas na Figura 9.
Figura 9. Micrografias SEM das amostras sintetizadas por Jean, et. al.46 variando-se a
concentração do ferro(III): (a) e (b) [Fe3+] = 0,3 mmol L-1 e (c) e (d) [Fe3+] = 0,8 mmol L-1.
[Retirado da referência 46]
Ou et al.47 realizaram a síntese solvotérmica utilizando o nitrato de ferro(III) como
precursor. Neste caso eles estudaram a cristalinidade da magnetita obtida para 24 h de
reação. Observou-se uma maior cristalinidade para as partículas obtidas a temperaturas
mais elevadas (265 °C). Foram obtidas partículas da ordem de 50 nm que, como
mostrado na Figura 10, aparecem aglomeradas. A magnetização de saturação foi em
torno de 60 emu g-1. É interessante notar neste trabalho como o mecanismo de
formação das partículas é afetado pela mudança do contra-íon no precursor de ferro.
(a) (b)
(c) (d)
19
Neste caso as partículas são impedidas de se auto-organizarem, levando a formação
de NP aglomeradas.
Figura 10. (a) e (b) Micrografias SEM das amostras de Fe3O4, obtidas a partir do nitrato
de ferro(IIII). [Retirado da referência 47]
A partir do exposto, a síntese solvotérmica foi a metodologia escolhida para a
síntese das partículas de Fe3O4, com o objetivo de se obter um material com elevada
Ms e morfologia controlada.
1.4. Síntese de partículas magnéticas do tipo Fe3O4@SiO2
É crescente na literatura o número de trabalhos utilizando óxidos de ferro -
magnetita (Fe3O4) e maguemita (γ-Fe2O3) – como caroço magnético e sílica como
casca na construção de partículas multifuncionais do tipo FexOy@SiO248,49. Além de
quimicamente inerte, a sílica confere reatividade às partículas uma vez que apresenta
em sua superfície uma elevada concentração de grupos silanol (Si-OH) que permite a
ligação de biomoléculas (antígenos-anticorpos, peptídeos, proteínas, ácidos nucléicos,
enzimas) metais e polímeros22.
O silício é abundante nos tecidos conjuntivos, cabelos, peles, tendões, músculos
e ossos, sendo que espécies de silício livres dissolvidas na forma de ácido
monossilícico podem difundir através do tecido celular, entrar na corrente sanguínea ou
linfa e, então, serem excretadas na urina50.
(a) (b)
20
A preparação de sílica pelo método sol-gel desenvolvida por Stöber51 é a base
da metodologia mais aplicada no recobrimento de partículas magnéticas para o
desenvolvimento de nanoestruturas multicomponentes do tipo Fe3O4@SiO2. Este
processo é baseado na hidrólise de um precursor alcóxido, como o tetraetilortossilicato
(TEOS) ou aminopropiltrietoxissilano (APTEOS) (quando o interesse é na obtenção de
sílica funcionalizada com grupos –NH2), na presença de água e um catalisador, seguido
da condensação na superfície do óxido metálico através dos grupos OH presentes.
Uma ligação química do tipo M-O-Si é estabelecida entre os átomos de metal da
superfície do caroço e o TEOS, seguido da formação de uma rede tridimensional de
siloxanos (Si-O-Si)22.
A sílica mesoporosa, com diâmetro de poros (φ) entre 2 e 50 nm, pode ser
preparada a partir do mesmo procedimento, porém, na presença de um surfactante que
atua como agente direcionador (template) na formação dos poros. Dependendo das
condições de síntese, da fonte de sílica ou do tipo de surfactante, vários tipos de
materiais mesoporosos podem ser sintetizados pelo mecanismo da auto-organização
cooperativa. Neste procedimento a auto-organização do agente direcionador é seguida
da formação da rede de sílica, depositada ao redor da micela auto-organizada. Os
agentes direcionadores podem ser surfactantes moleculares, copolímeros em bloco
anfifílicos, dendrímeros ou biomoléculas50. O interesse na obtenção da sílica
mesoporosa justifica-se pelo ganho em área superficial quando da presença dos poros.
Uma área superficial elevada favorece a funcionalização da partícula a partir da
adsorção de diferentes espécies.
A metodologia de síntese da casca mesoporosa explorada nesta Tese baseia-se
na utilização de um surfactante catiônico, o brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB),
como direcionador na formação dos poros.
Em 1992, os cientistas da Mobil Oil Research and Development anunciaram a
síntese da primeira família de peneiras moleculares mesoporosas obtidas utilizando-se
um surfactante catiônico com o objetivo de organizar os ânions silicatos presentes em
solução. Esta família de peneiras moleculares é identificada na literatura como M41S e
pode ser classificada de acordo com a estrutura do poro presente: MCM-41 (do inglês
Mobil Composition of Matter nº 41) refere-se às peneiras mesoporosas que apresentam
21
poros hexagonais; MCM-48 denotam mesoporos cúbicos e MCM-50 refere-se obtenção
de sílica em estrutura lamelar52. O mecanismo originalmente proposto para formação da
estrutura mesoporosa a partir de um surfactante catiônico, como por exemplo o CTAB,
envolve uma forte interação eletrostática e correspondência de carga entre o arranjo
micelar dos cátions quaternários de amônio (CTA+) como agentes direcionador de
estrutura e os ânions silicatos presentes em solução50.
Dentro deste contexto, o trabalho de Yang et al.53 envolve o recobrimento de
microesferas de magnetita com sílica mesoporosa a partir da metodologia sol-gel,
sendo o CTAB o surfactante utilizado como agente direcionador na formação dos poros.
A partir da síntese solvotérmica, foram obtidas microesferas de magnetita de 300 nm de
diâmetro. O recobrimento com sílica foi realizado durante o procedimento de hidrólise-
condensação do TEOS e pode ser dividido em duas etapas: na primeira etapa o
mecanismo de recobrimento aconteceu na ausência do CTAB, quando foi obtida uma
casca de sílica não porosa (ou densa) e, na segunda etapa, o procedimento foi
realizado utilizando-se o CTAB. Após remoção do CTAB da estrutura foi obtida uma
segunda casca de sílica, agora mesoporosa com poros desordenados num volume total
de 0,41 g cm-3 e área superficial de 378 m2 g-1. A superfície da sílica foi funcionalizada
com vanadato de ítrio dopado com európio(III) e ibuprofeno. Foram realizados estudos
de luminescência e de carreamento de fármacos mostrando que o sistema pode atuar
tanto como marcador luminescente como na liberação de fármacos. Um resultado
importante neste trabalho e que merece destaque é a área superficial, ressaltando que
o recobrimento das partículas com sílica mesoporosa resulta em sistemas de área
superficial elevada o que potencializa sua aplicação.
1.5. Aplicações dos sistemas magnéticos do tipo Fe3O4@SiO2
exploradas neste trabalho
As principais propriedades das micro e nanopartículas magnéticas que viabilizam
a sua aplicação no diagnóstico e tratamento de doenças são: (i) visualização - as NPs
superparamagnéticas utilizadas como contraste em exames de ressonância magnética
(RM) podem ser visualizadas; (ii) transporte - as partículas podem ser guiadas, ou
22
mantidas fixas em um determinado local, por meio de um campo magnético externo
aplicado; e (iii) aquecimento – as NPM podem ser aquecidas sob a ação de um campo
magnético alternado para desencadear a liberação do fármaco ou para produzir
hipertermia / ablação do tecido. É importante salientar que esta última funcionalidade,
produção de calor, não está restrita a NP magnéticas, mas também é característica de
outras partículas capazes de absorver no infravermelho próximo, microondas e
ultrassom54. A combinação dessas propriedades permite a atuação dos sistemas
magnéticos tanto no diagnóstico quanto no tratamento de doenças (teranóstico). Essas
diferentes formas de atuação são apresentadas na Figura 11.
Nesta Tese foram exploradas as propriedades da plataforma obtida como
carregadores de fármacos, em ensaios de hipertermia magnética e como sonda óptica
de temperatura.
Figura 11. Aplicações biomédicas das NPM. [Adaptado da referência 54]
1.5.1. Sistemas de liberação de fármacos
Paul Ehrlich (1854-1915) foi o bacteriologista alemão idealizador do mecanismo
de entrega seletiva de fármacos em alvos específicos no organismo. Segundo Paul, se
um agente biológico pudesse ser seletivamente direcionado a um organismo causador
de doença, então a toxina para aquele organismo poderia ser liberada diretamente na
região alvo pelo agente biológico. Desta forma a toxina atingiria exclusivamente o
organismo alvo minimizando possíveis efeitos colaterais do agente. Esta ideia de Paul
Nanopartículas magnéticas
Terapia Diagnóstico
Liberação de
fármacos
Radioterapia e Ressonância
Magnética por Imagem (RMI)
Hipertermia Ablação térmica
Doenças do sistema
musculoesquelético
Anemia crônica Doença dos rins
In vivo
In vitro
RMI
Sensores
Biosseparação
Imobilização de enzimas
Imunoensaios
Classificação celular
23
ficou conhecida como magic bullet (ou bala mágica). O bacteriologista recebeu o
Prêmio Nobel de Medicina em 1908 por seus trabalhos em imunologia e sua ideia da
bala mágica serviu como roteiro do filme Dr. Ehrlich’s Magic Bullet, de 1940. Desde
então várias estratégias têm sido propostas com o objetivo de se conseguir uma
entrega do agente terapêutico nas vizinhanças do tumor pelo uso de vetores sensíveis
aos estímulos físicos do tumor e capazes de reconhecer quimicamente o tumor e se
ligar a ele54.
Anteriormente a proposta de serem utilizadas na entrega de fármacos (ou drug
delivery) as NPM eram objetos de pesquisas na construção de sistemas que pudessem
atuar como agentes de contraste em terapias do câncer por radiação localizada e na
indução da oclusão vascular de tumores (terapia antiangiogênica). Freeman et al.55
propuseram em 1960 que partículas de ferro poderiam ser transportadas através dos
vasos sanguíneos e concentradas em uma parte específica do corpo com o auxílio de
um campo magnético externo.
Somando-se à propriedade de transporte, a utilização de micro e nano partículas
magnéticas para a entrega de quimioterápicos tem evoluído desde 1970. Zimmermann
et al.56 em 1976 utilizaram eritrócitos magnéticos na liberação de antibióticos. Senyei et
al.57 descreveram a marcação (ou target) de microesferas magnéticas de albumina com
a doxorrubicina, um agente anticâncer, buscando a liberação do agente somente nas
células tumorais. Em 1980, outros autores desenvolveram a mesma estratégia descrita
acima para a construção de microesferas e microcápsulas magnéticas que pudessem
atuar no campo da entrega seletiva de fármacos a um alvo específico58,59,60.
Os sistemas de liberação apresentam vantagens em relação à administração
usual de medicamentos, dentre elas destacam-se: (i) liberação local do fármaco em um
sítio específico do corpo, diminuindo assim o nível sistêmico do medicamento no
paciente; (ii) manutenção do nível de fármaco constante no organismo implicando em
uma maior eficiência na utilização do agente (ou seja, é necessário uma menor
quantidade do fármaco para produzir o mesmo efeito que os sistemas convencionais);
(iii) preservação dos medicamentos que possam ser biodegradados e, (iv) menor
frequência de administração do agente ativo, aumentando o conforto do paciente e a
eficácia do tratamento50.
24
Uma partícula magnética para atuar no carreamento de fármacos, ou seja, no
carregamento, transporte e liberação controlada do fármaco, deve apresentar algumas
características: (i) ser pequena o suficiente para permanecer em circulação depois da
injeção no organismo; (ii) não apresentar citotoxicidade sobre células saudáveis; (iii)
sua superfície deve ser constituída por polímeros orgânicos ou inorgânicos que sejam
biocompatíveis e não imunogênicos e (iv) atuar como um vetor a partir de uma
funcionalização direcionada visando um determinado sítio e que seja capaz de se ligar
ao alvo específico61.
As microesferas magnéticas contemplam essas características uma vez que a
elevada resposta magnética do sistema a campos magnéticos externos aplicados,
traduzida pela elevada Ms, permite que as partículas atinjam rapidamente o alvo e ali
sejam localizadas para a liberação do fármaco. A velocidade com que as partículas
conseguem atingir o alvo específico faz com que a remoção das partículas do sistema
circulatório pelo sistema retículo endotelial (SRE) seja minimizada. Além disso, no caso
do direcionamento para o tratamento de tumores as microesferas podem ser
internalizadas devido ao aumento da capacidade fagocitária observada para as células
tumorais62.
Para os ensaios de carregamento de fármacos do sistema desenvolvido nesta
Tese foi selecionada a molécula de levofloxacina (LEVO). A LEVO é um quimioterápico
antibacteriano sintético da classe das fluoroquinolonas (Figura 12). Essa classe de
antibacterianos apresenta atividade antibacteriana sobre cepas Gram-negativas, sendo
utilizada no tratamento de muitas infecções em humanos.
Como mostra a Figura 12, a molécula de LEVO possui grupos funcionais como
ácido carboxílico e amina que podem interagir com a superfície de sílica na
funcionalização do sistema magnético proposto. Outra característica relevante da LEVO
é a possibilidade de se obter diferentes espécies em solução conforme variação do pH.
Para promover uma interação com a superfície da sílica, o pH neutro é o mais indicado
devido a formação da espécie zwiteriônica que possui dois sítios diferentes de
interação, sendo um deles, o carboxilato, o de maior afinidade pela sílica.
25
H+
-O2C
H+
-O2C
pH ácido
pH básico
pH neutro
Levofloxacina
Espécies predominantes em diferentes pHs
Figura 12. Molécula de levofloxacina utilizada na funcionalização da plataforma
magneto-porosa para estudos de carregamento e liberação de fármacos.
1.5.2. Hipertermia Magnética
A hipertermia caracteriza uma modalidade de tratamento do câncer com
elevação da temperatura entre 41 e 45 ºC. Apesar desta técnica ser utilizada desde
1957, sua eficácia clínica com relação a destruição seletiva de tumores malignos
localizados e efeitos colaterais mínimos têm despertado atenção para pesquisas nesta
área50. As técnicas mais comumente utilizadas nos tratamentos por hipertermia incluem
a indução do calor por ultrassom, radiofrequência, microondas, radiação infravermelha
e água quente62. Os oncologistas frequentemente associam o uso da hipertermia aos
procedimentos de radioterapia ou quimioterapia. Alguns desafios no tratamento por
hipertermia tradicional compreendem: (i) o inevitável aquecimento das células
saudáveis provocando bolhas, queimaduras e desconforto ao paciente; (ii) o calor
gerado pelas fontes tradicionais como ultrassom e micro-ondas não penetram o
suficiente nos tecidos; (iii) o calor não atinge com eficiência regiões profundas do
organismo, levando ao crescimento recorrente do tumor62.
26
Logo, as partículas magnéticas surgem como uma alternativa para o
aquecimento de tumores considerando o conceito de hipertermia magnética. Esse
conceito é baseado no fato de que sob um campo magnético alternado (AMF, do inglês
Alternating Magnetic Field), partículas magnéticas podem gerar calor.
O procedimento de geração de calor pelas NPM envolve inicialmente a dispersão
das partículas no tecido a ser aquecido. Em seguida, a aplicação de um campo
magnético estático induz a magnetização das NPM e então, pela aplicação de um AMF
em frequências adequadas, a magnetização das NPM é continuamente revertida, o que
se traduz na conversão da energia magnética em energia térmica. O calor gerado é
liberado instantaneamente no tecido doente. Se a temperatura for mantida a 42 °C por
30 min ou mais, as células cancerosas são destruídas63.
Os materiais magnéticos podem gerar calor na presença de um AMF por três
mecanismos distintos63: (i) a partir da circulação de correntes induzidas no material; (ii)
nos materiais constituídos por multidomínios magnéticos, presentes em materiais ferro
e ferrimagnéticos, o calor pode ser gerado pela perda de energia por histerese (Figura
13 (a)) e, (iii) considerando monodomínios magnéticos, característicos de materiais
superparamagnéticos, a perda de energia ocorre por mecanismos de relaxação (Figura
13 (b)).
A perda de energia por relaxação em nanopartículas superparamagnéticas
acontece de dois modos: modo rotacional (de Brown) e modo de Néel.
Figura 13. Mecanismos de geração de calor em sistemas: (a) Ferro e ferrimagnéticos;
(b) Superparamagnéticos. [Adaptado da referência 63].
(a) NPs ferro/ferrimagnéticas (b) NPs superparamagnéticas
Relaxação de Néel Energia
Orientação do momento magnético
Relaxação de Brown Mecanismo de perda por histerese
27
No modo de Néel (Figura 13 (b)), os momentos magnéticos do cristal rotacionam
em direção ao campo externo. O mecanismo de Néel é análogo à perda de energia por
histerese em partículas magnéticas de multidomínio, já que existe uma “fricção interna”
devido ao movimento do momento magnético. No modo Browniano, a geração de calor
se dá através da rotação das partículas provocada pelo alinhamento em direção ao
campo magnético externo, sob o efeito de uma força térmica, contra a viscosidade em
uma suspensão. Esse mecanismo representa essencialmente o componente de fricção
mecânica das nanopartículas em uma suspensão50,63.
Em 1979 Gordon et al.64, propuseram o conceito de indução de hipertermia
intracelular usando nanopartículas de magnetita ligadas ao dextrano. Administraram
nanopartículas de magnetita via intravenosa em carcinoma mamário de ratos e
mostraram que houve indução de calor por AMF em seus experimentos.
Uma outra abordagem encontrada na literatura envolvendo a hipertermia
magnética é o controle da liberação de um fármaco pelo calor gerado em partículas
multicomponentes. O calor gerado pela partícula magnética carregada com um fármaco
pode potencializar a liberação em um alvo específico65,66.
A capacidade de geração de calor de NPM quando submetidas a um AMF é
expressa pela taxa de absorção específica (SAR, do inglês specific absorption rate),
que pode ser calculada de acordo com a equação (1):
SAR = C(∆T/∆t)(1/ma) (1)
onde C = capacidade calorífica da amostra (costuma-se utilizar a da água considerando
que são utilizadas suspensões magnéticas com baixa concentração de partículas);
∆T/∆t = aumento da temperatura em função do tempo (determinado a partir do
coeficiente angular da reta ajustada na linearização das curvas de temperatura versus
tempo) e ma = massa da amostra magnética. Os valores de SAR são normalmente
expressos em W g-1.
No mecanismo de geração de calor por histerese, ilustrado na Figura 13 (a), a
quantidade calor gerada é proporcional a frequência (f) do AMF aplicado e à área do
ciclo de histerese. O que significa que partículas com elevada Ms e que apresentam Hc,
28
devem gerar calor mais eficientemente. Existem algumas restrições fisiológicas
referente a intensidade do campo aplicado (B0, em A m-1) e da frequência (f, em kHz)
deste campo. De acordo com a literatura, para uma aplicação biológica o produto B0 x f
não deve ultrapassar o valor de 5·109 A m s-1 63.
Ma et al.67 estudaram a variação da SAR em função da Hc de partículas de Fe3O4
de diâmetro entre 7 e 400 nm. Os resultados obtidos são apresentados no gráfico da
Figura 14 e mostram que a SAR aumenta com o aumento da Hc (responsável pela área
no ciclo de histerese) e, da mesma forma, a SAR aumenta com o aumento diâmetro das
partículas de até 100 nm. Para NPM > 100 nm, tanto a Hc como a SAR diminuem.
Figura 14. Variação da SAR em função do diâmetro e da Hc de partículas de Fe3O4,
valores obtidos sob campo de 32,5 kA m-1 e frequência de 80 kHz. [Adaptado da
referência 67].
1.5.3. Sistemas Magneto-Luminescentes
Os materiais multifuncionais magneto-luminescentes têm atraído particular
atenção por apresentarem grande potencialidade de aplicação na área biomédica como
biomarcadores em ressonância magnética nuclear, imageamento confocal por
fluorescência e imageamento por fluorescência resolvida no tempo68.
Diâmetro (nm)
Diâmetro (nm)
Coe
rciv
idad
e, H
c(O
e) SA
R (W
/g de Fe)
SARHc
Diâmetro (nm)
Diâmetro (nm)
Coe
rciv
idad
e, H
c(O
e) SA
R (W
/g de Fe)
SARHc
29
A fabricação de micro ou nanocompósitos magneto-luminescentes tendo como
matriz um caroço magnético recoberto com sílica, têm despertado grande interesse por
caracterizar uma plataforma multifuncional que permite ensaios biomédicos simultâneos
de imagem e diagnóstico. O aperfeiçoamento na preparação desses sistemas requer
ainda muita pesquisa em diferentes áreas para que se possa atingir alguns objetivos,
dentre eles destacam-se: (i) recobrir homogeneamente o caroço magnético com sílica
tornado o sistema biocompatível e preservar suas propriedades magnéticas como
elevada magnetização de saturação e baixos valores de coercividade e remanência; (ii)
evitar a supressão da luminescência dos fluoróforos presentes na superfície das
partículas causada pelo caroço magnético, pela interação entre as moléculas e pelas
moléculas do solvente e (iii) elevar a fotoestabilidade do complexo de lantanídeo e, ao
mesmo tempo, melhorar a sua biocompatibilidade68.
Os complexos de íons lantanídeos trivalentes mostram propriedades únicas e
têm sido amplamente utilizados em ensaios biológicos. As transições luminescentes
características dos íons lantanídeos nestes compostos é consequência da forte
absorção na região do ultravioleta por um ou mais ligantes e a transferência de energia
não radiativa para o íon lantanídeo. Deste modo, os níveis emissores 4f são em geral
mais eficientemente populados por transferência de energia do que pela excitação
direta do íon. Portanto, a intensidade de luminescência 4f-4f na região do visível é
resultado de um balanço entre a alta absorção pelos ligantes, as constantes de
transferência e de retro-transferência de energia ligante-lantanídeo, e as constantes de
decaimentos radiativos e não-radiativos envolvidos no processo. Como os orbitais 4f
são blindados do ambiente químico pelos orbitais 5s e 5p preenchidos (efeito de
blindagem), os estados eletrônicos dos íons lantanídeos são fracamente afetados por
seus vizinhos mais próximos, resultando em emissão estreitas e de longo tempo de
vida. Sistemas moleculares de conversão de luz baseados em complexos de
lantanídeos possuem diversas aplicações em novas tecnologias tais como, materiais
luminescentes, fluoroimunoensaios, compostos bioinorgânicos fotossensíveis69.
Lu et al.68 desenvolveram uma microesfera multicomponente magneto-
luminescente contendo Fe3O4 como caroço magnético e sílica como casca. A casca de
sílica foi funcionalizada com o complexo [Eu(DBM)3·2H2O], onde DBM =
30
dibenzoilmetanato. Neste sistema, a camada de sílica teve o objetivo de isolar o óxido
de ferro do complexo para evitar fenômenos como supressão da luminescência. As
NPM de Fe3O4 foram obtidas por síntese solvotérmica e a casca de sílica foi depositada
via sol-gel. Os resultados experimentais mostram que a microesfera magneto-
luminescente apresenta um diâmetro final de 500 nm, sendo que o núcleo magnético
apresenta cerca 340 nm de diâmetro e casca de sílica dopada com o complexo de
európio(III) uma espessura média de 80 nm. O sistema apresentou Ms 25,84 emu g-1 e
Hc e Mr negligenciáveis à temperatura ambiente além de uma emissão vermelha
proveniente da transição 5D0 → 7F2 (611 nm) característica do íon Eu(III). Ensaios
microbiológicos monitorados por fluorescência confocal mostraram que as partículas
podem ser internalizadas por células HeLa. Estes resultados demonstram que as
microesferas magneto-luminescente possuem potencial para aplicações em
imageamento e diagnóstico.
Partículas luminescentes de sílica funcionalizadas com grupos amino foram
investigadas por Lourenço et al.70 para utilização em imunoensaios. As partículas de
sílica luminescentes foram preparadas pelo método de Stöber modificado na presença
do complexo [Eu(tta)3(H2O)2] (tta = tenoiltrifluoroacetonato). Os dados de bioensaios
mostram a potencialidade do sistema como marcador luminescente de proteínas.
O complexo diaquatris(tenoiltrifluoroacetonato)európio(III), referenciado
anteriormente como [Eu(tta)3(H2O)2] (Figura 15), foi a sonda óptica molecular
selecionada para ensaios de monitoramento da temperatura realizados neste trabalho.
31
O
O
FF
F
S
EuO
O
H
HH
H
3
Figura 15. Complexo diaquatris(tenoiltrifluoroacetonato)európio(III), utilizado nos
estudos de sensoriamento de temperatura.
De acordo com a literatura, o complexo [Eu(tta)3(H2O)2] apresenta características
de sonda de temperatura. O referido complexo foi utilizado como sonda óptica em uma
matriz de poli(metil)metacrilato para imageamento da temperatura em um circuito
integrado71. Outros trabalhos apresentam a mesma sonda sendo injetada em células
para a obtenção de imagens da produção de calor gerado por um receptor ativado em
células vivas72. Gaspar73 em seu doutorado estudou membranas de polidimetilssiloxano
(PDMS) contendo o complexo [Eu(tta)3(H2O)2], disperso ou ancorado, como sondas de
temperatura e oxigênio molecular.
Considerando que a temperatura é um parâmetro fundamental em todos os tipos
de ciência, além dos termômetros convencionais, os sensores ópticos são atrativos
para a detecção e monitoramento on line da temperatura. A vantagem de se determinar
a temperatura sem a necessidade do contato e a possibilidade do mapeamento da
temperatura em uma determinada região, são os grandes diferenciais dos sensores
ópticos. Termômetros infravermelhos baseados na radiação do corpo negro foram os
primeiros sensores ópticos utilizados para detecção da temperatura74.
A possibilidade de sensoriamento da temperatura associada à geração de calor
pelas NPM que se pretende investigar nesta Tese surge a proposta de se desenvolver
um sistema magnético que possa atuar como sonda óptica de temperatura e marcador
luminescente. Dessa forma, o calor gerado no processo de hipertermia magnética
poderia ser monitorado in situ, minimizando danos causados por calor excessivo.
Fórmula Molecular:
[Eu(tta)3(H2O)2]
32
33
Capítulo 2
OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho foi desenvolver uma plataforma magneto-porosa
do tipo caroço@casca contendo Fe3O4 como caroço magnético e sílica mesoporosa
como casca. Uma vez obtida a plataforma, prosseguiu-se os estudos com ensaios de
carregamento e liberação de fármacos a partir da adsorção de um medicamento e, a
partir da incorporação de um complexo luminescente de európio(III), investigou-se as
propriedades do sistema como sonda óptica de temperatura. Foram realizadas medidas
de hipertermia magnética para o caroço puro de Fe3O4 e para a plataforma magneto-
porosa. Vislumbrando uma aplicação biomédica para esses materiais, outro objetivo foi
estudar a citotoxicidade dos sistemas magnéticos constituídos apenas por Fe3O4 e para
a plataforma magneto-porosa.
2.2. Objetivos específicos
Conforme a proposta apresentada, os objetivos específicos deste trabalho
consistiram em:
•Sintetizar e caracterizar as partículas magnéticas do caroço;
•Recobrir as partículas magnéticas com sílica mesoporosa, acompanhando a
evolução da espessura da casca e da área superficial a partir do número de camadas
depositadas;
•Investigar o comportamento magnético do caroço e da plataforma magneto-
porosa;
34
•Utilizar a plataforma magneto-porosa como matriz para o carregamento da
levofloxacina e investigar a liberação do fármaco em solução.
•Realizar ensaios microbiológicos de atividade antibacteriana das amostras da
plataforma livre e carregada com levofloxacina;
•Incorporar à plataforma magneto-porosa o complexo [Eu(tta)3(H2O)2] e estudar o
comportamento luminescente do sistema em função da emissão do complexo na matriz
magnética. Investigar o comportamento do sistema frente ao decaimento radiativo da
emissão 5D0 → 7F2 do íon európio(III) em função da temperatura;
•Avaliar a citotoxicidade das partículas, tanto do caroço de Fe3O4 quanto da
plataforma magneto-porosa;
•Estudar o comportamento das partículas em ensaios de hipertermia magnética.
35
Capítulo 3
PARTE EXPERIMENTAL
3.1. Reagentes Utilizados
A Tabela 1 apresenta os reagentes utilizados neste trabalho. Todos os reagentes
foram utilizados sem nenhum tratamento prévio.
Tabela 1. Fórmula química, procedência e grau de pureza dos reagentes utilizados
neste trabalho.
REAGENTE FÓRMULA MARCA PUREZA (%)
Etilenoglicol (EG) C2H6O2 Vetec ≥99,5
Polietilenoglicol (PEG) C2n+2H4n+6On+2 Vetec - (a)
Acetato de sódio trihidratado NaC2H3O2·3H2O Vetec >99
Brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) C19H42Br Acros 99,99
Etanol C2H6O Synth >99 (b)
Hidróxido de amônio NH4OH Synth 27 (c)
Ácido clorídrico HCl Synth 36,5-38 (c)
Cloreto de ferro(III) FeCl3 Aldrich >97
Nitrato de ferro(III) nonahidratado Fe(NO3)3·9H2O Aldrich >97
Tetraetilortossilicato (TEOS) SiC8H2O4 Aldrich 98
Levofloxacina (LEVO) C18H20N3FO4 Aldrich ≥98
(a)Massa Molar = 4000; (c)Teor dissolvido em água; (b)Quando utilizado seco foi mantido em peneira
molecular previamente tratada em mufla a 600 °C por 2h.
36
3.2. Síntese da plataforma magneto-porosa do tipo
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
3.2.1. Síntese das partículas magnéticas constituintes do caroço da
plataforma magneto-porosa
Para a síntese das partículas de magnetita dissolveu-se, em um béquer, 5,0
mmol de FeCl3 em 40,0 mL de EG sob agitação magnética e à temperatura ambiente.
Obteve-se uma solução amarela transparente na qual foram adicionados 2,5 mmol de
NaC2H3O·3H2O e 1,0 g de PEG-4000, respectivamente, levando a formação de um
sólido avermelhado. Após a adição dos reagentes, o sistema permaneceu sob agitação
magnética à temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, a solução foi transferida
para uma autoclave, formada de um copo de teflon de capacidade igual a 80 mL, para
tratamento solvotérmico a 200 °C por 8 h. O sólido obtido foi centrifugado, lavado com
etanol e seco em estufa a 60 °C sob vácuo por 12 h53,75. A amostra obtida foi
denominada Fe_Cl. Foram também realizadas sínteses modificando o precursor de
ferro(III) para Fe(NO3)3·9H2O, cuja amostra foi identificada como Fe_NO3.
3.2.2. Deposição da sílica densa (dSiO2)
Para o recobrimento das partículas magnéticas com sílica utilizou-se uma
metodologia baseada na hidrólise e condensação de precursores alcóxidos
desenvolvida por Stöber51,53. Para posterior recobrimento com sílica, 100,0 mg de
partículas magnéticas foram tratadas com 20,0 mL de HCl 0,10 mol L-1 em ultrassom
por 20 min e, em seguida, separadas com o auxílio de um ímã e lavadas
excessivamente com água deionizada. As partículas tratadas com a solução de HCl
foram suspensas em uma solução contendo 80,0 mL de etanol e 20,0 mL de água
deionizada. A suspensão foi mantida em banho de ultrassom por 30 min. Após este
tempo, acrescentou-se 1,0 mL de NH4OH à suspensão que foi transferida para agitação
mecânica com rotação de 500 rpm. Sob agitação mecânica, foram adicionados 32,0 µL
de TEOS. A agitação prosseguiu por 6 h à temperatura ambiente. Após o período de
agitação, as partículas recobertas foram separadas da suspensão com o auxílio de um
ímã, lavadas com etanol e água deionizada em excesso e mantidas em água
37
deionizada para utilização na etapa seguinte. A amostra obtida nesta etapa foi
denominada Fe3O4@dSiO2, onde d designa a camada de sílica densa.
3.2.3. Deposição das camadas de sílica mesoporosa (mSiO2)
Para a deposição das camadas de sílica mesoporosa (mSiO2), as partículas
magnéticas recobertas com sílica densa (Fe3O4@dSiO2) foram suspensas em uma
solução contendo 80,0 mL de água deionizada, 60,0 mL de etanol e 1,0 mmol de CTAB.
A suspensão foi mantida em banho de ultrassom por 30 min. Em seguida, acrescentou-
se 1,0 mL de NH4OH e transferiu-se o sistema para agitação mecânica com rotação de
500 rpm. Sob agitação mecânica, foram adicionados 428 µL de TEOS. A agitação
prosseguiu por 6 h à temperatura ambiente. Após a agitação, as partículas recobertas
foram separadas da suspensão com o auxílio de um ímã, lavadas com etanol e água
deionizada em excesso, e secas em estufa sob vácuo a 60 °C por 12 h53. A amostra
obtida foi denominada Fe3O4@dSiO2@1mSiO2-CTAB. A amostra obtida realizando-se
duas vezes a etapa de recobrimento com sílica mesoporosa foi nomeada
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2-CTAB.
3.2.4. Remoção do CTAB das amostras Fe3O4@dSiO2@1mSiO2-CTAB e
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2-CTAB
Para remoção do CTAB, as amostras Fe3O4@dSiO2@xmSiO2-CTAB (onde x = 1
ou 2) foram suspensas em 15,0 mL de uma solução HCl:etanol (1:100 v/v) e tratadas
em banho de ultrassom a 60 °C por 15 min. As partículas foram secas em estufa sob
vácuo a 60 °C por 12 h76. As amostras foram denominadas: Fe3O4@dSiO2@1mSiO2,
para a amostra contendo uma camada de sílica, e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 para a
amostra com duas camadas de sílica. As referidas amostras são mencionadas no texto
como plataforma magneto-porosa, quando a discussão independe do número de
deposições.
38
3.3. Funcionalização da plataforma magneto-porosa
3.3.1. Carregamento da levofloxacina na plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
Suspendeu-se 100,0 mg de Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, em 40,0 mL de uma
solução etanólica de LEVO de concentração igual a 4,0 g L-1. O sistema foi mantido em
uma câmara incubadora com agitação orbital (shaker) da marca Marconi, modelo
MA420, a 180 rpm e 30 °C por 24 h. Após este tempo, as partículas foram separadas
do sobrenadante com o auxílio de um ímã, lavadas com 5,0 mL de etanol e secas em
estufa a 60 oC por 12 h77. A amostra obtida foi denominada
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO.
3.3.2. Incorporação do complexo [Eu(tta)3(H2O)2] à plataforma
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
O complexo diaquatris(tenoiltrifluoroacetonato)európio(III), [Eu(tta)3(H2O)2, (ou,
simplesmente Eutta) foi sintetizado no Laboratório de Materiais Funcionais, conforme
metodologia descrita na literatura78. Para a síntese do complexo, inicialmente dissolve-
se 444 mg do ligante tenoiltrifluoroacetonato (tta) em 10 mL de etanol a 40 °C. Após a
dissolução do ligante adiciona-se 2 mL NaOH (1,0 mol L-1). O sistema permanece em
agitação a 40 °C por 25 min. Em seguida, adiciona-se a solução etanólica de tta à 0,7
mL de uma solução aquosa de EuCl3 (1,0 mol L-1) diluída em 5 mL de água destilada. O
sistema permanece em agitação por 45 min a 50 °C até precipitação completa do
complexo. O sólido obtido é lavado com água e seco em estufa.
A incorporação do complexo foi realizada de acordo com o seguinte
procedimento: em um balão de fundo redondo foram dissolvidos 5,0 mg do complexo
Eutta em 10,0 mL de etanol seco, sob agitação magnética à temperatura ambiente.
Após total dissolução do complexo acrescentou-se à solução mais 10,0 mL de etanol
seco contendo 50,0 mg da plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, previamente tratada em
estufa a 60 °C por 8 h. O sistema permaneceu em agitação por 48 h. Em seguida, as
partículas foram separadas com o auxílio de um ímã e lavadas com 5,0 mL de etanol
39
seco. A amostra foi seca em estufa a 60 °C por 12 h. A amostra obtida foi denominada
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta.
Uma segunda amostra contendo o Eutta foi preparada a partir da plataforma
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. Primeiramente, tratou-se 50,0 mg da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 em uma mufla a 200 °C por 30 min. Em seguida, a mesma
amostra foi tratada com uma solução de NH4OH (0,1 mol L-1), sob agitação magnética
por 2 h à temperatura ambiente. As partículas tratadas foram então separadas da
suspensão com o auxílio de um ímã, lavadas com água deionizada e secas em estufa a
60 °C por 12 h. A funcionalização com o Eutta foi realizada em um balão de fundo
redondo, suspendendo-se 20,0 mg da amostra em 20,0 mL de etanol seco contendo
2,0 mg de Eutta. O sistema permaneceu em agitação por 48 h à temperatura ambiente.
O produto obtido foi lavado com 5,0 mL de etanol seco e mantido em estufa a 60 °C por
12 h para secagem. A amostra obtida foi denominada
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta.
3.4. Caracterização
3.4.1 Difratometria de raios X (XRD)
Para as medidas de XRD foi utilizado um difratômetro Shimadzu XRD-7000,
operando com radiação CuKα (λ = 1,5406 Å) a 40 kV e 30 mA, na região de 5 a 70° (2θ).
As medidas foram realizadas à temperatura ambiente na velocidade de 2θ° min-1.
3.4.2. Espectroscopia vibracional de absorção no infravermelho (IR)
Os espectros foram obtidos em um espectrofotômetro Bomem-MB 100, com
resolução de 4 cm-1 e acumulado em 16 varreduras, no intervalo de 4000 – 400 cm-1.
As medidas foram realizadas utilizando-se o método da pastilha em KBr.
3.4.3. Análise termogravimétrica (TGA/DTA)
O equipamento utilizado foi um SDT Q600/TGA-DTA. As amostras foram
analisadas no intervalo de 25 °C – 500 °C, com velocidade de 10 °C min-1 em cadinho
40
de platina e atmosfera de ar sintético. A vazão do gás foi de 100 mL min-1, utilizando-se
massa em torno de 10 mg.
3.4.4. Espectroscopia Raman
Os espectros Raman foram obtidos no equipamento Horiba T64000 do
Laboratório Multiusuário de Espectroscopia Óptica Avançada (LMEOA) do Instituto de
Química-Unicamp, acoplado a um microscópio óptico e laser de Ar de comprimento de
onda (λ) igual a 514 nm com potência na fonte de 10 mW. As amostras foram
analisadas na forma de pó e as condições de análise como potência do laser na
amostra, tempo de exposição e número de acumulações dos espectros foram definidos
para cada amostra e estão descritas na discussão dos resultados.
3.4.5. Microscopia eletrônica de varredura (SEM)
As microscopias foram obtidas em um microscópio eletrônico de varredura de
alta resolução FEI-Inspect 50, do Laboratório Nacional de Nanotecnologia (LNNano).
Para realização das análises as amostras foram previamente suspensas em água
deionizada e tratadas em ultrassom por 30 min. Após este tempo, as amostras foram
depositadas em porta-amostra de silício e secas a temperatura ambiente. Antes das
medidas as amostras foram recobertas com um filme de carbono.
3.4.6. Isotermas de adsorção e dessorção de N2
As isotermas de adsorção/dessorção de nitrogênio foram obtidas em um
analisador de área superficial e tamanho de poros Quantachrome NOVA 4200-e. As
amostras foram mantidas sob vácuo durante 6 h antes das análises.
3.4.7. Caracterização magnética
O comportamento magnético das diferentes amostras à temperatura ambiente foi
investigado por magnetometria de amostra vibrante (VSM) em um magnetômetro
LakeShore-7400, com campo máximo igual a 2 T, localizado no Laboratório de
Materiais a Baixa Temperatura (LMBT) do Instituto de Física Gleb Wataghin (IFGW) da
Unicamp. Para a análise, uma massa conhecida da amostra foi empacotada em filme
41
de policloreto de vinila (PVC) dentro de uma cápsula plástica acoplada ao equipamento
através de uma haste de quartzo. Foram realizadas também medidas a baixa
temperatura para obtenção das curvas ZFC-FC (do inglês Zero Field Cooling – Field
Cooling), utilizando-se um equipamento MPMS-Quantum Design (SQUID), com
variação de temperatura de 5 K a 400 K, velocidade igual a 2 K min-1 e campo
magnético aplicado de 50 Oe.
Os ensaios de hipertermia magnética foram realizados em colaboração com o
Dr. Carlos Sato, do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). As medidas foram
realizadas em um equipamento de indução magnética da marca Ambrell Easy Heat 4,2
kW (Figura 16(a)). Neste equipamento o campo magnético é gerado por uma bobina de
8 voltas que apresenta 37 mm de altura, 25,5 mm de diâmetro interno e 39,5 mm de
diâmetro externo (Figura 16(b)). A temperatura da bobina é mantida entre 23 e 25 °C
através da passagem de um fluxo de água à temperatura ambiente. Para as análises
pesou-se 2 mg da amostra em um frasco de vidro de 2 mL com tampa, onde foi
suspensa em 2,0 mL de água deionizada. O sistema permaneceu em ultrassom por 30
min para dispersão das partículas. A temperatura foi monitorada com o auxílio de um
termômetro de fibra óptica da marca Optocon, com resolução de 0,1 ºC s-1, acoplado à
tampa do frasco contendo a amostra, como ilustrado na Figura 16(b). O frasco foi
colocado em um porta-amostra de isopor posicionado no centro da bobina. As medidas
foram realizadas para um intervalo de tempo de 5 min variando-se o campo magnético
em 100, 200 e 300 Oe, sob frequência (f) de 313 kHz. As medidas foram realizadas em
triplicata e, para cada um dos campos magnéticos estabelecidos, foi realizado um
branco utilizando-se uma amostra de 2 mL de água deionizada.
42
Figura 16. (a) Equipamento de indução magnética e (b) Compartimento que contém a
amostra. Em destaque: (i) a bobina de 8 voltas; (ii) o porta-amostras de isopor e (iii) o
termômetro acoplado ao frasco contendo a amostra.
3.4.8. Espectroscopia eletrônica de absorção no UV-Vis (UV-Vis)
A isoterma de adsorção utilizada na determinação da indireta da quantidade de
LEVO adsorvida na amostra da plataforma magneto-porosa foi construída em um
espectrofotômetro Agilent HP8453 na faixa de 200 – 800 nm. Foram analisados o
sobrenadante da etapa de carregamento das partículas, o etanol de lavagem e a
solução estoque utilizada na adsorção. As análises foram realizadas em solução
utilizando-se uma cubeta de quartzo de caminho óptico igual a 1 cm. Todas as análises
foram realizadas tendo o etanol como branco e monitorando-se a absorção da LEVO
em 290 nm.
3.4.9. Espectroscopia de luminescência (LE)
Os espectros de excitação e de emissão das amostras contendo a LEVO e o
complexo Eutta foram obtidos em um Espectrofotômetro Horiba Jobin-Yvon FL3-22-
iHR-320 do Laboratório Multiusuário de Espectroscopia Óptica Avançada (LMEOA) do
Instituto de Química-Unicamp. As medidas foram realizadas no modo front face,
utilizando uma lâmpada de Xe (450 W) como fonte de excitação e, como porta-amostra,
uma janela de quartzo.
As curvas de decaimento da intensidade da emissão em relação ao tempo
(tempo de vida) das amostras contendo o complexo Eutta foram obtidas com uma
(i)
(ii)
(iii)
(a) (b)
43
lâmpada pulsada de Xe (150 W) utilizando o sistema de multicanais com 1024 canais,
variando-se a temperatura de 20 a 60 °C com o auxílio de um Peltier e, como porta-
amostra, utilizou-se uma janela de quartzo de 0,1 mm.
3.4.10. Estudos de cinética de liberação da LEVO
Os estudos de cinética de liberação foram realizados suspendendo-se 2,00 mg
da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO em 10 mL de água deionizada. Como
porta-amostra foi utilizado um tubo Falcon de 25 mL. Como referência utilizou-se uma
suspensão de 2,00 mg da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 sem a LEVO, em 10 mL de
água deionizada. Os dois tubos foram mantidos à temperatura ambiente em uma
balança agitadora para garantir agitação constante durante os estudos de cinética
(Figura 17).
Figura 17. Balança agitadora utilizada nos ensaios de liberação da LEVO.
A absorção na região do UV-Vis em 290 nm do sobrenadante foi o parâmetro
utilizado na determinação da concentração de LEVO liberada em solução. As medidas
foram realizadas em diferentes intervalos de tempo, totalizando 72 h. As alíquotas
analisadas eram retiradas da suspensão com o auxílio de uma pipeta automática
enquanto as partículas eram mantidas no fundo do frasco atraídas por um ímã.
Realizadas as medidas, as alíquotas retornavam aos frascos para manter a
concentração constante. Para determinação da massa de LEVO liberada construiu-se
44
uma curva de calibração da LEVO em água deionizada. Para a construção da curva
foram preparadas soluções de diferentes concentrações conhecidas de LEVO.
3.4.11. Ensaios microbiológicos
Os ensaios microbiológicos com a amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO foram
realizados em colaboração com o Prof. Dr. Wilton Rogério Lustri, do grupo de Química
Medicinal e Medicina Regenerativa do Centro Universitário de Araraquara - UNIARA.
As cepas bacterianas de interesse, Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC
25923, Gram-positiva) e Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa, ATCC 27853, Gram-
negativa), após certificação das espécies, foram cultivadas em tubos de cultura
contendo BHI (do inglês Brain Heart Infusion) e incubadas por 16-18 horas a 35-37 °C.
A seguir, um inóculo proveniente de cada cultivo foi semeado novamente em BHI
estéril. Os inóculos foram incubados a 35-37 °C até atingirem a escala turbidimétrica
0,5 de MacFarland (≈ 1,5·108 UFC/mL). A partir desses cultivos, uma amostra de cada
espécie bacteriana foi semeada, com swab de algodão hidrofílico estéril, em placas
contendo Ágar Muller-Hinton (MH)79.
Para os testes foram preparadas três suspensões, em 1,0 mL de água
deionizada, sendo uma delas utilizada para controle contendo 1,5 mg de LEVO livre (L).
Para o preparo das outras duas suspensões foram pesados 7 mg da plataforma
magneto-porosa sem a LEVO (P) e 7 mg da plataforma carregada com a LEVO (PL).
♦ Ensaios sob ação de campo magnético constante: Neste experimento, 10 µL
de cada suspensão foram aplicados em nove orifícios de 6 mm produzidos em
diferentes placas de Petri inoculadas com as bactérias S. aureus e P. aeruginosa. Nas
placas, os orifícios foram divididos em três grupos, L, P e PL, contendo três orifícios
cada (triplicata), como ilustrado na Figura 18. A cada 2 h as amostras foram submetidas
a um pulso magnético de 4 kG por 10 min. O campo foi gerado por ímãs cilíndricos de
Nd-Fe-B de 1x1 cm que ocupavam cada um dos orifícios (Figura 18). Este
procedimento foi repetido três vezes. Após cada período de exposição, as placas eram
incubadas a 36 °C em estufa bacteriológica. A leitura dos halos de inibição foi realizada
após 18 h de incubação.
45
Figura 18. Esquema de montagem dos ensaios microbiológicos realizados na presença
de um campo magnético externo (ímã).
♦Ensaios sob ação de laser: Neste procedimento, 10 µL de cada suspensão
foram aplicados em três orifícios de 6 mm produzidos em placas de Petri inoculadas
com as mesmas cepas bacterianas descritas acima. Foram preparadas três placas,
uma para L, uma para P e outra para PL, contendo três orifícios cada (triplicata). A cada
2 h as placas foram submetidas a um pulso eletromagnético gerado por um laser de
potência em torno de 200 mW por 10 min. Como ilustrado na Figura 19, a fonte de laser
foi um laser pointer verde (532 nm). Este procedimento foi repetido três vezes. Após
cada período de exposição, as placas foram incubadas a 36 °C em estufa
bacteriológica. A leitura dos halos de inibição foi realizada após 18 horas de incubação.
Figura 19. Esquema de montagem dos ensaios microbiológicos realizados na presença
de um campo eletromagnético externo (laser).
Base de madeira
Ímãs de Nd-Fe-B
Sobreposição
da placa semeada
Laser (532 nm)
<200 mW
PL P
L
Laser aceso
46
3.4.12. Ensaios de Citotoxicidade
Viabilidade celular através da redução do MTT
Nesse ensaio, a viabilidade celular é avaliada através da medida da capacidade
das células viáveis em reduzir o MTT (3-brometo de [4,5-dimetil-2-tiazolil]-2,5-difenil-
tetrazólio) a formazan. O formazan é um pigmento insolúvel que é extraído das células
e quantificado espectrofotometricamente em comprimento de onda (λ) igual a 570 nm.
A redução do MTT é catalisada principalmente pelas desidrogenases mitocondriais.
Portanto, a alteração da função mitocondrial poderá ser detectada através da variação
da capacidade de redução do MTT. Células não viáveis não são capazes de reduzir o
MTT.
Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em colaboração com a Drª.
Luciana Maria de Hollanda, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp.
Para os ensaios de citotoxicidade as linhagens de células do tipo A549 (ATCC®CCL-
185™), NIH/3T3 (ATCC®CCL-1658™, variedade não tumoral) e PANC-1
(ATCC®CCL-1469™) foram cedidas pelo Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho Ramos,
do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da
Unicamp. A linhagem NG97 (astrocitoma tipo III) foi cedida pela Profª. Drª. Liana Maria
Cardoso Verinaud, do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp. Todas as células foram
cultivadas em frascos de plástico (25 mL) com meio RPMI (do inglês Roswell Park
Memorial Institute Medium) suplementado com antibiótico/antimicótico80, e 10% de soro
fetal bovino (SFB) inativado como suplemento de crescimento. As culturas foram
incubadas a 37 °C sob atmosfera contendo 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 48 h
e quando a cultura atingiu a confluência, a subcultura foi efetuada por tratamento com
tripsina e ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA, do inglês ethylenediaminetetraacetic
acid)80. Em seguida, alíquotas de 300 µL de concentração de 105 até 107 células mL-1
foram suspensas em diversos poços de uma placa de 96 poços, contendo meio RPMI e
SFB, e permaneceram incubadas a 37 ºC sob atmosfera de 5% de CO2 por 24 h ou 48
h. As amostras de Fe3O4 e de Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, previamente autoclavadas a
120 ºC e 1,2 atm para esterilização, foram suspensas no meio de cultura em diferentes
concentrações (3,9 a 500 µg mL-1) e então adicionadas às culturas celulares. Para cada
ensaio, foi mantida uma linhagem de controle, sem partículas81,82.
47
Para os testes de citotoxicidade, 0,1 mL de meio RPMI (sem SFB e antibióticos)
contendo o corante MTT (0,5 mg mL-1) foi adicionado às amostras. Após 3 h de
incubação a 37 °C, o meio com o corante foi removido e 100 µL etanol foi
cuidadosamente adicionado para solubilizar o formazan azul (produto da redução de
MTT pelas células viáveis). As placas foram agitadas durante 10 min, e a absorbância
de cada poço foi lida num espectrofotômetro ELx800-AbsorbanceMicroPlateReader
(leitor de microplacas, Biotek, EUA) em λ = 570 nm81,83,84. A citotoxicidade do material
é, portanto determinada com base na intensidade da absorção em 570 nm em relação
às células-controle84,85.
48
49
Capítulo 4
RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1. Caracterização química, estrutural e morfológica das partículas
magnéticas do caroço
A primeira parte do estudo referente à síntese das partículas do caroço
magnético buscou investigar a influência do precursor de ferro(III), nitrato ou cloreto, na
fase cristalina e na morfologia das amostras obtidas. A fase cristalina foi investigada por
XRD, IR, Raman e TGA e a técnica de SEM foi utilizada no estudo da morfologia e na
determinação do diâmetro das partículas.
A Figura 20 apresenta o difratograma de raios X da amostra obtida a partir do
cloreto de ferro(III) (Fe_Cl). O difratograma revela que a amostra é cristalina e os planos
de difração foram indexados e podem ser atribuídos a fase magnetita - Fe3O4 (JCPDS-
19-629).
10 20 30 40 50 60 70
(111)
Magnetita
2θ (graus)
(440)
(511)
(422)
(311)
(400)
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
(220)
Fe_Cl
Figura 20. Difratograma de raios X da amostra Fe_Cl, destacando os planos de
difração e o padrão da magnetita (JCPDS 19-0629).
50
A magnetita apresenta uma estrutura cristalina do tipo espinélio inverso, de cela
unitária cúbica de face centrada contendo 32 íons O2- que são regularmente
empacotados em uma arranjo cúbico ao longo da direção [111]. O parâmetro de rede a
é igual 0,839 nm e existem oito fórmulas por cela unitária. A magnetita difere da maioria
dos outros óxidos de ferro por possuir em sua estrutura íons Fe(II) e Fe(III)86.
No entanto, devemos considerar que a maguemita (γ-Fe2O3) tem uma estrutura
cristalina similar à magnetita, com a diferença de que, no caso da maguemita, apenas
íons Fe(III) estão presentes. As vacâncias de cátions são compensadas pela oxidação
dos íons Fe(II). A maguemita apresenta cela unitária cúbica com a igual a 0,834 nm.
Cada cela unitária da maguemita possui 32 íons O2-, oito cátions ocupando os sítios
tetraédricos e o restante é distribuído aleatoriamente entre os sítios octaédricos e
tetraédricos86.
Como consequência, a semelhança nas estruturas cristalinas da magnetita e da
maguemita gera padrões de difração similares para as duas fases e parâmetros de rede
muito próximos. Sendo assim, apenas com os dados de XRD não é possível descartar
a formação da fase maguemita na amostra Fe_Cl. Outras técnicas foram necessárias
para confirmação da fase obtida e serão apresentadas no decorrer do texto.
Para a amostra obtida a partir do nitrato de ferro(III) como precursor (Fe_NO3), o
difratograma de raios X é apresentado na Figura 21. A partir da posição dos planos de
difração foi possível indexar diferentes fases do óxido de ferro. Além da magnetita e/ou
maguemita, para a amostra Fe_NO3 foi obtida também a fase hematita (α-Fe2O3).
A hematita é isoestrutural ao corundum (Al2O3). Apresenta cela unitária
hexagonal compacta com parâmetros de rede a = 0,5034 nm e c = 1,375 nm. Existem
seis fórmulas por cela unitária.
Além dos picos de difração característicos das diferentes fases do óxido de ferro,
o difratograma apresenta um pico bastante intenso abaixo de 10° (2θ) que pode ser
atribuído ao oxo-hidroxo acetato de ferro(III) hidratado (Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O), um
possível intermediário na síntese das partículas magnéticas.
51
10 20 30 40 50 60 70
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2θ (graus)
Fe_NO3
Hematita
Magnetita
Acetato de ferro
Figura 21. Difratograma de raios X da amostra Fe_NO3 destacando as diferentes fases
presentes na amostra e os padrões utilizados na indexação. (Magnetita - JCPDS 19-
629; Hematita - JCPDS 33-664; Oxo-hidroxo acetato de ferro(III) hidratado - JCPDS 50-
290).
Para a amostra Fe_Cl foi possível determinar o tamanho de cristalito (D) em 51,7
nm. O D foi calculado a partir da equação de Scherrer87 (2). O mesmo não foi possível
para a amostra Fe_NO3 devido a mistura de fases e sobreposição dos picos.
(2)
onde k = constante de forma, cujo valor utilizado é igual a 0,9 considerando que os
cristalitos sejam esféricos; λ = comprimento de onda da radiação utilizada nas medidas
de difração de raios X (CuKα = 1,5406 Å); Bm = largura a meia altura (em rad) do pico
de difração referente ao plano mais intenso (311) da magnetita, Bs = largura a meia
altura (em rad) do pico de difração de maior intensidade do padrão de silício utilizado
como referência nos cálculos.
52
Além do tamanho de cristalito, o parâmetro de rede a também foi calculado a
partir da equação 3, considerando um arranjo cúbico. O valor obtido foi de 0,840 nm,
valor este muito próximo do encontrado para a magnetita (0,839 nm).
(3)
onde dhkl distância interplanar; a = parâmetro de rede e h, k, l = índices de Miller.
Na busca da elucidação das fases presentes nas amostras, seguiu-se com a
caracterização das amostras por IR. De acordo com a literatura86, a banda de absorção
no IR característica do estiramento da ligação Fe-O pode ser utilizada para inferir sobre
a presença ou não da fase maguemita na amostra. Como mostrado na Figura 22, os
diferentes óxidos de ferro – hematita, maguemita e magnetita – apresentam diferenças
importantes na banda referente ao estiramento Fe-O. A hematita apresenta uma banda
larga desdobrada em torno de 600 cm-1 e uma absorção fraca acima de 600 cm-1. A
magnetita apresenta uma única banda larga em torno de 600 cm-1 e uma fraca
absorção próximo a 400 cm-1. Para a maguemita, o sinal aparece desdobrado em várias
bandas entre 700 – 400 cm-1.
dhkl =
Hematita
Magnetita
Maguemita
Figura 22. Espectros no infravermelho referente ao
estiramento da ligação Fe-O nos diferentes óxidos
de ferro: hematita, magnetita e maguemita.
[Adaptado da referência 86]
53
No espectro IR da amostra Fe_Cl, Figura 23, é possível observar uma única
banda abaixo de 600 cm-1, em 583 cm-1, atribuída ao νFe-O característico da fase
magnetita86. Como apresentado na Figura 23, observam-se duas bandas de baixa
intensidade que foram atribuídas a δCH2, em 1431 cm-1, e ao νCO, em 1076 cm-1. Esses
sinais indicam a presença na amostra de um resíduo orgânico derivado do EG e/ou
PEG na superfície das partículas88. As bandas observadas em 3454 cm-1 e 1622 cm-1,
correspondem ao νOH e δHOH, respectivamente, atribuídas às moléculas de água de
adsorção. Ou seja, de acordo com os dados de IR, a amostra Fe_Cl é constituída por
magnetita, corroborando com os dados de XRD.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
583
1076
1431
1622
3454
Número de onda (cm-1)
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Fe_Cl
Figura 23. Espectro de absorção no infravermelho da amostra Fe_Cl.
Para a amostra Fe_NO3, cujo espectro é apresentado na Figura 24, a banda
larga e desdobrada em torno de 600 cm-1 é característica da absorção referente ao νFe-
O na maguemita. Porém, por tratar-se de um sinal bastante largo e intenso as bandas
da hematita e magnetita podem também estar presentes. Sendo assim partindo-se da
mistura de fases sugerida por XRD, a banda observada em 607 cm-1 foi atribuída ao
νFeO no (Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O)89, enquanto que o mesmo sinal observado em 532
cm-1 pode ser atribuído a fase γ-Fe2O3 e, em 439 cm-1, a fase α-Fe2O3. São também
destacadas na Figura 24 outras bandas características do grupo acetato coordenado ao
Tra
nsm
itâ
nci
a (
u.a
.)
54
íon ferro, bandas do EG e PEG e das moléculas de água de adsorção presentes na
amostra.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
439
532
607
640
88511
2610
85
950
1444
1585
1633
1680
287129
21
3421
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Número de onda (cm-1)
Fe_NO3
Figura 24. Espectros de absorção no infravermelho da amostra Fe_NO3.
Os dados obtidos para as duas amostras Fe_Cl e Fe_NO3 e as respectivas
atribuições são sumariados na Tabela 2.
A espectroscopia Raman também foi utilizada na investigação da fase obtida nas
amostras do caroço magnético. Apesar de elucidativa na caracterização de óxidos de
ferro, diferentes trabalhos da literatura mostram que os óxidos de ferro são
extremamente sensíveis a radiação laser utilizada na obtenção dos espectros Raman,
sofrendo mudanças de fases cristalinas decorrentes do calor local provocado pela
incidência da radiação laser durante as medidas90. Logo, para cada amostra, é
necessário que se encontre a melhor condição de análise enquanto potência do laser e
tempo de exposição da amostra ao laser. Considerando o comportamento dos óxidos
de ferro quando aquecidos, temos que a magnetita oxida a hematita tendo a maguemita
como intermediário (Figura 25)91,92.
PEG PEG
Acetato
Tra
nsm
itâ
nci
a (
u.a
.)
55
Tabela 2. Atribuições dos principais modos vibracionais observados para as amostras
Fe_Cl e Fe_NO3.86,89,90
Amostra Atribuição Fonte Número de onda (cm-1)
Fe_Cl νFeO Fe3O4 583 νCO PEG/EG/ C2H3O2
- 1076 δCH2 PEG/EG 1431 δHOH H2O 1622 νOH Fe3O4/H2O 3454
Fe_NO3 νFeO α-Fe2O3 439 νFeO γ-Fe2O3 532 νFeO Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O 607 δCOC PEG 640 νCC PEG 885-950
νCOC PEG 1085-1126 νCOO sim Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O 1444 δHOH H2O 1633 νCOO assim Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O 1680 νCOO assim C2H3O2
- 1585 νCH2 PEG 2871-2921
νOH OH/H2O 3421
Figura 25. Interconversão entre as diferentes fases do óxido de ferro magnetita,
maguemita e hematita, destacando a: (a)Temperatura e (b) Equações químicas.
A Tabela 3 apresenta os modos vibracionais ativos no Raman para as diferentes
fases magnetita, maguemita e hematita, descritos na literatura91.
Tabela 3. Diferentes fases cristalinas de óxido de ferro e os respectivos modos
vibracionais observados no espectro Raman.91
Fase cristalina Número de onda (cm-1) / Modo vibracional ativo
Hematita 229/A1g 249/Eg* 295/Eg 302/Eg 414/Eg 500/A1g 615/Eg 660/Eu
Maguemita 365/T2g 511/Eg 700/A1g*
Magnetita 310/T2g 554/T2g 672/A1g*
*Modos de maior intensidade.
1 2 (a)
(b)
56
Na caracterização das amostras utilizou-se o laser verde (514 nm) em diferentes
potências mantendo-se fixo o tempo de exposição em 120 s. Os resultados obtidos são
apresentados na Figura 26.
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750
Fe_NO3 (1,7 mW)
Fe_Cl (4,5 mW)
590
393255
Número de onda (cm-1)
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
664
701494
338
216
276
Fe_Cl (1,7 mW)
Figura 26. Espectros Raman das amostras Fe_Cl com diferentes potências de laser e
da amostra Fe_NO3.
A amostra Fe_Cl foi utilizada como referência na seleção da potência do laser
uma vez que, de acordo com os dados mostrados até aqui, deve tratar-se de uma
amostra de magnetita, portanto sensível ao laser. É possível observar na Figura 26 que
a magnetita aparece como provável única fase considerando a presença da banda
intensa em de 664 cm-1, característica do modo A1g da magnetita (Tabela 3). Neste
caso, apesar do valor encontrado aproximar-se do modo Eu da hematita (em 660 cm-1,
de acordo com a Tabela 3), a presença desta fase foi descartada uma vez que a banda
mais intensa característica da hematita, em 249 cm-1, não foi observada. Para a
amostra Fe_Cl (Figura 26), observa-se que com o aumento da potência do laser é
possível identificar diferentes modos vibracionais característicos da fase maguemita. As
bandas observadas em 338, 494 e 701 cm-1, são atribuídas, respectivamente, aos
modos T2g, Eg e A1g da maguemita (Tabela 3). Como esperado, este resultado revela a
57
oxidação da magnetita a maguemita apenas a partir do aumento da potência do laser. A
partir desses resultados, podemos concluir que a amostra de Fe_Cl é constituída
predominantemente por magnetita.
A partir dos resultados obtidos para a amostra Fe_Cl fixou-se a potência do laser
em 1,7 mW para a análise da amostra Fe_NO3, variando-se agora o tempo de
exposição na tentativa de provocar a oxidação das outras fases de óxido de ferro
identificadas na amostra. O espectro Raman obtido (Figura 26) apresenta os modos
característicos da fase hematita, sendo os valores em 255, 276, 393 e 590 cm-1
referentes ao modo Eg, e a banda em 216 cm-1 característica do modo A1g da mesma
fase. Esse resultado sugere a hematita como fase predominante na amostra Fe_NO3.
A interconversão entre as diferentes fases – Fe3O4, γ-Fe2O3 e α- Fe2O3 – é uma
propriedade característica da família dos óxidos de ferro. A transformação da magnetita
em hematita envolve a oxidação dos íons Fe(II) a Fe(III). A oxidação da magnetita é
largamente descrita na literatura que sugere um mecanismo em duas etapas (como
mostrado na Figura 25), sendo a etapa intermediária caracterizada pelo ganho de
oxigênio e formação da maguemita, sendo esta uma fase metaestável que, com a
elevação da temperatura, leva a formação da hematita91,92.
A reatividade da magnetita frente a oxidação é depende de muitos fatores como,
por exemplo, a área superficial das partículas e a presença de defeitos e impurezas na
estrutura do cristal93. A temperatura de oxidação pode variar de acordo com as
características da amostra podendo ocorrer a temperaturas inferiores a 500 °C18.
Gallagher et al.94 propuseram um mecanismo para a oxidação da magnetita com base
na difusão de íons ferro(II). Eles encontraram que o coeficiente de difusão depende da
relação de Fe(II)/Fe total presente na amostra. Observaram também que partículas de
magnetita da ordem de 300 nm, foram oxidadas a hematita em temperatura inferior a
180 °C.
Neste trabalho, a oxidação da magnetita foi acompanhada por TGA/DTA. A curva
TGA/DTA para a amostra Fe_Cl é mostrada na Figura 27(a).
58
100 200 300 400 500
0
10
20
30
10 20 30 40 50 60 70
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
2θ (graus)
323
250219(a) Fe_Cl
Temperatura (0C)
dm/d
T (
µV)
∆massa = + 3,5%
γ-Fe2O
3
TG
DTA
100
102
104
% M
assa
100 200 300 400 5000
50
100
150
200
250
300
350
(b) Fe_NO3
Temperatura (0C)
Dif.
tem
p. (
µV)
290
80
85
90
95
100
DTA
*
10 20 30 40 50 60 70
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
2θ (graus)
% M
assa
∆massa = −20%
*
α−Fe2O3
TG
Figura 27. Curvas TGA/DTA das amostras: (a) Fe_Cl e (b) Fe_NO3.
Na figura 27(a) observa-se uma perda de massa até 150 °C atribuída a
dessorção de moléculas de água da superfície das partículas. Após este fenômeno,
entre 200-300 °C observa-se um ganho de massa de aproximadamente 3,5% que,
como discutido anteriormente, pode ser atribuído a oxidação da magnetita a
maguemita. Os resultados apresentados para Fe_Cl sugerem portanto, a magnetita
como fase predominante na amostra.
↓endo
↑exo
↑exo
↓endo
59
Um comportamento térmico diferente é observado para a amostra Fe_NO3, como
indica a Figura 27(b). Observa-se também uma perda inicial de moléculas de água de
adsorção até 150 °C, no entanto o sistema segue perdendo massa até 300 °C. Este
fato está de acordo com os dados apresentados anteriormente que sugerem a presença
na amostra de uma mistura de fases além de resíduo do EG e PEG95. Tanto o PEG
quanto o (Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O) sofrem decomposição térmica na região
considerada, entre 150-300 °C, totalizando 20% de perda de massa. Sendo assim, não
existe nenhuma evidência da formação da fase magnetita na amostra Fe_NO3. Logo, o
conjunto de dados obtidos por TGA/DTA, XRD, IR e Raman indicam uma mistura de
óxidos de ferro na amostra Fe_NO3, sendo predominante a hematita e, estando
presente também a maguemita.
A partir dos resultados apresentados para as amostras Fe_Cl e Fe_NO3 e de
acordo com dados da literatura45,96,97,98, propõe-se três etapas para a síntese das
partículas de magnetita. Inicialmente, durante os 30 min de agitação à temperatura
ambiente, o precipitado avermelhado que se obtém é constituído por
(Fe2O·(OH)3·(C2H3O2)·H2O). Quando o sistema é selado em autoclave e a temperatura
é elevada a 200 °C, ocorre a segunda etapa da síntese que consiste na oxidação do
EG, formação do Fe(OH)3 e redução parcial dos íons Fe(III) a Fe(II), levando a
formação dos respectivos hidróxidos de ferro, Fe(OH)2 e Fe(OH)3. Em uma terceira
etapa, à temperatura de 200 °C, os hidróxidos sofrem desidratação levando a obtenção
da fase magnetita.
Contudo o mecanismo proposto para a síntese da magnetita deve ser
considerado apenas quando o contra-íon precursor é o cloreto, tendo em vista que o
ânion nitrato leva a uma mistura de fases.
Sigoli et al.99 estudaram a influência do contra-íon na morfologia e cristalinidade
de hidroxicarbonatos de zinco obtidos via precipitação homogênea. Os autores
observaram que tanto a morfologia quanto a cristalinidade são função dos complexos
formados em solução aquosa e da interação dos ânions com os núcleos formados no
processo de precipitação. O cloreto e o nitrato diferem em volume e na geometria
espacial, podendo deste modo interagirem diferentemente com os núcleos de
precipitação, produzindo diferentes formas de partícula para mesma concentração. O
60
cloreto, mais volumoso e menos coordenante, permite que a precipitação ocorra mais
rapidamente, produzindo assim amostras menos cristalinas em relação aquelas obtidas
a partir de sal de nitrato.
Partindo-se das considerações acima é possível inferir que, da mesma forma
para a síntese solvotérmica da magnetita, os ânions cloreto e nitrato influenciam na
formação dos núcleos que levarão a obtenção das diferentes fases do óxido de ferro.
Provavelmente por ser mais volumoso e menos coordenante, o ânion cloreto permite
que os íons Fe(III) permaneçam livres em solução e possam ser reduzidos a Fe(II),
levando a precipitação dos respectivos hidróxidos que levarão a formação da fase
magnetita. Neste caso, a única diferença é que a cristalinidade das partículas é elevada
devido à alta temperatura utilizada na síntese (200 °C). Por outro lado, o ânion nitrato,
por apresentar um maior efeito coordenante, dificulta a redução dos íons Fe(III),
levando a formação de óxidos de ferro como hematita e maguemita que são
constituídas exclusivamente por Fe(III). Além disso, os ânions precursores afetam
também a morfologia final das partículas como será discutido a seguir a partir da
apresentação dos dados morfológicos das amostras.
A morfologia das partículas bem como o seu diâmetro médio foram estudados
por SEM. Com relação à morfologia das partículas, um comportamento diferente entre
as amostras também foi observado variando-se o ânion precursor. Analisando-se as
micrografias SEM da amostra Fe_Cl apresentadas na Figura 28(a), observa-se que
foram obtidas partículas dispersas com morfologia esférica e, de acordo com as
imagens mostrada nas Figura 28(b) e (c), as partículas são nanoestruturadas, ou seja,
formadas por agregados de partículas menores (nanogrãos), levando a obtenção de
suprapartículas ou microesferas de magnetita.
61
Figura 28. (a), (b) e (c) Micrografias SEM da amostra Fe_Cl.
(a)
(b)
(c)
62
A partir da contagem de 300 partículas, foi possível construir o histograma de
distribuição de tamanho apresentado na Figura 29. O diâmetro das partículas varia de
350-800 nm sendo o diâmetro médio resultante igual a 753 ± 11 nm. A contagem dos
grãos (150 contagens) permitiu a construção do histograma observado na Figura 29. O
diâmetro médio encontrado para os nanogrãos foi de 46 ± 1 nm. É interessante
destacar que o diâmetro médio estimado para os nanogrãos a partir das imagens de
SEM, é próximo do tamanho de cristalito determinado através dos dados de XRD (51,7
nm). Esta observação mostra que os dados de SEM e XRD convergem e permitem
propor que as partículas são nanoestruturadas e que cada nanogrão representa um
cristalito de Fe3O4.
0 200 400 600 800 1000
46 + 1 nm
Amostra Fe_Cl
Nº
de c
onta
gens
Diâmetro (nm)
Nanogrãos
753 + 11 nm
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 10000
20
40
60
80
100
Figura 29. Histograma da distribuição do diâmetro dos nanogrãos e do diâmetro de
partícula para a amostra Fe_Cl.
Essa nanoestrutração é decorrente do mecanismo de nucleação e crescimento
das partículas na síntese solvotérmica. Nesta metodologia, tanto o PEG como o próprio
solvente (EG) atuam como passivantes estéricos de superfície influenciando no
crescimento dos nanogrãos. Após a etapa de crescimento, os nanogrãos se auto-
organizam gerando as microesferas magnéticas45. Uma ilustração da auto-organização
das partículas é apresentada na Figura 30.
63
FeCl3 + NaC2H3O2·3H2O
EG-PEG
200 °C
Auto-organização
Microesferas magnéticas
Figura 30. Ilustração do processo de formação das microesferas magnéticas obtidas a
partir do cloreto de ferro(III). [Adaptado da referência 45]
Para a amostra Fe_NO3, Figura 31(a), nas micrografias SEM as partículas
aparecem encobertas pelo resíduo orgânico derivado da síntese, prejudicando assim a
atribuição de uma morfologia às partículas obtidas. A Figura 31(b), refere-se a amostra
Fe_NO3 após tratamento térmico à 500 oC e eliminação do resíduo orgânico. A imagem
de SEM revela que foram obtidas partículas esferoidais, porém não se observa nenhum
tipo de nanoestruturação.
(a)
µm1
(c)
200 nm
Figura 31. (a) e (b) Micrografias SEM da amostra Fe_NO3.
Considerando os resultados obtidos, a amostra Fe_Cl foi a que apresentou
pureza de fase e morfologia definida. Sendo assim, esta amostra foi a selecionada para
constituir o caroço magnético da plataforma magneto-porosa proposta. A partir deste
ponto do trabalho, a amostra passará a ser identificada simplesmente como Fe3O4 ou
ainda como caroço magnético.
(b) (a)
64
4.2. Caracterização química, estrutural e morfológica da plataforma
magneto-porosa caroço@casca do tipo Fe3O4@dSiO2@mSiO2
Nesta segunda etapa do trabalho foram obtidas duas amostras contendo as
partículas magnéticas nanoestruturadas de Fe3O4 como caroço da plataforma magneto-
porosa: (i) Fe3O4@dSiO2@1mSiO2, contendo o caroço magnético recoberto com uma
camada de sílica densa e uma camada de sílica porosa e a amostra (ii)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, contendo uma camada de sílica densa e duas camadas de
sílica porosa.
A Figura 32 ilustra o procedimento de recobrimento das partículas de Fe3O4 com
sílica a partir do TEOS. As etapas de hidrólise e condensação do alcóxido (etapas 1 e
2) acontecem na presença das microesferas de Fe3O4. A superfície dessas
microesferas sendo ricas em grupos OH, favorece a condensação do precursor alcóxido
hidrolisado na superfície das partículas, promovendo assim o recobrimento. Quando
acontece na ausência do CTAB (Etapa 1), a camada depositada é constituída de sílica
não porosa. A deposição desta primeira camada de sílica é de fundamental importância
no desenvolvimento da plataforma-magneto-porosa por dois motivos: (i) auxilia na
proteção do caroço magnético contra lixiviação nas etapas seguintes de recobrimento
com sílica mesoporosa e na etapa de remoção do CTAB e (ii) permite uma deposição
homogênea das camadas de sílica mesoporosa.
Figura 32. Ilustração do procedimento de recobrimento das partículas de Fe3O4 com
sílica.
O CTAB é um surfactante catiônico quaternário de amônio que atua como
direcionador de estrutura na formação dos poros na Etapa 2 do recobrimento. O
SiO
O
O
O+
etanol/H2O
OH-
TEOSFe3O4
OH
OH
OHOH
HO
HO
SiO
O
O
O+
etanol/H2O
OH-
TEOS CTAB
OH
OH
OHOH
HO
HO
Fe3O4@dSiO2 Fe3O4@dSiO2@mSiO2Etapa 1 Etapa 2
65
mecanismo que descreve a atuação do CTAB na formação dos poros envolve a forte
interação do conjunto de micelas carregadas positivamente - constituídas pelos íons
cetiltrimetilamônio - com os ânions silicato derivados da hidrólise-condensação do
TEOS em meio básico. Em temperatura ambiente, a distribuição dessas micelas é
aleatório o que resultara em um sistema poroso desordenado. De acordo com a
literatura, é possível estimar o diâmetro do poro que será formado quando da remoção
do direcionador de acordo com o comprimento da cadeia carbônica do mesmo. Para o
CTAB (C16), o diâmetro estimado para o poro é de 2,2 nm, o que caracteriza um
material mesoporoso52.
As metodologias utilizadas para a remoção do CTAB de matrizes de sílica são a
calcinação e a extração por solvente76. Para o nosso material a calcinação não é a
metodologia mais adequada, pois, como discutido previamente, o aquecimento leva a
oxidação da magnetita a hematita o que prejudicaria a resposta magnética da
plataforma final. Por esse motivo a extração por solvente foi a metodologia aplicada
neste trabalho. Foram realizados vários testes utilizando-se volumes e concentrações
diferentes de uma solução ácida de etanol até que se chegasse no procedimento
estabelecido neste trabalho em que se utiliza, para cada 100 mg de Fe3O4 de partida,
15 mL de uma solução de etanol-HCl 1% (v/v) à 60 °C por 15 min, em ultrassom.
Nessas condições as propriedades químicas e magnéticas das partículas do caroço são
preservadas.
Nos difratogramas de raios X das amostras recobertas com sílica (Figura 33),
observa-se que o padrão de difração do caroço de Fe3O4 é mantido mostrando que o
procedimento de recobrimento não interfere na fase magnética desejada. Na mesma
Figura 33, para a amostra recoberta com duas camadas de sílica porosa, observa-se
um halo entre 20 e 30 º (2θ), característico de sílica não-cristalina, confirmando a
presença da sílica no sistema. Para a amostra contendo apenas uma camada de sílica
porosa o halo não é observado devido a menor quantidade de sílica na amostra.
66
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Fe3O4 @dSiO2@2mSi
Fe3O4 @dSiO2@1mSi
Inte
nsi
dad
e (u
.a.)
2θθθθ (graus)
Fe3O4
Figura 33. Difratogramas de raios X do Fe3O4 e das plataformas magneto-porosas.
A Figura 34 apresenta os espectros de absorção no IR obtidos para as plataformas magneto-porosas e o espectro do caroço magnético para comparação.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
460
586
1200
1637
3460
% T
rans
mitâ
ncia
Fe3O
4
Fe3O
4@dSiO
2@1mSiO
2)
Fe3O
4@dSiO
2@2mSiO
2
Número de onda (cm-1)
Figura 34. Espectros de absorção no infravermelho da amostra Fe3O4 e das
plataformas magneto-porosas.
Tra
nsm
itâ
nci
a (
u.a
.)
67
As bandas no IR observadas na região de 3460 cm-1 e 1637 cm-1 são atribuídas
aos modos vibracionais νOH e δHOH, respectivamente, característicos das moléculas de
água adsorvidas na superfície das partículas. A banda que caracteriza o νFe-O na
magnetita em torno de 586 cm-1, é observada para as três amostras indicando que a
fase magnetita do caroço foi preservada durante as etapas de recobrimento. A
deposição da camada de sílica é evidenciada pela presença das bandas em torno de
1200 cm-1, referente à νSiOSi e 460 cm-1 atribuída ao δSi-O88. O estiramento dos grupos
silanol aparecem também na região de 3400 cm-1.
É importante destacar que nos espectros de absorção no IR das plataformas não
são observadas bandas atribuídas ao CTAB, indicando que a metodologia adotada foi
eficiente na remoção do template das amostras da plataforma magneto- porosa.
A obtenção da estruturação hierárquica do tipo caroço-casca é evidenciada nas
micrografias SEM obtidas para as amostras da plataforma magneto-porosa (Figura 35).
As micrografias da Figura 35 permitem identificar o caroço magnético revestido
pelas camadas de sílica. As partículas são revestidas individualmente, porém aparecem
agregadas. Analisando-se as figuras, observa-se que a espessura da camada de sílica
aumenta com o número de deposições.
68
1 µm
1 µm
1 µm
Figura 35. Micrografias de SEM das amostras: (a) e (b) Fe3O4@dSiO2@1mSiO2; (c) e
(d) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2.
Através da análise por SEM foi possível estimar a espessura das camadas de
sílica bem como o diâmetro das partículas a partir dos histogramas apresentados na
Figura 36. A camada de sílica densa depositada previamente nas partículas não pode
ser identificada por SEM, sugerindo uma espessura extremamente fina para esta
camada. Os resultados obtidos de espessura média da casca de sílica porosa e
diâmetro médio das partículas da plataforma são sumariados na Tabela 4.
(a) (b)
(c) (d)
69
0 200 400 600 800 1000 12000
20406080
100
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2
Caroço@casca
853 + 2 nm
(diâmetro)
Caroço
753 + 11 nm
(diâmetro)
Nº
de c
onta
gens
Comprimento (nm)
Casca
70 + 1 nm
(espessura)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 12000
20406080
100
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
Caroço@casca
1052 + 3,5 nm
(diâmetro)
Caroço
753 + 11 nm
(diâmetro)
Nº
de c
onta
gens
Comprimento (nm)
Casca
166 + 2,5 nm
(espessura)
Figura 36. Histogramas da distribuição da espessura da casca de sílica (esquerda), do
diâmetro do caroço de Fe3O4 (centro) e do diâmetro das partículas recobertas (direita)
para as amostras: (a) Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 e (b) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2.
Tabela 4. Valores calculados do diâmetro médio das partículas do caroço de Fe3O4 e
recobertas com uma e duas camadas de sílica. Estimativa da espessura da casca
obtida em cada etapa de recobrimento.
Amostra Diâmetro da partícula
(nm)
Espessura da casca
(nm)
Fe3O4 753 ± 11 - - - -
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 853 ± 2 70 ± 1
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 1052 ± 3,5 166 ± 2,5
A caracterização textural das amostras foi realizada a partir das isotermas de
adsorção/dessorção de N2. Uma isoterma de adsorção/dessorção de N2 mostra a
relação entre a quantidade molar de um gás (adsorbato) adsorvida ou dessorvida por
(a)
(b)
70
um sólido (adorvente), a uma temperatura constante, em função da pressão do gás.
Segundo a IUPAC (do inglês, International Union of Pure and Applied Chemistry), as
isotermas podem ser classificadas em seis diferentes tipos como ilustrado na Figura 37.
Figura 37. Classificação das isotermas de adsorção/dessorção segundo a IUPAC.100
A isoterma do tipo I (Figura 37 (a)) é característica de materiais microporosos (φ
< 2 nm). A isoterma do tipo II (Figura 37 (b)) é típica de adsorventes não porosos ou
macroporosos (φ > 50 nm). O ponto B destacado na Figura 37 caracteriza o ponto de
inflexão da isoterma. Este ponto indica o estágio em que o adsorvente está totalmente
recoberto por uma monocamada do gás e multicamadas de adsorção começam a se
formar. Os materiais cuja atração entre adsorvente-adsorbato é fraca apresentam
isoterma do tipo III (Figura 37 (c)). Neste caso o ponto B não é observado e as
interação adsorbato-adsorbato são predominantes. Isotermas do tipo IV (Figura 37 (d))
são características de materiais mesoporosos (2 < φ < 50 nm). A principal característica
desta isoterma é a presença de um ciclo de histerese no intervalo de P/P0 de 0,1 – 0,4
decorrente do fenômeno de capilaridade (ou condensação do gás) que ocorre dentro
dos poros. É também característico desses materiais o ponto B ocorrer na região de
P/P0 igual a 0,4100,101. O patamar final observado na isoterma indica o completo
I II
III IV
V VI
Qua
ntid
ade
adso
rvid
a
Pressão relativa
B
B
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
71
preenchimento dos poros, e o início da isoterma pode ser atribuído a uma adsorção do
tipo mono-multicamadas caracterizada pelo presença do ponto B, como observado nas
isotermas do tipo II. A isoterma do tipo V (Figura 37 (d)) é similar à do tipo IV porém,
assim como nas isotermas do tipo III, o ponto B não é observado indicando baixa
afinidade entre adsorvente-adsorbato. A isoterma do tipo VI (Figura 37 (f)) é obtida
através da adsorção do gás por um sólido não poroso de superfície quase uniforme, o
que representa um caso muito raro entre os materiais mais comuns.
As isotermas de adsorção-dessorção de N2 obtidas para a amostra Fe3O4 e para
as amostras da plataforma recobertas com sílica são apresentadas na Figura 38. A
isoterma de adsorção das partículas de Fe3O4 (Figura 38 (a)) pode ser classificada
como do tipo III. Neste caso a interação do adsorbato-adsorvente é fraca e, de acordo
com a literatura, este tipo de isoterma é característico da adsorção de moléculas de
nitrogênio em superfícies poliméricas como polietileno100. Para a amostra Fe3O4, este
fenômeno pode ser explicado pela presença de um resíduo polimérico derivado do
EG/PEG existente na superfície das partículas, como sugerido pelos dados de IR
discutidos anteriormente, mas não evidenciado por SEM em comparação com a
amostra Fe_NO3. A histerese observada na curva pode ser atribuída à porosidade
intrínseca do material que, como discutido anteriormente, é constituído por microesferas
de Fe3O4 nanoestruturadas. A auto-organização dos nanogrãos na formação das
microesferas resulta em um sistema não denso, permeável ao N2. Desta forma,
algumas moléculas de N2 podem ficar aprisionadas entre os nanogrãos o que implica
na não reversibilidade da curva de adsorção. A micrografia SEM das partículas de
Fe3O4, observada na Figura 28(c) ilustra claramente essa porosidade resultante da
auto-organização dos nanogrãos.
Para as partículas recobertas com sílica (Figura 38 (b) e (d)), as isotermas são
do tipo IV indicando a presença de mesoporos.
72
Fe3O4
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,00
10
20
30
40
50
Vol
ume
de N
2 ad
sorv
ido
(cm
3 g-1)
P/P0
F3O
4
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,020
40
60
80
100
120
Vol
ume
de N
2 ad
sorv
ido
(cm
3 g-1)
P/P0
F3O4@dSiO2@1mSiO2
5 10 15 20 25
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
dV(lo
g d)
/cm
3 g-1
Diâmetro de poro (nm)
Adsorção Dessorção
Fe3O
4@dSiO
2@1mSiO
2
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
60
80
100
120
140
160
180
200
Vol
ume
de N
2 ad
sorv
ido
(cm
3 g-1)
P/P0
F3O
4@dSiO
2@2mSiO
2
5 10 15 20 25
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
dV(lo
g d)
/cm
3 g-1
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
Diâmetro de poro (nm)
Adsorção Dessorção
Figura 38. Isotermas de adsorção/dessorção de N2 das amostras: a) Fe3O4; b)
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 e c) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. (Regiões destacas nas
isotermas: 1 = microporos, 2 = força de tensão e 3 = porosidade secundária)
(b) (c)
(d) (e)
1
3
2
1
2
3
dessorção
dessorção
adsorção
adsorção
*artefato
(a)
*artefato
73
É descrito na literatura que existe uma correlação entre o formato da histerese e
algumas propriedades relacionadas à porosidade dos adsorventes mesoporosos como,
por exemplo, tamanho e distribuição do diâmetro dos poros, geometria e conectividade.
Uma classificação empírica é dada pela IUPAC, como ilustrado na Figura 39.
Qu
an
tid
ad
e a
dso
rvid
a →
Pressão Relativa →
Figura 39. Classificação dos ciclos de histerese em materiais mesoporosos segundo a
IUPAC.101
De acordo com a IUPAC, a histerese do tipo H1 (Figura 39 (a)) é característica
de poros ordenados que formam canais de geometria e diâmetro bem definidos, ou de
poros associados ao empacotamento de esferas uniformes. Materiais que apresentam
porosidade desordenada, ou seja, sem definição de geometria e larga distribuição de
diâmetro de poros apresentam histerese do tipo H2 (Figura 39 (b)). Isotermas que
exibem histerese do tipo H3 (Figura 39 (c)) não apresentam um patamar de adsorção
para altos valores de P/P0. Este tipo de comportamento está associado com a presença
de agregados não rígidos que dão origem a poros do tipo fenda. Este tipo de
porosidade gera um ciclo de histerese na região de P/P0 entre 0,5–1,0. Na literatura,
esta porosidade é descrita como porosidade textural ou secundária enquanto que
aquela proveniente da ação de um direcionador de estrutura no interior de uma
(a) (b)
(c) (d)
74
estrutura é denominada porosidade confinada101. A histerese H4 (Figura 39 (d)) é
similar a H3 incluindo também a região de microporos.
A partir das considerações apresentadas, as histereses observadas nas
isotermas das amostras recobertas com sílica (Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 e
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2) apresentadas na Figura 38 (b) e (d), podem ser classificadas
como H4. Para as duas amostras observa-se a presença de um ciclo de histerese de
P/P0 acima 0,5, caracterizando a existência de porosidade secundária. Esta
característica do material pode ser verificada nas micrografias SEM (Figura 35) das
referidas amostras. Pode-se inferir também sobre a presença de microporos no
sistema.
A existência de microporos é evidenciada pelo comportamento da dessorção
para P/P0 < 0,4. Como pode ser observado nas Figuras 38 (a) e (b), as curvas de
adsorção-dessorção não são coincidentes e este comportamento é previsto
teoricamente como mostrado pelas curvas pontilhadas que definem esta região na
Figura 39 (d). Uma observação cuidadosa das curvas da Figura (b) e (c) mostra que,
com a deposição da segunda camada de sílica, parte dos microporos presentes na
amostra é preenchida, o que leva a uma maior homogeneidade no revestimento das
partículas e, consequentemente, a uma diminuição da abertura da curva para a amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 em relação a amostra Fe3O4@dSiO2@1mSiO2.
Uma característica relevante dos materiais mesoporosos, e que pode ser
extraída das isotermas, relaciona-se com a queda brusca da pressão em P/P0 ∼ 0,4, o
que promove o fechamento do ciclo de histerese (região indicada como 2 nas isotermas
da Figura 38). Este fenômeno é denominado tensile strenght (ou cavitação) e ocorre
devido à evaporação espontânea do N2 de dentro dos mesoporos provocada pelo
abaixamento da pressão100.
Para materiais com as características de dessorção descritas acima, a literatura
sugere que o diâmetro de poro seja estimado a partir dos dados de adsorção100. Caso
contrário, utilizando-se os dados de dessorção, a curva apresentaria um artefato devido
à evaporação espontânea do gás que levaria a uma interpretação equivocada dos
resultados. Nas Figuras 38(c) e (e), são apresentadas as duas curvas de distribuição de
75
diâmetro de poro obtidas a partir dos dados de adsorção, pelo Método BJH (do inglês
Barret-Joyner-Halenda), e a curva obtida a partir dos dados de dessorção.
A análise da curva de distribuição do diâmetro de poro da amostra
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2, obtida a partir da adsorção (Figura 38(c)), mostra uma
distribuição larga que varia de 3–18 nm, com máximos em 3,6, 4,6 e 7 nm. O artefato
gerado na curva obtida a partir da dessorção é destacado na Figura 38(c).
Para a amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 (Figura 38(e)), as mesmas
considerações podem ser feitas. Porém, como sugerido anteriormente, a segunda
camada de sílica leva a uma distribuição de tamanho mais estreita (3,2 <φ< 12 nm)
caracterizando um sistema mais homogêneo.
Os valores de área superficial das amostras foram calculados a partir da parte
linear do plot BET (do inglês Braunauer-Emmet-Teller) da curva de adsorção, como
recomendado pela IUPAC100. Os valores obtidos de área superficial e de diâmetro e
volume de poro para as amostras do caroço de Fe3O4 e das plataformas magneto-
porosas são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Valores de área superficial específica, diâmetro e volume de poros para as
amostras do caroço de magnetita e da plataforma.
Amostra Área (BET)
(m2 g-1)
Diâmetro de
poro (nm)
Volume de poro
(cm3 g-1)
Fe3O4 12 _ _
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 162 3,6 – 18 0,11
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 355 3,2 - 12 0,12
Analisando os valores de área superficial apresentados na Tabela 5, observa-se
que as amostras recobertas com sílica são porosas uma vez que a área do caroço de
magnetita aumenta em 13 vezes quando adicionada a primeira camada de sílica porosa
e, depois da segunda camada, este valor praticamente dobra sugerindo que a área é
diretamente proporcional ao número de camadas de sílica depositadas. Estes
resultados mostram que a metodologia desenvolvida para o recobrimento das partículas
76
magnéticas permite controlar a espessura da casca e, como consequência, a área
superficial através do número de deposições.
4.3. Comportamento magnético das amostras do caroço e das
plataformas magneto-porosas
4.3.1. Caracterização por VSM
O comportamento da amostra do caroço de Fe3O4 em relação a um campo
magnético externo está representado na Figura 40. Na ausência do campo (Figura
40(a)) as partículas permanecem suspensas em água. No entanto, na presença do
campo as partículas são instantaneamente atraídas pela ação do campo (Figura 40(b)).
Figura 40. Comportamento das partículas do caroço de Fe3O4 suspensas em água
deionizada: (a) Na ausência do campo magnético; (b) Na presença do campo
magnético.
A curva de magnetização (M) versus campo aplicado (H) para a amostra do
caroço (Fe3O4) é apresentada na Figura 41, juntamente com as curvas obtidas para as
plataformas magneto-porosas.
Partículas na
ausência do ímã Partículas na
presença do ímã
(a)
(b)
77
(a)
-20000 -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 20000-100
-50
0
50
100
Mag
netiz
atio
n (e
mu
g-1)
H (Oe)
Fe3O4
Fe3O
4@dSiO
2@1mSiO
2
Fe3O
4@dSiO
2@2mSiO
2
(b)
-1000 -500 0 500 1000-100
-50
0
50
100
Mag
netiz
atio
n (e
mu
g-1)
H (Oe)
Fe3O
4
Fe3O
4@dSiO
2@1mSiO
2
Fe3O
4@dSiO
2@2mSiO
2
Figura 41. (a) Curvas de magnetização das amostras Fe3O4, Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 e
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, obtidas à temperatura ambiente; (b) Ampliação das curvas de
magnetização para observação dos ciclos de histerese.
O perfil das curvas da Figura 41 é muito similar àquele apresentado por
partículas superparamagnéticas, com a diferença de que existe para as amostras uma
coercividade (Hc) e remanência (MR) diferente de zero. Considerando apenas as
características morfológicas e estruturais das partículas, tal comportamento não seria
Ma
gn
eti
zaçã
oM
ag
ne
tiza
ção
78
esperado, uma vez que, para a magnetita, o diâmetro da partícula abaixo do qual é
esperado comportamento superparamagnético é ~20 nm32. Desta forma, considerando
apenas os dados morfológicos, o sistema seria classificado como ferromagnético mole.
Entretanto, considerando apenas a curva de histerese, o sistema poderia ser
classificado como superparamagnético. Sendo assim, cabe uma discussão sobre este
tipo de comportamento dos materiais nanoestruturados como será apresentada a
seguir.
A partir da observação acurada dos resultados obtidos da ampliação da histerese
apresentada na Figura 41(b), verifica-se que as partículas de Fe3O4 apresentam um
pequeno valor de Hc (51,8 Oe) e MR (7,2 emu g-1) (Tabela 6). Este comportamento
surge da agregação dos nanogrãos que afeta diretamente o comportamento magnético
do sistema gerando assim uma resposta magnética coletiva34. Individualmente, esses
nanogrãos seriam superparamagnéticos. Porém, com a formação dos agregados, os
momentos magnéticos de cada nanogrão, que poderiam ser considerados
monodomínios, passam a acoplar com os momentos magnéticos dos nanogrãos
vizinhos resultando assim em um sistema que apresenta elevada magnetização de
saturação (Ms) e baixos valores de Hc e Mr, mostrando que as microesferas
nanoestruturadas conservam as características mais importantes das NP
superparamagnéticas.
As interações magnéticas, que contribuem para os valores de Mr e Hc, podem ser
de diferentes naturezas: dipolar, troca direta (entre partículas que se tocam) ou
supertroca. A aplicação de modelos teóricos para explicação de tais fenômenos em
sistemas reais é dificultada por diversos fatores, dentre eles destacam-se a combinação
de diferentes interações, a morfologia das partículas, a distribuição de tamanho e eixos
de anisotropia e, na escala nanométrica, ganham importância também os efeitos de
superfície102.
Ainda sobre os dados obtidos das curvas de magnetização, considerando que os
valores de Ms são obtidos em função da massa da amostra utilizada na medida, os
dados de VSM permitiram estimar a porcentagem de Fe3O4 presente nas diferentes
amostras103. A descrição do cálculo realizado é feita a seguir utilizando-se como
exemplo a amostra Fe3O4@dSiO2@1mSiO2. Inicialmente, a partir da massa da amostra
79
utilizada na medida (5,3·mg) e da Ms (44 emu g-1, da Tabela 6), determina-se a
magnetização (M) da amostra em unidades eletromagnéticas (emu):
Ms amostra x Massa amostra = 44 emu g-1 x 5,3·10-3 g = 0,232 emu
Nas amostras da plataforma magneto-porosa somente o caroço de Fe3O4 é
responsável pela resposta magnética e, portanto, esta M calculada (0,232 emu) é
atribuída ao Fe3O4. Como a Ms do caroço é conhecida (85 emu g-1) (Tabela 6), é
possível calcular a massa de Fe3O4 presente na amostra:
M calculada x (1/Ms Fe3O4) = 0,232 emu x 1/85 emu g-1 = 2,74 mg de Fe3O4
Assim, em 5,3·mg de amostra de Fe3O4@dSiO2@1mSiO2, 2,74 mg é de Fe3O4,
ou seja, 52 % com indicado na Tabela 7. Como observado na Tabela 7, a porcentagem
Fe3O4 na amostra diminui e, consequentemente, diminui a Ms. Este comportamento era
esperado uma vez que, de acordo com as micrografias SEM da Figura 35, a espessura
da camada de sílica aumenta com o número de deposições diminuindo assim a relação
Fe3O4/SiO2.
Os dados de Ms, Hc, Mr e porcentagem de Fe3O4 nas amostras estão sumariados
na Tabela 6.
Tabela 6. Magnetização de saturação (Ms), magnetização remanente (Mr), coercividade
(Hc) e % de Fe3O4 das amostras do caroço e das amostras recobertas com sílica.
Amostra Ms (emu g-1) Mr (emu g-1) Hc* (Oe) %Fe3O4
Fe3O4 85 7,2 51,8 100
Fe3O4@dSiO2@1mSiO2 44 2,8 73,0 52
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 28 1,9 71,5 33
*Os valores de coercividade foram calculados a partir da média dos valores de –Hc e +Hc retirados das
curvas de histerese das amostras.
80
4.3.2. Caracterização por SQUID
Na tentativa de inferir sobre a existência de monodomínios magnéticos nos
sistemas magnéticos obtidos, foram realizadas medidas de magnetização em função da
temperatura. As curvas obtidas são ilustradas na Figura 42 (a) e (b).
A primeira observação que se faz é com relação ao perfil da curva ZFC-FC
obtida para as diferentes amostras. Para um sistema puramente superparamagnético,
como ilustrado na Figura 7 da página 13, seria esperado um comportamento reversível
acima da temperatura em que as partículas aparecem desbloqueadas e, decorrente
desta reversibilidade, deveríamos ter um máximo bem definido na curva ZFC referente
a T do material.
Na curva ZFC da amostra Fe3O4 (Figura 42 (a)), é possível observar um máximo
em torno de 50 K, indicando que nesta temperatura o sistema começa a sentir os
efeitos da temperatura. Este ponto pode ser identificado como a TB característica de
nanopartículas superparamagnéticas. Esta temperatura fica mais evidente a partir da
derivada da curva apresentada como linha pontilhada na Figura 42 (a), referente a
diferença entre as curvas ZFC-FC. A largura da curva ZFC caracteriza sistemas com
larga distribuição de tamanho e, consequentemente de TB. Esta observação corrobora
com os dados estruturais que indicam a presença dos nanogrãos na estrutura das
partículas. A TB observada é, portanto atribuída a existência de uma fração desses
nanogrãos em regime superparamagnético, sendo que podem existir nanogrãos
constituídos por multidomínios magnéticos que contribuem para o alargamento da curva
ZFC. Esta observação é evidenciada quando observamos a curva FC. As curvas ZFC-
FC não coincidem, ou seja, com o resfriamento não observamos o aumento da
magnetização como seria esperado considerando um comportamento agora
paramagnético das partículas. O que se observa é um deslocamento entre as curvas
causado pelo acoplamento magnético entre os nanogrãos e pela presença de
multidomínios que gera uma magnetização remanente no sistema. Logo, acima da
temperatura de bloqueio o que se tem é uma resposta coletiva do sistema que
apresenta agora as características do agregado e não dos nanogrãos individualmente.
Isto acontece porque, até 300 K, as partículas não se encontram completamente
desbloqueadas, ou seja, o acoplamento existente impede que ocorra um alinhamento
81
coletivo das partículas na presença do campo. O mesmo comportamento do caroço
magnético é observado na amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, como indicado pela
similaridade das curvas ZFC-FC (Figura 42).
0 50 100 150 200 250 300 350 400 4508
10
12
14
16
18
20Fe
3O
4
M (
mem
u)
T (K)
TB = 50 K
0 50 100 150 200 250 300
8
10
12
14
16
18
Mag
netiz
ação
(m
emu)
T (K)
Fe3O
4@dSiO
2@2mSiO
2
TB = 25 K
Figura 42. Curvas ZFC-FC para a amostra (a) Fe3O4 e (b) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2,
com campo aplicado igual a 50 Oe.
(a)
(b)
D(MZFC-MFc)/T vs. T
D(MZFC-MFc)/T vs. T
82
A TB extraída da curva da Figura 42(a) pode ser utilizada para estimar o diâmetro
dos domínios superparamagnéticos presentes, como previsto pela teoria de Stoner-
Wohlfarth35, segundo a relação expressa na Equação 4:
TB = (K/25kb).V (4)
onde TB = temperatura de bloqueio (K); K = constante anisotrópica da magnetita = 3·104
erg/cm3; Kb = constante de Boltzmann = 1,38·10-16 erg/K e V = (4/3)πr3.
Substituindo-se na Equação 4 os dados obtidos das curvas da Figura 42(a), o
diâmetro estimado do domínio magnético encontrado para as nanoestruturas do caroço
foi de 22 nm. Uma vez que tanto o tamanho estimado para o cristalito (51,7 nm) e para
os nanogrãos (46 nm) são maiores que o diâmetro estimado para os domínios
magnéticos, pode-se dizer que as nanoestruturas de Fe3O4 são constituídas por
multidomínios magnéticos, sendo uma pequena fração formada por monodomínios.
Este comportamento é justificado considerando que a distribuição do diâmetro médio
dos nanogrãos é larga, como pode ser comprovado no histograma da Figura 29, página
58.
Com o recobrimento, Figura 42(b), observa-se um deslocamento na TB para 25
K. Sendo que neste caso, a TB também não é evidente. Este comportamento nos leva a
propor que, após o recobrimento, a contribuição das características individuais dos
nanogrãos diminui e o sistema passa a apresentar apenas uma resposta coletiva. O
deslocamento da TB para menor valor pode ser entendido como uma diluição.
Revestidas com sílica as partículas magnéticas estão mais distantes, diminuindo assim
a interação interpartículas e, consequentemente a TB. Como esperado, para
monodomínios presentes seriam estimados em 18 nm, muito próximo do estimado para
a amostra de Fe3O4 antes do recobrimento.
As curvas M versus H normalizadas obtidas a 5 K, apresentadas na Figura 43,
mostram que, para a amostra de Fe3O4, a Hc é maior do que aquela observada a
temperatura ambiente, confirmando que abaixo de 50 K existem partículas bloqueadas,
ou seja em regime superparamagnético. A mesma consideração pode ser feita em
83
relação às partículas da plataforma magneto-porosa. Considerando que os valores de
Hc são os mesmos (200 Oe), confirma-se que, abaixo de TB, as interações
interpartículas não são relevantes para a resposta final do sistema que reflete o
comportamento dos nanogrãos constituintes das partículas.
-3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000
-0,8
0,0
0,8
M n
orm
aliz
ada
H (Oe)
Fe
3O
4
Fe3O
4@dSiO
2@2mSiO
2
T = 5 K
Figura 43. Curva de magnetização das amostras de Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
medidas a 5 K.
O conjunto de resultados obtidos pelas diferentes técnicas de caracterização
magnética, permitem propor a existência, em uma mesma partícula, de mono e
multidomínios, portanto, a classificação mais adequada para os diferentes sistemas
estudados é a de ferrimagnetos moles, pois, apresentam elevada Ms e baixos valores
(mas não nulos) de Mr e Hc. É importante ressaltar que essas características viabilizam
o uso das partículas tanto no carreamento de fármacos. Com relação aos ensaios de
hipertermia magnética, a presença de um Hc pode levar a perda de energia por
histerese que representa um dos mecanismos pelo qual um material magnético pode
gerar calor em um campo magnético alternado.
É decorrente deste comportamento magnético a proposta de se estudar a
influência da aplicação de um campo magnético (ou eletromagnético) externo nas
propriedades da plataforma magneto-porosa. Além da magnetização auxiliar no
84
carreamento das partículas, a resposta do material magnético pode ser modificada
devido a interação da amostra com o campo magnético externo aplicado. Essa resposta
pode ser decorrente da interação com o próprio caroço magnético, como também, de
acordo com a literatura, devido às mudanças nas propriedades físico-químicas da água
quando na presença de um campo magnético estático. Segundo Ozeki et. al.104,
campos magnéticos estáticos podem alterar as interações água-sólido e induzir a
adsorção ou dessorção da água nas superfícies sólidas. Desta forma, a aplicação de
um campo magnético externo, ou até mesmo o próprio campo gerado pelo caroço
magnético, podem influenciar na liberação de moléculas adsorvidas na plataforma,
resultando em um processo de liberação controlada por ação do campo.
4.3.3. Hipertermia magnética
Os ensaios de hipertermia magnética foram realizados com a amostra do caroço
magnético (Fe3O4) e com a amostra contendo duas camadas de sílica mesoporosa
(Fe3O4@dSiO2@2mSiO2).
As curvas de temperatura versus tempo foram obtidas para campos magnéticos
de 100, 200 e 300 Oe, e frequência de 300 kHz.
A Figura 44(a) e (b) apresenta as curvas de variação da temperatura em função
do tempo para as amostras Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, respectivamente.
Os resultados obtidos, mostram que o caroço magnético é capaz de elevar a
temperatura em ~5 °C sob ação do campo mais baixo (100 Oe). Esta variação de
temperatura torna-se mais pronunciada quando o campo aplicado aumenta atingindo
uma variação de 23 °C sob 300 Oe. Porém, como apresentado na introdução deste
trabalho, para uma aplicação biológica, o produto campo aplicado B0 x f, não deve
ultrapassar 5·109 A m-1 s-1. Como apresentado nos gráficos da Figura 44(a), o campo
apropriado para uma aplicação biológica seria de até 200 Oe. Sob ação do campo de
200 Oe o caroço magnético eleva a temperatura em ~15 °C, o que viabiliza sua
aplicação uma vez que as células tumorais são suscetíveis a temperaturas próximas de
43 °C.
85
0 50 100 150 200 250 300 3500
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24 Fe3O
4
Var
iaçã
o da
tem
pera
tura
(ºC
)
Tempo (s)
100 Oe (2,5x109)* 200 Oe (5x109)* 300 Oe (7,5x109)*
0 50 100 150 200 250 300 3500
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Tempo (s)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
100 Oe (2,5x109)* 200 Oe (5x109)* 300 Oe (7,5x109)*
Var
iaçã
o da
tem
pera
tura
(ºC
)
Figura 44. Curvas de variação da temperatura em função do tempo das amostras: (a)
Fe3O4 e (b) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2.
Observando-se as curvas obtidas para a amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2,
Figura 44(b), é possível verificar que a plataforma magneto-porosa provoca um
aumento da temperatura da água em uma escala menor (~8 ºC), para um campo de
200 Oe, quando comparada ao caroço de Fe3O4. Este comportamento é justificado
considerando que a porcentagem de Fe3O4 na amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 está
em torno de 33%. Contudo, apesar da menor variação na temperatura, as partículas da
plataforma magneto-porosa conseguem atingir a temperatura necessária para um
(a)
(b)
86
tratamento por hipertermia (~43 °C) e, além disso, apresentam propriedades
diferenciadas sobre as partículas do caroço. A principal delas refere-se a maior área
superficial que possibilita a funcionalização da partícula para atuar como um vetor no
carreamento de fármacos para sítios específicos. Neste caso o aquecimento gerado por
hipertermia magnética pode potencializar a liberação do fármaco tornado o tratamento
conjunto mais eficiente contra a doença.
Os valores de SAR foram calculados para as amostras a partir da Equação 1:
SAR = C(∆T/∆t)(1/ma)
onde C = 4,18 J g-1 °C-1; ∆T/∆t = coeficiente angular da reta ajustada na linearização
das curvas de temperatura versus tempo e ma = massa da amostra magnética em g. Os
valores de SAR são obtidos em J s-1 g-1, como J s-1 = W tem-se que J s-1 g-1 = W g-1. No
gráfico da Figura 45 os valores de SAR são expressos em W g-1.
100 150 200 250 300
0
100
200
300
400
SA
R (
W g
-1 d
e am
ostr
a)
Campo (Oe)
Fe3O4
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
Figura 45. Curvas de SAR em função do campo para as amostras: (a) Fe3O4 e (b)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2.
Com relação aos valores de SAR, para uma aplicação em hipertermia, quanto
maior o valor atingido nas condições do experimento, mais eficiente será a liberação do
87
calor. Portanto, para uma comparação dos valores de SAR é preciso garantir que todas
as condições realizadas nos experimentos foram as mesmas.
Considerando as características magnéticas atribuídas às amostras a partir da
caracterização por VSM e SQUID, pode-se dizer que os diferentes mecanismos de
geração de calor (histerese e relaxação superparamagnética) devem contribui para o
aumento da temperatura observado para as amostras de Fe3O4 e
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2.
4.4. Caracterização das amostras contendo LEVO
A quantidade de LEVO carregada na amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 foi
determinada por UV-Vis através da isoterma de adsorção construída a partir da solução
estoque em diferentes concentrações. O valor encontrado para o carregamento foi de
12,25 % (m/m), o que equivale a 0,34 mmol de LEVO para cada grama de
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2. Considerando que o diâmetro da molécula de LEVO foi
estimado em 1,4 nm, na etapa de carregamento, as moléculas do fármaco devem ter
preenchido os poros da matriz de sílica uma vez que a distribuição do diâmetro de poro
da matriz apresenta 3,59 nm como valor médio. A ferramenta utilizada na estimativa do
tamanho das moléculas de LEVO foi o programa Avogadro 1.10 e o método foi a
otimização da geometria com campo de força UFF (do inglês, Universal Field Force),
considerando a distância entre os dois átomos mais distantes.
As quinolonas (Q) de importância clínica, como a LEVO, são substâncias
anfóteras e que possuem elevada hidrofilicidade. Em pH alcalino as quinolonas formam
carboxilatos (Q-) solúveis em água e, em pH ácido formam aminas protonadas (Q+)
também solúveis em água. Em pH neutro próximo do seu ponto isoelétrico, as
quinolonas possuem duas formas em equilíbrio: a forma neutra (Q) e a zwiteriônica
(Q±)105. A etapa de funcionalização da plataforma com a LEVO ocorreu em pH 6,5, o
que nos leva a propor que a forma zwiteriônica encontrava-se disponível em solução
para interagir com a sílica na superfície e no interior dos seus poros.
As soluções aquosas de LEVO exibem fluorescência intrínseca cuja intensidade
e máximos de excitação e emissão dependem do pH. Da literatura105, têm-se os
88
espectros de excitação e emissão da ofloxacina, isômero óptico da LEVO, em soluções
aquosas de diferentes valores de pH. A intensidade máxima nos espectros é observada
em soluções fracamente ácidas onde predominam as espécies protonadas (Q+) (pH ≅
4,0)(λexc = 300 nm, λem = 500 nm), enquanto que em soluções fortemente ácidas (pH ≅
2) ou fortemente alcalinas (pH ≅ 10,5) ocorre uma diminuição na intensidade da
fluorescência. Esta diminuição é acompanhada por um “red-shift” na emissão máxima
em soluções ácidas (λem = 505 nm) e por um “blue-shift” (λem = 475 nm) em soluções
alcalinas. Em pH = 7,0, existe em solução a mistura da forma protonada (Q+) e da forma
zwiteriônica (Q ±), com, λexc igual a 280 nm e λem igual a 450 nm, respectivamente.
Em nossos estudos partimos das considerações apresentadas acima sobre a
luminescência das quinolonas na tentativa de entender a interação da LEVO com a
plataforma magneto-porosa. Para tanto, foram obtidos os espectros de excitação e
emissão das amostras sólidas de Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO e da LEVO pura,
apresentados na Figura 46(a-b). No espectro de excitação da LEVO pura (Figura 46(a)),
observa-se uma banda larga, com alguns pontos de máximo destacados, atribuídos às
transições internas da molécula. Após adsorção na plataforma, o sistema passa a
apresentar uma banda mais estreita com máximo em 290 nm. A mudança no perfil da
banda e no máximo de excitação indica que a LEVO encontra-se adsorvida na amostra
e que ocorreram mudanças nos seus estados eletrônicos provocadas pela interação da
LEVO com a sílica. Ainda na Figura 46(a), aparece em destaque o espectro de
excitação da plataforma pura, Fe3O4@dSiO2@2mSiO2, que apresenta máximos de
excitação em torno de 272 e 365 nm. Essas bandas também aparecem no espectro da
amostra contendo a LEVO, e podem ser atribuídas à plataforma.
89
250 300 350 400
408
366
326
275290
280 300 320 340 360 380 400 420
365
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
272
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
λem= 450 nm
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
λem
= 500 nm
LEVOFe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO
326
(a)
400 450 500 550 600
500
400 450 500 550 600
412 435
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
λexc
= 270 nm
λexc = 280 nm
λexc
= 290 nm
LEVO
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO
Comprimento de onda (nm)
450
(b)
Figura 46. a) Espectros de excitação das amostras Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO e
LEVO pura; em destaque o espectro de excitação da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2;
(b) Espectros de emissão das amostras Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO e LEVO pura;
em destaque o espectro de emissão da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2.
Comparando-se os espectros de emissão, apresentados na Figura 46(b),
observa-se que, em relação a LEVO pura (λ máximo de emissão = 450 nm), a emissão
da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO sofre um “red-shift”, passando a apresentar
90
λ máximo de emissão em 500 nm. Este deslocamento sugere que predominam no
sistema espécies protonadas da LEVO tanto nos grupos amino quanto carboxílicos.
Esta observação sugere que a interação da molécula de LEVO com a plataforma
acontece através dos hidrogênios ácido da superfície da sílica106. O espectro de
emissão da plataforma em destaque na Figura 46(b), mostra que a plataforma
apresenta uma emissão abaixo de 450 nm, em 412 e 435 nm, característica da matriz
de sílica.
4.4.1. Estudos de Cinética de Liberação da LEVO
Para os ensaios de liberação da LEVO em água, foram utilizados 2,0 mg de uma
amostra de carregada com 10% do fármaco, suspensa em 10 mL de água deionizada. A
liberação da LEVO foi acompanhada por UV-Vis monitorando-se a absorção em 290
nm, característica do fármaco quando dissolvido em água. A cada leitura a alíquota era
devolvida ao sistema. A quantificação da LEVO liberada foi realizada a partir da
construção de uma isoterma de adsorção. Os resultados obtidos são apresentados na
Figura 47.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
16
18
20
22
24
26
Qua
ntid
ade
de L
evo
liber
ada
(%)
Tempo (h) Figura 47. Curva de liberação da LEVO em água obtida à temperatura ambiente.
91
Observa-se que nas primeiras 24 h é atingido o máximo de liberação da LEVO.
Após este período, as medidas realizadas posteriormente em 2, 3 e 4 dias não
mostraram um aumento significativo da quantidade liberada, podendo assim ser
considerado um total de 26,5% de liberação. Após o terceiro dia de monitoramento a
quantidade de levo em solução começa a diminuir indicando que a amostra está
reabsorvendo a LEVO, ou até mesmo, que a LEVO presente na solução está sofrendo
degradação.
O perfil de liberação da LEVO observado neste ensaio está de acordo com os
resultados observados por Wang et al.107. Os autores observaram uma liberação de
50% de LEVO em uma solução de SFB. Neste trabalho, a baixa porcentagem de
liberação é justificada considerando-se a alta afinidade da LEVO pelos grupos silanol da
matriz de sílica. O perfil de liberação obtido para a LEVO é comparável a um modelo
utilizado para o tratamento de infecções bacterianas, caracterizado por um choque
inicial do fármaco seguido por um tratamento com uma dose profilática sustentada
durante longos períodos77,107.
4.4.2. Análises Microbiológicas
Nos ensaios de atividade antibacteriana foram utilizados 7,0 mg da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO carregada com 12% do fármaco. Logo, na massa de
amostra utilizada, a massa estimada de LEVO carregada é de 840 µg.
A avaliação da sensibilidade das bactérias frente à ação dos antibacterianos
pode ser investigada a partir da determinação dos halos de inibição do crescimento das
bactérias, medidos diretamente nas placas utilizadas nos ensaios microbiológicos. De
acordo com os padrões apresentados pela CLSI (Clinical and Laboratory Satandards
Institute)108, para a atividade da LEVO sobre a cepa S. aureus (Gram-positiva), um halo
menor que 15 mm indica resistência da bactéria frente ao antibacteriano. A observação
de um halo entre 16 e 18 mm, indica uma sensibilidade intermediária enquanto que, um
halo maior que 19 mm mostra sensibilidade da bactéria ao antibacteriano. Para a P.
aeruginosa (Gram-negativa), os valores não variam muito sendo que um halo menor
que 13 mm indica resistência, a sensibilidade intermediária é dada por um halo entre14
e 16 mm e a sensibilidade é representada por um halo maior que 17 mm.
92
Desta forma, a quantidade de antibacteriano carregado na amostra, 840 µg é,
teoricamente, suficiente para gerar sensibilidade às bactérias estudadas. Considerando
os resultados obtidos na liberação do fármaco em água, da massa de LEVO carregada
apenas 26,5% deve ser liberada da plataforma magneto-porosa.
Com o objetivo de investigar se há influência do caroço magnético na liberação
da LEVO, foram realizados experimentos na presença de um campo magnético externo
constante gerado por um ímã cilíndrico. A irradiação das amostras com laser, foi uma
outra estratégia utilizada para verificar a possível influência da radiação na liberação do
fármaco.
As Figuras 48 e 49 ilustram os halos de inibição obtidos em um dos ensaios com
o imã e com o laser na presença das bactérias S. aureus e P. aeruginosa, considerando
que os mesmos foram realizados em triplicata.
S. aureus
Figura 48. Halos de inibição de crescimento da bactéria S. aureus nos ensaios
realizados: (a) na presença do campo magnético constante (ímã); (b) na presença do
laser e (c) controle, obtido na ausência do ímã e do laser. Identificação das amostras:
LEVO = levofloxacina pura, P = Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 e P_LEVO =
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO.
Na Figura 48 observa-se que para a bactéria S. aureus o halo de inibição para a
amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO existe mesmo no controle, indicando que a
LEVO pode ser liberada pela plataforma mesmo na ausência do ímã e do laser. A
Tabela 7 apresenta os valores médios dos halos obtidos nos diferentes experimentos
com a S. aureus.
Ímã Controle LEVO
P_LEVO
P_LEVO
P_LEVO P
LEVO
P
Laser (a) (b) (c)
93
Tabela 7. Resultados obtidos das leituras dos halos de inibição gerados pelas amostras
de LEVO livre (L), da plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 sem a levo (P) e da
plataforma carregada com a LEVO Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO (PL), nos ensaio
realizado com ímã e com laser nas placas contendo S. aureus. Na última coluna são
apresentados os resultados obtidos na ausência do ímã e do laser (controle).
S. aureus (ímã) (laser) Controle Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
LEVO (L) 38 (±0,1) 35 (±0,1) 36 (±0,1) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 (P) 0,0 0,0 0,0 Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO (PL) 28 (±0,1) 29 (±0,1) 27 (±0,1)
É importante ressaltar que, considerando que a amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO libera apenas 26,5% da LEVO carregada, a plataforma
se mostra eficiente quanto a atividade antibacteriana sobre cepas de S. aureus uma vez
que o halo obtido é muito próximo daquele apresentado pelo antibacteriano livre. Uma
explicação pode decorrer do fato de que apesar da concentração de levo ser pequena,
uma liberação lenta proporciona uma maior eficiência.
A Figura 49 ilustra os halos de inibição nos ensaios com a bactéria P.
aeruginosa.
P. aeruginosa
Figura 49. Halos de inibição de crescimento da bactéria P. aeruginosa nos ensaios
realizados: (a) na presença do campo magnético constante (ímã); (b) na presença do
laser e (c) controle, obtido na ausência do ímã e do laser. Identificação das amostras:
LEVO = levofloxacina pura, P = Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 e P_LEVO =
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO.
Ímã Laser
Controle
Controle
P P P_LEVO
LEVO
P_LEVO
LEVO
P_LEVO
(a) (b) (c)
94
Na Figura 49(a) para a P. aeruginosa na presença do ímã, assim como no
controle (Figura 49(c)), somente foram observados halos para a LEVO. No ensaio
realizado sob a irradiação com laser (Figura 49(b)) é possível identificar a formação de
um halo de inibição também para a amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO. Este
resultado sugere que, neste caso, a liberação da LEVO é influenciada pelo laser. O
aquecimento local provocado pela incidência da radiação deve estar atuando na
liberação do fármaco promovendo uma maior atividade. Esta propriedade pode ser
modulada na tentativa de se obter uma liberação controlada do fármaco.
A Tabela 8 apresenta os valores médios dos halos obtidos nos diferentes
experimentos com a P. aeruginosa.
Tabela 8. Resultados obtidos das leituras dos halos de inibição gerados pelas amostras
de LEVO livre (L), da plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 sem a levo (P) e da
plataforma carregada com a LEVO Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO (PL), nos ensaio
realizado com ímã e com laser nas placas contendo P. aeruginosa. Na última coluna
são apresentados os resultados obtidos na ausência do ímã e do laser (controle).
4.5. Caracterização das amostras contendo Eutta
O diâmetro da molécula de Eutta foi estimado em 1,6 nm pelo mesmo método
aplicado às moléculas de LEVO. Igualmente neste caso, o diâmetro da molécula é
suficiente para que a incorporação ocorra não somente na superfície das partículas da
plataforma magneto-porosa, mas também no interior dos seus poros.
A espectroscopia de luminescência foi a técnica utilizada na caracterização das
amostras contendo o complexo de európio(III). A Figura 50(a) apresenta o espectro de
excitação do complexo Eutta, obtido monitorando-se a transição 5D0→7F2 do íon
európio(III) (611 nm), no intervalo de 250-500 nm. No espectro são observadas três
P. aeruginosa (ímã) (laser) Controle Halo (mm) Halo (mm) Halo (mm)
LEVO (L) 29 (±0,1) 24 (±0,1) 26 (±0,1) Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 (P) 0,0 0,0 0,0 Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO (PL) 0,0 15 (±0,1) 0,0
95
bandas em 277 nm, 367 nm e 395 nm, atribuídas às transições do ligante 2-
tenoiltrifluoroacetonato, e um pico em 464 nm atribuído a transição 5D2←7F0
característica do íon európio(III). O espectro de emissão do complexo puro foi obtido na
região de 550-720 nm com excitação no estado tripleto do 2-tenoiltrifluoroacetonato
(367 nm). Como observado na Figura 50(b), o espectro mostra que a emissão
correspondente a transição 5D0→7F2 tem maior intensidade que a transição 5D0 →7F1,
indicando que o íon európio(III) ocupa um sítio de baixa de simetria109.
500 550 600 650 700
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
7F0
Fe3O
4@2mSiO
2@Eutta
Fe3O4@2mSiO2@Eutta_após medidas tempo de vida
5D0 7F1
5D0
7F25D0
7F35D0
7F15D0
7F45D0
λexc = 369 nm
Figura 50. Espectros de (a) excitação (λem = 611 nm) e (b) emissão (λexc = 367 nm), do
complexo Eutta.
250 300 350 400 450 500
277395
367
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
λem= 611 nm
5 D2
7 F0
464
(a)
(b) λexc = 367 nm
λem = 611 nm
96
As Figuras 51 (a) e (b) apresentam os espectros de excitação e de emissão da
plataforma magneto-porosa contendo o complexo Eutta adsorvido
(Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta).
250 300 350 400 450 500
340
270
340Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta
Fe3O
4@dSiO
2@2mSiO
2_200_Eutta (aquecimento 60 °C)
270
560 580 600 620 640 660 680 700 720560 580 600 620 640 660 680 700 720
7F0
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Fe3O
4@2mSiO
2@Eutta
Fe3O
4@2mSiO
2@Eutta_após medidas tempo de vida
5D0
7F1
5D0
7F2
5D0
7F3
5D0 7F
15D
0
7F45D
0
λexc = 340 nm
Comprimento de onda (nm)
Figura 51. Espectros da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta, antes e após
aquecimento a 60 °C: (a) excitação (λem = 615 nm) e (b) emissão (λexc = 340 nm).
*
(a)
(b)
*
*
λexc = 340 nm
λem = 615 nm
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta
(aquecido a 60 °C)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta
(aquecido a 60 °C)
97
Na obtenção dos espectros de luminescência da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta foram adotadas as mesmas condições de obtenção dos
espectros do complexo puro. No espectro de excitação mostrado na Figura 51(a) são
observadas basicamente duas bandas em ~270 e 340 nm, atribuídas ao ligante. Em
relação ao complexo, o perfil do espectro é diferente quanto ao número, posição e
intensidade das bandas. Essas diferenças sugerem a existência de interações entre o
complexo e a sílica da plataforma que provocam mudanças da energia dos estados
eletrônicos geradas pela distorção da simetria do complexo109,110. No espectro de
emissão da amostra Fe3O4@dSiO2@mSiO2_Eutta, Figura 51(b), observa-se um
alargamento das bandas de emissão em decorrência de uma distorção da simetria ao
redor do íon európio(III) provocada pela inserção do complexo na matriz de sílica
porosa.
Buscando investigar a potencialidade de aplicação do sistema como sonda de
temperatura, foram realizadas medidas de tempo de vida da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta. As curvas de decaimento da intensidade da emissão
foram obtidas variando-se a temperatura de 20 a 60 °C e os resultados obtidos são
apresentados na Figura 52(a). Para 20 e 30 °C, as curvas foram ajustadas para uma
exponencial de primeira ordem, revelando um único tempo de vida para o sistema, da
ordem de 0,20 ms. Este tempo de vida está de acordo com o valor obtido para
complexo Eutta quando preservadas as duas águas na esfera de coordenação70,110.
Porém, com o aumento da temperatura acima de 30 °C, as curvas ajustaram-se para
uma exponencial de segunda ordem, sugerindo dois tempos de vida diferentes, sendo
que o menor deles varia com a temperatura. Dentre os tempos sugeridos, para cada
uma das temperaturas, o de menor valor apresentou um decréscimo com o aumento da
temperatura. A variação do tempo de vida com a temperatura no intervalo de 20-60 °C
foi plotada em um gráfico apresentado na Figura 52(b). Observa-se que o sistema
apresenta uma resposta linear na faixa de interesse para uma aplicação em
hipertermia, entre 40-45 °C, como confirmam os dados ajustados a partir da curva.
Na Tabela 9 são sumariados os dados obtidos em cada medida de tempo de
vida, considerando-se apenas o de menor valor quando relacionados às temperaturas
maiores que 30 °C. Este comportamento observado para a amostra contendo o
98
complexo adsorvido indica que a temperatura influencia na interação do complexo com
a sílica, modificando assim a esfera de coordenação do íon európio(III).
0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
Tempo (ms)
20 °C 30 °C 40 °C 50 °C 60 °C
ln (
inte
nsid
ade)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 650.10
0.15
0.20
0.25
Tem
po d
e vi
da (
ms)
Temperatura (oC)
y = 2,95986 - 0,03031xr2 = 0,98329
Figura 52. (a) Curvas de decaimento radiativo da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta em diferentes temperaturas; (b) Variação do tempo de
vida do nível 5D0 com a temperatura.
Esta observação pode ser confirmada analisando-se os espectros de excitação e
emissão da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta, obtidos após as medidas de tempo
de vida, ou seja, após o aquecimento a 60 °C (Figuras 51 (a) e (b)). O perfil dos
(a)
(b)
99
espectros, enquanto posição das bandas e linha base, muda em relação aos espectros
obtidos antes das medidas de tempo de vida (antes do aquecimento), corroborando
com o comportamento observado para o tempo de vida.
Tabela 9. Valores de tempo de vida obtidos para as amostras nas temperaturas de 20 –
60 °C.
Temperatura
(°C)
1a medida
(ms)
2a medida
(ms)
3a medida
(ms)
Média
(ms)
Desvio
padrão
20 0,24 0,23 0,22 0,23 0,0097
30 0,22 0,23 0,20 0,21 0,0146
40 0,15 0,17 0,17 0,17 0,0094
50 0,14 0,13 0,14 0,14 0,0074
60 0,12 0,11 0,10 0,11 0,0088
Considerando que esta alteração no comportamento do complexo quando
adsorvido na sílica pode ser provocada, além da temperatura, por resíduos ácidos
decorrentes do procedimento de síntese e também da acidez intrínseca à superfície da
sílica, tratou-se uma amostra da plataforma magneto-porosa com NH4OH na tentativa
de neutralizar a sílica. Foram obtidos os espectros da amostra após neutralização
(Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta) que são apresentados nas Figuras 53 (a) e (b).
Os espectros são semelhantes aos discutidos anteriormente para o complexo adsorvido
na plataforma, sugerindo, também neste caso, interação do complexo com a plataforma
magneto-porosa.
100
250 300 350 400 450
346
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta
267
*
λem = 615 nm
560 580 600 620 640 660 680 700 720
Inte
nsid
ade
(u.a
.)
Comprimento de onda (nm)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta7F2
5D0
λexc = 340 nm
*7F0
5D0
7F25D0
5D0 7F15D0
5D0 7F35D0
5D0 7F45D0
Figura 53. Espectros da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta: (a) excitação
(λem = 615 nm); (b) Espectro de emissão da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_Eutta
(λexc = 346 nm). *Sinal referente a harmônico.
A diferença nas propriedades luminescentes dos sistemas surge na investigação
do decaimento radiativo da amostra Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta. A Figura 54(a)
ilustra a curva de decaimento que representa as demais curvas obtidas no intervalo de
temperatura estudado, de 20-60 °C. Todas as curvas obtidas foram ajustadas para uma
exponencial de primeira ordem, revelando um único tempo de vida, em torno de 0,4 ms,
que, neste caso, não varia com a temperatura conforme mostrado na Figura 54(b).
Outra observação que pode ser feita é em relação a interação complexo-sílica. Um
λexc = 346 nm
(a)
(b)
101
tempo de vida da ordem de 0,4 ms é característico do complexo Eutta sem as duas
águas, ou ao menos uma, na esfera de coordenação do íon európio(III). Este
comportamento diferenciado deve ter sido provocado pela mudança nas características
da superfície da sílica quando tratada com NH4OH. Nesta etapa deve ter ocorrido a
substituição dos hidrogênios dos grupos silanol por íons NH4+, em uma reação ácido-
base. Logo, quando o complexo foi adsorvido, a interação do complexo com a sílica foi
diferente em decorrência da presença dos íons amônio. Esta interação pode ter levado
a uma forte interação das moléculas de água do complexo com os íons NH4+, ou, até
mesmo, a sua substituição. Os espectros de emissão e excitação obtidos após o
aquecimento da amostra a 60 °C (não mostrados neste texto) não apresentaram
alterações em relação a amostra não aquecida.
1,00 2,00 3,00 4,00
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta
ln(in
tens
idad
e)
Tempo de vida (ms)
T = 30 °C
τ = 0,50 ms
20 25 30 35 40 45 500,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Tem
po d
e vi
da (
ms)
Temperatura (°C)
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta
Figura 54. (a) Curvas de decaimento radiativo da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta; (b) Variação do tempo de vida da amostra
Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_200_Eutta com a temperatura.
4.6. Ensaios de citotoxicidade
Os estudos de citotoxicidade das amostras de Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2
foram realizados para diferentes linhagens celulares, utilizando-se o ensaio colorimétrico
MTT para as células NIH/3T3, A549, NG97 e PANC-1 após 24 e 48 h de exposição aos
compostos em várias concentrações (de 3,90 a 500 µg mL-1). Cada linhagem celular foi
(a) (b)
102
comparada com o seu controle. Os compostos foram considerados citotóxicos quando
mais de 25% das células viáveis foram mortas.
Para as células saudáveis NIH/3T3, Figura 55(a), observa-se que as partículas
de magnetita e da plataforma magneto-porosa não são tóxicas após 24 horas de
exposição. Após 48 horas, a plataforma apresenta-se citotóxica para concentrações
entre 250-500 µg mL-1, consideradas muito elevadas para uma aplicação.
É importante destacar que, como esperado, o recobrimento com sílica diminui a
citotoxicidade das partículas de magnetita. Este comportamento das partículas viabiliza
o seu uso em aplicações biológicas sendo que um dos requisitos necessários para este
fim é que as partículas não sejam citotóxicas.
Figura 55. Resultados obtidos dos ensaios de citotoxicidade por MTT, das amostras
Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 para células NIH/3T3.
Para as células tumorais de câncer pulmonar (A549) (Figura 56(a)), os dois
sistemas mostraram-se tóxicos após 48 h em concentrações entre 250 e 500 µg mL-1.
Em até 24 h os sistemas não apresentaram citotoxicidade.
Sobre as células de câncer cerebral (NG47) (Figura 56(b)) e de pâncreas
(PANC-1) (Figura 56(c)) nenhum dos sistemas apresentou atividade citotóxica.
Ao contrário do que se espera para as células saudáveis, é interessante que
para uma aplicação antitumoral as partículas apresentem elevada toxicidade. Desta
forma, nenhumas das amostras testadas apresentam atividade antitumoral relevante.
103
Figura 56. Resultados obtidos dos ensaios de citotoxicidade por MTT, das amostras
Fe3O4 e Fe3O4@dSiO2@2mSiO2 para diferentes culturas de células: (a) A549; (b) NG97
e (c) PANC-1.
(b)
(a)
(c)
104
105
Capítulo 5
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS
Na síntese das partículas magnéticas, o precursor de ferro(III) exerce influência
direta na síntese solvotérmica enquanto controle de fase e morfologia das partículas
obtidas. Nossos estudos com os precursores cloreto e nitrato, mostraram que o FeCl3
leva a obtenção de partículas esféricas, da ordem de 753 nm, tendo como fase pura a
magnetita. As microesferas obtidas são nanoestruturadas e apresentam comportamento
de ferrimagneto mole com elevada Ms (85 emu g-1) e baixa Hc (51,8 emu g-1). Essas
características conferem às partículas uma resposta magnética imediata quando
submetidas à ação de um campo magnético externo e se dispersam facilmente quando
da retirada do campo.
Na etapa de síntese da plataforma magneto-porosa foi possível desenvolver um
protocolo que resultou na síntese de uma plataforma magneto-porosa com controle da
espessura da casca bem como da área superficial das partículas. É importante destacar
que, mesmo após a deposição de duas camadas de sílica, as partículas continuam
apresentando comportamento ferrimagnético mole com elevada Ms (28 emu g-1) à
temperatura ambiente, respondendo prontamente quando submetidas a um campo
magnético externo. As propriedades magnéticas aliadas à elevada área superficial (355
m2 g-1) conferem multifuncionalidade a plataforma desenvolvida.
Os ensaios microbiológicos realizados mostraram que a plataforma
Fe3O4@dSiO2@mSiO2 é eficiente tanto na etapa de carregamento quanto na etapa de
liberação da levofloxacina. A plataforma libera 26,5% do fármaco carregado em um
período de 24 h. Quanto à atividade antibacteriana, na ausência do ímã e do laser, os
resultados mostraram que a plataforma Fe3O4@dSiO2@2mSiO2_LEVO apresenta
maior atividade antibacteriana para cepa Gram-positiva em relação à Gram-negativa.
Os ensaios realizados na presença do ímã revelaram que um campo magnético
externo constante não atua de forma a interferir na liberação do fármaco uma vez que
106
não foram observadas diferenças nos halos de inibição obtidos na presença do ímã. Por
outro lado, a manutenção das propriedades da plataforma mesmo na presença de um
campo magnético externo, preserva a liberação do fármaco durante um processo de
carreamento garantindo assim uma concentração eficiente da espécie de interesse em
uma determinada região alvo.
Na presença do laser se observou um aumento no diâmetro médio dos halos de
inibição, ou surgimento do halo no caso da cepa P. aeruginosa. Tal comportamento
mostra que a radiação eletromagnética influenciou na liberação do antibacteriano
mostrando que é possível controlar a liberação do fármaco a partir da aplicação de um
campo eletromagnético externo.
Para o dispositivo magneto-luminescente, destaca-se que o procedimento
proposto levou a obtenção de um marcador luminescente, que atua ao mesmo tempo
como uma sonda óptica de temperatura. A sonda apresentou uma resposta linear na
faixa de interesse biológico, entre 40-45 °C. Essa resposta do material frente à variação
da temperatura, confere potencialidade ao sistema para que, em ensaios de
hipertermia, atue como sonda óptica da temperatura, aumentando assim a eficiência do
tratamento e diminuindo os efeitos colaterais causados pelo excesso de calor.
As partículas do caroço magnético e da plataforma magneto-porosa contendo
duas camadas de sílica, não apresentaram citotoxicidade sobre células não tumorais
(NIH / 3T3). Da mesma forma que não apresentam citotoxicidade relevante sobre
células tumorais.
Nos ensaios de hipertermia magnética as amostras forma eficiente na geração
de calor, promovendo a elevação da temperatura da em ~15 ºC quando na presença
caroço magnético e, ~ 8 ºC na presença da plataforma magneto-porosa, em condições
de campo aceitáveis para uma aplicação in vivo. Os valores de SAR foram elevados
para as duas amostras confirmando a potencialidade de aplicação dos sistemas em
hipertermia magnética.
Logo, o conjunto de resultados apresentados nesta Tese permite propor, como
perspectiva para este trabalho, a construção de uma partícula multifuncional
biocompatível que possa atuar in vivo no diagnóstico e tratamento e de doenças por
apresentar propriedades de carregador de biomoléculas, fonte de calor, marcador
luminescente e sonda de temperatura.
107
Capítulo 6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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