METODE DE EXTRACTIE SI SEPARARE A CAROTENOIDELOR DIN PLANTE

Consideratii generaleDezvoltarea impetuoasa a tehnicilor de izolare si identificare a

compusilor naturali a avut ca rezultat o imbogatire rapida a numarului pigmentilor carotenoidici. Pentru izolarea din amestecurile de produsi naturali, se tine cont de proprietatile lor fizice si chimice.

Pigmentii carotenoidici sunt sensibili la lumina, caldura, oxigen, acizi si baze alcaline. Din acest motiv, trebuie respectate anumite conditii, pentru pastrarea materialului supus analizei. Prin expunerea la lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor. De aceea, materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie ferite de actiunea luminii.

Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la 200C si la intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-600C). In prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in cromatograme, pe coloana si pe strat subtire). Este necesar sa se lucreze in stare inerta (in atmosfera de azot sau vacuum). Oxidarea in timpul extractiei si saponificarii poate fi minima prin utilizarea unei atmosfere de azot.

Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor biologice actiunii acizilor, au loc o serie de transformari, cum sunt descompunerile oxidative, izomerizarea cis-trans si izomerizarea 5,6-epoxizilor la 5,8-epoxizi. Inlaturarea acestor inconveniente se realizeaza prin neutralizarea cu CaCO3, piridina sau dimetilalanina. De asemenea, se lucreaza cu solventi purificati si proaspat distilati, indeosebi derivatii clorurati, cum este diclormetanul, care contine in mod frecvent HCl.

Depozitarea pigmentilor carotenoidici se realizeaza la intuneric, sub atmosfera de azot sau in vacuum, la o temperatura de .200C. Cel mai bine se pastreaza in stare cristalina. Pastrarea sub forma de solutie se realizeaza in eter de petrol, hexan sau benzen.

Determinarea unor constante fizice ca temperatura de topire, temperatura de fierbere, densitatea, indicele de refractie, intensitatea

1

absorbtiei la anumite lungimi de unda etc., ofera date distincte care permit individualizarea unui compus organic, caracterizarea lui. Totusi, in cercetarile actuale se utilizeaza metodele spectrale, care ofera informatii mai precise privind structura si proprietatile substantelor organice. Metodele spectrale au avantajul, fata de metodele chimice de identificare, ca furnizeaza date in timp mult mai scurt si sunt mai precise, necesita cantitati mici de substanta si ofera posibilitatea analizarii continue, in diferite etape ale prelucrarii compusului extras, fara modificarea compozitiei substantei cercetate, ceea ce permite recuperarea sa.

In lucrarea de fata sunt prezentate principalele metode de extractie, separare si identificare a compusilor organici, cu aplicatii directe la pigmenti carotenoidici.

Metode de extractieGeneralitati privind metodele generale de extractieDistributia intr-o mare varietate de materiale si lichide biologice

a compusilor biologic activi a facut sa nu se poata adopta o metoda general-valabila de extractie care sa poata fi aplicabila in mod universal si adoptata ca o tehnica standardizata. Acest lucru se datoreaza structurii diferite a compusilor biologic activi, chiar si cei din aceeasi clasa deosebindu-se intre ei prin lungimea catenei, prin grupari functionale specifice sau configuratie, solubilizarii diferite in solventi etc. Metoda de extractie se alege in functie de natura materialului vegetal, de usurinta extractiei cu solventi, de cantitatea si proprietatile compusilor supusi extractiei (solubilitate, termolabilitate) etc. [1]

Dupa natura substantei de extras, lichida sau solida, se aplica extractia solid-lichid, in marea majoritate a cazurilor, si extractia lichid-lichid, adica extractia unui lichid sau a principiilor active aflate intr-un lichid (rezultatul primei faze de extractie), cu ajutorul altui lichid nemiscibil.

Produsul vegetal proaspat sau uscat se pulverizeaza sau se zdrobeste foarte fin pana la gradul de maruntire convenabil realizarii extractiei. Alegerea solventului este determinata de natura principiilor active, proprietatile fizico-chimice ale solventului, selectivitatea solventului. In general, substantele termolabile sunt extrase la rece prin percolare sau agitare. Pentru extractia la cald se folosesc mai multe metode in functie de regimul de extractie, si anume extractia la reflux, extractia continua solid-lichid sau lichid-lichid. Cele mai bune rezultate se obtin prin aplicarea extractiei in contracurent. O metoda eficace de extractie o constituie ultrasonicarea materialului supus extractiei cu solventi.

2

Metode de extractie a carotenoidelorExtractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu

solventi organici nepolari, de regula eter etilic sau cloroform, prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in fierbere. Se impune un grad de maruntire avansat, deoarece solventul nepolar nu patrunde prin membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele.

Materialul vegetal supus extractiei poate fi in stare proaspata sau uscata.

Daca materialul supus extractiei se afla in stare proaspata, acest lucru implica si existenta apei in tesuturi, pentru indepartarea ei fiind necesara uscarea prealabila a materialului vegetal prin extractia cu solventi miscibili cu apa (acetona, metanol, etanol), materialul trebuind sa fie suficient de deshidratat pentru a se preta extractiilor ulterioare cu solventi neaposi. In cazul materialului uscat, extractia se realizeaza cu solventi nemiscibilicu apa.

Solutia extractiva organica contine derivati carotenoidici nativi, alaturi de numeroase substante balast, cum ar fi clorofila.

Extractia din tesuturile plantelor superioareSchema generala de extractie a carotenoidelor din produse

vegetale este cea prezentata mai jos.[2] Pentru tesuturile plantelor superioare se cunosc o multitudine de metode de extractie, in continuare fiind prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei generale de extractie. [1]

Metoda IMaterialul vegetal este maruntit foarte fin (din considerentele

aratate mai sus) si omogenizat cu acetona, timp de 1-2 minute, in atmosfera de azot. Omogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extractiei ulterioare cu acetona, pana cand omogenatul devine incolor. Extractele acetonice se reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare la rotavapor. Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic proaspat distilat, omogenizand amestecul si spalandu-l apoi cu o solutie de NaCl (pentru ca eterul etilic sa se indeparteze usor si pentru a se evita emulsionarea amestecului), pana la indepartarea completa a acetonei.

Aceasta metoda este foarte utilizata in cazul in care se realizeaza extractii ale tesuturilor verzi ale plantelor, flori si fructe.

3

EXTRACTIA CAROTENOIDELOR DIN PRODUSE VEGETALE

PRODUS VEGETAL PULVERIZAT -epuizare cu eter(cloroform);macerare,agitare,percolare,refluxare

FAZA ORGANICA

-distilare volum redus;agitare Na2CO3

REZIDUU VEGETAL

FAZA APOASA ALCALINA(sapunuri ale acizilor grasi liberi)

FAZA ORGANICA-saponificare KOH 10% in alcool(1-2 ore in baia de apain fierbere);racire;epuizare cu eter

FAZA ALCALINA(lipide saponificate)

FAZA ORGANICA

-anhidrizare cu Na2SO4 sicc.,filtrare,distilare vid volum mic

FAZA ORGANICA

-racire 5-10oC;filtrare Hidrocarburi alifatice precipitat alb-sidefos

FAZA ORGANICA-evaporare

REZIDUU TOTAL CAROTENOIDICreluari repetate cu eter

REZIDUU

reluari cu CH3OH 92%; filtrare;evaporare

SOLUTIE EXTRACTIVA ETERICA filtrare;evaporare

TOTAL CAROTENOIDIC I HIDROCARBURI CAROTENOIDICEXANTOFILE MONOHIDROXILATE

TOTAL CAROTENOIDIC II XANTOFILE DIHIDROXILATE ALTE CAROTENOIDE SUPERIOR OXIDATE

Metoda IIAceasta metoda este utila in cazul in care se lucreaza cu cantitati mici

de substanta. Tesutul este maruntit si triturat cu Na2SO4 anhidru, pana se obtine o pudra foarte fina, care este apoi supusa extractiei cu acetona, urmata de eter etilic. Extractul se centrifugheaza, precipitatul obtinut extragandu-se in continuare pana la incolor, solutiile supernatante reunindu-se si concentrandu-se, transferandu-se apoi intr-un volum egal de eter etilic, ca si in cazul metodei I.

Pentru ambele metode este necesara saponificarea, care permite indepartarea substantelor balast, mai ales a clorofilei, si hidroliza esterilor xantofilei. Saponificarea se realizeaza prin adaugarea de KOH

4

15% peste extract (1:10, v/v). Aceasta saponificare se poate realiza in doua moduri:

- incalzirea amestecului alcalin timp de 10-15 minute pe baie de apa, in atmosfera de azot,la intuneric;

- pastrarea la temperatura camerei sau la 50C, la intuneric, timp de 10-15 ore.

Este de preferat utilizarea metodei de saponificare prin racire, datorita faptului ca unii pigmenti carotenoidici (cum sunt xantofilele) sunt labile termic, existand posibilitatea degradarii.

Extractia din algeIn cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda

generala prezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta, este necesara o disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea, extractia carotenoidelor din alge se realizeaza cu solventi mai polari decat acetona (etanol sau amestec acetona:etanol), datorita faptului ca au polaritate mare si permit efectuarea saponificarii pe extractul initial. [3]

Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata si racirea timp de 5-8 ore inaintea extractiei propriu-zise, apoi extractia cu metanol. Un alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori de apa sau tratarea cu apa fierbinte, timp de 2-3 minute, apoi racirea rapida cu gheata. Acest ultim procedeu inlesneste extractia carotenoidelor, dar are si un inconvenient, si anume posibilitatea distrugerii enzimelor care actioneaza asupra carotenoidelor si clorofilelor.

Pentru o izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot fi supuse uscarii, desi, prin acest procedeu, unii compusi pot suferi modificari, si pot exista diminuari ale randamentelor de extractie.

Un procedeu care implica uscarea prealabila a algelor a fost utilizat la extractia carotenoidelor din Fucus serratus, cand algele sunt uscate timp de cateva zile, macinate, apoi pudra este amestecata cu apa (800 ml apa la 500 g pudra), dupa care amestecul este eluat intr-o coloana prin percolare cu amestec benzen:metanol (1:10, v/v). Eluatele de culoare verde se indeparteaza, iar zona bruta se elueaza cu mult solvent, se concentreaza si se cromatografiaza pe coloana de CaCO3.

CromatografiaCromatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia

componentelor dintr-un amestec intre doua faze: una fixa, denumita faza stationara, si alta mobila, ce strabate faza stationara. Faza stationara

5

poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbtie), un lichid depus pe suprafata unui suport solid (cromatografie de repartitie), un schimbator de ioni (cromografie prin schimb ionic) sau un gel (cromatografie prin excluziune sterica).[5]

Cromatografia se aplica in scopul izolarii unor componenti prin separarea acestora la elutia coloanei (in cromatografia pe coloana), prin razuirea spoturilor de pe cromatoplaci (cromatografia in strat subtire) sau prin taierea spoturilor de pe hartie (cromatografia pe hartie).[6]Termenul de cromatografie, care inseamna .scriere in culori. (chrom=culoare in limba greaca) a fost dat de Tvet (1906), cu ocazia separarii colorantilor din frunze verzi (clorofile, carotenoide), prin adsorbtie lichid-solid.

Principiul metodei Tvet consta in stabilirea unui echilibru intr-un proces cinetic de adsorbtie-desorbtie intre faza solida fixa si faza lichida mobila. Faza stationara este alcatuita din material adsorbant, granular, plasat intr-o coloana, iar faza mobila este o solutie a amestecului de separat intr-un solvent potrivit. Solutia se deplaseaza in coloana prin cadere libera sau cu ajutorul unei diferente de presiune. Pentru distantarea zonelor in care s-au adsorbit diversi componenti ai amestecului se adauga un solvent la partea superioara a coloanei. Componentii migreaza cu viteze diferite, datorita faptului ca sunt retinuti in mod diferit de catre faza stationara. Procesul este denumit developarea cromatogramei.

Separarea completa a componentilor din coloana, numita elutia cromatogramei, se realizeaza prin adaugarea de solventi diferiti si culegerea solutiilor respective in vase diferite. Componentii ies din coloana in ordinea inversa adsorbabilitatii lor in faza stationara.

Dintre metodele cromatografice, cromatografia in faza gazoasa si cromatografia gaz-lichid sunt foarte raspandite, datorita faptului ca pot fi aplicate oricarui amestec de componenti lichizi cu temperaturi joase de fierbere.

Pentru compusii organici cu volatilitate redusa, se utilizeaza cromatografia in strat subtire si cromatografia pe hartie.

In cromatografia pe hartie, faza stationara este constituita dintr-o foaie de hartie de filtru, pe care se aplica la o extremitate o picatura din amestecul de analizat. Hartia se introduce apoi cu extremitatea continand picatura intr-un eluent situat intr-un vas acoperit. Eluentul urca prin capilaritate si antreneaza componentele in ordinea crescanda a valorii Rf, ce reprezinta raportul dintre viteza de migrare a componentului si viteza de migrare a eluentului:

6

Rf =vcve

Practic se masoara distanta de migrare a solventului si distanta de

migrare a componentului.Recunoasterea componentilor incolori se realizeaza cu ajutorul unui

reactiv specific cu care dau compusi colorati.Cand se doreste separarea neta a componentilor unui amestec, se

realizeaza o cromatografie bidimensionala cand, dupa o prima developare, hartia se usuca, se roteste cu 900 si se asaza intr-un nou eluent.

In cromatografia in strat subtire, faza stationara este un strat adsorbant (de silicagel sau alumina) cu o grosime de fractiune de milimentru, depus pe o placa de sticla.

Principiul separarii este acelasi ca la cromatografia pe hartie, insa prezinta avantajul unei separari mai rapide si mai precise.

Metode de separare a carotenoidelorSepararea carotenoidelor dintr-un amestec este dependenta de natura

lor, si anume de polaritatea moleculei si de gruparile functionale din molecula, ce determina caracterul lor hidrofil. Datorita acestor proprietati exista doua metode de separare a carotenoidelor, si anume:

- repartitia intre doua faze lichide nemiscibile intre ele;- separare prin adsorbtie pe adsorbant.Schema generala de separare implica urmatoarele etape:- faza organica, obtinuta dupa saponificarea extractului, este

anhidrizata cu Na2SO4 sicc., se supune repartitiei intre eter de petrol-metanol 92% pentru a separa hidrocarburile carotenoidice si xantofilele monohidroxilate care trec in epifaza(eter), iar xantofilele dihidroxilate si alte carotenoide superior oxidate trec in hipofaza (alcool);

- fiecare faza se supune cromatografierii pe coloana de oxid de aluminiu (Al2O3 standardizat .Brockmann II-III) sau alt adsorbant, utilizand ca eluanti eter, alcool etilic:eter (1:9, v/v), alcool etilic absolut, acetona. Se retin fractiuni de 50-100 ml, carora li se determina puritatea prin cromatografie in strat subtire, folosind drept faza stationara silicagel, iar drept faza mobila un sistem de solventi.

7

Separarea prin repartitia lichid-lichidDupa cum s-a aratat mai sus, un sistem de repartitie il constituie eterul

de petrol si metanolul. Prin aceasta metoda se pot separa carotenoidele hidrocarburice de xantofile. Separarea este utilizata ca o faza preliminara cromatografiei pe coloana sau in strat subtire.

Separarea prin repartitie intre doua lichide poate fi o alternativa a saponificarii in vederea indepartarii clorofilei din extractele ce nu se pot saponifica prin adaugare de baze, datorita existentei carotenoidelor sensibile la aceste substante. Acest procedeu implica trecerea xantofilelor in hipofaza metanolica, clorofilele trecand in epifaza. O alta varianta este extractia unei solutii metanolice a unui pigment cu eter de petrol, pana cand clorofilele sunt indepartate. In ambele cazuri, xantofilele din hipofaza sunt trecute in eter etilic si apoi spalate cu apa.

Acest procedeu este din ce in ce mai putin utilizat datorita sensibilitatii metodelor cromatografice, prin repartitie randamentul de separare fiind destul de redus, carotenoidele, din cauza solubilitatii diferite, putandu-se gasi in ambele fractiuni de repartitie. In cazul unei carotenoide ce poseda solubilitate doar in unul din cei doi solventi (glicozid sau acid), acest procedeu se poate aplica, preferandu-se, totusi, metodele cromatografice.

Separarea prin metoda distributiei contracurentAcest procedeu consta in repartitie repetata intre cei doi solventi

descrisi mai sus, ajungandu-se la metoda denumita“distributia contracurent”.[7] Dupa un numar suficient de mare de repartitii, amestecul original este separat in fractiuni, avand fiecare o anumita solubilitate: hidrocarburi carotenoidice, xantofile mono si dihidroxilate, etc. Acest procedeu este urmat de o fractionare prin cromatografie pe coloana, prin adsorbtie diferita datorata gruparilor specifice fiecarei grupe de carotenoide. Acest procedeu este util in cazul separarii xantofilelor foarte polare, care sunt puternic adsorbite.

Separea prin metode cromatograficePentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele

cromatografice, atat cea in strat subtire, cat si cea pe coloana.

Cromatografia in strat subtireCromatografia in strat subtire este o tehnica foarte utilizata in

separarea si purificarea carotenoidelor. Tehnica de baza a acestei metode a fost descrisa de diferiti autori.[8] Gradul de purificare prin aceasta metoda este mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloana.

8

In functie de natura carotenoidului se vor alege faza stationara, precum si faza mobila si sistemul de eluare din placi.

In cromatografia in strat subtire a carotenoidelor trebuie luate anumite precautii, si anume:

- aplicarea rapida a probei;- aplicarea probei la lumina slaba;- developarea imediata a cromatogramei;- developarea la intuneric a cromatogramei;- utilizarea unei atmosfere de azot.Materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie

ferite de actiunea luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor. Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru. Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la 200C si la intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-600C). In prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in cromatograme, pe coloana si pe strat subtire).

Alegerea fazei stationarePot fi utilizati drept faza stationara foarte multi adsorbanti, dupa cum

rezulta din tabelul 1.Sistemele cele mai utilizate in cromatografia in strat subtire cuprind

separarea carotenoidelor pe strat cu silicagel si developarea cu eter de petrol (+5% eter etilic) sau pe MgO si developare cu benzen:eter de petrol (9:1, v/v). Cromatoplacile ce au drept sistem stationar ZnCO3, developate cu amestec hexan- alcool, dau rezolutii foarte bune pentru xantofile, in timp ce CaCO3, MgO si Ca(OH)2 sunt utile atat in separarea hidrocarburilor carotenoidice, cat si a xantofilelor.

Alegerea solventuluiSolventii utilizati in separarea carotenoidelor prin cromatografie in

strat subtire sunt eluanti slabi, cum ar fi eter etilic, benzenul, precum si amestec de solventi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Solventii care dau o inalta rezolutie, datorita proprietatilor lor, sunt alcoolii tertiari. Cloroformul este in general omis datorita urmelor de acid clorhidric pe care le contine si care pot conduce la

9

transformari ale carotenoidelor. Acidul acetic este utilizat doar in cazul carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant.

Adsorbanti utilizati pentru cromatografia in strat subtire a carotenoidelor (tabelul 1):

Detectarea carotenoidelorDatorita faptului ca acesti pigmenti sunt colorati, se poate realiza si

identificarea vizuala a lor (se poate detecta vizual pana la 0,05 g -caroten). Carotenoidele, insa, se decoloreaza rapid pe placa cromatografica, din acest motiv fiind necesara stropirea cromatoplacii cu o solutie de parafina in eter de petrol [8]. Unele carotenoide carbonilice sau produsii de descompunere oxidativa pot fi identificati cu o solutie de rodamina 1% inacetona [9] sau prin stropirea cu o solutie de SbCl3 in cloroform. Cea mai sensibila metoda ramane totusi identificarea cu vapori de iod, cand se formeaza spoturi de culoare bruna, prin aceasta metoda identificandu-se si eventualele impuritati. Compusii incolori pot fi detectati prin vizualizarea fluorescentei verde caracteristica la absorbtie in ultraviolet.

Eluarea carotenoidelor din cromatoplaci Eluarea se face in functie de stratul adsorbant si de polaritatea

carotenoidelor. La cromatografiere pe silicagel G eluarea se face cu eter

Nr.crt Adsorbant

1. Al2O3

2. Celuloza

3. CaCO3:MgO:Ca(OH)2

(30:6:5, m/m/m) 4. Ca(OH)2

5. Ca(OH)2:silicagel (1:1, m/m)

6. Kieselguhr

7. Manitol

8. MgO

9. MgO:celita(1:2, m/m)

10. MgO:silicagel(1:1, m/m)

11. Silicagel

12. Zaharoza

13. ZnCO3

10

etilic sau eter etilic +5-10% etanol (carotenoide polare), iar la cromatografiere pe MgO eluarea se face cu acetona (hidrocarburi carotenoidice si xantofile). Eluarea se face dupa scoaterea zonei colorate de pe suport, urmatã de filtrare.

Cromatografia pe coloanaCea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor,

cromatografia pe coloana, a fost inlocuita recent cu cromatografia in strat subtire prin caracteristicile sale de adsorbtie. Aceasta metoda este utilizata prin imbunatatirea ei odata cu descoperirea cromatografiei in faza lichida de inalta performanta, metoda care prezinta avantajele utilizarii cantitatilor micide substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o anumita scara, neputand fi utilizatã in scopuri preparative [10].

In functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si solventul de developare adecvat.

Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru separarea carotenoidelor, pot fi amintiti celuloza, Ca(OH)2 (utilizat mai ales la separarea hidrocarburilor carotenoidice), zaharoza, amidon, silicagel, Al2O3 (folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor), CaCO3 si MgO (acestia fiind utilaizaþi la separarea carotenoidelor cu polaritate intermediara, cum este cazul xantofilelor). Pe aceeasi coloana sepot utiliza si adsorbanti diferiti asezati in functie de puterea de adsorbtie, cel mai adsorbant fiind asezat in partea superioara a coloanei.[11]

Solventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor sunt eluanti slabi. De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Coloana de adsorbtie trebuie incarcata cu adsorbant in proportie de ¾, o parte ramanand pentru solvent si extract. Adsorbantul trebuie sa fie foarte bine compactat in coloana, din acest motiv umplerea coloanei realizandu-se cu portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. Extractul carotenoidic trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o singura data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se incepe developarea cu solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.[12]

In cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza pentru separarea carotenoidelor, si anume :

a) cromatografia in zone; b) cromatografia elutiei in trepte c)cromatografia elutiei in gradient.

11

Cromatografia in zoneAmestecul de carotenoide care se afla intr-un solvent nepolar se aplica

pe la partea de sus a coloanei. Pentru separarea zonelor pe coloana este utilizat un solvent adecvat pentru developare. Zonele sunt scoase din coloana, fiecare zona fiind apoi eluata individual cu un solvent polar.

Cromatografia elutiei in trepteIn aceasta metoda se aplica principiul general al cromatografiei pe

coloana, si anume introducerea amestecului carotenoidic in partea superioara a coloanei, apoi aplicarea solventilor, in functie de polaritate. Pigmentii sunt eluati in ordinea cresterii afinitatii lor de adsorbtie si colectati. Fiecare zona eluata este apoi evaporata la sec, redizolvata intr-un volum mic de solvent, in vederea spectrofotometrarii.

ConcluziiIn perioada actuala, cand pe plan national si international se pune un

accent deosebit pe valorificarea superioara a plantelor de cultura si a celor din flora spontana, a surselor naturale in general, in functie de compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor biologic active se impune ca o cerinta de prima marime. Numai prin cunoasterea compozitiei chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza fenomenelor biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu continut ridicat in substante biologic active, care maresc valoarea biologica a plantelor in care se gasesc.

Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si a proprietatilor fizico-chimice a unui compus biologic activ, este necesara mai intai izolarea lui din amestecul de compusi naturali.

Metodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie de proprietatile compusilor supusi extractiei. Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari (eter etilic, cloroform), prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in fierbere, impunandu-se un grad de maruntire avansat, datorita faptului ca solventul nepolar nu patrunde prin membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele.

Metodele de separare se aleg de asemenea in functie de proprietatile fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Dintre metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si in strat subtire, precum si separarile prin repartitia lichid-lichid si prin metoda distributiei contracurent.

12

BIBLIOGRAFIE

[1] V.Tamas, G.Neamtu-“Pigmenti carotenoidici si metaboliti”, vol 1, Ed. Ceres, Bucuresti (1986)

[2] I.Ciulei, V.Istudor, M.Palade-“Analiza farmacognostica si fitochimica a produselor vegetale”, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1997)

[3] B.Amotz, A.Katz, M.Avron- J.Phycol., 18:529-37 (1982)

[4] I.Pogany, M.Banciu-“Tehnica experimentala in chimia organica”, Ed.Stiint.Encicl.Bucuresti (1977)

[5] M.Iovu - Chimie organica, Ed Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1982)

[6] E. Lederer, M.Lederer-“Chromatography. A Review of Priciples and Applications”, Elsevier, Amsterdam (1979)

[7] I.A.Curl, G.F.Bailey - J.Agr.Food Chem., 9, 403 (1977)

[8] E.Stahl-“Thin-Laye Chromatography”, Springer-Verlag, N.Y. (1979)

[9]J.Avigan, D.Steinberg - J. Lipid Res., 4, 100 (1963)

[10] AB Barua, JA Olson- J.Chromat.Biomed.Sci.Appl., 707:1-2, 69-79 (1998)

[11]J.Dietz Bryant, J.D.McCord, L.Knight Unlu, J.W.Erdman- J.Agric.Food Chem.,vol.40, No.4, 545-549 (1992)

[12] P.Hugueney, S.Romer, M.Kuntz, B.Camara- J.Biochem., 209, 399-407 (1992) Butterworth, Londra (1964)

13