Exercise - ESIbadiaa/CHM3102_chromato3a.pdf10th International Symposium of Proteins, Peptides and Polynucleotides, Wiesbaden, Germany, October 1990 Chromatographie par interaction

Exercise

1CHM 3102

Dans le but de préparer une colonne d’immunoaffinité vousdevez purifier des anticorps IgG à partir d’épanchementascitique de souris, quelle mode de séparation et quel type de colonne utiliserez vous et comment pourriez vous vérifier la pureté de l’échantillon?

Chromatographie par interaction hydrophobique

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Principe de séparation∆G = ∆H - T∆S

Ligand PH

Protéine

Régionhydrophobe

Ligand

PH

+ +

Support solide

Moléculed’eau

L’échantillon protéique est dissout dans un tampon de sel de haute concentration.

Les molécules d’eau près de la surface du ligand et de la surface hydrophobe de la protéine sontplus ordonnées qu’en solution (effet “protection”).

Le déplacement des molécules d’eau entourant le ligand et la région H de la protéine donne lieu a une augmentation d’entropie rendant ainsi cette interaction thermodynamiquement favorisée.

Interactions de type van der Waals augmentent entre le ligand et la région H avec l’augmentation

de la structure ordonnée de molécule d’eau en présence de sel (“salting out”).

• Fractionation of proteins by hydrophobic interaction chromatography, with reference to serum proteins. Proceedings Intl. Workshop on Technology for Protein Separation & Improvement of Blood Plasma Fractionation. Reston, Virginia, 1977, 410–421, Hjertén, S.

• Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series. Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.

• Role of physical forces in hydrophobic interaction chromatography. Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.


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Facteurs affectant la chromatographie par interaction hydrophobique

Type de ligand et degré de substitutionType de support solideConcentration et type de selpHTempératureAdditifs


4CHM 3102

Type de ligand type et degré de substitution

Cap

acité

de

liais

on

(mg p

roté

ine/

ml gel

)

C4 C6 C8µmol ligand/ml gel10 20 30

• La capacité de liaison de l’adsorbant augmenteavec la chaine alkyl et le degré de substitution.

• Un plateau de capacité de liaison est atteintlorsque le degré de substitution est elevémarquant un ancrage multipoint de la protéine et une difficulté d’élution.

• Le degré de substitution est plus faible qu’enchromato. phase inverse (d’environ 30 vs. >100 µmol ligand/ml gel).

Les gels Sepharose sont produits par Amersham Bioscienceset comprennent de l’agarose (3,6-anhydro-L-galactose)“cross-linked” formant des macropores permettant l’accès de biomolecules de 4 MDa (agarose 6%), 27 MDa (agarose 4%). Les gels superose sont des billes de 13 um diam. d’agarose(12%) “cross-linked” pour colonne FPLC.


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Type de support

Les supports solides sont typiquement hydrophilique et contiennent des gels à base d’hydrate de carbone e.g. agarose ou co-polymères synthétique greffés.

La selectivité sur un support de co-polymère ne sera pas la même que sur un support de type agarose utilisant le mêmetype de ligand.

Pour obtenir le même type de résultats il serait nécessaire de modifier les conditions d’adsorption et d’élution.


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Concentration et type de sel

Capacité de charge sur unecolonne Phenyl Sepharose en fonction de la concentration de sel initiale (AmershamPharmacia Biotech).

Formationde ppt.

• Protéines sont injectées dans un tampon de sel de haute concentration (sous le point de ppt).

• La colonne est préconditionnée avec le mêmetampon et concentration de sel.

• Les protéines sont eluées avec un gradient de selprogressivement plus dilué (tampon dilué ou avec de l’eau).

Série de Hofmeister et effet sur la ppt

Aug. de la ppt (“salting out”)

Anions: PO43-, SO4

2-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4

-, I-, SCN-

Cations: NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+

Aug. de l’effet chaotropique (“salting in”)

Voir: Arch. Biochem. Biophys. 183 (1977) 200–215, Melander, W.,Horvath, C.Separation & Purification Methods 9 (1980) 267–370, Srinivasan, R., Ruckenstein, E.


7CHM 3102

pH Volume d’elution/volume protèines non-retenues

En général les interactions hydrophobiques sont diminuéesavec l’augmentation de pH possiblement avec l’apparitiond’un plus grand nombre de site négativement charge rendant la protéine plus hydrophilique.

La diminution du pH occasionneune augmentation apparentedes interactions hydrophobiquespossiblement dû a un changement de conformation rendant la protéine plus hydrophobe.

1: Soyabean trypsin inhib. 5: Enolase2: Hum. Serum Alb. 6: Ovalbumine3: Lysozyme 7: RNase4: Transferrin 8: Cytochrome C

Hjertén, S., Yao, K., Eriksson, K.-O., Johansson, B. “Gradient and isocratic High Performance Hydrophobic Interaction Chromatography of proteins on agarosecolumns”. J. Chromatog. 359 (1986) 99–109,


8CHM 3102

Température

Généralement les interactions hydrophobiques augmententavec l’accroissement de température dû à l’effet entropique et aux forces d’attractions van der Waals.

Cependant dans certains cas les protéines peuvent êtredénaturées et changer de conformation avec l’augmentation de température donnant lieu à un changement de solubilité en solution


9CHM 3102

Additifs

• De faibles concentrations d’alcools, détergents et d’agents chaotropique(“salting-in”) miscibles dans l’eau affaiblieront les interactions hydrophobiques et occasionneront l’élution des protéines.

• Les groupes non-polaires alkyls des alcools et détergents compétitionnentavec les protéines liées et peuvent déplacer celles-ci du ligand.

• Les effects chaotropiques des sels affectent la structure de la sphèred’hydratation des protéines liées et diminue la tension de surface de l’eau.

• L’utilisation d’additifs ne doit pas compromettre l’activité des protéines ouleur dénaturation.

• Ceux-ci peuvent etre utilisés pour reconditionner les colonnes et dissocierles protéines adsorbées.


10CHM 3102

Exemple de séparation% A

100

80

60

40

20

Colonne: Phenyl Superose PC 1.6/5Echantillon: Fraction active d’un homogénat de cerveau de

boeuf purifié par CEA.Tampon A: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA,

1.7 M (NH4)2SO4.Tampon B: 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, I mM EDTA.Débit: 50 µl/min.Détection: A280nm ou activité GAP-3 (hydrolyse 32P-GTP)

Nice, E., Fabri, L., Burgess, A., Simpson, R., Hellman, V., Andersson, K., A multidimensional HPLC strategy for the purification of proteins and peptides for micro-sequence analysis: - The role of micropreparative ion exchange columns. 10th International Symposium of Proteins, Peptides and Polynucleotides, Wiesbaden, Germany, October 1990


11CHM 3102

Exemple de séparation% B

100

80

60

40

20

0

Colonne: Alkyl Superose HR 5/5Echantillon: 100 µl ascite de souris contenant anticorps

monoclonal IgG1(a) ou IgG2a (b).Tampon A: 0.1M phosphate, pH 7, 2 M (NH4)2SO4.Tampon B: 0.1M phosphate.Détection: A280nm

Amersham Biosciences

Chromatographie sur phase inverse

12CHM 3102

Principe de séparation

Phase stationnaire greffée avec ligand C4, C8 ou C18

Peptide injecté dans la phase mobile et entrainevers la colonne

Peptide adsorbé sur la phase stationnaire

Peptide désorbé de la phase stationnaire avec le gradient d’acetonitrile

• Le peptide est d’abord adsorbé sur la phase stationnaire en présence d’une phase mobile aqueuse.

• La désoption du peptide est effectuée en augmentant le % solvant organique(e.g. acetonitrile) en utilisant un gradiant d’élution.

• La colonne est par la suite ré-équilibrée avec le solvant aqueux.

• Phénomène d’adsorption ou la séparation survient par un mécanisme de partition entrela phase mobile et la phase stationnaire.

• La distribution du peptide entre les deux phases depend des affinités hydrophobiqueset de la composition de la phase mobile


13CHM 3102

Facteurs affectant la chromatographie surphase inverse

Phase stationnaireType de ligandComposition de la phase mobile Diametre des poresTaille des particulesDimension de la colonneTempératureAdditifs


14CHM 3102

ColonneAcier inoxydable (pression)Diamètre des particules : 3 à 10 µmTaille des pores : 70 à 300 ÅAire : 50 à 250 m2/g


15CHM 3102

Phase stationnaire

[W.R.Melander, C.Horvath, Reversed-Phase Chromatography, in HPLC Advances and Perspectives, V2, Academic Press, 1980]

[K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979]


16CHM 3102

Phase stationnaire

Comprend des groupessilanol libres pouvantdonner lieu a d’autrestypes d’interactions


17CHM 3102

Phase stationnaire

Solubilité de la silice en fonction du pH

Limitations de la silicepH

<2 (hydrolyse Si-O-Si-R)>8 (dissolution)

Tamponphosphate (inorganique) vsTris (organique)Molarité

Température

Supports polymériques (PS-DVB) également utilisé


18CHM 3102

Phase stationnaire

Modification des groupes silanols


19CHM 3102

Type de ligand et diamètres des pores

300 Å50-100 Å

Transfert de masserestreint

Transfert de masseplus efficace

Diamètres des pores

Phase greffée

Silanol libre résiduel

Ether; source de silanol

n: 17, C187, C83, C4

Greffon

Groupe terminal (Capping group)


20CHM 3102

Composition de la phase mobile (solvants)Acetonitrile (ACN)• Volatile • Faible viscosité• Peu d’absorption UV adsorption à basse longueur d’onde• Couramment utilisé pour la séparation des peptides

Isopropanol• Utilisé pour les protéines de masse élevée ou tres hydrophobe• Viscosité élevée• Peut etre dilué avec ACN 1:1• 1-3% IPA dans ACN peut améliorer le rendement dans certain cas (Synthetic

Peptide Purification by Application of Linear Solvent Strength Gradient Theory, J.C. Ford and J.A. Smith, J. Chrom. 483, 131–143 (1989))

Ethanol• Utilisé pour purification a grande échelle• Bon solvant pour la chromato. phase inverse• Utilisé pour l’élution de protéines hydrophobes

Methanol et autres solvantsOffre tres peu davantage comparativement aux solvants plus couramment utilisés


21CHM 3102

Propriétés physiques des solvants


22CHM 3102

Viscosité des mélanges de solvants

La viscosité des mélanges eau-alcoolaugmente de façonsignificative jusqu’àune proportion 1:1.double

50%


23CHM 3102

Composition de la phase mobileGradient d’élution

Elution trop rapide

Elution trop lente

Elution trop rapide

Elution trop lente

Comment améliorer la résolution?


24CHM 3102

Gradient d’élution et solvant organique

N. C. Robinson, M.D. Dale, L.H. Talbert, “Subunit Analysis of Bovine Cytochrome c Oxidase by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography”, Arch. of Biochem. and Biophys. 281(2), 239–244 (1990)

Colonne: Vydac 218TP104Echantillon: Sous-unités cytochrome C oxidaseGradient: 25-50% acetonitrile (0.1%TFA)Détection: A214nm

Une meilleure résolution peutêtre obtenue avec un gradient plus lent

Il est recommandé d’avoir unecomposition initiale de 3-5% ACN pour réduire le temps de re-équilibration et la difficultéa rehydrater la phase stationnaire. On peut utiliserune pente d’élution de 0.5-1.0%/min


25CHM 3102

Composition de la phase mobileL’ionisation de differents acidesaminés peut influencer l’adsorption et l’ordre d’élution

1 Bradykinin2 Oxytocin3 Angiotensine II4 Neurotensine5 Angiotensine III

Effect du pH


26CHM 3102

Composition de la phase mobileFormation de paire d’ions

Acide trifluoroacetique (TFA)

• Courramment utilisé pour les séparations de peptides

• Volatil• Peu d’absorption UV a basse

longueur d’onde• Concentration typique: 0.1% dans

eau et ACN• Peu etre utilise pour solubiliser

protéines hydrophobiques

0.1% TFA

0.3% TFA

Digest trypsiqued’apotransferrin surcolonne Vydac218TP54

0.1% TFA

20 mM phosphate pH:2

5 mM HCl pH:2

Separation de peptides surcolonne Vydac218TP54

1. oxytocin2. bradykinin3. angiotensin II 4. neurotensin5. angiotensin I

Autres

Acide heptafluorobutyrique (HFBA)Triethylamine phosphate (TEAP)Acide formique – LC/MS

Variation de sélectivité


27CHM 3102

Taille des particules

Avantage: N ↑

Inconvénient : P ↑

3500

pdLN ≈

L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)


28CHM 3102


Perte de charge (∆P) : pression qu’il faut appliquer pour faire passer la phase mobile dans la colonne chromatographique

15022cpddFLP η

≈∆L : longueur de la colonne (cm)dp : diamètre des particules (µm)dc : diamètre de la colonne (cm)F : débit (mL/min)η: viscosité (cP)∆P : perte de charge (atm)

Horvath, C., in Chromatography, partie A, Heftmann (Ed.), Chap. 3, 1983


29CHM 3102


Separation de peptide standards surune colonne Vydac 214TP avec particules de differentes dimensions Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min.

5 µm

10 µm

15-20 µm

The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002

Largeur de pic selon la variation de la taille des particules et de la quantité chargéeConditions: VYDAC® 214TP, 5 µm, 10 µm, 15–20 µm, 20–30 µm Gradient: 24–95 % ACN (0.1% TFA) en 30 min debit: 1.5 mL/min; echantillon: ribonuclease.

Les difference de performance analytique entre les tailles de particulesdeviennent moins grande avec la quantite chargee.


30CHM 3102

Dimension de la colonne et considérationspratiquesDébit actuel peut varier d’un facteur 2 plus haut ou plus bas dependant de la méthode

Capacité de charge optimalecorrespond a la quantité de peptide pouvant être chargé sur la colonne sans compromettre la résolution

Quantité maximale de charge correspond à la quantité maximaled’échantillon pouvant être purifiésur la colonne avec un rendementet une pureté raisonable

The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Grace Vydac, 3rd Edition, 2002

Pression pour une colonne de 25 cm (1:1 eau:ACN) est typiquement de 1000-1800 PSI


31CHM 3102

Température

La température de la colonne peutaffecter la viscosité du solvant, la pression (perte de charge), le temps de rétention et la sélectivité. Unetempérature < 60°C estrecommandée afin de limiter la dégradation de la phase stationnaireet l’élévation accrue de la pression(<5000 PSI).

Separation de digest trypsique de l’hormone de croissance humaineConditions: C18, 4.6 x 150 mm. Debit: 1 mL/min. Gradient de 0–60% ACN (0.1% TFA) en 60 min. Hancock et al.

Temperature as a variable in reversed-phase high-performance liquid chromatographic separations of peptide and protein samples. I. Optimizing the separation of a growth hormone tryptic digest, W.S. Hancock, R.C. Chloupek, J.J. Kirkland and L.R. Snyder, J. Chrom. 686, 31–43 (1994)


32CHM 3102

Exemple de séparation

Identification de variant génétique lors de l’apparitionde globule rouge anémiquede type faucille

Conditions: VYDAC® 218TP51 (C18, 5 µm 1.0 x 250 mm) Gradient: 0–40% ACN en 50 min (0.1% TFA) debit 50 µL/min.

Automated Analytical System fo the Examination of Protein Primary Structure,Y.L.F. Hsieh, et.al., Anal. Chem. 68, 455–462 (1996)

Le phénotype est caracterisé par une substitution de l’acideglutamique par une valine en position 6 de l’hémoglobine. Cechangement se distingue par l’apparition d’un peptide plus hydrophobe


33CHM 3102

Exemple de séparationLa déamidation des peptides est un phénomene courant et possiblementnaturel. La déamidation non-enzymatique de l’asparagine (et a un moindre degré la glutamine) peut se produire naturellement par l’isomérisation et la racémisation de l’aspartate et l’asparagine en condition de pH neutre ou basique. Certaineséquence comprenant les acides aminésGN et SN sont plus susceptibles à la déamidation et peuvent accélérer ceprocessus.

Wright, H. T. CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1991, 26, 1-52.Bischoff, R.; Kolbe, H. V. J. J. Chromatogr., A 1994, 662, 261-278.

Séparation de peptides trypsiques de la somatotropin de boeuf(BST) montrant la déamidation de Asn99. Conditions: VYDAC®218TP54 (C18, 5 µm, 4.6 x 250 mm) gradient: 0–15% ACN en 20 min, 15–21% ACN (0.1%TFA) en 12 min, 21–48% ACN en 27 min, 48-75% ACN en 4 min debit: 2.0 mL/min.

Purification and Characterization of Recombinant BovineSomatotropin Containing an Isoaspartyl Residue, M.R. Schlittler,P.C. Toren, N.R. Siegel and B.N. Violand, Ninth ISPPP, 1989, Abstract 621

34CHM 3102

Détecteurs

Détecteurs (3 classes) :

Universel : Basé sur une propriété fondamentale des moléculesEx. : réfractométrie

Sélectif : Basé sur une propriété particulière d’une famille de composés, par exemple la présence d’un élément ou d’un group. fonctionnelEx. : UV, fluorescence, électrochimie

Spécifique : Basé sur une propriété unique à un composéEx. : spectrométrie de masse (MS)

35CHM 3102

Détecteurs

RéfractométrieMesure continue de la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’effluent de la colonne

Réfractomètre à

déviation

36CHM 3102

Détecteurs

AvantagesUniverselFacteur de réponse semblable pour des produits de même classe

Réfractométrie

InconvénientsManque de sensibilité(général)

dépend de ∆nD entre soluté et éluant

Affecté par T, qui doit être contrôlée à 0.001, et par le débit de la phase mobileGradient d’élution possible seulement si les deux solvants ont des indices de réfraction semblables

37CHM 3102

Détecteurs

Détecteur UVLongueur d’onde variable

Cellule de détection

Phasemobilelcε=A

38CHM 3102

Détecteurs

Détecteur UV : Barrette de photodiodes (DAD; PDA)

39CHM 3102

Détecteurs

Détecteur UV :

InconvénientsSubstances : chromophoreFacteur de réponse : différent pour chaque composéDAD : emploi plus difficileLimité par le « cut-off »de la phase mobile

Avantages Sélectif : choix de la longueur d’ondeDAD : mesurer àplusieurs λ (puretéd’un pic)Peu sensible à T et débitFacile à utiliser et àentretenirPeut être utilisé en mode gradientNon destructif

40CHM 3102

Électrophorèse

Électrophorèse :Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l’influence d’un champ électrique Technique complémentaire à la chromatographie liquide Modes de séparation

Classique (papier ou acétate de cellulose, gel)Capillaire (solution libre ou zone, milieu micellaire, gel, focalisation isoélectrique, isotachophorèse, électrochromatographie)

41CHM 3102

Electrophorèse

Electrophorèse sur gel Une dimension (SDS-PAGE)Bi-dimensionnelle (gel 2D)

Electrophorèse capillaireSolution ou ZoneIsotachophorèseFocalisation isoélectriqueGelEn milieu micellaire

42CHM 3102

Electrophorèse

Concept de base – mobilité ionique

ElectrophorèseElectrolyse

+ -2 H2O + 2e → H2 + 2 OH-

2 H2O + → O2 + 4 H+

+ 4e

Electrolytes

V

Distance

R ~ 0

+ -

+-

SupportFaible conductivité

V

Distance

R >> 0

43CHM 3102

Electrophorèse

Concept de base – mobilité ionique

Champs électrique (V/cm)

q E = f v

µ = v/E = q/f

Charge

Coefficient de friction

Vélocité(cm s-1)

Mobilité ionique(cm2V-1s-1)

44CHM 3102

Electrophorèse sur gelSupport solide et réseau poreux

Catalyseur: Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)

CH2=CH-

CO

NH2

CH2=CH

CO

NH

CH2

CO

CH2=CH

+

Acrylamide

Methylene-bis-acrylamide

(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2

Initiateur: Persulfated’ammonium/potassium

S2O82- → SO4

•-

CH2=CH-

CO

NH2

CH2=CH

CO

NH

CH2

CO

CH2=CH

- CH2- CH-

CO

NH2

NH2

CO

CH2-CH-

NH2

CO

- CH2-CH-

La concentration de TEMED determine la longueur des chaines de polymere et sastabilite mecaniqueLa dimension des pores est controllee par la concentration d’acrylamide et de bis-acrylamide. La composition des gels est definie par %T et %C:

%T = (poids en g de monomère + cross-linker)/100 mL varie entre 5 et 20%%C = 100 (poids du cross-linker)/(poids du monomère + cross-linker)

45CHM 3102

Electrophorèse sur gel

Mobilité electrophorètique

CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-, Na+

1% SDS100°C

β-ME2 min

• Réduction des ponts disulfure• Dénaturation et linéarisation de la

protéine• Le SDS se lie a la protéine ~ 1

molécule/3 lien peptidique• Charge/poids de protéine est ~ cst• Force électrique est proportionnelle à la

charge et donc Fe/Mr ~ cst• Si Fe/Mr est ~ cst comment se fait

la séparation?

Lo

g M

r

Mobilité rel.0 0.2 0.4 0.6 0.8

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

46CHM 3102


Instrumentation• Les gels sont disponible en format

deja polymerisé• On choisit %T pour la gamme de

poids moléculaire désiré• L’échantillon (avec marqueur de

migration bleu de bromophenol) est appliqué dans un puit au haut du gel

• Des standards de poids moléculairepre-colorés sont disposés de chaque coté de façon a faciliterl’alignement

• On utilise un “stacking gel” de faible %T pour compresser les protéines en début de gel et obtenir une meilleure résolution

• Le gel est coloré par la suite au coomassie ou à l’argent

47CHM 3102


Préparation des échantillons

Tampon de resolubilisation

Produits Concentration2X 4x

Tris-HCl, pH 6.8* 0.125 M 0.25 MSDS 4 % 8 %β-ME** 5 % 10 %DTT** 0.15 M 0.3 MGlycerol 20 % 30 %Bromophenol bleu 0.01 % 0.02 %

* Utiliser Tris base et ajuster pH avec HCl pour éviter force ionique trop grande** Utiliser le β-ME ou le DTT

Précautions: Utiliser gants pour eviter contamination (keratin ~ 55kDa). Manipulation sous la hotte SDS et β-ME sont toxiques. Eviter la surcharge doser les proteines par BCA avec leur séparation sur gel 10 cm ~ 0.5–4.0 µg pour échantillons purifiés et 40–60 µg pour echantillons bruts avec Coomassie (sens. ~100ng) ou ~ 50 x moins avec coloration à l’argent (sens. 2-5 ng). Utiliser DNase pour réduire les aggrégats d’ADN

48CHM 3102


% acrylamide et la gamme de poids moléculaire

Source: Bio-Rad: The little book of standards

Électrophorèse bi-dimensionnelle

49CHM 3102

HistoriqueIntroduit en 1975 par P.H. O’Farrell et J. Klose. 1ere

dimension utilise gel-ampholyte dans tubes étroits.Résolution accrue issue de l’orthogonalité et des performances respectives de IEF et SDS-PAGE.Introduction de bandes avec gradient de pH immobilisé en 1982 par A. Görg et al. permettant unemeilleure reproductibilité.Développement commercial par Amersham, Bioraden ~ 1990.

O'Farrell, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007–4021 (1975).Klose, J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approachto testing for induced point mutation in mammals. Humangenetik 26, 231–243 (1975). Bjellqvist, B., Ek, K., Righetti, P.G., Gianazza, E., Görg, A., Westermeier, R., Postel, W. Isoelectric focusing in immobilized pH gradients: principle, methodology and some applications. J. Biochem. Biophys. Methods 6, 317–339 (1982).


50CHM 3102


1ere dimension (séparation par pI)

Ampholytes: gel en tubes comprennant un melange d’ampholytes avec unegamme de pI.

Bandes d’immobilines comprenant un melange de composes ayant des fonctionsacides et base et lie a un monomere d’acrylamide le tout immobilise sur une bandede plastique:

CH2= CH–C–NH–RO

R = Groupes tampons acides ou bases faibles

2e dimension (séparation par Mr)

Gel acrylamide (SDS-PAGE) de plus grande dimension et accommodant la longueur des tubes ou bandes immobilines %T: 10 ou 12 % ou gradient de 8-12%.


51CHM 3102



52CHM 3102

Équipement

Etan IPGphorFocalisation isoélectrique

Etan DaltSDS-PAGE (12 gels)

Carottier automatiséPermet l’excision des

protéines sur gel


53CHM 3102

Préparation de l’échantillon

Lyse cellulaire (choc osmotique, gel/dégel, detergents, enzymatique), fractionnement mécanique (sonication, french press, billes de verre, etc..)Utilisation d’inhibiteur de protéolyseCentrigugationPrécipitation (sulfate d’ammonium, TCA, acétone)Enlever contaminants potentiels (nucleotides, métabolites, phospholipides, sels, detergents, AND, ARN, polysaccharides, lipides)Dosage (BCA, Lowry, Bradford, etc…)


54CHM 3102

Solubilisation de l’échantillon (avant IEF)

8 M urée, 4% CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte™ 3–10, 0.002% bromophenol bleu.

Pour protéines de haute masse moléculaire ouhydrophobes:

7 M urée, 2 M thiourée, 4% CHAPS, 60 mM DTT, 2% Pharmalyte pH 3–10, 0.002% bromophenol bleu.

NB Urée et thiourée perturbe les ponts hydrogenes et les forces de LondonUrée peut former des modifications (carbamylation) si T°>37°C

cyanate (HN=C=O) carbamylation (Lys, Arg)(R-NH2 R-NH-CO-NH2)serie de carbamylation


55CHM 3102

Sélection de bande d’immobiline

Bandes (3 mm x 18 cm x 0.5 mm)

4 7

3.5 4.5 5.5 6.7

4.0 5.0 6.0

3 10

6 11

Gamme large

Gamme moyenne

Gamme étroite


56CHM 3102

Sélection de bande d’immobiline

(41.5 kDa ; pI 4.91)

pH 4.5-5.5

pH 3-10

pH 4.0-7.0

(41.2 kDa ; pI 4.94)

Gamme étroite

Gamme moyenne

Gamme large

Permet une augmentation de la résolution


57CHM 3102

Rehydratation de l’échantillon• Échantillon charge (urea, CHAPS, DTT,

ampholytes, etc…) dans une cassette• En présence d’huile non conductrice• Température ambiante• Période: ~12 h

pI

++ --- - - -+ + + + + ++ -

pH 4 pH 7

CathodeAnode

Focalisation isoélectrique• Température: 20°C• 80 mA/bande• 500-8,000 V sur 12 h• 32,000 Vh


58CHM 3102

2e dimension (SDS-PAGE)

Conditions

• 500 V• 1600 mW/gel• Contrôle de la T a°20C• ~6 h

-

+Gel 10% acrylamide(22 cm x 23 cm x 1 mm)

2% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 6 M uree, 30% (v/v) glycerol, 0.002% bromophenol bleu15 min 10 ml + 100 mg DTT15 min 10 ml + 250 mg IAA

Equilibration

4 7MW


59CHM 3102

Coloration• Coomassie

• Sensibilité (~50 ng)• Non spécifique• Non quantitatif

• Argent• Sensibilité (0.5-1.2 ng)• Longue préparation• Non spécifique• Protéines peuvent avoir une coloration négative

• Colorants fluorescent (SYPRO ruby)• Sensibilité (1-2 ng)• Spécifique, quantitatif• Excision problématique


60CHM 3102

Analyse d’image

5.5 6.05.04.54.0

116

66

97

55

81

30

45

21

14

pI

Mr(kDa)

(4.5-5.5)

(4.0-5.0) (5.0-6.0)

Assemblage des gels, comparaison de l’expression différentiellepour l’échantillonnage réitéré et excision des protéines d’intérêt

Documents

Exercise - ESIbadiaa/CHM3102_chromato3a.pdf10th International Symposium of Proteins, Peptides and Polynucleotides, Wiesbaden, Germany, October 1990 Chromatographie par interaction