exercices corrig©s en Chromatographie

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1 : On dtermine les temps de rtention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protines suivantes dont on connat la masse molculaire (MM) (Le dbit de la colonne est de 5 ml / min) :MM Aldolase Lactate dshydrognase Phosphatase alcaline Ovalbumine Lactoglobuline 145000 135000 80000 45000 37100 tr (min) 10,4 11,4 18,4 26,2 28,6

1 - Calculer les volumes d'lution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous ? 2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Dterminer sa masse molculaire l'aide du graphique prcdent. Existe t'il une autre mthode pour dterminer la MM ?

CorrectionCorrection exercice 1 :

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appele : tamisage molculaire, gel filtration, permation de gel). La connaissance du dbit de la colonne (5 ml / min) et des diffrents temps de rtention nous permet de calculer le volume d'lution pour chaque compos (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'lution) = d (dbit) x tr (temps de rtention) La reprsentation graphique du log de la masse molculaire (log MM) qu'il faut calculer pralablement (voir tableau) en fonction du volume d'lution (Ve) nous donne une droite :MM Aldolase Lactate dshydrognase Phosphatase alcaline Ovalbumine Lactoglobuline 145000 135000 80000 45000 37100 Log MM 5,16 5,13 4,9 4,65 4,57 tr (min) 10,4 11,4 18,4 26,2 28,6 Ve (ml) 52 57 92 131 143

Le

fait

de

visualiser

une

droite

signifie

qu'aucune

protine

n'est

exclue

du

gel.

2 - La glucokinase, avec un temps de rtention de 21 min, est lue un volume d'lution de 5 x 21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour dterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse molculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ. Ici, on a trac le logarithme de la masse molculaire en fonction du volume d'lution : log MM = f (V e). L'autre reprsentation serait de porter le logarithme de la masse molculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) Mais pour cela, il faudrait connatre le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt).

Exercice 2Exercice 2 : On veut sparer 3 acides-amins : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonate (-SO3 ). Les pH isolectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, 25 C. On dpose ces 3 acides amins sur la colonne, pH 2, puis on lue en amenant progressivement le pH 7. Question :

1 - Quels acides amins sont lus et dans quel ordre ? (On considrera que les interactions acide aminrsine sont uniquement d'ordre lectrostatiques).

Correction 2

Correction

exercice

2

:

1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie changeuse d'ions. Une rsine polystyrnique substitue par des groupements sulfonate (-SO3 ) est charge ngativement et est donc une rsine changeuse de cations. Lorsque le pH est suprieur au pHi (pH > pHi), l'acide amin est charg ngativement (forme anionique). Lorsque le pH est infrieur au pHi (pH < pHi), l'acide amin est charg positivement (forme cationique). Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids amins, pH = 2 et pH = 7.acide amin : Acide L-Glutamique (Glu) L-Leucine (Leu) L-Lysine (Lys) pHi : 3,22 5,98 9,74 charge pH = 2 : + + + charge pH = 7 : +

Ainsi, pH = 2, les trois acides amins sont chargs positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne. A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargs ngativement, seront lus. Lys reste fix la colonne. Glu est lu en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98).

Exercice 3Exercice 3 : La carboxymthylcellulose (CM-cellulose) est un support changeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxymthyls (-CH2-COOH). Questions :

1 - Quelle est la proportion des groupements carboxymthyls chargs ngativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considrera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxymthyls est 4,76). 2 - Parmi les protines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose pH 7 ? (On considrera que les interactions protine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre lectrostatiques).

CORRECTION 3Correction exercice 3 :

1 - Proportion des groupements carboxymthyls (pKa = 4,76) chargs ngativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9. Le pH est donn par la relation suivante :

pH = 1 :

= pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76

donc :-4

= 1,74 10

-4

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10 .(A), (A) est mis en facteur : (A) =

on en dduit que (A) + 1,74 10 .(A) = 100 100 /(1 + 1,74 10 )-4

-4

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %

pH = 4,76 :

= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0

donc :

=1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + (A) = 100 (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24

donc :

= 173,78

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + 173,78(A) = 100 (A) = 100 /(174,78)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %

pH = 9 :

= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24

donc :

= 13378

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + 13378(A) = 100 (A) =-3

100

/(13379)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10 % et (B) = 99,994 %

Globalement, on peut donc constater qu' un pH infrieur au pKa (pH acide), les groupements carboxymthyls se prsenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH). l'inverse, un pH suprieur au pKa (pH basique), les groupements carboxymthyls se prsenteront

majoritairement

sous

forme

basique

(-CH2-COO )

-

2 - pH = 7, on a pu calculer que la rsine tait 99,425 % sous forme basique, charge ngativement (-CH2COO ). Protine : Ovalbumine Cytochrome c Lysozyme pHi : 4,6 10,65 11 Charge ph = 7 : ngative positive positive

Ainsi, seule l'ovalbumine, qui pH = 7 est charge ngativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenus.

Exercice 4Exercice 4 : La dithylaminothylcellulose (DEAE-cellulose) est un support changeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements dithylaminothyls :CH2-CH3 / -CH2-CH2- NH+ \ CH2-CH3

Questions

:

1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargs positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considrera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4). 2 - Parmi les protines suivantes : Srumalbumine (pHi = 4,9), Urase (pHi = 5), Chymotrypsinogne (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considrera que les interactions protine-DEAE-cellulose sont uniquement de type lectrostatiques).

Correction 4Correction exercice 4 :

1 - Proportion des groupements dithylaminothyls (DEAE : pKa = 9,4) chargs ngativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12. Le pH est donn par la relation suivante :

pH = 2 :

= pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4

donc :-6

= 3,98 10

-6

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), (A) est mis en facteur : (A) =

on en dduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100 100 /(1 + 3,98 10 )-6

-6

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %

pH = 7 :

= pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4

donc :-3

= 3,98 10

-3

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 .(A), (A) est mis en facteur : (A) =

on en dduit que (A) + 3,98 10 .(A) = 100 100 /(1 + 3,98 10 )-3

-3

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %

pH = 9,4 :

= pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0

donc :

=1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A) est mis en facteur :

on en dduit que (A) + (A) = 100 (A) = 100 /(2)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %

pH = 12 :

= pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6

donc :

= 398,1

Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), (A) est mis en facteur : (A)

on en dduit que (A) + 398,1(A) = 100 = 100 /(1 + 398,1)

On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %

Globalement, on peut donc constater qu' un pH infrieur au pKa (pH acide), les groupements + dithylaminothyls se prsenteront majoritairement sous forme acide (-NH ). l'inverse, un pH suprieur au pKa (pH basique), les groupements dithylaminothyls se prsenteront

majoritairement

sous

forme

basique

(-N)

2 - pH = 7, on a pu calculer que la rsine tait 99,996 % sous forme acide, charge positivement. Protine : Srumalbumine Urase Chymotrypsinogne pHi : 4,9 5 9,5 Charge ph = 7 : ngative ngative positive

Ainsi, pH = 7 la srumalbumine et l'urase sont charges ngativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogne ne sera pas retenus.

Exercice 5Exercice 5 : Le coefficient de partag