Examenul bacteriologic

  • View
    203

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Examenul bacteriologic

Examenul bacteriologic Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lnga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea n consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca perico lul pe care-l prezinta, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesi tate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc. toate transmisibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei. Ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee: a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza inti pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambnd gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. b) Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaa organului si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa organul prin suprafaa cauterizata, facnd cteva miscari spre interior. Se scoate acul din organ si se face insamntarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facndu-se pe suprafaa acestuia miscari in zig-zag, incepnd de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara. c) Cu poriuni de organ. Cnd organul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secionarea unor bucai cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate. d) Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de organ. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a Tehnica samnarii materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea organelor sau secionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic. Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie meninerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie). Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (cteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamnteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si ra cita in cultura veche, dupa care se face insamntarea pe mediile proaspete (inti in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul). Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclnd o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete. In timpul insamntarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere cteva reguli general valabile: nsmnrile se execut n boxe sterile sau n hote speciale care permit sterilizarea periodic i nu permit formarea de cureni de aer n timpul lucrului; n timpul operaiunilor de nsmnare se evit pe ct posibil conversaia i orice micare de prisos n jurul operatorului; ansa cu care se execut nsmnarea nu trebuie s fie atins de nici un obiect nesteril (mn, halat, mas de lucru, etc.); nsmnrile se vor executa ct mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de nsmnat cu atmosfera ambiant; n timpul ct recipientele sau tuburile de cultur, sterile sau nsmnate sunt deschise, vor fi inute n poziie nclinat ct mai aproape de flacr pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosfer; imediat dup nsmnare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fr a se omite data nsmnrii.

-

Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de o importanta hotrtoare. Cunoscnduse insusirile germenilor cautati, conditiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in funcie de specia microorganismului in cauza. Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,27,4), sa asigure condiiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati.

Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. leptospirele se multiplica la 2830C). Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii: medii uzuale (obinuite), pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe; medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. Ele pot fi: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale ; mediile speciale de izolare favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitnd anumite condiii speciale sau anumii ,,factori de plecare". Mediile de imbogire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bnuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaie. Astfel de medii sint mediul KaufmannMuller (pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni). Mediile selective favorizeaza, prin compoziia lor chimica, dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sint mediul WilsonBlair si Drigalski (pentru salmonele), mediul Istrati Meitert (pentru Escherichia, Shigella, Salmonella), mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci). Mediile diferenfiale permit cresterea difereniata a unor specii microbiene sau pun in evidena anumite particularitati metabolice cu semnificaie diagnostic. Ele evideniaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitnd in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.). Includerea in componena acestor medii a unor substane indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv. Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide, semisolide, lichide. Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate). Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt : Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are largi utilizari, in special cnd i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: - apa distilata - peptona - NaCl 100,0 ml 1,0 g 0,5 g

Se ajusteaza pH-ul la 7,27,4, se incalzete 15 minute la 115C pentru precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.

Cnd se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata. Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine i cabaline, mai rar din cea de pasare. Muschii se curaa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decanteaza i se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniial. Se incalzeste la 8090C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid. Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7,27,6) prin metoda colorimetrica. Se incalzeste la autoclav la 115C timp de 15 minute. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repartizarea in tuburi, in cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute