FACULTAD DE CIENCIAS LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGA

ASIGNATURA: Genmica, Protemica y Metabolmica GRUPO: A SEGUNDO EXAMEN PARCIAL

NOMBRE DEL ALUMNO: Jonathan Olmos Zrate FECHA: 01/06/15 PROFESOR: M. en C. Csar Reyes Reyes

INSTRUCCIONES: Explica las siguientes preguntas, se breve y concreto (Valor: 100 % del examen).

Examen a libro abierto.

1. Realiza el planteamiento del siguiente artculo: Tissue proteomics using chemical

immobilization and mass spectroscopy (De qu se trata?, Qu resultados se

obtienen? y Cmo lo llevaron a cabo?)

ste artculo habla sobre los anlisis protemicos de alto rendimiento usando tejidos por

incrustacin OCT, ha sido difcil el anlisis por MS debido a la interferencia de OCT.

Debido a esta razn en este artculo se desarroll una nueva metodologa usando inmovilizacin

qumica de protenas por extraccin de pptidos (CIPPE, por sus siglas en ingles).

En el mtodo que se maneja furon inmovilizadas las protenas en un soporte y los contaminantes

de los tejidos y de la incrustacin por OCT (optimal cutting temperature medium) fueron removidos

por un lavado riguroso.

Seguido de ello los pptidos fueron removidos de la fase solida por protelisis permitiendo as el

anlisis de espectrometra de masas (MS). Esta metodologa es la primera en validada para eliminar

las interferencias de la OCT de las protenas estndar, suero de albumina humana, dando como

resultado la eliminacin de todos los picos producidos a causa de la OCT.

En forma semejante este mtodo fue aplicado para un anlisis protemica en tejidos congelados y

con OCT usando un marcador isobrico para la cuantificacin relativa y absoluta (iTRAQ por sus

siglas en ingles) y espectrometra de masas en tndem acoplada a cromatografa liquida

bidimensional.

Deentro de ste articulo en los datos que se obtuvieron se pudo observar una extraccin y

cuantificacin reproducible de 10,284 protenas en 3996 grupos y una influencia mnima de la

incrustacin por OCT en el anlisis global del proteoma en las muestras de tejido usadas

2. En este mismo artculo; la Figura 1 presenta un esquema de inmovilizacin de

protenas, de qu se trata? Para qu lo hicieron? En la Figura 2 los autores muestran

una deteccin de pptidos por Espectroscopia de masas; explcala y menciona los

principales resultados derivados de este anlisis. Posteriormente, en la Figura 3 se

muestra un anlisis de rin de ratn; De qu se trata? Por ltimo, explica la Figura 3

y como estos resultados enriquecieron las conclusiones que los autores presentan.

Las diferentes protenas se conjugan sobre un soporte slido y los compuestos no unidos son

arrasados fuera. Los pptidos se liberan del soporte slido usando la proteolisis y son analizados

utilizando LC -MS / MS

La forma de analizar el proteoma de los tejidos, por lo tanto, empleado el mtodo CIPPE basado

en la captura de protenas por conjugacin de los grupos amino de las protenas a las perlas que

contienen grupos aldehdo.

Acto seguido del lavado , las protenas unidas a las perlas se reducen, (carbamidometilado), y son

proteolizadas para liberar los pptidos para un anlisis protemico. En el uso de este mtodo, las

protenas que se extrajeron a partir de tejidos y son qumicamente inmovilizadas sobre una fase

slida mediante aminacin reductora, los pptidos fueron liberados de fase slida mediante la

digestin proteoltica.

En la Figura 2

Gracias a la espectroscopia de masas utilizada para este estudio, se pudieron detectar los

distintos pptidos provenientes de la digestin proteoltica y con ello conocer su

concentracin proveniente de distintos procesos.

1. Deteccin de espectroscopia de masas de los pptidos trpticos de HSA (Albumina serina

humana) con y sin OCT (media de temperatura ptima de corte) se muestra en la grfica

A y nos muestra los distintos niveles abundancia relativa, los cuales estn en un patrn

ms ordenado y consistente a la concentracin.

2. Un espectro representativo (ESI) de los pptidos trpticos de HSA (Albumina serina humana)

contaminada -OCT digiere en solucin.

i. En la grfica B se muestra un espectro ESI representante de HSA

contaminada OCT despus de la eliminacin OCT usando CIPPE.

3. De igual manera que la grfica C, se exhibe espectro ESI representante de limpia HSA

digeridos en solucin y al no contar con la presencia de OCT se muestran concentraciones

y un comportamiento similar a la grfica B donde OCT fue eliminada

Posteriormente, en la Figura 3 se muestra un anlisis de rin de ratn; De qu se trata?

Por ltimo, explica la Figura 3 y como estos resultados enriquecieron las conclusiones que

los autores presentan.

En el siguiente esquema se puede observar el mtodo de cuantificacin relativa utiliza para estudiar el impacto de OCT en muestras de tejido utilizando el mtodo CIPPE. El rin de un ratn se dividi a la mitad; una mitad se incrusto en OCT y la segunda mitad se congel directamente a -80 C. Las protenas que se extrajeron de los dos tejidos unidos a OCT y los dos tejidos congelados utilizando CIPPE. Los pptidos fueron etiquetados con etiquetas iTRAQ(etiqueta isobrica de cuantificacin absoluta y relativa), y los pptidos etiquetados se combinaron.

El estudio antes realizado dio a notar que las protenas del tejido se pueden analizar utilizando protemica de escopeta que incorporan CIPPE y MS / MS. La metodologa de CIPPE descrita aqu se utiliz para llevar a cabo los anlisis proteomicos de tejidos unidos a OCT y tejidos congelados. Este mtodo es altamente eficiente en la eliminacin de contaminantes y otras molculas y en la extraccin de pptidos para la protemica escopeta usando MS. Nuestros datos indican que la TCO no parece afectar el proteoma de tejidos. Por lo tanto, CIPPE se puede utilizar para la protemica y el anlisis de los tejidos adheridos PTM -OCT, lo que lleva a la posibilidad de los protemica de tejidos unidos a OCT. Concluimos que los tejidos obtenidos de los riones del ratn funcionan de manera importante para poder determinar un tejido de prueba bajo ciertos estudios de CIPPE y con ello observar las reacciones que tienen las protenas bajo ciertas caractersticas fisicoqumicas as como se podran observar en el espectrofotmetro.

3. Realiza el planteamiento del siguiente artculo: The utility of metabolomics in natural

product and biomarker characterizacion (De qu se trata? Qu resultados

obtuvieron? y cmo lo llevaron a cabo?)

El artculo : The utility of metabolomics in natural product and biomarker characterizacion habla

elementalmente sobre el hecho que la metabolmica es un campo de investigacin en rpido

desarrollo dentro de los sistemas biolgicos, nos dice tambin que las recientes mejoras en

tecnologas de la metabolmica puede darnos valores ms exactos en cuanto al uso de productos

naturales.

Tambin que la metabolmica representa un campo de investigacin en desarrollo que implica la

evaluacin de algn metabolito especifico cuantitativa y cualitativamente con diversas aplicaciones

Dado esto, en el artculo se revisa algunas de las metodologas principales implicadas en la

metabolmica; prominentes de la adquisicin de datos y anlisis de los productos naturales as como

el uso de biomarcadores para reconocer enfermedades especficas en etapa temprana, estas

metodologas son:

1. GCMS approaches

2. C-MS approaches

3. MSI based approaches

4. NMR-based approaches

5. NMR-based diagnostic metabolomics

6. MR-based plant metabolomics

7. Integrated approaches

8. Computational tolos

En ste review se demuestra que la metabolmica representa una tecnologa de punta para diversas

aplicaciones que van desde el lado toxicolgico para el diagnstico de enfermedades, o para

proporcionar un estado gentico funcional de un organismo, esto hacindolo mediante exmenes o

pruebas bioqumicas, tambin estas tcnicas, juegan un papel (que est en creciente desarrollo)

que es la dilucidacin de transformaciones de biosntesis de productos naturales y deteccin de

biomarcadores preclnicos de numerosas enfermedades.

4. El articulo muestra 16 figuras de resultados; ordnalos de forma secuencial, explcalos

e indica los mtodos y resultados de cada uno de ellos. Finalmente describe las

conclusiones del anlisis realizado.

Figura 1. La imagen muestra que en una plataforma metabolmica para realizar LC-MS, los metabolitos obtenidos en cromatografa son expuestos a una fuente inica que los disocia en derivados inicos (esta forma es necesaria para el anlisis de masas). Formas de ionizacin ms comunes son APCI (atmospheric pressure chemical ionization), APPI (atmospheric pressure photoionization), FAB (fast atom bombardment) y ESI (electrospray ionization). De estas la ms comn para metabolmica es ESI porque es capaz de ionizar tanto compuestos polares como semi-polares dentro de un espectro amplio de pesos moleculares. Las capacidades (polaridad de la molcula contra peso molecular) de estos mtodos de ionizacin.

Figura 2 En esta figura se muestra un ejemplo veraz de un anlisis metabolmico realizado en Shewanella oneidensis por Shen et al. En este estudio se lograron detectar ms de 5000 metabolitos de un solo experimento utilizando una plataforma capilar en la tcnica RPLC-IT-TOF-MS/MS. .

Figura 3. En esta imagen hablan elementalmente sobre el l diagnstico para cncer de vejiga y que es un buen ejemplo para usar un anlisis metabolmico basado en una resonancia magntica nuclear (NMR), el cual tiene la ventaja de ser muy sensible y tener un enfoque especfico de control no invasivo. Zhang et al, perfilaron los metabolitos de la orina de perro con carcinoma de celular transicionales (TCC), el cual se comprob que es similar al cncer de vejiga humano, utilizando NMR y anlisis estadstico. La orina se estabilizo para obtener un espectro correcto en el NMR y se identificaron 21 metabolitos. En la figura 3A se observa el anlisis OSC-PLS-DA (orthogonal signal correction pretreated partial least squares-discriminant analysis), realizado para encontrar las diferencias significantes entre la orina de perros con TCC y los perros sanos. En la figura 3B se observan las predicciones para los modelos de clase asignado verdaderos y modelos permutados, utilizando las caractersticas de funcionamiento del receptor (ROC) para validar el anlisis (Monte Carlo Cross Validation).

Figura 4. En esta imagen se hace incapie hacia el desarrollo de metabolomas de plantas para el descubrimiento de frmacos Esto es posible usar un ensayo de NRM ya que es altamente cuantitativo y cualitativo lo cual permite una alta reproducibilidad (este aspecto es el ms crtico en la investigacin para el descubrimiento de nuevos frmacos). Se demostr una aplicacin de esta tcnica en combinacin con un anlisis de datos multivariado de los anlisis cuantitativos de los alcaloides de ndole monoterpenicos (MIA) de Catharanthus roseus, que demostr producir vinblastina. Se desarrollaron dos tipos de transgnicos de la planta, el primero sobre expresa ORCA3 (Octadecanoid-derivative Responsive Catharanthus AP2-domain) y regulador crucial en genes en la biosntesis de MIA y el segundo sobre expresa ORCA3 y G10H (geraniol 10-hydroxylase), que cataliza el primera paso de la biosntesis de MIA. Los metabolitos obtenidos de los tejidos de cada planta fueron medido y analizados utilizando NMR y un anlisis multivariado por el mtodo de PSL-DA (mostrados en la figura 4B). De igual manera el espectro del NMR de la sobre expresin del transgnico y el control mostraron un alto grado de homologa (se muestra en la figura 4A). Resultados con el transgnico regulado con ORCA3 y G10H mostraron seales de alanina, acido glutmico, arginina, glucosa, sucrosa, 2,3-butanediol, queratina-3-O-glucoside, strictosidina, vindolina y catharanthine y por otro lado los controles mostraron seales de treonina, secologanina, 2,3-DHBA, cido clorognico, cido quininico 4-Ocaffeoyl, cido mlico y cido fumarico. Estos resultados sugieren que la sobre expresin de ORCA3 y G10H estn relacionados a la biosntesis de MIA y podran afectar otras rutas metablicas.

Figuras 5 y 6. En la figura 5 se muestra un rbol filogentico en el cual se se hace comparacin entre Aspergillus nidulans clade y Podospora anserina, en el cual se describe que existe una divergencia muy fuerte entre ellas y que a pesar de ello Slot et al, observo la existencia de un cluster de 24 genes intacto codificado para la produccin de esterigmatocistina en P. anserina que es homologo al cluster encontrado en A. nidulans. En la gifura numero 6 empleando un anlisis de 23 clusters de genes, se revelaron 6 patterns topolgicos, que dan soporte a la hiptesis a que la habilidad de P. anserina en producir esterigmatocistina fue obtenida de una transferencia horizontal de genes de A. nidulans.

Figura 7 En sta imagen Encontraron la incorporacin de un analisis metabolmico con el uso de clulas MALDI-TOF-MS que sern productivas en la produccin fenotpica con marcadores, para diferenciar de forma rpida y fiable entre especies debido a su perfil de metabolito. Por ejemplo, cuando compararon las huella digitales metabolmicos de especies Pseudoalteromonas y especies de Alteromonas no haba biomarcadores superpuestas como se ve en la figura.

Figura 8 En la imagen se muestran las principales coordenadas del anlisis de dispersin de los metabolitos de Pseudoalteromonas sp. Detectado por MALDI-TOF-MS, por otro lado se muestra un rbol filogentico basado 16S rDNA de Pseudoalteromonas sp. Muestran las masas relativas resultantes en un paquete estadstico multivariado, con esto se pudo graficar estos puntos de dispersin y los dendogramas donde podemos observar que la familia F2 Y F3 estn relacionadas estrechamente, pero F1 se encuentra demasiado lejano a las dos anteriores.

Figura 9 Esta imagen habla sobre los mtodos y anlisis para detectar tumores beningnos o malignos de cncer con diferentes mtodos (cada imagen corresponde a un mtodo especifico) la separacin de las muestras de control sanos. De un total de 2.140 metabolitos divergentes de las muestras de suero de pacientes, 1384 fueron de RPLC y 756 de HILIC. Los metabolitos detectados eran evaluados segn su importancia variable en los valores del proyecto (VIP), que en ltima instancia identificado 58 candidatos de biomarcadores por RPLC y 36 por HILIC potencialmente aplicables a la deteccin del carcinoma de clulas renales. Los datos se analizaron posteriormente por el PCA produciendo una separacin clara entre los pacientes de control de anlisis y aquellos con carcinoma de clulas RENALES. La puntuacin basada en datos (A) RPLC, (B) Datos HILIC, y (C) los conjuntos de datos combinados ( pacientes con carcinoma de clulas renales, pacientes de control). (D) La estadificacin de los pacientes de carcinoma de clulas renales RPLC combinado / datos HILLIC-MS. ( pacientes control, estadios T1-T2, T3-4 etapas).

Figura 10 En esta parte se analizaron 69 muestras de saliva de 69 pacientes, con cncer oral y 87 pacientes del grupo control fueron sometidos a electroforesis capilar para detectar los biomarcadores candidatos, se detectaron 3041 picos por muestra de saliva, discriminando 28 metabolitos en ambos grupos del ensayoAnalizaron Eje X es el tiempo de migracin y eje Y es m / z. los picos son significativamente diferentes (pb 0,05) entre los dos grupos. Rojo corresponde al grupo de cncer oral y azul de controlar.

Figura 11 Esta figura muestra un mapeo por color de 57 picos candidatos como biomarcadores que fueron obtenidos a partir de muestras de 215 pacientes (control 85, enfermedad = 128) de saliva. Cada columna representa un paciente y las filas el metabolito especifico. Esto lo lograron mediante un modelo de regresin logstica mltiple para discernir los picos detectados ms aplicables para la discriminacin entre los grupos de prueba se instalaron en 57 metabolitos que mostraron una diferencia significativa (p N 0,05) entre el grupo control y uno o ms grupos de enfermedades

Figura 12.

La imagen muestra que se llev a cabo una Evaluacin de Micromonospora spp. y Verrucosispora

spp. que fue aislado a partir de ascidias tropicales.

Como es observable pueden aparecer microbios diferentes cultivados morfolgicamente y poseen

diferentes secuencias de 16S, mientras que se siguen produciendo los mismos metabolitos

secundarios. Por otro lado en la inversa, las cepas puede parecer idnticos, con homologa de

secuencia 16S, y producir diferentes metabolitos secundarios. Su blanco a conseguir fue novedosos

para los productos naturales (es decir, los productos finales del metabolismo de primer paso) de la

replicacin mediante el uso de anlisis metabolmico fue mucho ms prctico que el anlisis

gentico indirecto.

Adems de dar prioridad a las fuentes de nuevos productos naturales el anlisis metabolmico

tambin puede servir para identificar nuevos mecanismos de accin de drogas.

Figura 13.

Esta imagen muestra en general la representacin de la ruta metablica del piruvato en S. aureus.

En este diagrama se muestra lo que se observ en cultivos tratados conTPBC que fue una

alteracin en el exometaboloma que indica un TPBC inducido por disfuncin metablica que detuvo

la oxidacin de la glucosa a nivel de piruvato, esencialmente para prevenir la actividad metablica

bsica.

Adems al sondear la va conocida del piruvato en S. aureus fue posible identificar el complejo

piruvato deshidrogenasa bacteriana como el sitio de accin para TPBC y esto ayudo a proponer el

sitio como un blanco potencial de accin de frmacos para ponerse en bacterias resistentes a los

antibiticos.

Figura 14.

En esta imagen se muestra la naturaleza holstica de la metabolmica permite para la construccin

de redes biolgicas a nivel de sistemas para ser construida y consultada. Desde el punto de vista

de los productos naturales, las redes espectrales derivados de la metabolmica se pueden separar

fcilmente en compuestos por parentesco estructural en grupos discretos, y permitir que el enfoque

est en nodos que representan qumicamente a los estructuras nicas

Al hacer uso de anlisis metabolmico como parte de una multired componente con datos

correlativos de protemica y anlisis micrfono de genotipo, que ofrece el potencial para modelar

ms estrechamente sistemas complejos.

La figura se esquematiza un mapa de redes con protuberancias basadas en espectros similares, en

la cual en uno de los apartados se puede observar la estructura qumica de las protuberancias o

nodos.

Figura 15

sta imagen nos dice que cuando se cundo se combinan con los datos genmicos, tal mapeo de

red permite sondear las posibles interacciones posteriores por perturbacin de nodos anteriores.

sta imagen ilustra en general algunos procesos que se pueden realizar a muestras desde la

genmica, las trascriptmica, la protemica y la metabolmica que se basa en diferentes fases en

las cuales se analizan los datos y se comparan con bases de datos establecidas.

Figura 16

En esta figura se muestra un anlogo de didemnina B posterior que posee un cadena lateral

modificada Deshidrodidemnina B (aplidina / plitidepsin), aislada de un tunicado mediterrneo en el

Aplidium gnero se encontr que posee mayor actividad antitumoral y mejor perfil de seguridad.

Utilizando las bacterias marinas Tistrella mobilis, descubierto a biosintetizar didemnina B, se utiliz

pirosecuenciacin para secuenciar el genoma completo. El modelo de la biosntesis de didemninas

basado en un pptido no ribosomal sintetasa-polictido sintasa (NRPS-PKS) en va modular, que

posteriormente se utiliza para consultar el genoma para el grupo de genes corolarios.