LP11.Evidentierea cromosomilor la animale

Metodele pentru studiul cromosomilor la animale presupun parcurgerea urm toarelor faze: colchicinizarea, hipotonia, fixarea, etalarea cromosomilor pe lam i colorarea. 1. COLCHICINIZAREA pre-tratamentul cu un inhibitor mitotic (colchicin sau colcemid) realizeaz acumularea n esuturi a unui num r mare de mitoze blocate n metafaz (prin inhibarea fusului de diviziune) 2. HIPOTONIA - tratamentul cu solu ii hipotonice de KCl 0,56%, citrat de sodiu 0,6-1,2%, determin o umflare i o fluidizare a citoplasmei, permi nd dispersia cromozomilor, deci o bun etalare a acestora. Timpul de hipotonie variaz ntre 10 i 60 min. n func ie de consisten a esutului i temperatura la care se realizeaz tratamentul. 3. FIXAREA - determin moartea celulelor f r s altereze componentele celulare. Cel mai folosit fixator este amestecul de alcool metilic sau etilic cu acid acetic glacial n raport de 3:1. Timpul necesar fix rii este de 5-10 min. 4. COLORAREA se face pentru ob inerea contrastului necesar observ rii la microscop a cromosomilor. Colorarea trebuie s se realizeze naintea efectu rii preparatelor tip squash sau dup efectuarea frotiurilor uscate la aer. Coloran ii nucleari cei mai folosi i n citogenetic sunt: carminul acetic, orceina acetic , reactivul Schiff i solu ia Giemsa. 5. ETALAREA - cromosomilor n celul se face n timpul realiz rii preparatelor pe lam pentru observarea la microscop prin dou metode: tehnica squash i tehnica frotiurilor uscate la aer sau flac r .

a. TEHNICA SQUASH1. 2. 3. 4. In mijlocul unei lame bine degresate se pun: o pic tur de acid acetic (dac materialul este bine colorat, dac nu, se folose te orcein acetic care realizeaz simultan fixarea i colorarea esutului) i fragmente de esut; peste aceasta se pune o lamel (uns cu albumin glicerinat i trecut repede prin flac r pentru coagularea albuminei, care are rolul de-a mpiedica dispersarea cromosomilor n celul ); lamela se love te cu un be i or de lemn pentru etalarea materialului; pentru eliminarea excesului de acid acetic sau colorant, se pune peste lamela o bucata de hrtie de filtru si cu degetul mare se apasa uniform si destul de puternic; preparatele prospete astfel obtinute se pot observa la microscop.

b.TEHNICA FROTIURILOR USCATE LA AER SAU LA FLAC Rpe o lam bine degresat se pune cu o pipet Pasteur o cantitate mic de suspensie celular ; suspensia se r spnde te uniform pe lam prin mi c ri de balansare; se las la temperatura camerei 10-12 min. s se usuce sau se trece rapid prin flacara unei lampi de spirt (determina o buna aderare a celulelor de lama); frotiurile uscate se spal cu ap de robinet 20-30 min., apoi se cl tesc cu ap distilat pentru nl turarea urmelor de fixator, care mpiedic realizarea unei bune colora ii; frotiurile se coloreaz cu solu ie Giemsa sau alt colorant; se scot lamele din colorant, se spala bine cu apa de robinet si se usuca in pozitie verticala. Materialul biologic folosit pentru studiul cromosomilor poate fi: esut hematopoetic, hepatic, splenic, gonadal, epiteliul cornean, esuturi embrionare sau de regenerare sau indirect din culturi de celule i esuturi (tesuturi cu activitate mitotica).

Studiul stucturii fine a cromosomilorse folosesc mai multe metode, dintre care un loc important il ocupa metodele de bandare. Aceste metode constau n colorarea diferen iat a unor benzi alternative, mai intens sau mai slab colorate, corespunz toare diferitelor tipuri de cromatin . Modelele de benzi sunt caracteristice fiec rei specii i nu variaz n timpul dezvolt rii organismului, permi nd identificarea diverselor tipuri de restructur ri ce apar n diferite st ri patologice sau n evolu ie. Cu ajutorul metodelor de bandare se pot identifica perechile de cromosomi i astfel se pot elabora cariotipurile diferitelor specii de animale. Clasificarea benzilor se face: dup tipul colorantului folosit sau dup segmentele cromosomiale pe care le eviden iaz , astfel: benzi de tip Q (quinacrin ), G (Giemsa), R (de reversie), T (telomerice), F (Feulgen), C (centromerice), N (organizator nucleolar), Cd (kinetocori). dupa caracteristicile lor intrinseci in: benzi heterocromatinice: constante si fluctuante i benzi Cd (kinetocorice)

A) BENZILE HETEROCROMATINICE CONSTANTE sunt echivalente cu cele de tip C, N i T. Ele sunt vizibile pe tot parcursul ciclului celular (n interfaz i diviziunea celular ) fiind relativ constante ca m rime. La plante, sunt singurelele tipuri de benzi care se eviden iaz . B) BENZILE HETEROCROMATINICE FLUCTUANTE sunt echivalente cu benzile Q, G i R. Acestea nu se disting n interfaz , n profaz apar ca puncte care ncep s fuzioneze, iar n metafaz devin benzi ntunecate. Au fost eviden iate la p s ri, mamifere i reptile. C) BENZILE Cd apar la nceputul mitozei i dispar la sfr itul ei. M rimea i pozi ia acestor benzi corespunde cu kinetocorii.

Tipuri de bandareBANDAREA Q se realizeaz cu ajutorul coloran ilor fluorescen i de tipul: - quinacrin , - acridin- orange - sau a unor antibiotice (adriamicin ); rezulta benzi pozitive verzi alternnd cu interbenzi ro ii-portocalii ce pot fi observate la microscopul cu fluorescen . Benzile mai intense corespund regiunilor din ADN bogate n A-T , n timp ce n regiunile C-G intensitatea scade.

BANDAREA G se realizeaz cu solu ie Giemsa i permite ob inerea de preparate permanente. Benzile intens colorate corespund, ca i la bandarea Q, cu regiunile bogate n A-T. Ambele tipuri de benzi caracterizeaz heterocromatina intercalar . BANDAREA R presupune colorarea cu solu ie Giemsa sau acridin orange (colorant fluorescent). sunt eviden iate zonele bogate n CG. Acest tip de bandare este reversul band rii Q i G, i coloreaz i termina iile cromosomilor.

BANDAREA C eviden iaz zona centromeric alc tuit din heterocromatin constitutiv , Principiul acestei metode se bazeaz pe denaturarea - renaturarea diferen iat a ADN prin diferite tratamente (denaturare cu NaOH urmata de neutralizare cu HCl). Benzile C se eviden iaz prin colorare cu solu ie Giemsa.

BANDAREA T eviden iaz heterocromatina constitutiv de la nivelul telomerelor i se folose te pentru identificarea cromosomilor care nu difer mult n dimensiuni i morfologie. Colorarea se realizeaz cu solu ie Giemsa sau acridin orange. BANDAREA N permite eviden ierea organizatorului nucleolar (regiune n care exist genele pentru ARNr). Colorarea se realizeaz cu argint, care se leag preferen ial de proteinele histonice sau nonhistonice, rezultnd un corpuscul brunnegru sferic pe cromatid .

LP. 12. CARIOTIPUL UMAN NORMAL SI PATOLOGIC

Cariotipul uman normalCromosomii metafazici ai celulelor somatice formeaz perechi cromosomi omologi, unul provenit de la mam i altul de la tat . O pereche de cromosomi difer din punct de vedere morfologic la sexul femel (cromozomii XX la mamifere, ZW la p s ri) i la sexul mascul (XY la mamifere, ZZ la p s ri), cromosomii acestei perechi numindu-se gonozomi sau heterozomi. Cromosomii din celelalte perechi se numesc autozomi i sunt identici la ambele sexe n toate celulele somatice Cariotipul uman normal posed : 22 de perechi de cromosomi autozomi si o pereche de heterozomi sau gonozomi (XX la femeie si XY la b rbat). Cele 22 perechi de cromosomi autozomi sunt mp r ite n apte grupe morfologice, notate de la A la G (fig. 1).

Grupa A (1-3): cuprinde cromozomi mari metacentrici (1 i 3) i submetacentrici (2). Cromozomii se pot deosebi u or ntre ei prin m rimea i pozi ia centromerului. Grupa B (4-5): cuprinde cromozomi mari submetacentrici. Se deosebesc cu dificultate ntre ei. Grupa C (6-12) i cromozomul X: cuprinde cromozomi de m rime medie. Cromozomii din perechile 6, 7, 8 i 11 sunt metacentrici. Cromozomi din perechile 9, 10 i 12 sunt submetacentrici. Grupa D (13-15): cuprinde cromosomi acrocentrici de m rime medie. To i cromozomii acestui grup prezint sateli i. Grupa E (16-18): cuprinde cromozomi mici cu centromer situat aproape median (16) sau submedian. Grupa F (19-20): cuprinde cromozomi scur i cu centromeri aproximativ mediani Grupa G (21-22) i cromozomul Y : uprinde cromozomi acrocentrici foarte scur i. Cromozomii 21 i 22 pot avea sateli i. Cromozomul Y este asem n tor cu ace ti cromozomi, fiind de obicei mai mare dect ei.

2. Cariotip uman patologicAneuploidii heterozomaleSindromul Klinefelter 47 XXY, 48 XXXY, 49 XXXXY Cariotip 47 XYY Cariotip 47 XXX Sindromul Turner 45 XO

Aneuploidii autozomaleTrisomia 13 (47, +13), sindromul Patau Trisomia 18 (47, +18), sindromul Edwards Trisomia 21 (47, +21), sindromul Down.

PoliploidiiTriplodia 69 XXY, 69 XXX, 69 XYY Tetrapoidia XXYY, XXXX

Modific ri structuraleSindromul Cri-du-chat (del 5p) Sindromul Prader-Willi (del 15q). Sindromul Down 45 t (21; 14) Sindrom X fragil Leucemia cronic mieloid t (9; 22).

Aneuploidii heterozomaleEmbrionii f r un cromosom X sunt neviabili i sunt elimina i prin avort spontan. Adi ia unui cromosom X sau Y determin tulbur ri fizice i psihice la indivizii afecta i. Sindromul Klinefelter 47 XXY, 48 XXXY, 49 XXXXY. Se remarc napoierea mintal accentuat , dezvoltare sexual slab i fertilitate redus n 60% din cazuri cauza apari iei trisomiei este nondisjunc ia de origine matern . Prezen a unui cromosom X suplimentar la b rbat, legat de apari ia corpusculului Barr, are o inciden medie de 1/1.000 de na teri la b ie i. Adi ia unui cromosom X accentueaz simptomele maladiei.

Cariotip 47 XYY Cromosomul Y supranumerar, conduce la o tulburare a personalit ii, indivizii avnd un comportament antisocial. Anomaliile somatice lipsesc, au n l ime peste medie, indivizii nu sunt sterili, organele genitale sunt normale iar inteligen a este medie sau la limita inferioar a normalului. Zigotul 47 XYY are viabilitate mare. Frecven a sindromului este de 1/1.000 de na teri la b ie i. Cariotip 47 XXX Persoanele cu acest cariotip pot fi normale sau s prezinte o u oar cre tere a sterilit ii i napoiere mintal . Frecven a sindromului este de 1/1.000 de na teri la fete. Sindromul Turner 45 XO Femeile prezint anomalii n dezvoltarea sexual , somatic , tulbur ri metabolice i psihice. Talia copilului este mic , exces de piele pe ceaf , malforma ii cardiace, dezvoltarea mental n limite normale. Individele supuse unui tratament hormonal pot avea copii dar riscul de avort este mare. Inciden de 1/ 2500 de na teri feminine, dar 90-95% din embrionii XO mor nainte de na tere.

Aneuploidii autozomale Trisomia 13 (47, +13), sindromul Patau. Sindrom rar ntlnit, 1/ 20.000 de na teri, 50% din copii mor n prima lun , iar restul pn la 6 luni. Copii cu ochi mici buze t iate, polidactilie, malforma ii ale sistemului nervos i cardiac, ceea ce presupune c modific rile anormale ncep n timpul embriogenezei. Trisomia 18 (47, +18), sindromul Edwards. Majoritatea copiilor cu acest sindrom sunt de sex feminin (80%), sunt mici la na tere, cresc ncet i sunt ntrzia i mintal. Supravie uiesc 2-4 luni. Frecven a apari iei sindromului este de 1/ 8.000 de na teri.

Trisomia 21 (47, +21), sindromul Down. Prezint cea mai mare r spndire dintre toate aneuploidiile. Copiii se nasc de obicei prematur (2,9 kg) i prezint microcefalie, urechi i nas mici, o cut specific a pielii din col ul ochiul ochiului (mongolism) buze groase, gt scurt i tegumentul aspru, anomalii cardiace, ntrziere mintal .

Este asociat cu vrsta naintat a mamei frecven a este de 1:50 pentru cele de peste 40 de ani i 1:1500 pentru cele sub 30 de ani. La persoanele n vrst cu sindrom Down s-a constat c apare maladia Alzheimer, care este provocat de gene (pentru sinteza proteinei F-amiloid) plasate pe bra ul lung al cromosomului 21.

Poliploidiin urma unor diviziuni meiotice anormale pot apare game i diplozi, care prin fecundare duc la formarea unor zigo i triploizi sau tetraploizi. Triplodia 69 XXY, 69 XXX, 69 XYY. n 15-20% din avorturile spontane fetu ii sunt triploizi. Circa 75% dintre triploizi au dou genomuri paterne i unul matern, cauza form rii acestora fiind fecundarea unui ovul de doi spermatozoizi. Triploizii mor ntr-o lun de la na tere prezentnd multiple anomalii: cap mare, degete reunite, malforma ii ale gurii, achilor i organelor genitale. Frecven a este de 1/ 10.000. Tetrapoidia XXYY, XXXX. Apare n 5% din avorturile spontane i foarte rar se nasc copii. Cauza producerii acestora se presupune c este prima diviziune mitotic anormal dup fecundare, n care dup replicarea i separarea cromosomilor nu se mai realizeaz citokineza.

Modific ri structurale

Abera iile cromosomale structurale pot fi detectate cu ajutorul band rilor, deoarece cromosomii omologi trebuie s prezinte acela i model de bandare. Modific rile structurale constau n transloca ii, duplica ii, dele ii, inversii. Au fost descrise modific ri structurale la toate perechile de cromosomi.

Sindromul Cri-du-chat (del 5p). Este determinat de o dele ie a bra ului scurt (p) al cromosomului 5 (grupa B). Copiii prezint defecte faciale, dezvoltarea anormal a glotei din cauza c reia emit un ip t asem n tor cu cel al pisicii, malforma ii gastrointestinale, ntrziere mintal . Frecven a este de 1/ 100.000 de na teri.

Sindromul Prader-Willi (del 15q). Este determinat de o dele ie a unui mic fragment din bra ul lung (q) al cromosomului 15. Persoanele afectate prezint o dezvoltare fizic redus , ntrziere mintal , obezitate, diabet (deoarece copii de la 4-5 ani manifest o poft de mncare anormal ). Frecven a este de 1/ 10.000- 1/ 25.000 i afecteaz n specia b ie ii.

Sindromul Down 45 t (21; 14). La 5% dintre persoanele afectate de acest sindrom este prezent o transloca ie ntre cromosomii 14 i 21 (acrocentricii din grupele D i G). De i au 2n=45 de cromosomi, persoanele afectate sunt normale, ele avnd un cromosom normal 14, unul 21 i un cromosom translocat 14/21. Probabilitatea de-a avea copii cu sindrom Down este de 33% sau 1/3 putndu-se ob ine trei categorii de zigo i viabili 2n = 46 normal, 2n= 46 sindrom Down prin transloca ie, 2n=45 purt tor al tranloca iei i trei zigo i neviabili (monosomie 14, monosomie 21 i trisomie 14). Sindrom X fragil. Locusurile fragile sunt regiuni cromozomiale susceptibile la rupturi. Acest sindrom se transmite ereditar X-linkat manifestndu-se prin ntrziere mintal . Leucemia cronic mieloid t (9; 22). reprezinta o proliferare a globulelor albe din seria granulocitelor (polinucleare). LMC este asociata cu o anomalie cromozomiala (cromozomul Philadelphia), in care se produce o translocare de material genetic intre cromozomii 9 si 22, ceea ce duce la o scurtare a bratului lung al cromozomului 22, antrenand perturbari genetice ce se afla la originea LMC. Acest tip de leucemie este mai rar si nu reprezinta decat 2 sau 3% din leucemiile copilului. LMC se prezinta sub doua forme: forma juvenila, care afecteaza copiii cu varste sub 2 ani si forma adulta, care afecteaza indeosebi adolescentii.

Cauzele anomaliilor cromosomale sunt adesea : vrsta naintat a mamei; gene care favorizeaz nondisjunc ia cromosomal ; tulbur ri autoimune parentale (cnd mama are anticorpi antitiroidieni apar abera ii numerice); ac iunea mutagen a radia iilor preconcep ionale nondisjunc ie; infec ii virale parentale, mai ales materne; mame foarte tinere embrioni monosomici sau trisomici.