Evaluation Qualitative Et Quantitative Des Ac A

EVALUATION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DES

ACIDES AMINES

METHODES CHROMATOGRAPHIQUES.

METHODES ELECTROPHORETIQUES.

DOSAGES SPECIFIQUES.

CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER.

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE.

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE.

CHROMATOGRAPHIE SUR ECHANGEUR DIONS.

Les protines: purification

La chromatographie est une technique de sparation qui utilise un support

qui possde des proprits physico-chimiques particulires.

Ce support va retenir les protines en fonction de critres variables.

- en fonction de la charge des protines.

- en fonction de leur affinit pour des molcules (ligands).

- en fonction de leur taille.

Chromatographie sur colonne: rservoir

colonne

phase stationnaire

Solvant

(phase mobile)

collecteur


Chromatographie dchange dions:

La phase stationnaire est compose dune rsine qui peut tre

- charge positivement (changeuse danions)

- charge ngativement (changeuse de cations)

Les interactions molcules-colonne vont dpendre de la charge des

molcules. Ces interactions pourront tre modules par le pH et la force

ionique (concentration en sels) du milieu.

CH2

C

O

O

CH2

SO3-

C2H

4N

+

C2H

4

C2H

4

H

Exemple dune purification par change de cations: sparation de 3 acides amins Ser, Asp et Lys

- tape 1: la colonne (charge ngativement) est quilibre avec

une solution faiblement concentre en sels.

Les cations de la solution (ici Na+) vont se fixer sur les charges

ngatives de la phase stationnaire.

SO3-

Na+

Bille de rsine

- tape 2: la solution contenant le mlange des molcules sparer est

dpose sur la colonne.

Ce sont les molcules prsentes en plus grande concentration qui se

fixent la colonne.

Ici, les groupement chargs positivement vont se fixer la colonne la

place des ions Na+

Asp

Lys

Ser

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

COO-NH3+

NH3+ CH COO-

CH2

COO-

NH3+ CH COO-

CH2OH

- tape 3: On lue (on rince) la colonne avec une solution de NaCl un peu

plus concentre.

Les ions Na+ tant plus nombreux que prcdemment ils vont entrer en

comptition avec les acides amins pour se fixer sur la colonne.

Ils vont remplacer tout dabord les acides amins les moins positifs.

NH3+ CH COO-

CH2OH

NH3+ CH COO-

CH2

COO-

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

COO-NH3+

Asp

Lys

Ser

Les Protines: Purification

- tape 4: On augmente la concentration en NaCl de lluant.

La concentration en Na+ tant plus forte, seuls les acides amins les plus

chargs vont rester fixs la colonne.

NH3+ CH COO-

CH2OH

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

COO-NH3+

Lys

Ser

- tape 5: On augmente encore la concentration en NaCl de lluant.

Les ions Na+ sont en large excs, ils vont remplacer toutes les molcules

qui taient encore sur la colonne.

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3+

COO-NH3+

Lys

Les Protines: Purification

On a rinc la colonne avec un gradient de concentration en NaCl

1 2 3 4

1-2: On dpose le mlange, les molcules les plus charges se fixent tout

de suite alors que les moins charges se fixent plus bas.

3-4: On rince la colonne avec une solution de NaCl de concentration

croissante. On dcroche successivement les diffrentes molcules.


Dans lexemple prcdent on a modifi la force ionique de lluant pour

dcrocher les diffrents acides amins.

On aurait galement pu modifier le pH de lluant et garder une

concentration en NaCl constante. En fonction de leur pKa respectifs les

acides amins auraient chang de charge et se seraient dcrochs de la

colonne.

Le principe est strictement le mme pour une protine.

Chromatographie daffinit: On greffe sur la colonne une molcule qui

interagit de faon spcifique avec la protine que lon veut purifier.

1-2: Quand on met le mlange sur la colonne, seule la protine qui peut interagir avec le ligand se fixe.

3-4: Pour dcrocher la protine de la colonne, on lue avec une solution contenant le ligand.


21 3 4

Chromatographie de permation sur gel (ou dexclusion):

On parle aussi de tamisage molculaire car cette technique spare les

protines en fonction de leur taille.

La colonne est remplie de billes poreuses. Les petites molcules pourront

passer par ces pores et entrer dans les billes alors que les grosses

molcules en seront exclues.

Les petites molcules vont donc perdre du temps dans les billes alors

que les grosses molcules vont trs vite traverser la colonne.


retard

lution avec le

volume mort

(Vm)

grosses

molcules

excluespetites molcules

incluses

Chromatographie de permation sur gel

billes poreuses

Avec ce type de chromatographie, il ny a pas dinteractions directes

entre la phase stationnaire et les molcules.

ce sont les molcules les plus grosses qui migrent le plus vite.


Dtection des protines:

On utilise les proprits dabsorption de la lumires des acides amins aromatiques.

Ces acides amins absorbent la lumire 280 nm

On pourra ainsi dtecter la sortie de toutes les protines de la colonne.

dtecteur280nm

Volume dlution

absorption

Pour savoir o se trouve la protines recherche il faudra doser son activit

REACTION A LA NINHYDRINE.

Detecteur uv .

Enregistreur + Trace.

temps de rtention (min)

DO 215 nm

L'lectrophorse est une technique biochimique de sparation fonde sur le fait que des molcules portant des charges lectriques diffrentes migrent des vitesses diffrentes lorsqu'elles sont places dans un champ lectrique.

llectrophorse est devenue une technique de routine dans les laboratoires o on lutilise pour sparer notamment les protines et les acides nucliques.

Llectrophorse des protines peut tre ralise sur des supports varis, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel dagarose

Deux facteurs vont influencer la migration des protines: leur

charge et leur taille. Plus la protine est charge plus sa migration

sera importante. Au contraire plus la protine sera grosse moins

sa migration sera importante.

Le sens de migration de la protine va dpendre de son pI (point

isolectrique). En fonction du pH la protine sera charge

positivement ou ngativement, elle migrera donc vers lanode (charge +) ou la cathode (charge -).

migration protines charges - migration protines charges +

dpt

anode + cathode -

Cuve pour lectrophorse clinique

Prparation du gel et dpt des

chantillons

Les gels supports

prts l'emploi sont

constitus d'une mince

couche d'agarose

coule sur un support

plastique de 100 mm

x 75 mm permettant

leur manipulation

aise.

Une fois le gel sorti de son

emballage, la zone de dpt est

essore avec une bande de papier

filtre pour faciliter la diffusion des

chantillons lors du dpt.

Essorage de la zone de dpt

La bande est ensuite retire et jete et on

dispose la mme place un masque de

dpt form d'une bande de plastique comportant 10 fentes.

Mise en place du masque de dpt

Dpt des chantillons Essorage du liquide en excs

Un volume de 5 L des chantillons

analyser est dpos sur les fentes et

abandonn pendant 5 minutes pour

assurer leur diffusion au niveau de la

zone de dpt.

Le liquide non absorb par le gel est

ensuite essor avec une autre bande

de papier filtre et le masque de dpt

est jet.

Gel en place dans la cuve

Phase de migration

Le gel est alors mis en place dans la cuve et puis aprs fermeture du couvercle et

mise en marche de lalimentation, la migration des protines dmarre

La tension applique au gel et le temps de migration dpendent de la nature des

chantillons analyser.

Ensemble du dispositif d'lectrophorse

Fixation et coloration

Une fois la migration lectrophortique termine, le gel est plong pendant deux minutes dans le

fixateur (acide alcool), sch puis plong

pendant trois minutes dans le colorant.

Une succession de bains dans la solution de dcoloration permet ensuite d'liminer la

coloration du fond de faon faire apparatre les

bandes correspondant aux diverses protines

spares.

Dcoloration du fond

Le gel est ensuite sch ce qui

permet de le conserver dans de

bonnes conditions.

lecture

peut se faire l'oeil nu (analyse qualitative)ou par densitomtrie (enregistrement de

l'absorbance en fonction de la distance de

migration) ; dans ce cas, l'intgration des

pics permet une analyse quantitative des

fractions.

Trac densitomtrique du

protinogramme d'un srum humain

normal

Documents

Evaluation Qualitative Et Quantitative Des Ac A