Click here to load reader
Upload
catherine-philippot
View
107
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
Etude structurale de la Stromélysine-3, protéase impliquée dans l'invasion tumorale, complexée avec un inhibiteur phosphinique.
A.L. GALL §, R. KANNAN ‡, I. STOLL ‡, M. RUFF §, V. DIVE *, A. YIOTAKIS ¶, M.C. RIO ‡, P. BASSET ‡ et D. MORAS §.
§Laboratoire de Biologie Structurale et ‡Laboratoire de Recherches sur le Cancer du Sein, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), B.P. 163, 67404 Illkirch Cedex, France; *CEA, Département d'Ingénierie et d'Etudes des Protéines, CEA-Saclay, 91191 Gif/Yvette Cedex, France; ¶Department of Chemistry, Laboratory of Organic Chemistry, University of Athens, Panepistiomiopolis, Zografou, Athens, Greece.
La Stromélysine-3, une cible thérapeutique.
Expression, purification et caractérisation de la protéine recombinante.
Cristallisation du complexe.
Figure 3: Protocole de purification.
CultureTransformation de bactéries E. coli BL21 par choc thermique.
Induction de l'expression de la stromélysine-3 par ajout d'IPTG.
Lyse chimique et mécaniqueSonication.
Isolation des corps d'inclusionCentrifugation et lavages successifs.
Solubilisation des corps d'inclusion
Chromatographie échangeuse d'anions (Colonne Q-Sépharose)Elution de la protéine par gradient de NaCl et en présence de 6M urée.
Renaturation/Repliement Elimination progressive de l'urée par dialyses.
Elimination des aggrégats insolubles par ultracentrifugation.
ConcentrationEn présence d’un détergent doux (CHAPS). Figure 5: Purification de la forme recombinante.
Gel de polyacrylamide (15%) dénaturant coloré au Bleu de Coomassie.
Figure 4: Construction utilisée.
Figure 6: Test d’activité de la Stromélysine-3.A: Principe du test. B: Résultats obtenus. (Kannan R. et al. (1999) Purification of active matrix metalloproteinase catalytic domains and its use for screening of specific stromelysin-3 inhibitors. Protein Expression and Purification 16: 76-83.)
Figure 2: Alignement des séquences des domaines catalytiques de métalloprotéases matricielles (MMPs).st: stromélysine; mmp07: matrilysine; mmp12: élastase; mmp08: collagénase 2; mmp01: collagénase 1; mmp13: collagénase 3; mtmmp: MMP de type membranaire;m: souris; h: humain; x: xénope
* 20 * 40 * 60 * 80 *mst3 : ..FVLSGGRWEKTDLTYRILRFPWQLVREQVRQTVAEALQVWSEVTPLTFTEV........HEGRADIMIDFARYWHGDNLPFDGPGGILhst3 : ..FVLSGGRWEKTDLTYRILRFPWQLVQEQVRQTMAEALKVWSDVTPLTFTEV........HEGRADIMIDFARYWDGDDLPFDGPGGILxst3 : ..FVLSGGRWDKTNLTYKIIRFPWQLSKVKVRRTIAEALKVWSEVTPLTFTEV........HEGRSDIIIDFTRYWHGDNLPFDGPGGILmmmp07 : YSLMPNSPKWHSRIVTYRIVSYTSDLPRIVVDQIVKKALRMWSMQIPLNFKRV........SWGTADIIIGFARRDHGDSFPFDGPGNTLhmmp07 : YSLFPNSPKWTSKVVTYRIVSYTRDLPHITVDRLVSKALNMWGKEIPLHFRKV........VWGTADIMIGFARGAHGDSYPFDGPGNTLmmmp12 : ........RWMKRYLTYRIYNYTPDMKREDVDYIFQKAFQVWSDVTPLRFRKL........HKDEADIMILFAFGAHGDFNYFDGKGGTLhmmp12 : ........RWMKRYLTYRIYNYTPDMKREDVDYIFQKAFQVWSDVTPLRFRKL........HKDEADIMILFAFGAHGDFNYFDGKGGTLhmmp08 : FMLTPGNPKWERTNLTYRIRNYTPQLSEAEVERAIKDAFELWSVASPLIFTRI........SQGEADINIAFYQRDHGDNSPFDGPNGILmmmp08 : FLLTPGSPKWTHTNLTYRIINHTPQLSRAEVKTAIEKAFHVWSVASPLTFTEI........LQGEADINIAFVSRDHGDNSPFDGPNGILhmmp01 : FVLTEGNPRWEQTHLTYRIENYTPDLPRADVDHAIEKAFQLWSNVTPLTFTKV........SEGQADIMISFVRGDHRDNSPFDGPGGNLhst1 : FRTFPGIPKWRKTHLTYRIVNYTPDLPKDAVDSAVEKALKVWEEVTPLTFSRL........YEGEADIMISFAVREHGDFYPFDGPGNVLhst2 : FSSFPGMPKWRKTHLTYRIVNYTPDLPRDAVDSAIEKALKVWEEVTPLTFSRL........YEGEADIMISFAVKEHGDFYSFDGPGHSLmst1 : FSTFPGSPKWRKSHITYRIVNYTPDLPRQSVDSAIEKALKVWEEVTPLTFSRI........SEGEADIMISFAVGEHGDFVPFDGPGTVLmst2 : ..TFPGSPKWRKSHITYRIVNYTPDLPRQSVDSAIEKALKVWEEVTPLTFSRI........SEGEADIMISFAVGEHGDFYPFDGPGQSLhmmp13 : YNVFPRTLKWSKMNLTYRIVNYTPDMTHSEVEKAFKKAFKVWSDVTPLNFTRL........HDGIADIMISFGIKEHGDFYPFDGPSGLLhmt1mmp : ..YAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATYEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMIFFAEGFHGDSTPFDGEGGFLmmt1mmp : ..YAIQGLKWQHNEITFCIQNYTPKVGEYATFEAIRKAFRVWESATPLRFREVPYAYIREGHEKQADIMILFPEGLHGDSTPFDGEGGFLhmt3mmp : ..YALTGQKWQHKHITYSIKNVTPKVGDPETRKAIRRAFDVWQNVTPLTFEEVPYSELENG.KRDVDITIIFASGFHGDSSPFDGEGGFL 100 * 120 * 140 * 160 * mst3 : AHAFFPKTHREGDVHFDYDETWTIGDNQ..GTDLLQVAAHEFGHVLGLQHTTAAKALMSPFY...TFRYPLSLSPDDRRGIQHLYGhst3 : AHAFFPKTHREGDVHFDYDETWTIGDDQ..GTDLLQVAAHEFGHVLGLQHTTAAKALMSAFY...TFRYPLSLSPDDCRGVQHLYGxst3 : AHAFFPKTHREGDVHFDYDEAWTIGNNI..GTDLLQVAAHEFGHMLGLQHSSISKSLMSPFY...TFRYPLSLSADDKHGIQFLYGmmmp07 : GHAFAPGPGLGGDAHFDKDEYWTDGEDA..GVNFLFAATHEFGHSLGLSHSSVPGTVMYPTYQR.DYSEDFSLTKDDIAGIQKLYGhmmp07 : AHAFAPGTGLGGDAHFDEDERWTDGSSL..GINFLYAATHELGHSLGMGHSSDPNAVMYPTYGN.GDPQNFKLSQDDIKGIQKLYGmmmp12 : AHVFYPGPGIQGDAHFDEAETWTKSFQ...GTNLFLVAVHELGHSLGLQHSNNPKSIMYPTYR.YLNPSTFRLSADDIRNIQSLYGhmmp12 : AHVFYPGPGIQGDAHFDEAETWTKSFQ...GTNLFLVAVHELGHSLGLQHSNNPKSIMYPTYR.YLNPSTFRLSADDIRNIQSLYGhmmp08 : AHAFQPGQGIGGDAHFDAEETWTNTSA...NYNLFLVAAHEFGHSLGLAHSSDPGALMYPNY.AFRETSNYSLPQDDIDGIQAIYGmmmp08 : AHAFQPGQGIGGDAHFDSEETWTQDSK...NYNLFLVAAHEFGHSLGLSHSTDPGALMYPNY.AYREPSTYSLPQDDINGIQTIYGhmmp01 : AHAFQPGPGIGGDAHFDEDERWTNNFR...EYNLHRVAAHELGHSLGLSHSTDIGALMYPSY.TF..SGDVQLAQDDIDGIQAIYGhst1 : AHAYAPGPGINGDAHFDDDEQWTKDTT...GTNLFLVAAHEIGHSLGLFHSANTEALMYPLYHSLTDLTRFRLSQDDINGIQSLYGhst2 : AHAYPPGPGLYGDIHFDDDEKWTEDAS...GTNLFLVAAHELGHSLGLFHSANTEALMYPLYNSFTELAQFRLSQDDVNGIQSLYGmst1 : AHAYAPGPGINGDAHFDDDERWTEDVT...GTNLFLVAAHELGHSLGLYHSAKAEALMYPVYKSSTDLSRFHLSQDDVDGIQSLYGmst2 : AHAYPPGPGFYGDVHFDDDEKWTLAPS...GTNLFLVAAHELGHSLGLFHSDKKESLMYPVYRFSTSPANFHLSQDDIEGIQSLYGhmmp13 : AHAFPPGPNYGGDAHFDDDETWTSSSK...GYNLFLVAAHEFGHSLGLDHSKDPGALMFPIY.TYTGKSHFMLPDDDVQGIQSLYGhmt1mmp : AHAYFPGPNIGGDTHFDSAEPWTVRNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSSDPSAIMAPFYQ.WMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGmmt1mmp : AHAYFPGPNIGGDTHFDSAEPWTVQNEDLNGNDIFLVAVHELGHALGLEHSNDPSDIMSPFYQ.WMDTENFVLPDDDRRGIQQLYGhmt3mmp : AHAYFPGPGIGGDTHFDSDEPWTLGNPNHDGNDLFLVAVHELGHALGLEHSNDPTAIMAPFYQ.YMETDNFKLPNDDLQGIQKIY.
La Stromélysine-3 est une métalloprotéase matricielle (MMP-11)* décrite chez l'homme (hST3), la souris (mST3) et le xénope (xST3)* impliquée dans des processus physiologiques ou pathologiques où sont observées une prolifération intense et/ou une dégénérescence tissulaire (métamorphose des amphibiens, développement embryonnaire des mammifères, involution de la glande mammaire après lactation, cicatrisation de la peau, réparation osseuse ou carcinomes)* exprimée dans des cellules liées à des phénomènes d'invasion (implantation de l'embryon, morphogenèse osseuse et carcinomes invasifs)
Figure 1: Expression de la ST3.A: Tissus normal du sein. B: Cancer du sein. La ST3 (coloration brune) est exprimée dans les cellules fibroblastiques du stroma, au voisinage immédiat des îlots de cellules cancéreuses.Dans un contexte de carcinome invasif, la ST3 est un marqueur de mauvais pronostic.
A B
Ilôt decellulescancéreuses
Stromatumoral
Figure 7: Cristaux du complexe.A: Cristaux cubiques (environ 100µm de côté). B: Cristaux hexagonaux mâclés (300µmx100µmx70µm). C: Baguettes monocristallines (20µmx50µmx20µm). Ces cristaux ont permis l’enregistrement de données.
CA B
Taille des cristaux 20µmx20µmx50µm
Groupe d'espace Orthorhombique
Paramètres de maille a=140.1Å;
b=148.5Å; c=91.4Å;
α=ß=γ=90°Molécules/unit é asymétrique 6 moléculesPourcent aged esolvant 68%
Table 1au : Paramètre s cristallographique .s
Collecte des données
Source des rayons X Rayonnement synchrotron (E.S.R.F.)
Température d’enregistrement -150°C
Résolution limite 2.6Å
Nombre total de réflexions 59 660
Espace enregistré 100°
Complétude (%) 100%
Indexation (Denzo et Scalepack)
Résolution 20Å - 2.6Å
Rsym (%) 11.9%
Résolution de la structure par Remplacement Moléculaire
Résolution 20Å - 2.6Å
R (%) 28.3%
Rsym (%) 31.6%
Tableau 2: Statistiques relatives à la résolution de la structure.
Figure 8: Modèle moléculaire du complexeLe complexe comporte deux atomes de zinc, un atome de calcium, une molécule d ’inhibiteur phosphinique et deux molécules de CHAPS.
COOH
NH2
CHAPS
CHAPS
Inhibiteur phosphinique
Ca2+
Zn2+
Zn2+