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1 Informe Final SIP 2008-0800 Informe Final ESTUDIO DE POBLACIONES MICROBIANAS CON POTENCIAL PARA EL APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS INDUSTRIALES NO TOXICOS Proyecto SIP: 2008-0800 Director del proyecto: Dra. María del Carmen Villegas Hernández Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada – IPN, Tlaxcala Resumen Uno de los principales problemas en la actualidad es el manejo de desechos sólidos, en especial de aquellos generados en la industria, y que a menudo se clasifican como “de tratamiento especial”. Sin embargo, no todos los desechos sólidos industriales requieren ser confinados o son potencialmente tóxicos, por ejemplo, derivado del tratamiento de efluentes de la industria papelera se generan lodos ricos en celulosa y lignina, fuente potencial de carbono aprovechable para la recuperación de suelos. Por ello, se propuso diseñar una estrategia para el aprovechamiento de desechos industriales no tóxicos enfocándonos a la preparación de una composta mejorada con fines de recuperación de suelos forestales y agrícolas. En este proyecto nos enfocamos al aislamiento y evaluación de sistemas de biodegradación (cepas puras o consorcios microbianos), diseño de sistemas de inoculación con cepas o consorcios microbianos que incluyan fijadores de nitrógeno, bioaumentación con cepas de colección, compostaje con otros materiales de desecho agroindustrial (para optimizar la relación C/N), y con ello, favorecer la biodegradación y la consecuente liberación de nutrientes al medio. Introducción La composta es obtenida de manera natural, por descomposición bioquímica, al favorecer la fermentación aeróbica de residuos orgánicos como restos vegetales, animales o excremento. Ello, por medio de la reproducción masiva de bacterias aerobias termófilas que están presentes en forma natural en casi cualquier lugar; posteriormente, la fermentación la continúan otras especies de bacterias, hongos y actinomicetos. Se trata de evitar, en lo posible, la putrefacción de los residuos orgánicos (por exceso de agua) bajo condiciones anaeróbicas

ESTUDIO DE POBLACIONES MICROBIANAS CON POTENCIAL PARA EL APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS ... · 2011-11-14 · de los microorganismos que causan enfermedades ... 1998). Las aplicaciones

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1 Informe Final SIP 2008-0800

Informe Final

ESTUDIO DE POBLACIONES MICROBIANAS CON POTENCIAL PARA EL

APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS INDUSTRIALES NO TOXICOS Proyecto SIP: 2008-0800 Director del proyecto: Dra. María del Carmen Villegas Hernández Centro de Investigación en Biotecnología Aplicada – IPN, Tlaxcala Resumen Uno de los principales problemas en la actualidad es el manejo de desechos sólidos, en especial de aquellos generados en la industria, y que a menudo se clasifican como “de tratamiento especial”. Sin embargo, no todos los desechos sólidos industriales requieren ser confinados o son potencialmente tóxicos, por ejemplo, derivado del tratamiento de efluentes de la industria papelera se generan lodos ricos en celulosa y lignina, fuente potencial de carbono aprovechable para la recuperación de suelos. Por ello, se propuso diseñar una estrategia para el aprovechamiento de desechos industriales no tóxicos enfocándonos a la preparación de una composta mejorada con fines de recuperación de suelos forestales y agrícolas. En este proyecto nos enfocamos al aislamiento y evaluación de sistemas de biodegradación (cepas puras o consorcios microbianos), diseño de sistemas de inoculación con cepas o consorcios microbianos que incluyan fijadores de nitrógeno, bioaumentación con cepas de colección, compostaje con otros materiales de desecho agroindustrial (para optimizar la relación C/N), y con ello, favorecer la biodegradación y la consecuente liberación de nutrientes al medio. Introducción La composta es obtenida de manera natural, por descomposición bioquímica, al favorecer la fermentación aeróbica de residuos orgánicos como restos vegetales, animales o excremento. Ello, por medio de la reproducción masiva de bacterias aerobias termófilas que están presentes en forma natural en casi cualquier lugar; posteriormente, la fermentación la continúan otras especies de bacterias, hongos y actinomicetos. Se trata de evitar, en lo posible, la putrefacción de los residuos orgánicos (por exceso de agua) bajo condiciones anaeróbicas

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que generan mal olor. Además, durante la descomposición de la materia orgánica se genera un calor de aproximadamente 70° C, esto sirve para matar los huevecillos de insectos y la mayoría de los microorganismos que causan enfermedades (Eweis et al. 1998; Semple et al. 2001). La composta puede ser utilizada para abonar terrenos desgastados o pobres en nutrientes, aunque es un producto concentrado que debe ser mezclado con el suelo u otros ingredientes antes de su uso. El porcentaje máximo de composta en una mezcla es de alrededor del 30% y varía en función de su uso posterior. En paisajismo y jardinería, por ejemplo, puede ser usado de forma directa como cobertura para el suelo. En cualquier caso, al igual que el propio suelo, no debe aplicarse sobre los troncos de árboles y arbustos, ya que esta práctica provoca el aumento de los daños causados por insectos. También se considera que la aplicación de composta mejora la estructura del suelo, incrementa la cantidad de materia orgánica y proporciona nutrientes, como el nitrógeno, potasio y fósforo (Eweis et al. 1998; Semple et al. 2001). A la composta también se le llama "humus artificial", el humus natural o "mantillo" ocupa la capa más superficial del suelo y proviene de la descomposición de materias orgánicas. Esta descomposición es llevada a cabo principalmente por microorganismos, aunque algunos animales como lombrices y hormigas contribuyen al proceso. La descomposición ocurre de forma natural en la mayoría de los ambientes, excepto en aquellos más hostiles, como desiertos muy áridos, que impiden que los microbios y otros agentes en descomposición se desarrollen (Hsu y Lo, 1999). Cuando un proceso se lleva a cabo de forma lenta en la propia naturaleza, puede prepararse un entorno optimizando las condiciones para que los agentes de la descomposición proliferen. Estas condiciones incluyen una mezcla correcta de carbono, nitrógeno, y oxígeno, así como control de la temperatura, pH o humedad. Si alguno de estos elementos abundase o faltase, el proceso se produciría igualmente pero, muy probablemente, de forma más lenta e incluso desagradable por la actuación de microorganismos anaerobios que producen olores (Hsu y Lo, 1999). El compostaje más rápido tiene lugar cuando hay una relación (en seco) carbono-nitrógeno de entre 25/1 y 30/1, es decir, que haya entre 25 y 30 veces más carbono que nitrógeno. Por ello, muchas veces se mezclan distintos componentes de distintas tasas C/N. Los recortes de césped tienen una tasa 19/1 y las hojas secas de 55/1. Mezclando ambos a partes iguales se obtiene una materia prima óptima. También es necesaria la presencia de celulosa (fuente de carbono) que las bacterias transforman en azúcares y energía, así como las proteínas (fuente de nitrógeno) que permiten el desarrollo de las bacterias. Son fuentes de carbono la paja y hojas secas, astillas, aserrín, y algunos tipos de papel y cartón sin tintas (Eweis et al. 1998; Semple et al. 2001).

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Un factor clave en el diseño de un proceso exitoso de compostaje radica en la selección de su composición y contenido de aditivos y/o agentes de volumen, lo cual conlleva a un aumento en la velocidad de biodegradación de los contaminantes. Sin embargo, si se emplea una gran cantidad de aditivos, el área necesaria para el tratamiento se incrementa (Eweis op. Cit. 1998). Las aplicaciones más comunes del compostaje incluyen el tratamiento de residuos agrícolas, de desechos de jardinería y cocina, de residuos sólidos municipales y de lodos. Sin embargo, existen investigaciones a nivel laboratorio, piloto y a gran escala donde se ha demostrado que el proceso de compostaje, así como el uso de composta madura, es una solución de bajo costo y tecnológicamente efectiva para remediar suelos contaminados por residuos orgánicos peligrosos como los HTP, solventes, explosivos, pesticidas e HAP (Eweis et al. 1998; Semple et al. 2001). Las condiciones óptimas y el éxito de un proceso de compostaje depende de diversos parámetros, los cuales pueden resumirse en tres categorías: las características del suelo, las condiciones climáticas y las características de los contaminantes. Una de las condiciones recomendadas para el empleo de este tipo de tecnología de biorremediación para suelos es el clima cálido, donde la temperatura oscile entre 20 y 40°C, ello debido a que estos sistemas requieren temperaturas de operación entre 5 y 40°C (Eweis et al. 1998). La temperatura de operación de una biopila, normalmente debe encontrarse entre los 30 y 40 °C (etapa mesofílica) o entre 50 y 60 °C (etapa termofílica) y depende principalmente del calor generado por la actividad metabólica de los microorganismos en la composta y por las condiciones climáticas del lugar (Eweis et al. 1998). Objetivo general Diseñar una estrategia de utilización de desechos no tóxicos de la industria papelera para la recuperación de suelos, mediante técnicas microbiológicas y de compostaje. Objetivos particulares

- Determinar la composición estructural y física de los lodos de desecho de la industria papelera.

- Evaluar cepas o consorcios microbianos capaces de iniciar la degradación de lodos ricos en fibras cortas de celulosa, provenientes de la industria papelera.

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- Construir un consorcio con microorganismos nativos o bioaumentándolos con cepas de colección que se hayan reportado como degradadores de residuos celulósicos.

- Establecer métodos de compostaje, enriquecimiento o inoculación que faciliten la biodegradación de los lodos aplicados in situ.

- Identificar mediante técnicas bioquímicas y moleculares (secuencia del 16S rDNA ó 23 S rDNA) las cepas o consorcios microbianos útiles para la degradación de lodos generados en la industria papelera.

- Estabilizar los lodos para facilitar la acción de los consorcios microbianos y permitir el uso de los mismos en campo abierto.

- Estimar la tasa de degradación del material primario de los lodos y su aporte al suelo mediante monitoreo por técnicas espectrofotométricas (Absorción infrarroja).

- Evaluar diferentes formulaciones y mezclas (con tratamiento de compostaje, enriquecimiento o inoculación) en función del tipo de suelo en que se va a aplicar

- Diseñar ensayos preliminares de aplicación en campo en zonas estratégicas (por demanda) de común acuerdo con la SEMARNAT

- Evaluar la tasa de degradación de lodos y enriquecimiento del suelo en parcelas experimentales en zonas estratégicas de aplicación, según información provista por la SEMARNAT

Producto final

1- Generar un consorcio microbiano capaz de degradar materia orgánica con alto índice C/N, proveniente de la industria papelera.

2- Caracterización bioquímica y genética del consorcio microbiano seleccionado para la biodegradación de lodos de desecho de la industria papelera.

3- Protocolos piloto de aplicación de cepas o consorcios microbianos, para el aprovechamiento de residuos no tóxicos de la industria papelera, en diferentes condiciones climáticas, tipos y usos de suelo.

4- Estimaciones de la tasa de degradación de desechos no tóxicos de la industria papelera en condiciones de invernadero y a nivel de parcelas experimentales in situ.

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Materiales y Métodos Aislamiento de microorganismos con potencial de degradación de lodos industriales no tóxicos Obtención de muestras de suelo de bosque y de composta doméstica, se utilizaron 4 diferentes medios de cultivo (TY, LB, DPM y PDA). Se evaluó el tipo de crecimiento en cada uno de los medios. Se prepararon diluciones decimales a partir de una suspensión de suelo o composta y se sembró masivamente en placas de Petri con medio gelificado. Se incubó a 28 - 30oC por al menos dos semanas. Del crecimiento obtenido, se eligieron las colonias de hongos y bacterias con mejor crecimiento (5 hongos y 2 bacterias), los cuales se propagaron en las mismas condiciones de incubación, utilizando medio PDA para hongos medio TY para bacterias. Posteriormente, se modificaron las composiciones de los medios de cultivo, sustituyendo las fuentes de carbono y nitrógeno por los desechos industriales no tóxicos. En placas de Petri, se depositaron 40 grs. aproximadamente de lodos industriales, en forma individual o mezclando los lodos provenientes de una industria papelera y una industria refresquera. Se sembró en medio PDA, incubando a Tº 22, 30 y 37 ºC, en todos se obtuvo crecimiento, pero el mejor crecimiento se obtuvo en incubación a 37 ºC. Por ello, en lo subsecuente se mantuvo esta temperatura de incubación para la propagación de las cepas en estudio. Ensayos de composición de compostaje a nivel invernadero Estos ensayos se efectuaron en el invernadero del CIBA-IPN, Tlaxcala, considerando las composiciones experimentales incluidas en la tabla 1. Se montaron ensayos de compostaje utilizando mezclas de igual proporción pero inoculados con diferentes hongos aislados de suelo y de composta.

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Tabla 1.- Composición “A”

GRUPO DE COMPOSTAS CON INOCULACIÓN No. Cepa

fúngica Lodo (1) Lodo (2) Basura

orgánica Hojarasca Suelo de

Altzayanca 1 1 5 kg 1 kg ½ kg ½ kg 3 kg 2 2 5 kg 1 kg ½ kg ½ kg 3 kg 3 3 5 kg 1 kg ½ kg ½ kg 3 kg 4 4 5 kg 1 kg ½ kg ½ kg 3 kg

Las mezclas indicadas en la tabla 1 fueron comparadas contra testigos sin inoculación, montadas en paralelo. Para poder evaluar el efecto de adición de agentes texturizantes (hojarasca)y complementarios (basura orgánica) se montó una serie de mezclas de compostaje sin inoculación, como se muestra en la siguiente tabla. Tabla 2.- Composición “C” (Evaluación de agentes texturizantes y complementarios) GRUPO DE COMPOSTAS SIN INOCULACIÓN (TESTIGOS 2) No. Vermiculita

con arena (1:1)

Composta doméstica

Composta Apatzingan

Lodo (1)

Lodo (2)

Basura orgánica

Hojarasca Suelo de Altzayanca

9 - - - 5 kg 1 kg ½ kg ½ kg 3 kg 10 - - - 2.5

kg 1 kg 1.5 kg 1.5 kg 3.5 kg

11 10 kg - - - - - - - 12 - 10 kg - - - - - - 13 - - 10 kg - - - - - En este ensayo se incluyó una mezcla con vermiculita y arena estéril 1:1 (como sustratos inertes), composta doméstica y composta de Atizapan de Zaragoza (como referencia de sustratos similares). Ensayos de efecto sobre germinación de semillas Utilizando alícuotas de las diferentes mezclas detalladas en la sección anterior, se montaron ensayos de siembra de frijol y maíz con semillas previamente humedecidas. Cada alícuota fue depositada en cuatro macetas (Tabla 3). En cada maceta se depositaron 4 semillas, 3 en forma triangular y una al centro.

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Tabla 3.- Siembra de frijol y Maíz en macetas con las diferentes compostas montadas en invernadero. Compos ta

Frijol Grs/ maceta

Dias de germinación

Observaciones (Apariencia física)

Maíz Grs/ maceta

Dias de germinación

Observaciones (Apariencia física)

1 Si 442 NG Aparentemente muy dura y con poca permeabilidad.

Si 400 NG Muy dura, poco permeable

2 Si 454 NG Poco estructurada y poco permeable

Si 472 NG Buena apariencia física, pero poco permeable

3 Si 420 9 Poco estructurada y poco permeable

Si 458 NG Poco estructurada, poco permeable

4 Si 394 NG Poco estructurada y poco permeable

Si 428 4 Poco estructurada, poco permeable

5 Si 394 9 Muy reseca, muy poco permeable

Si 414 4 Muy dura, muy reseca, poco permeable

6 Si 374 10 Aparentemente muy dura y poco permeable

Si 414 4 Muy dura, poco permeable

7 Si 396 10 Muy permeable Si 414 3 Poco permeable 8 Si 276 10 No retiene

humedad y dura Si 368 4 Muy permeable,

Buena apariencia física

9 Si 438 10 Aparentemente dura y poco permeable

Si 456 3 Poco estructurada, poco permeable

10 Si 438 11 Muy permeable Si 352 3 Poco permeable 11 Si 428 10 Permeable,

Buena apariencia Si 340 3 Permeable, Buena

apariencia 12 Si 430 10 Permeable,

Buena apariencia Si 410 3 Permeable, Buena

apariencia 13 Si 210 NG Aparentemente

muy permeable Si 570 3 Muy Buena

apariencia, muy permeable

14 Si 260 NG Aparentemente permeable

Si 262 NG Muy Buena apariencia, muy permeable

NG: No germinó. Último día de lectura: 27/01/09 En la tabla 3, se resumen las condiciones bajo las cuales se ensayó el efecto de la composta sobre germinación de semillas de frijol y maíz en maceta.

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Resultados Aislamiento de microorganismos con potencial de degradación de lodos industriales no tóxicos Si bien se obtuvieron tanto cepas bacterianas (2) como fúngicas (5), se decidió pasar a ensayos a nivel de invernadero utilizando como inóculo exclusivamente cepas fúngicas debido a la velocidad de crecimiento de las cepas en medios de cultivo con fuentes de C y N modificadas (sustitución con lodos industriales no tóxicos) y la degradación aparente de los lodos en ensayos in vitro. En las figuras 1 y 2 se muestran los resultados de primoaislamiento y el esquema general de aislamiento y propagación de cepas microbianas (hongos y bacterias) con potencial degradador de lodos industriales no tóxicos. Ensayos a nivel invernadero De acuerdo al montaje resumido en la Tabla 1, y a 4 meses de maduración de las compostas, éstas presentaron una mejor apariencia física que los testigos correspondientes. Se observó cambio en la apariencia física de las compostas (Fig. 3), en forma particular en la capa superficial, en esta se observó pigmentación verde opaca a beige, aparentemente relacionada al grado de propagación microbiana y la temperatura alcanzada por la pila de compostaje. También se percibió la disminución gradual del mal olor emanado en las primeras fases por los lodos industriales de la refresquera. La consistencia de la mezcla cambió notablemente, mejorando su estructura y modificando gradualmente la textura hacia agregados de menor tamaño. De acuerdo a los resultados cualitativos obtenidos, a partir de la composta doméstica se obtuvieron microorganismos con mayor capacidad de degradación de desechos industriales no tóxicos, en comparación con los aislados a partir del suelo de bosque. Ello con base en la maduración de la composta (evaluada por aspecto y olor) en las mezclas inoculadas con los diferentes microorganismos. Por otro lado, las compostas que contienen mayor cantidad de lodo industrial no tóxico de la industria papelera presentan un olor menos desagradable que las que contienen mayor cantidad de lodo industrial no tóxico de la industria refresquera. Sin embargo, el tiempo de maduración también disminuye con la adición de lodos provenientes de la industria refresquera. Así mismo, la degradación aparente de lodos de las dos empresas es más rápida si se le agrega hojarasca y basura orgánica, como agentes texturizantes y favorecedores de la oxigenación de la mezcla.

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Fig. 1 Esquema general de aislamiento y propagación de cepas microbianas

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Fig. 2 Diferentes sistemas de primo-aislamiento y cultivo han permitido detectar la presencia de hongos filamentosos, levaduras y bacterias La inoculación de cepas fúngicas en las diferentes mezclas de compostaje permitió acelerar hasta en un 50% la degradación de los desechos industriales no tóxicos, tanto de la industria refresquera como de la papelera, con base en la apariencia de la composta y pruebas preliminares de efecto sobre germinación de semillas.

Fig. 3 Diseño preliminar de compostaje, considerando diferentes mezclas con otros sustratos Ensayos de efecto sobre germinación de semillas En el caso del maíz todas fueron germinadas y en el caso del frijol, sólo 2 semillas germinaron antes de sembrarlas. En las mezclas de composta conteniendo una mayor cantidad

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de lodo industrial no tóxico de la industria papelera, la consistencia es más dura y poco manejable, además de que es donde la semilla tardó más en germinar, por lo que muchas de ellas no crecieron. Al día 27 de enero del 2009, las macetas mejor crecidas fueron las que contienen semillas de maíz en comparación con las de frijol. De las mezclas inoculadas, la que presenta mejor apariencia es inoculada con la cepa fúngica 3. Es necesario puntualizar que las bajas temperaturas alcanzadas durante el año 2008 limitaron los alcances de este estudio, pues los tiempos de maduración de la composta se prolongaron casi al doble de tiempo observado en los ensayos montados en verano. Ello impidió que se efectuaran las estimaciones cuantitativas de tasa de degradación, así como la caracterización de las cepas, pues se esperaban los resultados de efecto sobre la velocidad de maduración de las compostas.

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Impacto Indudablemente, las mejoras que puedan hacerse al proceso de compostaje, especialmente cuando se agrega en la composición de la misma una fracción de lodos industriales no tóxicos, repercutirán en la factibilidad de recuperación o mejora de la calidad nutricional y textura de los suelos. Una composta mejorada bajo estas condiciones puede aportar grandes beneficios. Por un lado, el enriquecimiento del sustrato con fuentes alternativas de carbono y nitrógeno, los dos elementos principales limitantes de la vida en el planeta. Pr otro lado, el ofrecer una alternativa sustentable para el correcto encauzamiento de desechos sólidos, tanto orgánicos (como pueden ser los residuos sólidos urbanos) como industriales, a condición de que no sean potencialmente tóxicos. La condición sin equa non para que este proceso sea realmente efectivo es la participación de diferentes actores de la sociedad, desde las autoridades municipales que faciliten la recolección y encauzamiento de residuos sólidos orgánicos (domésticos, de mercados o tianguis), las industrias locales que estén interesadas en aportar a la mejora del medio ambiente y, paralelamente, reducir sus costos de inversión por tratamiento de desechos sólidos especiales, el productor de cultivos de consumo humano, animal o de productos forestales, e incluso, un grupo de la población interesado en desarrollar una empresa responsable de la producción de esta composta mejorada que con algunas modificaciones podría llegar a constituir un sustrato mejorados de suelos o incluso un sustrato mejorador específico para cultivo agrícola. En otro aspecto, este estudio ofrece una alternativa de generación de empleos, además de que ayuda a disminuir costos de inversión en la producción agrícola y forestal. Sin contar aún con que se puede disminuir notablemente la aplicación de insumos agrícolas de tipo fertilizante químico, pesticidas, herbicidas, y con ello, evitar la contaminación de suelos, mantos freáticos y grandes acumulaciones de agua, al tiempo que se preserva la biodiversidad.