Estudi de la relació estructura/funcióen Metal·lotioneïnes d’Invertebrats, Protozous i Plantes

TESI DOCTORALRealitzada al Departament de Genètica de la Facultat de

Biologia de la Universitat de Barcelona, sota la direcció de laDra. Sílvia Atrian i laDra.Mercè Capdevila

i defensada l’11 de gener de 2007.

Jordi Domènech Casal

Introducció

Donada l’estructuració d’aquesta tesi com acompendi de publicacions, la introduccióque es presenta a continuació té un caràctergeneral, reservant-se per a cada capítolconcret els coneixements més específics.

1- METAL·LOTIONEÏNES:DESCRIPCIÓ GENERALEl 1957, els investigadors Margoshes iVallee injectaren cadmi en cavalls in’analitzaren els extractes de còrtex deronyó, descobrint una nova proteïna que escaracteritzava per tenir un baix pesmolecular, contenir cadmi i sofre, i perl’absència d’aminoàcids aromàtics (Fig. 1).Aquest fou només el primer membre d’unallarga llista de proteïnes que es coneixengenèricament com a Metal·lotioneïnes (MT).

Fig. 1.-Amb el títol “A Cadmium Protein from equinekidney cortex”, el 1957 es publicaren les primeres dades

d’una MT (Margoshes & Vallee, 1957).

Les MT constitueixen una superfamília deproteïnes representada molt àmpliament enels organismes vius, tant en organismesunicel·lulars (cianobacteris, llevats, iprotozous) com en metazous (vertebrats,invertebrats i plantes). Presenten homologiadins de subgrups taxonòmics concrets(p.ex. dins del gènere Tetrahymena, dins delgrup dels vertebrats o el gènere Drosophila)però no a nivell general.

La seva presència tan generalitzada i laseva capacitat d’unió a metalls han suscitatun gran interès, tant per la incògnita de laseva funció i la peculiaritat de la sevaestructura, com per la possible aplicacióbiotecnològica que se’n deriva.Les característiques generals de les MT són:Mida. Tenen un baix pes molecular, entreels 2,5 i 16 kDa, que suposaaproximadament entre uns 25 i 160aminoàcids, tot i que la majoria de les MTconegudes tenen al voltant de 6 kDa.Composició. Tenen un alt contingut decisteïnes, que representen un terç del totald’aminoàcids, i també de serines i glicines.Presenten rarament aminoàcids aromàtics(Phe, Tyr, Trp) en la seva seqüència. Lescisteïnes estan distribuïdes al llarg de laseqüència i formen motius cisteínicscaracterístics Cys-Cys, Cys-X-Cys, Cys-Cys-Cys, entre d’altres (essent X un aminoàcidqualsevol).Expressió. La seva síntesi s’indueix perexposició a metalls pesants (Zn, Cu, Cd,Hg, Ag,...) i situacions d’estrès i/o els seusintermediaris. Les MT es trobenprincipalment a citosol, però endeterminades situacions, també a nucli.

Fig. 2- Cluster metal-tiolat que forma un domini de laMT2 de mamífer amb Cd. S’aprecien les Cys

(numerades en el gràfic) coordinant els ions metàl·lics,(en xifres romanes en el gràfic). Imatge modificada de

Blindauer et al., 2001.Propietats funcionals. Són capaces d’unirmetalls pesants, ja siguin tòxics (Cd, Hg,Pb, Ag, Pt,…) com fisiològics (Zn o Cu), a

Introducció

través dels grups tiol de les cisteïnes,formant clusters metall-tiolat (Fig. 2).Propietats estructurals. Adquireixen laseva estructura mitjançant la formaciód’enllaços entre els residus de cisteïna i elsmetalls. Tenen comportaments químics iespectroscòpics propis dels agregats metall-tiolat, i perden la unió a metalls a pH àcid ien condicions oxidants.

2- LA COORDINACIÓMETÀL·LICA I LESMETAL·LOPROTEÏNES

2.1- Els metalls pesantsEs coneixen com a metalls pesants un grupd’elements que tenen en comú la sevaelevada massa atòmica i la seva toxicitat, ique inclou elements amb característiquesquímiques diverses. N’existeixen diferentsdefinicions, la més àmplia de les quals és lade Hawkes, que el 1997 els definí comaquells elements situats entre els grups 3 i16 i a partir del període quart de la taulaperiòdica, tal com es presenta a la Fig. 3.

Fig. 3- Enmarcats amb un requadre negre,els metalls pesants segons Hawkes.

La majoria d’aquests elements pertanyen albloc d, és a dir, aquells que en algun delsseus estats d’oxidació habituals tenen elsorbitals d semiplens. Les seves propietatstòxiques depenen del metall pesant que esconsideri, de la seva forma química iconcentració, i es deuen principalment al fetque tenen una elevada afinitat per enllaçar-se a macromolècules biològiques, interferintamb enzims que usen metalls com acofactors, alterant la membrana lipídica ointeraccionant directament amb el DNA(Madden, 2003, Garza et al., 2006).

Pel que fa a l’estudi de la interacció entremetal·lotioneïnes i metalls pesants,destaquen per la seva abundància elsestudis sobre agregats Zn-, Cu- i Cd-MT. ElZn i el Cu són metalls fisiològics. En canvi,el Cd és un metall xenobiòtic, i la sevapresència en l’organisme s’associa aintoxicació. En aquest apartat es fa una breusíntesi de les propietats químiques del Zn,el Cu i el Cd, que són els metalls amb quès’ha treballat en aquesta tesi. El Cu és unmetall de transició, i com a tal dóna lloc acompostos de coordinació o complexes. Enles seves formes iòniques, el Cu potpresentar dos estats d’oxidació: l’estatdivalent +2 o l’estat monovalent +1, ques’escriuen, respectivament, Cu(II) i Cu(I). ElCu(I) pot oxidar-se i passar a Cu(II) i aquestes pot reduir a Cu(I). Aquesta capacitat detransformació redox del Cu li confereix unagran capacitat catalítica, cosa que fa quesigui present en molts enzims quecatalitzen reaccions redox. Un exemple enseria la Citocrom C oxidasa, en què el Cujuga un paper clau en la cadena respiratòria(Belevich et al., 2006). En les MT, el Cu estroba coordinat com a Cu(I), en la formamonovalent, i pot adoptar diversesgeometries de coordinació, digonal,trigonal, o fins i tot tetraèdrica(Christianson, 1991; Kulkarni et al., 2006).En canvi, tant el Zn com el Cd són metallspesants que habitualment presenten unúnic estat d’oxidació divalent +2, (Zn(II) iCd(II)), i solen presentar geometries decoordinació tetraèdriques (Christianson,1991, Sarkar et al., 2005). La semblança entreel Zn i el Cd fa que en molts estudis de lespropietats estructurals d’agregats biològics,el Cd(II) sigui usat com a model del Zn(II),donades les seves propietats magnètiquesmolt útils en tècniques bàsiques dedeterminació estructural, com l’NMR.

2.2- La coordinació metàl·lica en proteïnesEls metalls són elements determinants enl’estructura i funció de moltes proteïnes.Segons una revisió recent (Kulkarni et al.,2006), una de cada tres proteïnes de què esconeix l’estructura conté metall com acofactor. Aquesta proporció inclou més de

Introducció

700 proteïnes amb Zn i prop de 170proteïnes amb Cu (Degtyarenko, 2000). Lacoordinació metàl·lica implica la unió d’unió metàl·lic (normalment amb càrregapositiva) amb un lligand (neutre o carregatnegativament), per formar un compost decoordinació (que pot ser neutre o carregat).El lligand, per poder coordinar ionsmetàl·lics ha d’ésser una base de Lewis, és adir, disposar d’un parell d’electrons lliuresque pot compartir amb el metall. Lesproteïnes poden coordinar els metalls através de diversos lligands. Depenentd’aquests i del metall que s’enllaci, quedendeterminades les propietats delcorresponent cluster metàl·lic. En funció delseu origen, els lligands es poden classificarcom a lligands endògens (que formen partde la cadena polipeptídica) o lligandsexògens (que no en formen part)(Degtyarenko, 2000).

Lligands endògens i MTEls aminoàcids contenen grups capaços decoordinar metalls. Entre els lligandsendògens més habituals en les proteïnes hitrobem el grup tiolat de la cisteïna, el grupcarboxilat de l’aspartat i el glutamat, i elgrup imidazol de la histidina. Altres grupsmenys freqüents són el grup tioèter de lametionina, els grups amida i carbonil del’enllaç peptídic, el grup hidroxil de laserina i la treonina, el grup amino de lalisina, el grup fenol de la tirosina, el grupselenol de la selenocisteïna i els grupsamino- i carboxi- terminals dels extrems delpèptid (Degtyarenko, 2000, Auld, 2001).Mentre els metalls durs (Fe, Cr, Vn)prefereixen donants durs (del tipus delcarboxilat), els metalls tous (Zn, Cu, Cd)prefereixen donants tous (del tipus deltiolat, tioèter, imidazol) (Belle et al., 2005).Malgrat que aminoàcids com l’aspartat, elglutamat, l’asparagina o la tirosinaparticipen en la coordinació metàl·lica enaltres proteïnes, en les MT aquestsaminoàcids jugarien només papers menorsen l’estabilització dels agregats, ja que pelque fa als lligands endògens, la coordinaciómetàl·lica en les MT és duta a termeprincipalment per la cisteïna i, en algun cas,

també la histidina (Pande et al., 1985). Totseguit, es comenten amb més profunditatles propietats d’aquests dos lligands.

La cisteïna coordina a través del grup tiolEls grups tiol (R-SH) de les cisteïnes (Cys),que poden desprotonar-se (R-S-) i donarlloc a grups tiolat capaços de coordinar-se acentres metàl·lics (Fig. 4A). La unió de Cysamb més d’un ió metàl·lic pot generarclusters metall-tiolat d’estructures diverses,dependent de la disposició de les Cys alllarg de la cadena peptídica, i en els qualscada centre metàl·lic pot presentargeometries de coordinació variablesdepenent de la naturalesa del metall. Lescisteïnes contribueixen també a lareactivitat de les MT davant els agentselectrofílics (oxidants) - ja que l’oxidació dela cisteïna (R-SH) a cistina (R-S-S-R) potresultar en l’alliberament del metall- i en launió a metalls proporcionen una elevadaestabilitat termodinàmica combinada ambuna labilitat a nivell cinètic. És a dir,agregats proteïna-metall molt estables peròtambé molt aptes per a l’intercanvi demetalls (Maret, 2004). La substituciómetàl·lica segueix en les MT l’ordrecaracterístic d’afinitat metàl·lica dels grupstiol: Hg2+ > Ag1+ = Cu1+ > Cd2+ > Zn2+, demanera que partint d’una Zn-MT es podenobtenir els agregats amb qualsevol delsaltres metalls, per substitució.

Fig. 4- Esquema de la Cys (A) i la His (B). Marcats ambfletxes grises, el lloc d’unió al metall

B

A

Introducció

El radical tiol oxidat esdevé un radical tiyl,que té un estat d’oxidació intermedi entre eldel sofre del grup tiol i el del pont di-sulfur(Ferreri et al., 2005) i al que s’ha atribuït unpaper redox important (Giles et al., 2001).Algunes dades indiquen que podrien tambéexistir radicals tiyl permanents en MT quetindrien una facilitat especial per a acollir-ne la formació (Sievers et al., 1996). En lamajoria de casos, però, quan la cisteïnas’oxida ho fa completament, generant grupsdisulfur.

La histidina, la gran desconeguda en les MTLa histidina (His) és un aminoàcid amb ungrup imidazòlic a la seva cadena lateralsusceptible de coordinar metalls (Fig. 4B).El recent descobriment d’una nova famíliade proteïnes (les polihistines) quecoordinen metalls exclusivament a travésd’histidines (Gupta et al., 2002) és unexemple del gran potencial de coordinaciómetàl·lica que té també aquest aminoàcid,present en altres proteïnes riques encisteïnes relacionades amb la coordinaciómetàl·lica, com és el cas de la proteïnaCRP1, de E.bucholzi (Willuhn et al., 1994).Tot i que les MT es descriguereninicialment com a proteïnes mancades deresidus His, aquest aminoàcid és presenten diverses MT (per exemple, les MT CUP1i CRC5 del llevat S.cerevisiae, CeMT2 iCeMT2 de C.elegans i MT de l’au G.gallus, laplanta M.grisea i el bacteri Synechococcus).La seva participació en la formació declusters metall-MT ha estat corroboradanomés en el cas de les MT SmtA i SmtB, deSynechococcus (Blindauer et al., 2001) (Fig. 5)i proposada per a les MT del fong M.grisea(Tucker et al., 2004) i la MT de G.gallus(Villarreal et al., 2006). Estudis amb formesmutades de MT de mamífer han demostratque la His pot suplir el paper de la Cys enla coordinació metàl·lica(Romero-Isart et al.,1999). En tot cas, malgrat que les cisteïnesjuguen indubtablement un paper essencialen la determinació de les propietats delsagregats metall-MT, s’ha demostrat que elsaminoàcids no cisteínics poden arribar adeterminar la seva afinitat pels metalls iles preferències coordinants. Aquest fet

s’ha pogut observar en comparar MT1, MT2i MT4 de mamífer i les MT de H.pomatiaentre elles (Winge & Miklossy, 1982;Dallinger et al., 1997; Tio et al., 2004), quemostren especificitats metàl·liques diferentsmalgrat presentar un patró de cisteïnesidèntic.

Fig. 5.-Estructura de SmtA, del cianobacteriSynechococcus. Els 4 ions Zn2+(A, B, C, D) són

coordinats per residus de Cys (en groc a la figura) iresidus d’His (identificats per fletxes a la figura).

Imatge modificada de (Blindauer et al., 2001).

Lligands exògens i MTIons inorgànics poden formar part delscomplexos metall-MT tot completantl’esfera de coordinació dels metalls. Entreels lligands exògens més habituals en lesproteïnes hi trobem aigua, clorur, cianur,oxigen, amoni, sulfit i sulfur (Degtyarenko,2000).La participació d’ions sulfur ha estatdemostrada en els agregats metàl·lics d’unspèptids estretament relacionats amb lesMT, les fitoquelatines (PC). Les PC sónpèptids de síntesi enzimàtica formats perunitats de �-glutamil-cisteïna quecoordinen metalls mitjançant Cys i sulfurs,formant unes estructures en les que el

Introducció

recobriment proteic embolcalla unmicrocristall d’un sulfur metàl·lic, i ques’anomenen cristallytes (Winge et al., 1992)(Fig. 6).

Fig. 6-Les PC contenen estructures metall-sulfuranomenades cristallytes formades per exemple per

xarxes de CdS unides a les PC mitjançant enllaços Cd-Cys. Imatge extreta de (Winge et al., 1992).

Les PC tenen característiques funcionals iestructurals similars a les MT, i per això lapossible presència d’ions sulfur en les MTha estat un dels temes d’estudi en aquestatesi.

2.3- Propietats funcionals dels agregatsmetàl·licsCom hem dit, les propietats estructurals iredox de cada agregat metàl·lic depenen deles característiques químiques del metall, ial mateix temps, dels diferents entorns decoordinació que adopti aquest en cadacomplex (Maret, 2005). S’observa, perexemple, que els clusters metàl·lics ambentorns que contenen histidina i lligandsexògens inorgànics amb aigua, nitrogen, ooxigen com a àtoms donadors, solenconformar dominis catalítics, mentre queels clusters formats exclusivament perentorns amb cisteïnes s’associen a dominisestructurals (Vallee & Auld, 1990; Auld,2001) (Fig. 7). La cisteïna pot donar lloctambé a clusters amb papers relacionatsamb reactivitat redox (Maret, 2005), o -combinada amb histidina- formarestructures del tipus “dits de Zn” (Vallee &Auld, 1990; Auld, 2001).

Fig. 7-Les propietats dels agregats depenen també dela distribució i el tipus de lligands. Imatge extreta de

(Auld, 2001).

3- ESTRUCTURA ICLASSIFICACIÓ DE LESMETAL·LOTIONEÏNESLes MT estan distribuïdes molt àmpliamententre els éssers vius, i presenten una grandiversitat de comportaments d’unió ametalls, seqüències i estructura. Com hemdit, presenten homologia exclusivamententre els membres d’un mateix gruptaxonòmic, però no de forma general. Peraixò, s’han usat diversos criteris per aclassificar-les i ordenar-ne el seu estudi.

3.1- Estructura primàriaUna classificació inicial basada enl’homologia amb la MT de cavallLa primera MT estudiada fou la de cavall,però de seguida es començaren acaracteritzar MT d’altres mamífers, queresultaren tenir una semblança molt granentre elles, fet que portà a parlargenèricament de MT de mamífer. Els estudisposteriors començaren a identificar, enaltres organismes, MT que mostraven grausde semblança molt menors. A partird’aquestes primeres observacions esproposà una classificació d’aquestesproteïnes segons la seva estructuraprimària, en funció de la semblança quepresentaven amb la MT de cavall (Fowler etal., 1987), que establia tres classes:Classe I: Inclou les MT d’entre 59 i 63aminoàcids (dels quals 20 són cisteïnes) lesseqüències proteiques de les quals s’alineen

Introducció

perfectament amb la de MT de cavall. Quancoordinen metalls divalents, s’estructurenen dos dominis i en general no presentenaminoàcids aromàtics. Formen partd’aquesta classe les MT de vertebrats,mol·luscs i crustacis.Classe II: Inclou les MT que no s’alineenamb les MT de cavall. Tenen mides icontinguts de cisteïna variables, i podenpresentar aminoàcids aromàtics en petitesproporcions. Formen part d’aquesta classeles MT d’insecte, nemàtodes, ciliats, fongs,plantes i cianobacteris.Classe III: Inclou les fitoquelatines (PC) icadistines, que són sintetitzatsenzimàticament mitjançant lapolimerització d’unitats de �-glutamil-cisteïna, i que responen a la fórmula (�-Glu-Cys)nGly. Aquests pèptids han estatdescrits en plantes i fongs, tot i quedarrerament s’ha hipotetitzat la sevapresència també en metazous, protozous,llevats i cianobacteris, ja que s’hi haidentificat l’enzim responsable de la sevasíntesi (PC-sintasa) (Cobbett &Goldsbrough, 2002; Clemens, 2006). No sóndoncs pròpiament MT, però encomparteixen moltes de les característiquesfuncionals.Cal remarcar que aquesta classificació nodóna una visió general de les MT, ja queagrupa en la Classe II una sèrie de proteïnesque no tenen cap relació entre elles, niestructural ni evolutiva. Es pot consideraruna classificació desfasada, però és encarausada en alguns casos i per això hemconsiderat important de citar-la aquí.Malauradament, encara avui, en moltespublicacions, per a definir les MT de formagenèrica s’usen inadequadament lescaracterístiques que són exclusives de laClasse I.

La taxonomia i l’estructura: una segonaclassificacióEn les MT, les cisteïnes estan distribuïdesen patrons Cys-Xn-Ym-Cys (essent X i Yaminoàcids qualsevol i n i m valors entre 0 i1), essent en general molt freqüent ladisposició Cys-X-Cys, que, curiosament, és

la menys habitual en la resta de proteïnes(Miseta & Csutora, 2000).La incorporació de criteris taxonòmics i laidentificació de patrons de seqüènciacisteínics resultà en una nova classificacióde les MT més detallada proposada perBinz i Kägi (2001), que divideix les MT en15 famílies principals (Taula 1).Les famílies 1 (vertebrats), 3 (crustacis) i 4(equinoderms) d’aquesta classificacióclassificació presenten patrons de cisteïnesque s’han associat a uns dominis (dominisalfa i beta), que es diferencien entre ellsprincipalment per la presència de dobletsCys-Cys, i que, com veurem més endavant,configuren estructures tridimensionals icomportaments coordinants diferenciats. Eltipus i ordenació d’aquests dominis al llargde la seqüència és diversa en les 3 famílies.Mentre en vertebrats es dóna unadisposició beta-alfa, en crustacis és beta-beta,i en equinoderms una estructura de tipusalfa-beta respecte el sentit N-terminal�C-terminal del pèptid. La família 2, o MT demol·lusc, presenta similitud amb les MT demamífer (raó per la qual estaven incloses enla Classe I), però la seva estructuraciósembla ser molt més heterogènia. Lesfamílies de la 5 a la 14 queden restringidesen molts casos a rangs taxonòmics moltbaixos i presenten una elevada variabilitatentre elles.La família 15 és constituïda per les MT deplanta, que presenten dominis rics encisteïna units entre si per dominis sensecisteïnes, que reben el nom d’espaiador.Aquest espaiador no té funció coneguda i laseva longitud ha servit com un dels criterisper establir una subclassificació dinsd’aquesta família (Cobbett & Goldsbrough,2002, Taula 1).La classificació de Binz i Kägi, tot i ser unaclassificació amb uns criteris més sòlids quela primera, dóna lloc a un nombre excessiude grups, classes i subclasses que tampocs’associen a criteris funcionals ni lligamsevolutius..

IntroduccióFAMÍLÍA AA PATRÓ DE SEQÜÈNCIA, CARACTERÍSTIQUES I PARADIGMES

1.-VertebratsMamífers, aus, amfibis,

rèptils, peixos.

60-68 K-x(1,2)-C-C-x-C-C-P-x(2)-C.S’estructuren en dos dominis, alfa i beta, quan coordinen metalls divalents (4 i 3, respectivament). Cada espècie pot presentar multiplicitat d’isoformes, enocasions amb preferències de coordinació específiques d’isoforma.

M.musculus MT1 MDPNCSCTTGGSCACAGSCKCKECKCTSCKKCCSCCPVGCAKCAQGCVCKGSSEKCRCCA � �

2.-Mol·luscsM.edulis, H.pomatia

C.virginica, D.polimorfa

64-75 C-x-C-x(3)-C-T-G-x(3)-C-x-C-x(3)-C-x-C-K.Existeixen indicis que s’estructuren en dos agregats metàl·lics, tot i que existeixen algunes isoformes que poden tenir més de dos dominis. Presentenestequiometries metàl·liques equivalents a les de vertebrat. Cada espècie pot presentar diverses isoformes, en ocasions amb preferències metàl·liquesespecífiques.

M.edulis10MTIV MPAPCNCIETNVCICDTGCSGEGCRCGDACKCSGADCKCSGCKVVCKCSGSCACEGGCTGPSTCKCAPGCSCK3.-Crustacis

H.americanus, C.sapidusP.potamios, S.serrata

58-60 P-[GD)-P-C-C-x(3,4)-C-x-C.S’estructuren en dos dominis de tipus beta que enllacen respectivament 3 metalls divalents. Alguna espècie presenta múltiples isoformes amb preferènciesde coordinació específiques d’isoforma.

H.americanus MTH MPGPCCKDKCECAEGGCKTGCKCTSCRCA PCEKCTSGCKCPSKDECAKTCSKPCKCCP � �

4.EquinodermsS.purpuratus, P.lividusS.granularis, L.pictus

64-67 P-D-x-K-C-[V,F)-C-C-x(5)-C-x-C-x(4)-C-C-x(4)-C-C-x(4,6)-C-CS’estructuren en dos dominis, alfa i beta, que enllacen respectivament 4 i 3 metalls divalents. Els dominis estan disposats en ordre oposat al de vertebrats.Existeixen també altres isoformes de mida menor, específiques d’embrió.

S.purpuratus SpMTA MPDVKCVCCKEGKECACFGQDCCKTGECCKDGTCCGICTNAACKCANGCKCGSGCSCTEGNCAC � �

5.-DíptersD.melanogaster

D.simulans

40-43 C-G-x(2)-C-x-C-x(2)-Q-x(5)-C-x-C-x(2)D-C-x-CPer semblança amb la CUP1 de S.cerevisiae i donat el baix nombre de Cys, es suposa que forma un sol domini. 4 isoformes descrites fins ara enD.melanogaster. MT d’altres insectes, com la de Orchesella cincta no es poden incloure en aquest grup, i estan pendents d’atribució.

D.melanogaster MTNB MVCKGCGTNCQCSAQKCGDNCACNKDCQCVCKNGPKDQCCSNK6.-Nematodes

C.elegans62-74 K-C-C-x(3)-C-C

S’han descrit dues isoformes en C.elegans, que presenten aminoàcids no habituals en MT, com la Tyr i la His. C.elegans MT1 MACKCDCKNKQCKCGDKCECSGDKCCEKYCCEEASEKKCCPAGCKGDCKCANCHCAEQKQCGDKTHQHQGTAAAH

7.-CiliatsT.termophilaT.pigmentosaT.pyriformis

107-168 No s’ha atribuït cap patró, tot i que és comú el patró x-C-C-C-x. Són anormalment llargues.Tot i que el nom de la família inclou tots els ciliats, només té en compte les MT del gènere Tetrahymena. Presenta nombroses isoformes específiques perinducció de metalls resultat de duplicacions i repeticions internes. L’especificitat es correspon amb la presència/absència de triplets Cys.

T.termophila MTT1 MDKVNSCCCGVNAKPCCTDPNSGCCCVSKTDNCCKSDTKECCTGTGEGCKCVNCKCCKPQANCCCGVNAKPCCFD PNSGCCCVSKTNNCCKSD TKECCTGTGEGCKCTSCQCCKPVQQGCCCGDKAKACCTDPNSGCCCSNKANKCCDATSKQECQTCQCCK

8.-Fongs 1N.crassa, A.bisporus

25-27 C-G-C-S-x(4)-C-x-C-x(3,4)-C-x-C-S-x-C. Formen un sol agregat amb 3 metalls divalents o 6 metalls monovalents.

N.crassa MT MGDCGCSGASSCNCGSGCSCSNCGSK9.-Fongs 2

C.glabrata62 Aquesta família està formada per una sola MT, raó per la qual no consta cap patró.

Forma un sol agregat metàl·lic de 18 Cys coordinant 11-12 Cu.

C.glabrata MT2 MANDCKCPNGCSCPNCANGGCQCGDKCECKKQSCHGCGEQCKCGSHGSSCHGSCGCGDKCECK

Introducció

10.-Fongs 3C. glabrata

51 Aquesta família està formada per una sola MT, raó per la qual no consta cap patró.Forma un sol agregat metàl·lic de 16 Cys coordinant 10 Cu.

C.glabrata MT2 MPEQVNCQYDCHCSNCACENTCNCCAKPACACTNSASNECSCQTCKCQTCKC11.-Fongs 4

Y. lipolitica54-55 C-X-K-C-x-C-x(2)-C-K-C.

Quatre isoformes que tenen en comú la presència d’un triplet Cys. Tenen His i Phe a N-term. Y.lipolitica MT3 MEFTTAMLGASLISTTSTQSKHNLVNNCCCSSSTSESSMPASCACTKCGCKTCKC

12.-Fongs 5S.cerevisiae

61 Sense patró associat.Formada exclusivament per la CUP1 de llevat. Forma agregats amb 8 Cu en un sol domini. Presència de His i Phe.

S.cerevisiae CUP1 MFSELINFQNEGHECQCQCGSCKNNEQCQKSCSCPTGCNSDDKCPCGNKSEETKKSCCSGK13.-Fongs 6

S.cerevisiae69 Sense patró associat.

Formada exclusivament per la CRS5 de llevat. Possiblement formi dos dominis. Presència de 2 His. S.cerevisiae CRS5 TVKICDCEGECCKDSCHCGSTCLPSCSGGEKCKCDHSTGSPQCKSCGEKCKCETTCTCEKSKCNCEKC

14.ProcariotesSynechococcus sp

S.vulcanus

53-56 K-C-A-C-x(2)-C-L-C.En aquest grup s’inclouen només les MT d’alguns cianobacteris. Tenen His i Tyr conservades, i s’estructuren en un sol domini que conté una hèlix alfa similara la dels dits de Zn. Dimeritza per a obtenir la seva activitat biològica.

Synechococcus sp SmtA MTTVTQMKCACPHCLCIVSLNDAIMVDGKPYCSEVCANGTCKENSGCGHAGCGCGSA15.-Plantes Les MT de planta presenten regions sense Cys en la seva seqüència, anomenades espaiador, o spacer region. Segons la disposició i característiques

d’aquestes regions, s’han classificat en 5 subfamílies. No hi ha dades concloents sobre la seva estructura 3D.

Plantes Tipus 1 C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)-espaiador- C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3).L’espaiador sol mesurar al voltant de 40 aminoàcids i presentar aminoàcids aromàtics com la Phe o la Tyr. Estudis de coordinació metàl·lica indiquen que l’espaiador podriaser processat post-traduccionalment. N’existeix un subtipus (Brassicàcies) que tenen un espaiador més curt. La MT de l’alga F.vesciculosus es classifica provisionalmentcom a membre d’aquest subtipus.

Pisum sativum MT MSGCGCGSSCNCGDSCKCNKRSSGLSYSEMETTETVILGVGPAKIQFEGAEMSAASEDGGCKCGDNCTCDPCNCK

Plantes Tipus 2 C-C-X(3)-C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)-espaiador- C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)- C-X-C-X(3)L’espaiador sol mesurar al voltant de 40 aminoàcids i presentar aminoàcids aromàtics com la Phe o la Tyr. Té una estructura primària similar al tipus 1, excepte un dobletCys afegit a N-term.

L.esculetum MT MSCCGGNCGCGSSCKCGNGCGGCKMYPDMSYTESSTTTETLVLGVGPEKTSFGAMEMGESPVAENGCKCGSDCKCNPCTCSK

Plantes Tipus 3 Un sol representant. Presenta espaiador llarg, al voltant de 40 aminoàcids. Només 4 Cys en el domini N-term, i un doblet Cys en el domini C-term. Presenta aminoàcidsaromàtics a l’espaiador.

A.thaliana MT3 MSSNCGSCDCADKTQCVKKGTSYTFDIVETQESYKEAMIMDVGAEENNANCKCKCGSSCSCVNCTCCPN

Plantes Tipus 4 o Ec C-x(4)-C-X-C-X(3)-C-X(5)-C-X-C-X(9,11)-HTTCGCGEHC-X-C-X(20)-CSCGAXCNCASC-X(3,5).Les MT d’aquest grup presenten la peculiaritat de tenir dos espaiadors enlloc d’un i l’absència d’aminoàcids aromàtics.

T.aestium MT MGCNDKCGCAVPCPGGTGCRCTSARSDAAAGEHTTCGCGEHCGCNPCACGREGTPSGRANRRANCSCGAACNCASCGSTTATaula 1.- Classificació de les MT en funció de la seva estructura primària, segons Binz & Kägi, 2001. (http://www.biochem.unizh.ch/mtpage/classif.html). Es detallen alguns aspectes estructurals ifuncionals de cada família. Els patrons de seqüència de les famílies 1, 3 i 4 estan compostos per unitats similars que es corresponen amb les estructures terciàries alfa i beta comentades en el text.. Laclassificació interna de la família 15 en 4 tipus no és la original de Binz i Kägi i ha estat substituïda per una classificació més recent de Cobbet i Goldsbrough, 2002. Els aminoàcid aromàtics (Y,W,F) iles Cys i His apareixen marcats en les seqüències.

Introducció

3.2- Estructura secundàriaMolts autors afirmen de manera genèricaque les MT estan mancades d’elementsd’estructura secundària (Zhu et al., 1994;Cobine et al., 2004; Bilecen et al., 2005;Calderone et al., 2005). No obstant això,estudis estructurals demostren que enalgunes MT es poden trobar hèlixs 310, �-turns de tipus I i II, �-sheets i �-helixs, tot ique la presència d’aquests elements no espot generalitzar al llarg de la taxonomia.La formació d’elements d’estructurasecundària podria ser un pas important pera la disposició correcta dels residuscoordinants, i afavorir l’intercanvi demetalls, tot i que també s’ha proposat quepodria existir un efecte plantilla delsmetalls, de manera que la coordinaciód’uns primers ions metàl·lics afavoriria laformació de les estructures secundàries,que al seu lloc afavoririen la coordinacióglobal (Rigby & Stillman, 2004; Rigby et al.,2006). En proteïnes que uneixen metalls, engeneral, les estructures secundàries estanconformades per espaiadors entreaminoàcids que uneixen metalls. Així, enMT, el patró de Cys, i, per tant la mida del’espaiador entre Cys, condicionarien eltipus d’elements d’estructura secundària(Auld, 2001).

Els mamífers i equinoderms presentenMT amb hèlixs 310 i �-turns tipus II peròno �-helixs ni �-sheetsLes MT de mamífer i equinoderm estanconstituïdes per dos dominis, anomenatsalfa i beta. Estudis de NMR amb les MT demamífer O.cuniculus MT2 (conill),M.musculus MT1 i MT3 (ratolí) i la MT del’equinoderm S.purpuratus SpMTAcoordinant metalls divalents (Zn(II), Cd(II))demostraren que al domini alfa d’aquestesisoformes s’hi generen hèlixs del tipus 310

(Wagner et al., 1987; Riek et al., 1999; Oz etal., 2001), acompanyades en algun cas dehalf-turns. Al domini beta, tant en mamífers(M.musculus) com equinoderms(S.purpuratus), alguns autors hi hanobservat �-turns, principalment de tipus II(Pande et al., 1986; Wagner et al., 1987; Rieket al., 1999). Les estructures tipus �-helix, �-

sheet i �-turns de tipus I es troben absents opoc representades en mamífers iequinoderms, i només en MT3 s’ha descritl’excepcional presència d’un curt segmentd’�-helix, que podria tenir importànciafuncional (Oz et al., 2001; Wang et al., 2006).En mamífers i equinoderms, doncs, deforma general es distribuirien dos tipusd’estructures secundàries: hèlix 310 en elsdominis alfa i �-turns de tipus II en elsdominis beta.

Fig. 8-A i B: Estructura 3D de la cadena peptídica enels dominis alfa (A) i beta (B) de la MT de peix

N.coriiceps, tal i com es descriu a Scudeiro et al., 2005.Se n’aprecien clarament les estructures secundàries.

C: estructura 3D de la MT CUP1 de S.cerevisiae., segonsBertini et al., 2000. Encerclada, la zona amb estructura

�-hèlix.

La resta d’organismes estudiats presentenalmenys una �-helix i �-turns del tipus IL’ �-helix tan poc abundant en les MT demamífers i equinoderms, és present en laresta de MT d’estructura coneguda. Se’ndetecta en MT dels crustacis H.americanus

A

B

C

Introducció

(llamàntol) (Muñoz et al., 2002) i C.sapidus(Narula et al., 1995) i el peix N.coriiceps(Scudiero et al., 2005) quan formen agregatsamb metalls divalents (Zn(II), Cd(II)) (Fig.8). Les MT de peixos i crustacis presenten�-helixs i hèlixs 310, i sempre situades al’extrem C-term. A l’extrem N-term, encanvi, solen presentar �-turns,majoritàriament de tipus I, que es podenpresentar també en l’extrem C-term.Pel que fa als llevats, tot i que s’ha proposatque la MT de S.cerevisiae CUP1 estariamancada d’elements d’estructurasecundària (Calderone et al., 2005), s’hadescrit per NMR la presència de �-helixentre els aminoàcids 18-22 (Bertini et al.,2000).

Cianobacteri: l’única MT amb �-sheetTot i que alguns autors afirmen que algunesMT de mamífer i planta podrien tenir �-sheets (Elgren & Wilcox, 1989; Zhu, 2000),els estudis d’estructura per NMR i raigs Xnomés en confirmen la presència en el casde les MT del bacteri Synechococcus sp.SmtA i SmtB presenten �-helixs i �-sheets,elements que tenen una gran importànciafuncional en aquesta MT (Cook et al., 1998;Blindauer et al., 2001).

3.3- Estructura terciàriaLes MT adquireixen la seva estructuraterciària com a conseqüència de lacoordinació de metalls. Quan una MT estroba en forma lliure de metalls (formaapo), presenta una estructura 3Ddesordenada (Random coil), i és lacoordinació metàl·lica i la formació declusters metall-tiolat el que li proporcionauna estructura terciària. Per tant, unamateixa MT pot presentar estructures 3Ddiferents en funció del metall que té unit.Actualment, les dades d’estructura terciàriade què es disposa es limiten només a lesMT d’alguns grups taxonòmics, icoordinant un metall determinat. L’elevadaflexibilitat de les MT dificulta ladeterminació de la seva estructuratridimensional, tot i que aquesta solromandre molt similar quan la MTcoordina ions metàl·lics de volum molt

diferent, com el Zn(II) i el Cd(II)(estructures isomorfes).

Les Metal·lotioneïnes de vertebrat: un casparadigmàticEls estudis realitzats amb MT2 (una de lesquatre isoformes de mamífer) per difraccióde raigs X de cristalls de Cd5Zn2-MT2nativa i per NMR de Cd7-MT2 reconstituïdamostraren que aquesta MT uneix 7 àtomsdivalents repartits en dos dominis globularsindependents (Furey et al., 1987; Wagner etal., 1987; Robbins et al., 1991). El domini alfa,format pels aminoàcids 31 a 61(corresponent a la meitat C-term), uneix 4ions divalents, formant el cluster metàl·licA. El domini beta, format pels aminoàcids 1a 30 (corresponent a la meitat N-term),uneix 3 ions divalents formant el clustermetàl·lic B. Estructures equivalentss’obtingueren per a MT1 i MT3 de mamífer(Zangger et al., 1999; Oz et al., 2001) (Fig. 9).Una estructuració similar ha estat descritaper a la MT del peix N.coriiceps, estudiadaper NMR (Capasso et al., 2003).No es disposa de dades estructurals pelsagregats homonuclears de Cu si bé dadesespectroscòpiques dutes a terme amb laMT1 de mamífer suggereixen quel’estructuració en dos dominis (que esmanté mentre hi ha un ió Zn2+ enllaçat a laproteïna) es perd quan els darrers ions Zn2+

són substituïts per Cu (Bofill et al, 2001).Donada la homologia que existeix entre lesMT de vertebrats, s’assumeix que totes ellesqueden definides de forma general perl’existència de dos dominis globularsindependents en disposició i tipus beta-alfa,que configuraran clusters metall-proteïnadel tipus B i A, respectivament.Tot i això, treball realitzats amb les MT demamífer indicarien que existeix unalleugera interacció entre els dos dominis,que s’intercanviarien metalls (Otvos et al.,1993) i no serien completamentindependents l’un de l’altre (Rhee et al.,1990; Capdevila et al., 1997).

Introducció

Fig. 9- La MT1 humana, estructurada en dos clusters demetalls divalents. A i B) Gràfic representant

l’estructuració en dos dominis. C) Detalls dels dosclusters metàl·lics corresponents a cada domini. En

verd, els ions Zn2+; en groc, els àtoms de S de les Cys.Imatge modificada de Rigby et al., 2004.

Les Metal·lotioneïnes de crustaci id’equinoderm: una proposta evolutiva?Les dades obtingudes per NMR a partir deformes reconstituïdes amb Cd de les MTdels crustacis H.americanus (Zhu et al., 1994;Muñoz et al., 2002), S.serrata (Otvos et al.,1982) i C.sapidus (Narula et al., 1995),determinaren que aquestes MTs’estructuren també en dos dominisglobulars quan coordinen ions divalents.Els dos dominis contenen 3 àtoms de Cdcadascun i s’estructuren en forma de clusterB. Donada l’elevada homologia deseqüència dins aquest grup, les MT decrustaci queden definides de forma generalper l’existència de dos dominis globularsindependents en disposició i tipus beta-beta.Malgrat que el domini beta es defineix envertebrats i equinoderms com el dominique no té doblets Cys-Cys, la semblançaestructural a nivell d’estructura terciària hafet que els dos dominis de crustaci (que sí

presenten doblets Cys-Cys) siguincomunament anomenats dominis beta.

Fig. 10- Representació esquemàtica de les disposicionsdels dominis alfa i beta en les MT de

mamífer (A), equinoderm (B) i crustaci (C). En destacala inversió en l’ordre dels dominis beta i alfa entre

equinoderm i mamífer.

La SpMTA de l’equinoderm S.purpuratusfou estudiada per NMR (Riek et al., 1999), iels resultats demostraren que quan uneixCd s’estructura en dos dominis globularsindependents que formen respectivamentclusters A i B similars als de vertebrats, peròamb dues particularitats:1) l’ordenació dels clusters sobre laseqüència de la proteïna és la inversa queen mamífer, de manera que el domini beta(corresponent al cluster B) es situa a la zonaC-term, mentre el domini alfa (corresponental cluster A) es situa a la zona N-term (Fig.10).2) SpMTA inclou un aminoàcid aromàtic,fet que no s’observa en cap MT de vertebrati que es dóna més freqüentment en les MTde planta i organismes de llinatgesevolutius inferiors.La semblança que s’observa entre lesrespectives estructures primàries i terciàriesva portar a proposar que els dominis beta i

A

B

C

�

��

�

��

A

B

C

Introducció

alfa de les MT d’equinoderm, crustaci ivertebrats poden tenir un origen evolutiucomú, suposant que a partir d’un dominibeta primitiu s’hagués originat un dominialfa més modern. Les duplicacions i latransposició d’aquest domini de N-term a C-term és el que hauria donat lloc al’estructura que observem en vertebrats(Nemer et al., 1985; Harlow et al., 1989).Les MT de Drosophila, petites ipresumptament monodominials, podrienser un cas especial, amb connexionsfuncionals amb les MT de l’insecte O.cincta(Hensbergen et al., 1999), l’equinodermA.crassispina (Ohtake et al., 1983) i l’anèl·lidE.foetida (Gruber et al., 2000), i CUP1 deS.cerevisiae (Bertini et al., 2000), totes ellespèptids de mida similar, tambépresumptament monodominials.

SmtA i SmtB, del procariotaSynechococcus. Al límit de la definició deMTEls resultats de Blindauer et al. (2001)mostren que les dues histidines d’aquestesMT prenen part en la formació d’un únicagregat metàl·lic que conté 4 ions de Zn2+ ique presenta una estructura molt similar ala del domini alfa de mamífer, però moltpropera també a l’estructura dels agregatsanomenats “dits de Zn” pel que fa a l’entornde coordinació d’alguns d’aquests ionsZn2+. La peculiaritat de les característiquesestructurals i funcionals d’aquestes MT faque es puguin considerar al límit de ladefinició de MT (Olafson et al., 1988; Cooket al., 1998).

Les MT de fong CUP1 i NcMT, les sevesestructures amb Cu són monodominialsCUP1 és una MT de S.cerevisiae ques’indueix en resposta a altes concentracionsde Cu. Els estudis per difracció de raigs Xamb CUP1 contenint únicament ions de Cumonovalent mostraren que es formava unsol domini al voltant d’un cluster metàl·licque contenia els ions de Cu amb entorns decoordinació digonals i trigonals (Calderoneet al., 2005). Estudis per NMR demostrarenque la MT de N.crassa uneix 6 ions Cu(I)

també en un sol domini (Cobine et al., 2004)(Fig. 11).

Fig. 11- Estructura tridimensional de CUP1 deS.cerevisiae (A) i NcMT de N.crassa (B), gràfics extrets

de Calderone et al., 2005 i Cobine et al., 2004.

Les MT de planta, dos dominis en uncluster?Els estudis sobre l’estructura terciària de lesMT de planta estan encara en fases moltprimerenques i han aportat només resultatsindirectes i conclusions contradictòriesusant diversos casos model.Els primers estudis foren realitzats en la MTde P.sativum sintetitzada heteròlogament(Kille et al., 1991), i indicaven que els dosdominis cisteínics que es troben en les MTde planta separats entre sí per un domini“espaiador” formaven un sol cluster metàl·licen coordinar Cd, que podem anomenarestructura en forma de “pinça” (Fig. 12A).Aquests resultats foren recolzatsposteriorment per (Tommey et al., 1991).Estudis realitzats posteriorment en les MTde F.vesciculosus (alga), T.durum (blat) iA.chinensis (Kiwi), en canvi, recolzen unmodel en què cada domini cisteínic formaun cluster metàl·lic independent (Zhu, 2000;Bilecen et al., 2005; Merrifield et al., 2006), enforma de “pesa” (Fig. 12B).Donada la peculiaritat de l’estructuraprimària de les MT de planta i elconeixement que es té de les altres MT, enmolts casos es dóna per fet que existiria unsol model estructural que explicaria elconjunt de les MT de planta, i que aquestseria constant, i no variaria en funció defactors fisiològics. Cal tenir present queaquesta suposició no té una base ferma, ique suposant que existeixi un model únic laseva construcció és un tema controvertit i

AB

Introducció

sobre el qual es disposa de poques dadesexperimentals. En la descripció dels casosmodel es comenten amb més profunditataquestes dades experimentals.

Fig. 12- Estructures de la MT de planta en forma depinça (A) i en forma de pesa (B), segons les dades

publicades per a la MT de P.sativum (Kille et al., 1991) iT.durum (Bilecen et al., 2005). Les zones corresponents

a l’espaiador es mostren encerclades. Els gràfics sónadaptacions dels que apareixen en les publicacions

citades.

3.4- Estructura quaternàriaMoltes proteïnes obtenen propietatsfuncionals especials gràcies a la formació dedímers o polímers. Encara que les MT sónconsiderades proteïnes essencialmentmonomèriques, en alguns casos s’ha descritla formació d’agregats dimèrics opolimèrics, amb efectes en el seucomportament biològic. Per exemple, s’haproposat que la formació de dímers seriaun mecanisme d’intercanvi de metalls entreMT, i de MT amb altres proteïnes(Nettesheim et al., 1985; Hathout et al.,2002), que podria incrementar la capacitatquelatant de la MT (Palumaa et al., 1992); ique la formació d’oligòmers podria alterarel paper detoxificador de les MT(Templeton & Cherian, 1985; Andersen et

al., 1989; Kar et al., 1997; Wilhelmsen et al.,2002). El dímers o polímers s’han observattant en complexos metall-MT purificatsdirectament de teixits nadius (Andersen etal., 1989; Gruber et al., 2000), com expressatsheteròlogament (Wang et al., 1994) oreconstituïts químicament (Palumaa et al.,1992), i s’han observat en MT de diversosgrups, per exemple mamífer (Zangger &Armitage, 2002), mol·lusc (Serra et al., 1999;Geret & Cosson, 2002), equinoderm (Wanget al., 1994), planta (Bilecen et al., 2005) icianobacteri (Kar et al., 1997; Cook et al.,1998). S’han proposat dos mecanismesprincipals d’oligomerització:

Mediada per metallEn aquest cas, el dímer es forma mitjançantla intervenció d’un ió metàl·lic ques’enllaçaria a dues MT simultàniament(Afonso et al., 2004). Aquest tipus de dímerss’han proposat com a mecanismed’intercanvi metàl·lic i s’han observatprincipalment en sobrecàrrega in vitro deCd o altes concentracions de MT (Palumaaet al., 1992; Otvos et al., 1993; Palumaa &Vaher, 1996; Zangger & Armitage, 2002).Aquests dímers es caracteritzen per formarunions reversibles mitjançant la competicióamb agents quelatants, com l’EDTA (Wanget al., 1994; Gan et al., 1995; Tang et al.,1999). S’ha proposat també la dimeritzacióa través de metall per a la MT de G.gallus.Aquesta MT presenta una histidina al’extrem C-term que participaria en laformació d’un pont metàl·lic inter-molecular (Villarreal et al., 2006).

Mediada per pont disulfur intermolecularLa natura química del grup tiol fa que siguialtament sensible a l’oxidació, quecomporta la formació de ponts disulfur.Quan aquests ponts es formen entre duesmolècules de MT, es forma un dímer MT-MT mediat per un pont de sulfurintermolecular (Fig. 13) (Suzuki et al., 1983;Fang et al., 1994; Serra et al., 1999; Zanggeret al., 2001). Aquests dímers són reversiblesmitjançant la reducció dels ponts disulfur agrups tiol per mitjà d’un agent reductor, del

B

A

Introducció

tipus del beta-mercaptoetanol (Tang et al.,1999).

Fig. 13- MT1 de ratolí dimeritzada per ponts disulfur,intermoleculars formats entre Cys dels dominis alfa de

dues MT, segons Zangger et al., 2001.

Fins i tot s’ha proposat que el mecanismede formació de dímers en MT podria ésserespecífic de domini: segons Zangger et al,2002, la metal·lotioneïna de mamíferdimeritza a través de metalls pel seudomini beta, i a través de ponts disulfur pelseu domini alfa.Malgrat les evidències a favor de lapossibilitat química de formació de dímers ipolímers de MT, i les seves possibilitats anivell funcional, la seva formació s’haobservat principalment en condicions invitro excepcionals o bé com a resultat d’unaoxidació de les cisteïnes, interpretable coma símptoma d’inestabilitat o un efecteartefactual (Suzuki et al., 1983; Hathout etal., 2002). L’únic cas en què s’ha demostratla significació biològica de la dimeritzacióés el cas de SmtB del cianobacteriSynechococcus, que forma estructuresespecials similars als dits de Zn (Fig. 14)(Cook et al., 1998; Kar et al., 1997; Kar et al.,2001). En la resta de casos, la significacióbiològica de les estructures quaternàries deles MT és actualment objecte decontrovèrsia.

3.5- Classificació FuncionalEn general, les proteïnes es classifiquensegons la seva funció i després esdiscriminen diferències entre les sevesestructures primàries. Així, hi ha definides“fosfatases”, “hidrolases” i “quinases” que

es divideixen en sub-grups en funció decriteris estructurals (homologies i/osimilituds de seqüència). En aquest apartatde la introducció es descriu la propostad’una classificació per a les MT que adopticriteris de funció molecular i noestrictament d’estructura.

Fig. 14- Representació dels dímers mediats per Zn2+ deSmtB, del cianobacteri Synechococcus, extreta de Cook

et al., 1998.

La preferència pel Cu o el Zn, un caràcterfuncional mesurableLes MT presenten diverses estequiometriesi preferències d’unió a metalls, fins i totentre diverses isoformes MT d’un mateixorganisme. Aquestes preferències d’uniópoden reflectir especialització funcionalrelacionada amb les restriccionsgeomètriques dels metalls amb què hagid’interaccionar cada isoforma.Aquesta visió constitueix una aproximaciómés funcional respecte les MT, i ha estatelaborada i analitzada en el grup de recercaen què s’ha realitzat aquesta tesi doctoral.La síntesi heteròloga en E.coli de diversesMT i l’estudi de les propietats dels agregatsobtinguts en medis enriquits en Cu(I) oZn(II), han permès demostrar quedeterminades MT mostren una preferènciacoordinant pel Zn(II), mentre d’altresmostren una preferència pel Cu(I), fet quees pot avaluar en l’estabilitat i el graud’estructuració dels agregats metàl·licsrespectius (Valls et al., 2001). Els criterisutilitzats per a aquesta classificació són:Metal·lotioneïnes de Zn o Zn-tioneïnes:Es consideren Zn-tioneïnes aquelles MTque en ésser sintetitzades heteròlogamenten medis enriquits amb Cu resulten en

Introducció

agregats heterometàl·lics Zn,Cu-MT, fet quereflecteix que el Zn(II) és un requerimentper a l’estabilitat dels agregats contenintCu(I) in vivo. És el cas de MT1 deM.musculus (Bofill et al., 2001) i MTH deH.americanus (Valls et al., 2001).Metal·lotioneïnes de Cu o Cu-tioneïnes:Es consideren Cu-tioneïnes aquelles MTque en ésser sintetitzades en medisenriquits amb Cu es constitueixen enagregats homometàl·lics Cu-MT, ipresenten un alt grau d’estructuració. Ensón exemples MTNA de D.melanogaster(Valls et al., 2000), CUP1 de S.cerevisiae(Winge et al., 1985), el domini beta isolat deMT1 de M.musculus (Bofill et al., 1999) i laisoforma MT4 de mamífer (Tio et al., 2004).Malgrat que els criteris usats en laclassificació proposada pel nostre grup detreball es basa en les característiques delsagregats metall-MT recuperats per síntesirecombinant, a la literatura s’atribueixtambé el caràcter de Cu- o Zn-tioneina auna MT en funció dels patrons d’inducciódels seus gens (síntesi en resposta a Zn oCu), les seves capacitats detoxificadores (deZn o Cu) o quins metalls enllaça en ésserpurificada de teixit natius. Així s’hanclassificat pèptids MT de procedènciataxonòmica molt diversa, als que s’haatribuït una especialització funcional enversel Cu -C.sapidus CuMT (Brouwer et al.,2002), T.termophila MT2 (Boldrin et al.,2002), H.pomatia CuMT (Dallinger et al.,2004)- o el Zn/Cd, com és el cas de C.sapidusCdMT (Brouwer et al., 2002), T.termophilaMT1 (Boldrin et al., 2002), H.pomatia CdMT(Dallinger et al., 2004).

La preferència davant Cu o Zn, un caràcteratàvic relacionat amb el patró cisteínic?Inicialment, s’havia atribuït a les MT de Cumonodominials un “caràcter atàvic”,mentre la preferència de Zn (més exigentestèricament) i l’estructuració en dosdominis havia estat interpretada com un“caràcter modern” (Nemer et al., 1985).Estudis realitzats en el nostre grup ambanterioritat a aquesta tesi, determinarenque MTNA de D.melanogaster manifestavauna clara preferència per Cu (Valls et al.,

2000), i que el mateix feia el domini beta dela MT de vertebrat, estudiat com a pèptidindependent (Bofill et al., 1999). Aquestavenç trencava amb la idea que lapreferència pel Cu fos un caràcteratàvic,present tan sols en MT d’organismesmolt primitius en l’escala evolutiva, comsón els fongs i llevats.El fet que la MT d’H.americanus (formadaper dos dominis beta) presentés preferènciesde coordinació metàl·lica de Zn (Valls et al.,2001) excloïa la possibilitat que factorsexclusivament d’estructura terciàriadeterminessin el comportament opreferència coordinant. Entre les MT ques’havien estudiat inicialment, les quepresentaven motius Cys-X-Cys mostravenuna preferència pel Cu, mentre aquellesque mostraven una preferència pel Znpresentaven també motius Cys-Cys en laseva seqüència (Nemer et al., 1985). Malgrataixò, posteriorment, en el nostre grup esdeterminà que la MT4 de mamífer mostrauna certa especialització funcional enversCu, malgrat presentar motius Cys-Cys (Tíoet al., 2004). A més, en H.pomatia, dues MTamb patrons cisteínics idèntics semblenpresentar especialitzacions funcionalsdiferents (Dallinger et al., 1997; Dallinger etal., 2004). Aquestes dades posen demanifest que la preferència per Zn o Cu noqueda determinada únicament pel patró dedistribució de cisteïnes, sinó que hiparticipen també altres determinants deseqüència. La preferència per Zn o Cu, mésque un caràcter atàvic o modern, seria unaespecialització funcional que pot haveraparegut diverses vegades en l’evolucióadaptativa de les MT, configurant casos deconvergència funcional a partir deseqüències palesament no homòlogues.En conjunt, la classificació de MT entrepreferències de coordinació de Zn i per Cués complementada per altres indicacionsd’especificitat metàl·lica i trascendeix lesbarreres taxonòmiques, permetent establiruna classificació funcional de les MT, que esrelaciona d’una manera complexa amb laseva estructura primària.

Introducció

4- REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓDE LES MTLa síntesi de MT s’indueix en resposta ametalls i determinats estressosEn general, la síntesi de MT es sol induir encondicions d’estrès, principalment ambaltes concentracions de metalls pesants (Cd,Zn, Hg, Cu, Au, Ag, Co, Ni, Bi...) o ensituacions d’estrès oxidatiu (Cai et al., 1999;Giedroc et al., 2001; Haq et al., 2003; Amiardet al., 2006). Els glucocorticoides, il’interferó indueixen també la síntesi de MTen mamífers (Cai et al., 1999; Haq et al.,2003). Pot donar-se especificitat pel que fa ala inducció, fins al punt que diferentsisoformes MT d’un mateix organismepresenten respostes diferents (Amiard et al.,2006), amb patrons d’expressió diferenciatstissularment i temporalment.Una de les situacions on la síntesi de MTsembla més universalment rellevant és laproliferació cel·lular (Cai et al., 1999), ja quees detecten nivells molt alts de MT encèl·lules de teixits en regeneració o encèl·lules tumorals (Theocharis et al., 2004).Així mateix, en processos dedesenvolupament embrionari, s’observenpatrons d’expressió de MT específics, jasigui pels nivells d’expressió, com perquèen alguns casos s’expressen isoformesespecífiques d’aquestes fases. (Haq et al.,2003; Cherian & Kang, 2006). En la majorpart dels casos, la regulació de la síntesi deles MT s’efectua a nivell transcripcional. Elsseus gens tenen en el promotor diversoselements reguladors, els principals són elsARE (Elements de Resposta Antioxidant),GRE (Elements de Resposta alsGlucocorticoides) i MRE (Elements deResposta a Metalls) (Lichtlen et al., 2001;Haq et al., 2003). Els MRE tenen unaseqüència consens tipusCTNTGCRCNCGGCC molt conservada i estroben en la pràctica majoria dels genscodificants per MT descrits D’entre elsfactors de transcripció que interaccionenamb MRE, en destaca MTF1.

MTF1, un element reguladorMTF1 (Metallothionein Transcription Factor)és un factor de transcripció que mostrahomologia entre insectes i vertebrats(Andrews, 2001). MTF1 és activat per lapresència de metalls i per estrès oxidatiu(Ghoshal et al., 1998).

Fig. 15- La MT, com a metal·loproteina (MP), pren parten la regulació de l’activació de la transcripció del genque la codifica, participant en la integració de senyals

d’estrès oxidatiu (ROS) i de metall (Me). Esquemaextret de Haq et al., 2003

A nivell molecular, aquesta activaciórequereix un canvi conformacionalmediatitzat per la unió de Zn, fet que liconfereix estructures similars als dits de Zn(Haq et al., 2003). En ésser activat, MTF1 estransloca a nucli, on s’uneix directament ales caixes MRE dels promotors, activant latranscripció dels gens Mt (Fig. 15)(Andrews, 2001; Giedroc et al., 2001; Haq etal., 2003). En el cas de SmtB del cianobacteriSynechococcus, s’ha proposat que aquestaMT respondria al Zn2+ interaccionantdirectament amb el DNA, regulant lasíntesi de MT en aquest organisme, però elmecanisme concret sembla ésser complex(Kar et al., 2001).La regulació de l’expressió de les MT s’harelacionat també amb l’estructura de lacromatina, i el desfàs entre els nivellsd’mRNA i de proteïna observat en algunscasos indica que pot existir regulació post-transcripcional significativa (Haq et al.,2003).

Introducció

5- FUNCIÓ DE LESMETAL·LOTIONEÏNESDonat que les MT foren inicialment aïlladesen resposta a metalls xenobiòtics, se’lsatribuí inicialment una funció bàsicadetoxificadora de metalls. Però l’exposicióa metalls xenobiòtics és un fet poc habitualen la natura, i es pot considerar que aquestahipòtesi està mancada de sentit evolutiu.De fet, la consideració de les propietatsquímiques de les MT i els estudisfuncionals en éssers vius han obert unventall molt ampli de possibles escenaris onles MT podrien participar. La funció de lesMT, donada la seva ubiqüitat en els éssersvius, hauria de ser una funció amb elevadacomponent “house-keeping”. Però, al mateixtemps, cèl·lules de ratolins amb nivellsd’expressió de MT alterada no solenpresentar alteracions importants que noestiguin relacionades amb metalls tòxics osituacions d’estrès (Dalton et al., 1996;Klaassen & Liu, 1998). Aquestes dadesaparentment contradictòries configuren unpanorama funcional complex per a les MT,expressat en el títol de la revisió “The elusivefunction of metallothioneins” (Palmiter, 1998).Exposem aquí una visió general de lesprincipals funcions proposades fins avui endia per a les MT.

Les MT col·laboren en l’homeòstasi del Zni el CuLes MT natives es troben en l’organisme encondicions fisiològiques unint Zn i/o Cu(Haq et al., 2003). Aquests metalls juguenpapers essencials en el metabolisme,actuant sovint com a cofactors enzimàtics oproteics. Estudis in vitro demostren que laMT és capaç d’intercanviar metalls ambaltres molècules (Maret et al., 1997; Jacob etal., 1998). Això ha dut a proposar que lesMT poden actuar de magatzem de Zn i/oCu en forma soluble, que cedirien per a lasíntesi de diverses metal·loproteïnes(Amiard et al., 2006) o alliberarien enmoments clau del desenvolupament i/odiferenciació cel·lular segons elsrequeriments metabòlics (Nemer et al., 1991;Palmiter, 1998). En tot cas, aquest paper noseria essencial, ja que en ratolins mutants

K.O. per a 3 de les 4 isoformes de MT nos’aprecien fenotips relacionats ambdisfuncions associades a aquests metalls(Dalton et al., 1996; Klaassen & Liu, 1998).

Les MT protegeixen de la toxicitat delsmetalls pesants xenobiòticsLa toxicitat dels metalls xenobiòtics es deuprincipalment a la seva interacció amb lesestructures cel·lulars i els centres catalíticsenzimàtics. Donades les preferències d’unióals metalls dels grups tiol, els metallsxenobiòtics com el Cd i el Hg podendesplaçar el Zn de la MT (Vasak, 1991), quesegresta així els metalls tòxics, i impedeixque interfereixin en el metabolismecel·lular. Com a conseqüència, el Zn2+ ésalliberat de la MT, i s’ha proposat quepassaria a unir-se i activar el factor MTF1,constituint la via d’inducció de síntesi deMT provocada pel primer metall (Fig. 16).

Fig. 16- Esquema del mecanisme d’activació delsistema MT per a la detoxificació metàl·lica. La MT

captura el Cd que interfereix en l’activitat dels lligandsi s’allibera el Zn que activarà la inducció per MTF1.

Esquema extret de Amiard et al., 2006.

Segons aquest model, les MT anirienquelatant el metall tòxic i serienposteriorment acumulades als lisosomes, enquè s’han detectat grans quantitats de S imetalls (Amiard et al., 2006).s’ha comprovatque la sobreexpressió de MT confereixresistència incrementada a metalls pesantsen S.cerevisiae i M.musculus (Liu et al., 1995b;Pena et al., 1998; Vasak, 2005) icomplementàriament, les soques d’aquestsorganismes defectives en MT presentenfenotips d’alta sensibilitat a la toxicitat per

Introducció

metalls (Hamer et al., 1985; Masters et al.,1994).Els patrons d’expressió diferencialsd’isoformes d’un mateix organismeobservats en mol·luscs, insectes i crustacisindiquen que podria existir unaespecialització funcional per la qual unaisoforma seria responsable de detoxificaciómentre l’altra ho seria de l’homeòstasi demetalls (Amiard et al., 2006).

Les MT, una protecció contra l’estrèsoxidatiuEls grups tiol són susceptibles de seroxidats mitjançant oxidants febles, fet quepermetria a les MT absorbir el danyoxidatiu abans que aquest afectésestructures cel·lulars (Thornalley & Vasak,1985; Coyle et al., 2002). Aquesta hipòtesis’ha comprovat experimentalment, i s’hadescrit que les MT són capaces de capturarradicals oxidants com el radical hidroxil(Kumari et al., 1998), i de protegir el DNA,els lípids i les proteïnes dels efectes delsradicals oxidants i la radiació UV (Sato &Bremner, 1993; Cai et al., 1999; Viarengo etal., 2000; Vasak, 2005). Conseqüentmentamb aquesta proposta, s’ha observat que lamanca de MT comporta sensibilitatincrementada a l’estrès oxidatiu (Lazo et al.,1995; Pitt et al., 1997; Liu et al., 1999).Al mateix temps, les MT jugarien un paperindirecte en el control de l’estrès oxidatiu,tant per la captura de Cu (evitant laparticipació del Cu en la reacció de Fenton-Fig. 17), com per l’emmagatzematge d’ionsde Zn i Cu, necessaris per a la Zn,Cu-SOD(superòxid dismutasa) (Meneghini, 1997;Viarengo et al., 2000; Bertinato & L'Abbe,2004), un enzim clau en la prevenciócel·lular i extracel·lular de lesionsprovocades per estrès oxidatiu.

Fig. 17- Reacció de Fenton/Haber-Weiis, per la qual elCu és capaç de transformar radicals oxidants com l’ió

superòxid i el peròxid d’hidrogen en radicals hidroxil,més agressius per a l’entorn cel·lular.

A més, en absorbir el dany oxidant,l’oxidació dels grups tiol provocal’alliberació dels ions Zn de la Zn-MT,donant així lloc a una activació delsprocessos de resposta a estrès oxidatiu.Com succeeix amb la captura de metallspesants, la MT actuaria a dos nivells: com adetector de situacions d’estrès i com amecanisme de contenció dels seus efectestòxics.

Algunes MT presenten funcionsfisiològiques molt concretes, específiquesd’isoformaDeterminades isoformes de MT presentenactivitats biològiques que es relacionen ambprocessos molt concrets. Se’n coneixen pocsexemples, però cal esmentar la MT3 demamífer, que té una capacitat inhibidoradel creixement neuronal (Uchida et al.,1991), raó per la qual és també anomenadaGIF (growth inhibitor factor). La MT4 demamífer s’expressa específicament a epiteliestratificat escamós, i s’ha proposat quepodria regular processos de diferenciaciócel·lular (Quaife et al., 1994).

6- DESCRIPCIÓ DE CASOSMODELEntre les MT, les més ben conegudes són lesMT de vertebrat. El 2006, una cerca a labase de dades PubMed amb el terme“metallothionein” ha donat lloc a 7517documents. Fent una cerca combinada ambels termes “metallothionein” i “vertebrate”, esrecuperen 6270 documents, mentres’obtenen molts menys documents en fer lamateixa cerca combinada amb termesd’altres rangs taxonòmics com“invertebrate” (489), “plant” (246) o “fungi”(405), tot i que aquests grups taxonòmicsinclouen moltes més espècies i representenen conjunt una diversitat biològica moltmés elevada. Aquesta aproximació, encaraque no representa directament la quantitatde coneixements que es tenen per a lesrespectives MT, és significativa pel que fa al’esforç i interès que s’ha dedicat acadascun d’aquests casos. La manca dedades en els rangs filogenètics diferents avertebrats es supleix sovint amb

Introducció

extrapolacions a partir del coneixementobtingut en vertebrats. Com hem vist alllarg de la introducció, la diversitat a nivelld’estructura primària és molt gran, fet queinvalida pràcticament qualsevoldeducció/inducció que es vulgui aplicar.Això fa que es necessitin dades directessobre la funcionalitat i el comportamentcoordinant de cada MT que es vulguiestudiar, a qualsevol nivell de coneixement.En aquest apartat, es presenten només elscasos model que han estat objecte d’estudien aquesta tesi, i s’exposa el sistema MT enquè estan ubicat.

6.1- El sistema MT en l’insecte Drosophilamelanogaster està format per 4 gens MT,anomenats: MtnA (Mtn), MtnB (Mto), MtnCi MtnD (Lastowski-Perry et al., 1985; Maroniet al., 1987; Mokdad et al., 1987; Egli et al.,2003). La proteïna MtnA té 40 aminoàcids,dels que 10 són Cys, distribuïdes en motiusdel tipus Cys-X-Cys, i és lleugerament méspetita que les altres tres isoformes (MtnB,MtnC, MtnD), que estan codificades pergens agrupats en un mateix cluster gènic isón molt similars entre si. Les proteïnesMtnB, MtnC i MtnD tenen 43-44aminoàcids i 12 Cys, de les quals duesformen un doblet Cys-Cys (Fig. 18).L’homologia que s’observa entre MtnB,MtnC i MtnD suggereix que aquestes tresMT provenen d’una duplicació recent.Evolutivament, es considera que les MT deD.melanogaster podrien provenir d’una MTancestral monodominial, com les deN.crassa i S.cerevisiae (Nemer et al., 1985). Lamajoria d’estudis d’expressió i funció s’handut a terme amb MtnA i MtnB, les primeresque varen ésser identificades.

Les MT de D.melanogaster s’expressen enresposta a metalls i estrès oxidatiuTant MtnA com MtnB foren descobertes apartir de l’anàlisi de gens que s’expressenper la inducció amb metalls pesants(Lastowski-Perry et al., 1985; Maroni et al.,

1987; Mokdad et al., 1987). El gen MtnA fouaïllat a partir de mRNAs de larves subjectesa exposició a Cu (Lastowski-Perry et al.,1985), mentre que MtnB fou aïllat a partirde mRNAs expressats davant l’exposició aCd (Mokdad et al., 1987). Tot i que les MTde D.melanogaster es sintetitzen com aresposta a diversos metalls (Cd, Cu, Hg iAg), d’altres (Zn, Rb, Co, Ni i Mn) gairebéno n’indueixen la síntesi (Mokdad et al.,1987; Silar et al., 1990; Durliat et al., 1995).La inducció per Cu és lleu per a MtnB(Mokdad et al., 1987), mentre és molt fortaper a MtnA (Lastowski-Perry et al., 1985).L’expressió té lloc principalment en elsistema digestiu (Durliat et al., 1995), on esformen complexos luminiscents Cu-MT(McNulty et al., 2001), que es localitzen enels lisosomes de cèl·lules intestinals(Lauverjat et al., 1989; Silar et al., 1990) icèl·lules secretores d’àcid (McNulty et al.,2001). MtnB s’expressa constitutivament enestadis molt primerencs, i MtnA en larva iadult (Silar et al., 1990; Silar & Wegnez,1990). Ambdues MT es sintetitzen també enresposta a estrès oxidatiu (Bonneton et al.,1996).Les seqüències codificants de MtnC i MtnDforen identificades in silico per homologiaamb MtnA i MtnB (Egli et al., 2003). Elsestudis d’inducció de l’expressió de MtnC iMtnD en resposta a metalls demostren queambdós s’indueixen més eficaçment per Cdque per Cu (Egli et al., 2003).Els promotors dels quatre gens Mt deD.melanogaster presenten elements MRE(Maroni et al., 1987; Silar et al., 1990; Durliatet al., 1995; Egli et al., 2003), i s’ha demostratque la seva expressió és regulada a travésdel factor dMTF1 (Zhang et al., 2001; Egli etal., 2003), homòleg a MTF1 de mamífer, ique respon també a situacions d’estrèsoxidatiu (Egli et al., 2003). Altres elementsde tipus GATA podrien participar en laregulació tissular (Durliat et al., 1995;Bonneton et al., 1996;) de l’expressió.

Introducció

Fig. 18- Alineament de les seqüències de MTNA, MTNB, MTNC i MTND de D.melanogaster

Les MT de D.melanogaster confereixenresistència a metallsLes duplicacions gèniques i l’increment del’expressió és un mecanisme general deresistència als metalls en insectes(Timmermans et al., 2005) que també s’haobservat en el sistema MT deD.melanogaster, en què l’amplificació delnombre de còpies gèniques de MtnB i MtnAconfereixen una major resistència alsmetalls Cd i Cu, respectivament (Maroni etal., 1987; Mokdad et al., 1987). S’hademostrat també que mutants deD.melanogaster defectius per a totes les MTtenen augmentada la sensibilitat al Cd i alCu (Egli et al., 2003). L’efecte detoxificadorde les MT en Drosophila podria ésser elresultat d’especialització d’isoformes, ja quementre MtnB sembla tenir un efecte moltimportant en la detoxificació del Cd, MtnAté un efecte molt important en ladetoxificació del Cu. Tot i això, tant MtnBcom MtnA mostren capacitat detoxificadorade Cu en llevat (Silar & Wegnez, 1990).MtnC i MtnD tenen capacitatsdetoxificadores molt més lleus per als dosmetalls (Egli et al., 2006b).Aparentment, en D.melanogaster hand’existir altres sistemes de detoxificació demetalls encarregats de fer front al Zn, ja quesi bé mosques D.melanogaster defectives enMT no presenten un fenotip de sensibilitatal Zn, sí que ho fan les defectives en dMTF1(Egli et al., 2003, Southon et al., 2004; Egli etal., 2006b;). Per tant, dMTF1 controlariadiversos gens del sistema de defensa demetalls pesants, ja que la seva mancaprovoca sensibilitat combinada al Zn, Cu iCd (Egli et al., 2003; Southon et al., 2004).

Les MT de D.melanogaster podenpresentar comportaments coordinantsdependents d’isoformaEstudis realitzats anteriorment en aquestgrup demostraren que MtnA mostra una

preferència de coordinació pel Cu, i, pertant, funcionalment pertany al grup de lesCu-tioneïnes (Valls et al., 2000). Des d’unpunt de vista estructural, no es tenen dadessobre l’estructura terciària dels seusagregats, però el fet que d’altres MT ambnombre similar de Cys es pleguin en un soldomini recolzaria una estructura d’aquesttipus. Els estudis realitzats amb anterioritata aquesta tesi, ja suggerien que els agregatsmetall-MtnA podrien contenir ions sulfurcom a lligands addicionals (exògens) (Vallset al., 2000).

6.2- El sistema MT en l’equinodermStrongylocentrotus purpuratusLes MT d’equinoderm manifestenhomologia i estructura tridimensionalsimilars a les MT de mamíferLes MT d’equinoderm descrites fins almoment són homòlogues entre elles iconstitueixen la família 4 segons laclassificació de Binz i Kägi, amb una midad’aproximadament 70 aminoàcids, delsqual 20 són Cys. Mentre a l’extrem C-term,el patró de distribució de les Cys és Cys-X-Cys, a l’extrem N-term el motiu majoritariés el doblet Cys-Cys (Nemer et al., 1985;Harlow et al., 1989). L’estudi de l’estructuratridimensional de l’agregat Cd7-SpMTA del’eriçó de mar S.purpuratus (Wang et al.,1995; Riek et al., 1999) ha demostrat que lesMT d’equinoderm es pleguen en dosdominis d’estructura homòloga als dominisalfa i beta de vertebrat, però situats en ordreinvers en la cadena polipeptídica, tal comsuggerien les similituds en l’estructuraprimària (Nemer et al., 1985; Harlow et al.,1989).Malgrat l’elevada similitud de seqüència iestructura que presenten per separat elsdominis alfa i beta, el seu l’ordre invers faque les seqüències de les MT d’equinodermi vertebrat no s’alineïn correctament, i per

Introducció

això les MT d’equinoderm formaven partde les MT de Classe II.la presència en el gen d’un quart exó nocodificant (Cserjesi et al., 1997) i la presènciad’aminoàcids aromàtics en algunesseqüències de MT d’equinodermsuggereixen un procés evolutiu particularper a les MT d’equinoderm. Segons lespropostes evolutives de Nemer et al. (1985) iHarlow et al. (1989), la inversió entre elsexons dos i tres que s’observa en els gensMt d’equinoderm respecte mamíferexplicaria la posició invertida dels dominisen la proteïna.

La regulació de l’expressió de les MTd’equinoderm en resposta a metalls esprodueix a través de MREL’expressió de les MT d’equinoderm ésinduïble per metalls pesants, essent la mésestudiada la inducció per Zn (Nemer et al.,1984; Wilkinson & Nemer, 1987; Nemer etal., 1991). Tant SpMTA com SpMTB, deS.purpuratus, presenten caixes GATA i MREen els seus promotors. Les primeres serienresponsables de la restricció espacial, i lessegones de la inducció per metalls(Wilkinson & Nemer, 1987; Harlow et al.,1989; Nemer et al., 1991; Nemer et al., 1995).Els senyals de regulació per MRE presentenalgunes particularitats en equinoderms: 1)SpMta té un element MRE en el seu intró(Nemer et al., 1991) que participacooperativament en la inducció gènica itindria un paper important en l’especificitattissular (Nemer et al., 1995). 2) Estudis

realitzats amb l’equinoderm L.pictusindiquen que en aquest cas les caixes MREfuncionen correctament en S.purpuratus i encèl·lules d’H.sapiens, però les caixes MRE dela MT2 humana no funcionen correctamenten L.pictus (Cserjesi et al., 1997).

Les MT d’equinoderm podrien presentarespecificitats funcionals depenents d’e laisoformaLes isoformes de MT d’equinodermspresenten patrons d’expressió diferenciatstant entre MT paràlogues com ortòlogues,que suggereixen una elevada especificitatfuncional depenent d’isoforma. SpMTA iSpMTB constitueixen el sistema MT deS.purpuratus. SpMta s’expressaconstitutivament i en resposta a baixosnivells de Zn2+, en ectoderma aborald’embrió, i en canvi, SpMtb s’indueix enresposta a alts nivells de Zn2+ a endoderma,mesoderma i ectoderma oral (Nemer et al.,1984; Angerer et al., 1986; Wilkinson &Nemer, 1987; Nemer et al., 1991). Aquestspatrons tant restringits semblen sercaracterístics de l’espècie S.purpuratus, jaque les MT de L.pictus mostren patronsd’expressió molt menys restrictius (Cserjesiet al., 1997). Addicionalment, s’ha descrit enA.crassispina la presència d’una proteïna detipus MT de 3600 Da (Ohtake et al., 1983),que uneix Zn2+ i s’expressa a la fased’embrió, similarment a l’observat per laMT de planta de tipus 4 o Ec (Kawashima etal., 1992).

Fig. 19- Alineament de seqüències de MT d’equinoderm, Spur (S.purpuratus), SpGr (Sphaerechinus.granularis) i Lypic(Lytecnius pictus). A la part inferior, es marquen les regions corresponents als dominis alfa i beta.

Introducció

Les MT d’equinoderm s’associen al’homeòstasi de Zn (Scudiero et al., 1997)però estudis realitzats en 6 espèciesdiferents mostren que no en són les úniquesresponsables (Scudiero et al., 1994). A més,algunes seqüències genòmiquesd’equinoderm (GenBank, XM_775501.1)codificarien per una proteïna homòloga a lafitoquelatin-sintasa., per tant és possible lapresència d’aquests pèptids de síntesienzimàtica, que podrien jugar un paperimportant en la detoxificació metàl·licatambé en animals (Clemens, 2006;Vatamaniuk et al., 2001).

6.3- El sistema MT en el mol·lusc MytilusedulisLes MT de mol·lusc són similars a les MTde mamífer, i presenten homologia entreellesLes MT de mol·lusc són les MTd’invertebrat més similars a les de vertebrat(Dallinger et al., 1993; Dallinger, 1996).Configuren la família 3 segons laclassificació de Binz i Kägi, i per lahomologia amb les MT de vertebrat,formaven part de la Classe I. Són pèptidsd’entre 60 i 70 aminoàcids i presenten unadistribució de 20 Cys en patrons del tipusCys-X-Cys, molt conservada, especialmententre gasteròpodes (Berger et al., 1997).Partint de la seva semblança a nivelld’estructura primària se n’ha inferit la sevaestructuració en dos dominis (Dallinger etal., 2001; Vergani et al., 2005), similar a la demamífer, amb dominis de tipus beta o alfacombinats de forma diferent segonsl’espècie. Per exemple, en H.pomatia s’haproposat la presència de dos dominis detipus beta (Dallinger et al., 2001) i en C.gigass’ha proposat l’estructuració també en dosdominis, en aquest cas, beta i alfa per aCgMT1 (Tanguy et al., 2002).Algunes isoformes de MT de Mol·luscpresenten mides anormalment grans, quepoden ser degudes a una amplificació delgen per exon-shuffling (Lieb et al, 2003),duplicant-se algun domini sencer, com enels casos de C.virginica i C.gigas, en què lesMT es correspondrien, respectivament, aestructures de 4 dominis alfa (Jenny et al,

2004) o de dos dominis beta i un alfa(Tanguy & Moraga, 2000). Malgrat tot, lesprediccions d’estructura terciària no hanestat comprovades mitjançant estudisestructurals.

Les isoformes MT de mol·lusc presentenespecificitat d’inducció per metallsEn la majoria d’espècies de mol·luscestudiades, s’han aïllat diverses isoformesde MT (Ciocan & Rotchell, 2004), quepresenten elements MRE en els promotorsdels seus gens (Khoo & Patel, 1999). Elsestudis d’expressió mostren patronscaracterístics: mentre algunes isoformespresenten una clara inducció per exposicióal Cd, d’altres isoformes presenten inducciómés dèbil, o s’indueixen principalment enresposta al Zn o el Cu (Roesijadi et al., 1989;Dallinger et al., 1997; Barsyte et al., 1999;Viarengo et al., 1999; Chabicovsky et al.,2003;; Dallinger et al., 2004; Jenny et al.,2004; Lecoeur et al., 2004; Dondero et al.,2005). En algun cas, s’ha observat tambéinducció en resposta a estrès oxidatiu(Cavaletto et al., 2002).En M.edulis s’identificaren 9 isoformes, quees classificaren en dos tipus (Mt10 i Mt20)en funció del seu comportamentcromatogràfic en purificar-les de teixit: lesisoformes Mt10 i Mt20. Les 5 isoformesMt20 es recuperaren en un piccromatogràfic associat a formes dimèriquesi les 4 isoformes Mt10 es recuperaren enforma monomèrica en una altre piccromatogràfic (Mackay et al., 1993). Pel quefa a l’estructura primària, totes elles tenenla mida i la distribució Cys-X-Cys habitualsen mol·lusc, però el tipus Mt20 presenta enla seva seqüència un doblet Cys addicional(Fig. 20). Tot i que les MT de tipus Mt10 iMt20 s’han trobat també en B.termophilus(Hardivillier et al., 2004), iM.galloprovincialis (Ceratto et al., 2002),l’origen dels dos tipus sembla serevolutivament recent (Barsyte et al., 1999).La síntesi de les MT de tipus Mt20 ésfortament induïda per Cd però no per Cu niZn. En canvi, les Mt10 són induïdes perl’exposició a Zn, però no per Cu (Soazig &Marc, 2003). En relació al Cd, la síntesi de

Introducció

les isoformes Mt10 mostra un patróparticular: s’activa a baixes concentracionsde Cd, però s’atenua a altes concentracionsde Cd (Barsyte et al., 1999; Ferrarello et al.,2000; Lemoine et al., 2000; Soazig & Marc,2003; Ciocan & Rotchell, 2004).El tipus Mt20 també s’ha trobat enM.galloprovincialis (Ceratto et al., 2002), iB.termophilus (Hardivillier et al., 2004). Enaltres MT de mol·lusc, s’han trobat tambéindicis de dimerització. Comportamentscromatogràfics estranys atribuïbles adimerització, han estat també detectats enMT de C.gigas (Roesijadi et al., 1989), i enM.crenulata s’ha identificat el patró deseqüència “KEGEA”, associat a la formaciód’un loop acídic responsable de la interaccióentre proteïnes (Lieb, 2003).Les MT de M.edulis s’han associattradicionalment a la detoxificació metàl·lica.S’ha descrit que tant a M.edulis com aB.termophilus existeixen al mateix tempsgens funcionals Mt10 i Mt20 amb introns(Hardivillier et al., 2004) i sense introns(Leignel et al., 2005), que podrien estarassociats a diferents papers de les MT i adiferents velocitats de reacció davantl’exposició a metalls, aspecte en què tambéhi intervindria el turn-over excepcionalmentcurt que presenten les MT de M.edulis enrelació a les MT de vertebrat (Bebianno &Langston, 1993).Addicionalment, M.edulis presenta algunesparticularitats en el seu sistema dedetoxificació metàl·lica que cal destacar. Peruna banda, els metalls estan

majoritàriament immobilitzats en fraccionsinsolubles (Geffard et al., 2005) o acumulatsen lisosomes terciaris, compartiments alsque no es sol associar les MT en mol·lusc(George, 1983).Així doncs, malgrat que les isoformes Mt20de M.edulis tinguin capacitat per a capturarel Cd, sembla que en aquest organisme hiparticipen també altres sistemes dedetoxificació metàl·lica. Per exemple, s’hiha descrit la presència de metal·loproteïnesriques en His (CdBP) capaces d’unir Cd(Nair & Robinson, 1999).

Estudis precedents sobreM.galloprovincialis Mt10.Mt10 de M.galloprovincialis té una elevadasemblança amb Mt10 de M.edulis, i se n’haestudiat el comportament coordinantdavant el Cd mitjançant la seva síntesiheteròloga i l’estudi dels agregats obtinguts(Vergani et al., 2005). Els resultats obtingutsmostren que Mt10 enllaça 7 ions de Cd, i -comparada amb SpMTA de S.purpuratus-,té una alta estabilitat tèrmica i facilitat per acedir els metalls en condicions oxidants.S’aprecia la formació de dímers,possiblement mediats per metall i l’espectreDC està desplaçat cap al vermell respectel’habitual en les Cd-MT, suggerint unaestructuració peculiar. Els estudis in silicoproposen per a Mt10 una flexibilitat menorque la MT de mamífer o peix.

Fig. 20- Alineament de les isoformes MT de M.edulis (medu), amb alguns isoformes de M.galloprovincialis (mgallo). Lesisoformes ambel numero 10 són aquelles que es corresponen al tipus Mt10.

Introducció

6.4- El sistema MT en el nematodeCaenorhabditis elegans consta de duesisoformes, Mtl1 i Mtl2. MTL2 fou isoladaper purificació a partir d’extractes deC.elegans que havien estat exposats a Cd(Slice et al., 1990). Posteriorment, en treballsamb mRNAs acumulats en resposta a Cd,s’identificà també una seqüència codificantper MTL1 (Imagawa et al., 1990) i esseqüencià la regió genòmica codificant delsdos gens MT de C.elegans, mtl1 i mtl2(Freedman et al., 1993). MTL1 i MTL2configuren la família 6 de la classificació deBinz i Kägi descrita a l’inici d’aquestaintroducció.

Les dues MT de C.elegans tenen His en laseva seqüènciaLes proteïnes MTL1 i MTL2 sónhomòlogues entre elles, però no amb lesMT de mamífer (Imagawa et al., 1990;Kondo et al., 1990). Les dues MT presenten18 Cys i una llargada d’entre 63 i 77aminoàcids, i la peculiaritat de presentarhistidines en la seva seqüència, fet pochabitual en MT (Fig. 21). (Imagawa et al.,1990; Slice et al., 1990).

Les isoformes de MT de C.eleganspresenten diferents patrons d’induccióLes dues MT de C.elegans tenen l’expressióregulada independentment (Swain et al.,2004) i els seus promotors sónconsiderablement diferents entre ells (Sliceet al., 1990). Mtl1 s’expressaconstitutivament en farinx (Freedman et al,1992), i per a les dues MT, s’aprecia unaclara inducció per Cd, però no per Cu ni Zn(Imagawa et al., 1990; Liao & Freedman,1998; Swain et al., 2004). Concretament, en

resposta a Cd, mtl1 i mtl2 s’expressen enintestí, en els estadis de larva i adult,respectivament. (Kondo et al., 1990;Freedman et al., 1993).

El sistema de regulació de l’expressió deMT en C.elegans és diferent al d’altresorganismesRespecte els altres organismes coneguts:1) Els promotors dels dos gens presentencaixes d’activació per elements GATA iGRE, però només s’ha trobat una caixaMRE en mtl2, (Freedman et al., 1993;Kugawa et al., 1994).2) Els promotors dels gens mtl1 i mtl2 nosón funcionals en cèl·lules de mamífer(Kugawa et al., 1994).3) No s’han localitzat en el genoma deC.elegans seqüències codificants per MTF1,el factor que regula l’expressió de MT permetalls en mamífers i Drosophila (Swain etal., 2004).D’aquests fets se’n conclou que, enC.elegans, altres mecanismes independentsde MRE i MTF1 regulen l’expressió de lesMT en resposta a metalls (Swain et al.,2004).Tant mtl1 com mtl2 tenen llocs d’activacióper GATA en el seu promotor que sónnecessaris per a la seva expressió en intestí(Moilanen et al., 1999). Segons el modelproposat per altres autors, (Swain et al.,2004), les caixes GATA determinen lasíntesi constitutiva en intestí, que seriainhibida per algun factor inhibidordesconegut. Segons Moilanen et al. (1999) lapresència de metalls inactivaria aquestfactor inhibidor, punt clau de la regulacióde l’expressió per metalls en aquestorganisme.

Fig. 21- Alineament de les seqüències de MTL1 i MTL2 de C.elegans

Introducció

Les MT de C. elegans podrien participar enun complex sistema de detoxificaciómetàl·licaLes MT de C.elegans s’expressen en respostaal Cd, però no a altres metalls. OrganismesK.O. per mtl-1 i mtl-2 o la inhibiciód’aquests gens per RNAi resulten en unasensibilitat incrementada a la toxicitat perCd (Swain et al., 2004). Totes aquestes dadesindiquen que les MT de C.elegans podrienconstituir un mecanisme específic dedefensa contra el Cd. Tot i això, el sistemade defensa contra metalls pesants resultariaen C.elegans bastant més complex, per lapresència addicional dels següentselements:1) Fitoquelatines: en C.elegans s’haseqüenciat una regió codificant per a lafitoquelatin-sintasa (Ce-pcs1). La inhibicióde l’expressió de Ce-pcs1 també origina enC.elegans una sensibilitat incrementada alCd (Vatamaniuk et al., 2001).2) CeHMT-1: és una proteïna homòloga aSpHMT1 (Proteïna de S.pombesegrestadora-transportadora d’agregats Cd-PC associada a vacuola) i és capaç dedesenvolupar funcions similars en S.pombe(Vatamaniuk et al., 2005). Tot i així, estudisamb C.elegans mutants defectius per Cehmt-1 i Ce-pcs1 demostren que l’acció protectoracontra el Cd de Cehmt-1 no es desenvolupaexclusivament a través de fitoquelatines(Vatamaniuk et al., 2005).3) Les proteïnes CDR: són proteïnes desíntesi induïble per Cd (Dong et al., 2005),que s’associarien a lisosomes de cèl·lulesintestinals. Tenen caixes GATA i sóntransmembrana. La inhibició per RNAiresulta en sensibilitat incrementada al Cd.

En resum, tot i que les MT de C.eleganssemblen desenvolupar un paper importanten la detoxificació de Cd, altres mecanismesmés específics semblen ésser presents. El fetque en mutants daf-2 de C.elegans (unmutant en què s’aprecia una resistènciaincrementada a estrès oxidatiu i metalls) elsnivells de MT siguin més elevats respecte elsilvestre (Barsyte et al., 2001), suggereix queles MT de C.elegans podrien tenir un paper

més general i vies d’activació més àmpliesque la inducció per Cd.Els anèl·lids són un grup filogenèticament ibiològicament proper als nematodes. LesMT d’anèl·lid mostren un contingut de Cysi mida similar, i són també induïblesespecíficament per Cd (Marino et al., 1998).L’expressió de MT està també relacionadaamb lisosomes intestinals (Sturzenbaum etal., 2004). De la mateixa manera, aquestsorganismes presenten també d’altressistemes de protecció front als metalls(Willuhn et al., 1994) i la resposta a induccióés també diferent a la dels vertebrats(Sturzenbaum et al., 2004).Donada la semblança biològica entre elsanèl·lids i els nematodes, les peculiaritatsdel sistema MT en C.elegans podrien tenirrelació amb pressions evolutives comunesals dos grups filogenètics.

Enllaç a metalls i estructuraEls únics estudis realitzats fins al momentsobre els agregats metall-MT que formenles MT de C.elegans es centren en MTL2,que en sintetitzar-se heteròlogament enmedi enriquit en Cd, resulta en un agregatmetàl·lic Cd-MTL2 que conté 6 ions Cd2+

enllaçats tetraèdricament. (You et al., 1999).Dades sobre les MT de C.elegans purificadesde l’organisme sotmès a altesconcentracions de Cd indiquen proporcionsmetall/MT similars, tot i que per a MTL1 esdetecta una presència addicionalminoritària de Zn (You et al., 1999).

6.5- El sistema MT en el protozouTetrahymenaTot i que s’ha descrit la presència de MT endiversos protozous, l’estudi de les MT enaquest grup es centra en el gènereTetrahymena.

Les MT de Tetrahymena i la detoxificacióEn els protozous en general, la resposta acondicions d’estrès metàl·lic inclou laformació de corpuscles citoplasmàticselectrodensos en què s’acumularien elscomplexos metall-MT (Marigómez et al.,2002). Les MT de Tetrahymena foren aïlladescom a proteïnes que s’expressaven en

Introducció

resposta al Cd i al Cu, però no al Zn(Piccinni et al., 1999; Santovito et al., 2001;Shang et al., 2002). L’estudi dels promotorsdels seus gens mostra que presenten caixesde resposta del tipus MRE (Boldrin et al.,2003). El gènere Tetrahymena mostra unacapacitat de mantenir els metalls en soluciómolt més elevada que d’altres protozous(Piccinni, 1996), i que s’ha descrit lapresència de regions codificants perfitoquelatin-sintases (Amaro et al., 2005,GenBank Accession number DQ082725.2).

El gènere Tetrahymena té diversesisoformes homòlogues de MTEls estudis realitzats fins al moment ambTetrahymena demostren que aquest gènerepresenta una gran quantitat d’isoformes,amb peculiaritats importants en la sevaestructura primària. S’han estudiat les MTen tres espècies: T.pigmentosa (TpigMt1 iTpigMt2), T.pyriformis (TpyrMt1, TpyrMt2) iT.termophila (TterMt1, TterMt2, TterMt3,TterMtt1, TterMtt2, TterMtt5) (Piccinni et al.,1987; Santovito et al., 2001; Shang et al.,2002; Boldrin et al., 2006; Fu & Miao, 2006)(Fig. 22) i tenen en comú una midainusualment llarga, d’entre 93 i 162aminoàcids. L’elevada homologia interna

entre regions de cadascuna d’aquestes MTindica que la seva longitud és moltprobablement el resultat de duplicacionsinternes (Piccinni et al., 1987). Existeix ungrau elevat de semblança entre les diversesisoformes, i la isoforma Mt1 éspràcticament idèntica en les tres espècies deTetrahymena. Tot això indica que aquestsistema tan complex hauria estat originat apartir de duplicacions d’una seqüènciaancestral, de la qual Mt1 en seria la méspropera (Boldrin et al., 2003).

Les MT de Tetrahymena tenen unaestructura primària peculiarEn totes elles, excepte en TpigMT2 iTterMT2 i TterMTT2 es repeteix unacaracterística poc comuna en MT: lapresència en la seva seqüència de tripletsde Cys. Els altres organismes que presentenalguna MT amb triplets de Cys són elcrustaci C.sapidus (Syring et al., 2000), elfong Y.lipolytica (Prado-González, GenBankAccession number CAA80801.1), l’anèl·lidE.foetida (Gruber et al., 2000), i el mol·luscC.gigas (Jenny et al., 2004).

Fig. 22- Alineament de les MT del gènere Tetrahymena conegudes el 2006. D’algunes d’elles, només es té constància de laseva codificació en el genoma.

Introducció

Les MT de Tetrahymena són les úniques quepresenten triplets i doblets Cys en unamateixa seqüència. En les MT deTetrahymena, a més, aquesta característicasembla associar-se a la seva resposta ainducció: l’expressió de les MT amb tripletsCys sol ésser induïda per Cd, mentre lesMT que no en presenten solen ésserinduïdes per Cu (Santovito et al., 2001;Shang et al., 2002). Curiosament, enC.sapidus s’observa una relació en sentitinvers: els triplets Cys estan presents en laMT induïda per Cu, per la qual cosa nosembla que hi hagi relació directa entreaquesta disposició i les preferències decoordinació metàl·lica d’una MT.

Les MT de Tetrahymena podrien presentarun comportament coordinant iestructuració especialsActualment, es disposa de molt poquesdades sobre la funcionalitat de les MT deTetrahymena. La disposició de Cys entriplets s’observa molt rarament en lesproteïnes i no es tenen dades estructuralsassociades. Alguns resultats d’estudiscromatogràfics suggereixen que la MT deTetrahymena no adoptaria una formaglobular. Respecte la capacitat coordinant,existeixen evidències que MTT1 i MT1 deT.termophila són capaces de coordinar 16 i12 ions de Cd, respectivament (Dondero etal., 2004; Piccinni et al., 1994).

6.6- El sistema MT en la planta QuercussuberLes MT de planta tenen dominis senseCys i diversos patrons de CysLes MT de planta no s’alineen amb les MTde mamífer, raó per la qual se les haviainclòs dins la Classe II, i ara formen lafamília 15 segons la classificació de Binz iKägi. Aquesta família es caracteritza per lapresència d’un domini sense Cys entre elsdominis cisteínics, que rep el nomd’espaiador. S’han fet diversessubclassificacions de les MT d’aquestafamília en funció de la posició i mida del’espaiador i dels patrons de Cys dels dosdominis cisteínics. Actualment, la

classificació de les MT de planta proposadaper Cobbet i Goldsbrough (Cobbett &Goldsbrough, 2002), completa laclassificació general proposada per Binz iKägi el 2001. Segons aquests primersautors, les MT de planta es divideixen en 4tipus principals (Fig. 23). Les MT de tipus 1contenen 6 motius Cys-X-Cys, 3 a cadascundels extrems de la seqüència. L’espaiadorcompta amb uns 40 residus i contéaminoàcids aromàtics. Dins d’aquest tipus,s’hi inclouen també les MT de Brassicàcies,amb un espaiador més curt. Les MT detipus 2 són similars a les de tipus 1, però escaracteritzen per tenir un doblet Cysaddicional en el domini cisteínic N-terminal. Les MT de tipus 3 presenten laparticularitat de tenir només 4 Cys en el seudomini cisteínic N-terminal. Per acabar, lesMT de tipus 4 o Ec, enlloc de tenir dosdominis cisteínics, en tenen 3, separatsentre ells per espaiadors d’entre 10 i 15aminoàcids.Tot i que inicialment es suposava que en lesplantes no hi havia MT i la funció dedetoxificació era duta a terme per lesfitquelatines, darrerament s’ha demostratque la presència de MT en les plantes és unfet habitual, i que moltes plantes contenenmúltiples isoformes MT que pertanyen a alsdiversos tipus esmentats anteriorment(Giritch et al., 1998).

Els patrons tissulars i temporalsd’expressió suggereixen especialitzaciófuncional depenent de tipusLes MT de tipus 1 es solen aïllar en arrels, iles de tipus 2 en fulles (Cobbett &Goldsbrough, 2002), mentre les MT de tipus3 s’expressen principalment en fruitsmadurs (Ledger & Gardner, 1994;Clendennen & May, 1997) i les de tipus 4 estroben principalment en llavors(Kawashima et al., 1992; Liu et al., 1995a).Aquesta associació entre patronsd’expressió i característiques de seqüènciade les MT de planta suggereix una relacióestructura-funció, relació que no està encaraexplicada per característiques funcionalsconcretes.

Introducció

Les MT de planta s’expressen en respostaa estímuls molt variatsLes MT de planta responen a estressos imediadors molt variats, com metalls, elfred, l’etilè, l’estrès lumínic , la dessecació,la radiació UV, l’estrès salí (Cho et al., 2006),i també a processos del desenvolupament.Per exemple, la MT Ec de T.aestivum esprodueix constitutivament en períodesembrionaris primerencs, en relació al’homeòstasi del Zn (Kawashima et al.,1992), mentre les MT de tipus 2 es solensintetitzar en teixits senescents, i en relacióamb l’homeòstasi del Cu (Murphy & Taiz,1995; Cobbett & Goldsbrough, 2002).Es tenen poques dades sobre els elementsreguladors de l’expressió dels gens de MTen planta i els promotors estudiats fins almoment no mostren caixes MRE, però sícaixes ARE (Antioxidant ResponseElements) i GABARE (GABA-ResponseElements) (Kawashima et al., 1992; Zhou etal., 2005). No es tenen tampoc dades queindiquin quins són els factors detranscripció que en regulen l’expressió.

Les MT de planta i els metallsCom per a la resta de MT, des d’un punt devista funcional, s’ha proposat que les MT deplanta intervenen tant en la homeòstasi demetalls essencials, com en la detoxificacióde metalls xenobiòtics. El cas de les plantesés peculiar perquè presenten de formageneral un sistema de fitoquelatines (PC)

molt actiu, a què s’ha ja atribuït un rolimportant en la detoxificació de metalls.S’ha demostrat que les PC prenen partimportant en la detoxificació del Cdmitjançant la formació de complexos Cd-PCque són translocats als vacúols (Hall, 2002)amb participació molt significativa d’ionssulfur (Fig. 24), i que la unió a PC és el destíde la major part dels àtoms de Cd quepenetren a la planta (Robinson et al., 1987).

Tot i que les MT semblen tenir tambécapacitat per a la detoxificació del Cd enplantes (Lee et al., 2004; Zimeri et al., 2005),

MT1aMADSNCGCGSSCKCGDSCSCEKNYNKECDNCSCGSNCSCGSNCNC

MT2aMSCCGGNCGCGSGCKCGNGCGGCKMYPDLGFSGETTTTETFVLGVAPAMKNQYEASGESNNAENDACKCGSDCKCDPCTCK

MT3MSSNCGSCDCADKTQCVKKGTSYTFDIVETQESYKEAMIMDVGAEENNANCKCKCGSSCSCVNCTCCPN

MT4MADTGKGSSVAGCNDSCGCPSPCPGGNSCRCRMREASAGDQGHMVCPCGEHCGCNPCNCPKTQTQTSAKGCTCGEGCTCASCAT

Fig.23- Sequències de 4 MT de A.thaliana, representants dels quatre tipus de la classificació segons Cobbet i Goldsbrough, 2002.Enaquest cas, la MT1 pertany al subtipus de les brassicàcies, i per tant, presenta un espaiador anormalment curt per a les MT de tipus 1.En negreta, s’han marcat les cisteïnes, i en subratllat els dominis espaiadors.

Fig.24- Els metalls tòxics (M) són capturats per les PC, queincrementen el seu potencial quelatant gràcies als ions de

sulfur, formant complexos Cd-PC-S d’alt pes molecularque es situen en vacúols. Esquema modificat de Hall,

2002.

Introducció

la síntesi de les MT de planta raraments’indueix en resposta a Cd, i en canvi solrespondre a Cu o altres factors norelacionats directament amb els metalls(Murphy & Taiz, 1995; García-Hernandez etal., 1998; Cobbett & Goldsbrough, 2002;Brkljacic et al., 2004; Roosens et al., 2004).Així doncs, els nivells alts de MT de plantaes correlacionen positivament amb lapresència de Cu (Murphy et al., 1997). Amés, el Cu és el metall que solen presentarles MT de planta purificades de teixitsnatius (Murphy et al., 1997) i front al qualdemostren tenir un major poderdetoxificant de forma general (Cobbett &Goldsbrough, 2002), poder que exerceixentant en plantes, com en ésser expressadesheteròlogament en llevat (Zhou &Goldsbrough, 1994). De formacomplementària, les PC mostren tenir pocacapacitat detoxificadora enfront de Cu(Howden et al., 1995).Per tot això, es considera que les PC tenenper paper la detoxificació de metalls tòxics(Cd), mentre les MT s’ocupen de lahomeòstasi de metalls fisiològics (Cu)(Cobbett & Goldsbrough, 2002), i que elpaper detoxificador de les MT esdesenvoluparia en un pla temporal: les PCconstituirien la resposta ràpidad’acumulació i les MT serien la respostalenta de redistribució (Morris et al., 1999).

Les MT de planta estan relacionades ambl’estrès oxidatiuS’ha comprovat també que els nivells deMT de planta estan incrementats en elsteixits senescents (Cobbett & Goldsbrough,2002), tant per processos d’envelliment(Butt et al., 1998) com per processosestacionals (Coupe et al., 1995; Davies &Robinson, 2000). L’estrès oxidatiu juga unpaper actiu en la senescència, a través de lesespècies reactives d’oxigen (ROS) generatsen la cèl·lula senescent. Els ROS activen lasíntesi de MT de planta possiblementmitjançant l’activació de les caixes AREpresents en els promotors dels gens que lescodifiquen. Aquesta activació permetriaque les MT protegissin les estructurescel·lulars de lesions per ROS (Buchanan-

Wollaston, 1994; Coupe et al., 1995;Navabpour et al., 2003) mitjançantmecanismes descrits per a les MT engeneral en aquesta introducció.

Estudis funcionals i estructurals en MT deplantaEl coneixement de les propietatscoordinants i estructurals de les MT deplanta és encara molt incipient. Els estudisd’unió a metalls s’han realitzatprincipalment per síntesi heteròloga enmedis suplementats amb metalls, ja que elsagregats metall-MT resulten molt degradatsdurant el seu procés de purificació. Elsresultats indiquen que l’afinitat cap alsmetalls seguiria un ordre de preferència deltipus Cd > Cu > Zn > Fe en les MT de V.fava(Foley et al., 1997), mentre els pH dedissociació indiquen, en PsMTA deP.sativum, una afinitat major pel Cu que pelCd o el Zn (Tommey et al., 1991).Una comparació general indica que lesmostres analitzades de complexes metall-MT de plantes, tant natius comrecombinants, mostren un contingut globalde Cu més elevat que de Cd i Zn (Taula 2,pàg. 30), com és habitual en MTs d’animals.

Fig. 25- Les MT de planta, depenent de la interaccióentre els seus dominis podrien generar estructures en

forma de pinça (A) o en forma de pesa (B). En aquestesquema, de Morris et al., 1999, es proposa l’estructuraen forma de pinça per a les MT de planta de P.sativum i

la MT de F. vesciculosus, en comparació amb la MT depeix, que té una estructura en forma de pesa.

A

B

Introducció

Tal com s’ha comentat en la secció sobrel’estructura terciària de les MT, per a lesMT de planta s’han proposat diversosmodels de plegament. Els dos modelsproposats són: el model “de pesa”, similar alde les MT de vertebrat, en què els dominiscisteínics formen cadascun d’ells un agregatmetàl·lic, o bé el model de “pinça”, en quèels dos dominis cisteínics col·laboren per aformar un únic cluster metàl·lic (Fig. 25).Des d’un punt de vista experimental, lasíntesi heteròloga de la PsMTA deP.sativum en E.coli resultà en agregatsmetàl·lics la caracterització dels qualsindicava que es formava un únic clustermetàl·lic format per la interacció dels dosdominis cisteínics, i que l’espaiador eraproteolitzat posteriorment, possiblementdurant la purificació (Kille et al., 1991;Tommey et al., 1991). En el model en forma“de pesa” l’espaiador tindria la funció defacilitar la interacció entre els dos dominis.Estudis computacionals prediuen que en la

MT de la planta A.chinensis, l’espaiadorcontindria 2 �-sheet i 3 �-turns queconfigurarien una forma de U (Zhu, 2000),apropant, més que separant, els dosdominis cisteínics. Els estudis de modelatgemolecular per threading (predicció persemblança de seqüència/estructura)prediuen en el cas de M.guttatus, T.durum,A.chinensis, T.caerulescens i A.thaliana (deMiranda et al., 1990; Zhu, 2000; Roosens etal., 2004; Bilecen et al., 2005;) que elsdominis cisteínics formarien clustersmetàl·lics independents, amb unaestructura en forma de pesa. A mésd’aquestes dades de predicció d’estructura,s’ha observat per DC que en l’acidificacióde la MT de F.vesciculosus, aquesta MTallibera els metalls en dues fases, que elsautors interpreten com l’alliberament desde dos dominis independents (Merrifield etal., 2006).

Metall suplementat en el medi Zn Cd Cu Zn, Cd, Cu, Fe Refs.

Tipus isoforma Contingut metàl·lic dels agregats

I V.fava MT1a 2.6 Zn3 --- --- 1.7 Cd 1 Cu 0.1 Zn Foley et al., 1997

V.fava MT1b 3.25 Zn3 --- --- 2 Cd 0.4 Cu 0.02 Zn Foley et al., 1997

A.thaliana MT1 --- --- 7.3 Cu2 --- Murphy et al., 1997

P.sativum MT 6 / 11.5 Zn1 4 / 5.7Cd1 6.17 Cu1 --- Tommey et al., 1991

-- 6.1 Cd -- -- Kille et al., 1991

II L.esculetum MT --- 5.8 Cd --- --- Rauser et al., 1987

V.fava MT2 3.95 Zn --- --- 2 Cd 0.4 Cu 0.1 Zn Foley et al., 1997

A.thaliana MT2 --- --- 5.5 Cu2 --- Murphy et al., 1997

III A.thaliana MT3 --- --- 8.45 Cu2 --- Murphy et al., 1997

IV/Ec T.aestivum 5 Zn* --- --- --- Robinson et al., 1993

Zea mays --- 8 Cd* --- --- Bernhard et al., 1987

S.indicum 2 Zn --- 2 Cu Chyan et al., 2005

?3F.vesciculosus MT --- 7 Cd 13 Cu2 --- Merrifield et al., 2006

6 Zn2 6 Cd Merrifield et al., 2006Taula 2- Taula general de dades de capacitats quelatants de les MT de planta. Les dades es refereixen a la proporciómetall/proteïna dels agregats obtinguts en síntesi heteròloga en medis suplementats en el metall/metalls indicats a laprimera fila. *En els casos marcats amb un asterisc, els agregats metall-MT s’obtingueren directament de la planta. 1Elsautors adverteixen de possibles errors en la mesura de l’estequiometria metall/MT. 2 Agregats metall-proteïna obtingutsper reconstitució in vitro de la proteïna.3 La MT de F. vesciculosus podria pertànyer al tipus I, subtipus brassicàcies, peròla seva classificació és controvertida.