Espectroscopía de Fluorescencia 2

Ana Denicola

“Quenching” de fluorescencia

quenching = desactivación= apagamiento = menor emisión

IF (Q) < IF (-Q)

Reacciones en el estado excitado (Quenching colisional)

Entrecuzamiento intersistema a estado Triplete

Rearreglos moleculares

Transferencia de energía

Transferencia de carga

Formación de complejo en el estado basal (Quenching estático)

F Q F Q

F Q F Q

F Q F Q

F Q P

*

* *

* + -

*

+ → +

+ → +

+ → +

+ →

Mecanismos de desactivación bimolecular

d[F*]dt

[F*] + [F*] + [F*][Q]r nr d= Σ Σ Σk k k

Quenching colisional

Transferencia de energía

Transferencia de carga

Reacción

τ0

τ / τ0 = F/F0

Quenching colisional o dinámico

X X*hν

hν’

τ < τ0

QXQ*

X + Q

X

kQ

A una concentración fija del fluoróforo, medimos cómo varía la fluorescencia con concentraciones crecientes de quencher y se calcula:

F0/F (F0: fluorescencia en ausencia de quencher)

F0/F

[Q]

1

Ksv

Gráfico de Stern-VolmerF0/F = 1 + Ksv [Q]

Ksv = constante de Stern-Volmer, depende de:

• tipo de fluoróforo y quencher

• accesibilidad del fluoróforo

(viscosidad,temperatura)

Quenching colisional o dinámico

Quenching colisional o dinámico

F0/FStern-Volmer

Quenching de triptofano por O2

KSV = 32 M-1

Quenching colisional o dinámico

KSV = kq τ0 kq = cte. vel. quenching

k0 = cte. vel. colisional (controlada por difusión)

fQ = fracción de encuentros efectivos que terminan en quenching

kQ se determina experimentalmente a partir de KSV. Se estima la eficiencia de quenching fQ calculando k0 según Smoluchowski:

O se conoce la eficiencia de quenching fQ entonces se calcula k0 para estimar el coeficiente de difusión D usando la ecuación de Stokes-Einstein:

= 1

Quenching dinámico y estático

• Se requiere contacto entre Q y F, interacción molecular

• Quenching dinámico o colisional: Q + F*

• Quenching estático: Q + F

• Q debe difundir hacia F distancias moderadas (a diferencia de relajación por solvente)

Indica localización del F, exposición de F de manera de ser accesible a Q

Colicin E1 = proteina de membrana12 W

Quenchers of W emission: Iodide, acrylamide, disulfide, e-defficient groups like –NH3+, -COOH, histidine protonated

Carga del quencher afecta el quenching (Ksv)

DHE = dihidroequinelin = esteroide fluorescenteSBP = steroid binding protein

Impedimento estérico disminuye quenching (Ksv)

Quenching intermolecular

Q y F están unidos covalentemente

Enzima flavina reductasa con FMN unidoLa F de FMN en solución > F de FMN unido

La Y35 responsible de quenching interno de FMN por transferenciaelectrónica

Autoquenching – elevada concentración del fluoróforo

Fluoróforos con pococorrimiento Stokes

- reabsorción de las λmenores de emisión

- formación de excímeros

Rodamina 6G

5 µM

0.16 mM

5.7 mM

Transferencia de energía

hνDonante Aceptor

hν1

FRET

hν2

Cuando una molécula del donante absorbe un fotón y hay una moléculade aceptor cerca, puede ocurrir la transferencia de energía del estadoexcitado del donante al aceptor por una via no radiativa.

Como resultado de la transferencia de energía se observa una disminuciónen la intensidad de fluorescencia emitida por el donante y, si el aceptor esfluorescente, la aparición de una nueva señal fluorescente.

RESONANCE ENERGY TRANSFER (RET o FRET):

λEM D λEX A

A

λEM A

A

λEM A

λEX D

D*

λEX D

D

F

A *

D

Solapamiento espectral

Donante

Aceptor

Solapamiento

Absorbancia

Absorbancia

Fluorescencia

Fluorescencia

La eficiencia de la transferencia depende de:

• la distancia entre D y A

• el grado de solapamiento entre el espectro de emisión de D y el de absorción de A

• la orientación relativa entre D y A

• el tiempo de vida de D*

kT (r) = (1 / τD) (R0 / r)6

R0: distancia de Föster (depende del par D-A)r: distancia D-A

La constante de velocidad del proceso es:

22 )coscos3(cos ADT θθθκ −=

R

D

AθD

θTθA

φ

donde θT es el ángulo entre losmomentos de D y A , dado por

ADADT θθφθθθ coscoscossinsincos +=

θD, θA son los ángulos entre el vector de separación R, y los momentos D y A, respectivamente, y φ es el ángulo entre los planos (D,R) y (A,R)

Los límites para κ2 son 0 to 4, si las moléculas presentan movimientosisotrópicos rápidos κ2 = 2/3

El factor de orientación

D

D*A*

A

Transiciones acopladas

D* A* Interacción dipolo-dipolodepende de la distancia entre moléculas y de la orientación relativa entre los dipolos

Diagrama de energía simplificado

k JN rTE

d,a d

d

a=

⋅ ⋅ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅

9000 10128

2

45 6ln κ Q

ηπ τ

Eficiencia de la transferencia de energía

Experimentalmente, E puede calcularse a partir de los tiempos de vida o intensidades de fluorescencia del donante en ausencia y presencia del aceptor.

d,a d,a

d d

I1 1

I E = - -

ττ

=

TE

TE + i

kE =k k∑

Eficiencia de la transferencia de energía

E Rr R

=+ο

ο

6

6 6d,a

E k

k=

+TE

d TE1 / τ k RΤΕ τ

( od

) = 1

R JNo

d

a6

59000 10

128

2

4=

⋅ ⋅ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ln κ Q

ηπ

k JN rTE

d,a d

d

a=

⋅ ⋅ ⋅ ⋅⋅ ⋅ ⋅ ⋅ ⋅

9000 10128

2

45 6ln κ Q

ηπ τ

Dependencia con la distancia

E Rr R

=+ο

ο

6

6 6d,a

Donante Aceptor Ro (Å)

Fluoresceina Tetrametilrodamine 55 IAEDANS Fluoresceina 46 Fluoresceina Fluoresceina 44 BODIPY FL BODIPY FL 57

0

0.25

0.5

0.75

1

0 20 40 60 80 100

Distance in Angstrom

Effic

ienc

y of

tran

sfer

Se pueden medir distancias porFRET entre ~0.5 R0 and ~1.5R0

¿Para que sirve?• para medir distancia inter o intramoleculares.Con esa informacion se puede:-estudiar cambios conformacionales-medir asociaciones- colocalizar in vivoetc,etc

λEM AλEX D

F

• se puede ver la disminución de la fluorescencia de D o el aumentode la emisión de A. En general se usa la primera forma.

Hidrólisis de un sustrato

Unión de un sustrato

Fusión de vesículas

Cambios conformacionales

Medir distancias intramoleculares

Formación de agregados moleculares