126
cenidet Centro Nacional de Investigación y Desarrollo Tecnológico Departamento de Mecatrónica TESIS DE MAESTRÍA EN CIENCIAS Construcción y Monitoreo de Variables de un Prototipo para el Tratamiento Biológico de un Efluente con Colorante Naranja II, Mediante el Hongo Trametes Versicolor presentada por José Efraín Ruiz Ramírez Ing. Electromecánico por el I. T. de Zacatepec como requisito para la obtención del grado de: Maestría en Ciencias en Ingeniería Mecatrónica Director de tesis: Dr. Rigoberto Longoria Ramírez Co-Director de tesis: Dra. María del Refugio Trejo Hernández Cuernavaca, Morelos, México. Octubre de 2010

Escalamiento biorreactores-Cenidet

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Escalamiento biorreactores-Cenidet

cenidet Centro Nacional de Investigación y Desarrollo Tecnológico

Departamento de Mecatrónica

TESIS DE MAESTRÍA EN CIENCIAS

Construcción y Monitoreo de Variables de un Prototipo para el

Tratamiento Biológico de un Efluente con Colorante Naranja II, Mediante el Hongo Trametes Versicolor

presentada por

José Efraín Ruiz Ramírez Ing. Electromecánico por el I. T. de Zacatepec

como requisito para la obtención del grado de: Maestría en Ciencias en Ingeniería Mecatrónica

Director de tesis: Dr. Rigoberto Longoria Ramírez

Co-Director de tesis: Dra. María del Refugio Trejo Hernández

Cuernavaca, Morelos, México. Octubre de 2010

Page 2: Escalamiento biorreactores-Cenidet

cenidet Centro Nacional de Investigación y Desarrollo Tecnológico

Departamento de Mecatrónica

TESIS DE MAESTRÍA EN CIENCIAS

Construcción y Monitoreo de Variables de un Prototipo para el Tratamiento

Biológico de un Efluente con Colorante Naranja II, Mediante el Hongo Trametes Versicolor

presentada por

José Efraín Ruiz Ramírez Ing. Electromecánico por el I. T. de Zacatepec

como requisito para la obtención del grado de:

Maestría en Ciencias en Ingeniería Mecatrónica

Director de tesis: Dr. Rigoberto Longoria Ramírez

Co-Director de tesis:

Dra. María del Refugio Trejo Hernández

Jurado: Dr. Enrique Quintero Mármol – Presidente Dra. Sara Lilia Moya Acosta – Secretario

Dra. María del Refugio Trejo Hernández – Vocal Dr. Rigoberto Longoria Ramírez – Vocal Suplente

Cuernavaca, Morelos, México. Octubre de 2010

Page 3: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Agradecimientos

A Dios por permitirme llegar hasta este momento tan importante de mi vida y lograr otra meta

más en mi carrera.

A mis padres por su apoyo, confianza y amor. Gracias por ayudarme a cumplir mis objetivos

como persona y estudiante. Por brindarme los recursos necesarios y estar a mi lado

apoyándome. A mi hermana Mayra por sus consejos y apoyo. A mi sobrino Mateo que vino a

dar mucha alegría a mi hogar y con una sonrisa ilumina todo.

A mi novia Alejandra por su apoyo, compresión y amor que me permite sentir poder lograr lo

que me proponga. Gracias por escucharme y por tus consejos. Gracias por ser parte de mi

vida; eres lo mejor que me ha pasado.

A la Dra. Trejo por su importante aporte y participación activa en el desarrollo de esta tesis,

por su orientación y atención a mis consultas. Debo agradecer también su amabilidad y

disponibilidad y por sus substanciales sugerencias en la redacción de esta tesis.

Al Dr. Longoria por haberme dado la oportunidad de participar en este trabajo. Por sus

consejos brindados durante el desarrollo de la tesis.

Al Dr. Quintero por sus consejos y apoyo otorgado cuando se presentaron problemas con el

desarrollo de la tesis.

Gracias a mis amigos de la prepa que siempre me han prestado un gran apoyo moral y

humano. Mil gracias por todos los momentos que hemos pasado juntos y por que han estado

conmigo siempre. A Manuel, Hilario, Cinda e Iván que con ellos compartí conocimiento y

momentos muy agradables durante la maestría.

Al Téc. M.B. Académico Daniel Guzmán por su apoyo y opiniones para la realización de este

trabajo. A mi compañera y amiga Aurora Riegas Villalobos por su apoyo para la realización

de los experimentos biológicos.

Page 4: Escalamiento biorreactores-Cenidet

i

Contenido

Índice de figuras ..................................................................................................................................... v

Índice de tablas ..................................................................................................................................... vii

Nomenclatura ....................................................................................................................................... viii

Abreviaturas ........................................................................................................................................... ix

Resumen ................................................................................................................................................. xi

Abstract ................................................................................................................................................. xiii

CAPÍTULO 1 .......................................................................................................................................... 1

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 1

1.1 Introducción ..................................................................................................................................... 2

1.2 Planteamiento del problema ......................................................................................................... 3

1.3 Justificación ..................................................................................................................................... 4

1.4 Hipótesis ........................................................................................................................................... 4

1.5 Objetivo general .............................................................................................................................. 5

1.5.1 Objetivos particulares ............................................................................................................. 5

1.6 Metas ................................................................................................................................................ 5

1.7 Alcances ........................................................................................................................................... 6

CAPÍTULO 2 .......................................................................................................................................... 7

MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................ 7

2.1 Fuentes de compuestos tóxicos ................................................................................................... 8

2.2 Colorantes ........................................................................................................................................ 8

2.3 Hongo Trametes Versicolor........................................................................................................... 9

2.4 Hongo Pleurotus ostreatus ............................................................................................................ 9

2.5 Biorreactores ................................................................................................................................. 10

2.6 Tipos de biorreactores ................................................................................................................. 10

2.6.1 Biorreactores agitados .......................................................................................................... 10

2.6.2 Biorreactores de columna .................................................................................................... 11

2.6.3 Biorreactores de circulación................................................................................................. 11

Page 5: Escalamiento biorreactores-Cenidet

ii

2.6.4 Biorreactor airlift ..................................................................................................................... 11

2.7 Escalamiento de biorreactores ................................................................................................... 15

2.7.1 Criterios de escalamiento ..................................................................................................... 16

2.8 Variables a medir y monitorear en el biorreactor ..................................................................... 17

2.8.1 El pH ........................................................................................................................................ 18

2.8.1.1 Electrodo de vidrio ......................................................................................................... 18

2.8.1.2 Funcionamiento del electrodo de pH .......................................................................... 19

2.8.2 Temperatura ........................................................................................................................... 20

2.8.2.1 Termopares ..................................................................................................................... 20

2.8.3 Absorbancia ............................................................................................................................ 21

2.8.3.1 Espectrofotómetro .......................................................................................................... 22

2.8.3.2 Componentes de un espectrofotómetro ..................................................................... 23

2.8.3.3 Utilidad del espectrofotómetro ..................................................................................... 23

2.8.3.4 Fotorresistencia .............................................................................................................. 23

2.8.3.5 LED ................................................................................................................................... 24

CAPÍTULO 3 ........................................................................................................................................ 26

DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DEL COLORANTE NARANJA II ................................................ 26

3.1 Preparación de inóculo en medio sólido ................................................................................... 27

3.2 Preparación del medio líquido para la inoculación del hongo ............................................... 27

3.3 Inoculación ..................................................................................................................................... 28

3.4 Inmovilización del hongo ............................................................................................................. 28

3.5 Preparación de buffer pH = 6 ...................................................................................................... 30

3.6 Colorante Naranja II ..................................................................................................................... 31

3.7 Biodegradación del colorante Naranja II en matraces ............................................................ 32

3.8 Biodegradación del colorante Naranja II en un biorreactor .................................................... 34

3.9 Conclusiones experimentación con el hongo ........................................................................... 34

CAPÍTULO 4 ........................................................................................................................................ 35

DISEÑO FÍSICO .................................................................................................................................. 35

4.1 Dimensionamiento y construcción del biorreactor ................................................................... 36

4.1.1 Soporte para el biorreactor .................................................................................................. 40

Page 6: Escalamiento biorreactores-Cenidet

iii

4.2 Módulo electrónico ........................................................................................................................ 41

4.3 Medidor de absorbancia .............................................................................................................. 43

4.3.1 Sensor de absorbancia ......................................................................................................... 43

4.3.2 Rueda de LEDS ..................................................................................................................... 43

4.3.3 Bomba de recirculación ........................................................................................................ 45

4.3.4 Integración de los elementos del medidor de absorbancia ............................................ 45

4.4 Medidor de temperatura............................................................................................................... 47

4.5 Medidor de pH ............................................................................................................................... 48

4.6 Programación microcontrolador ................................................................................................. 49

4.7 Programación interfaz gráfica ..................................................................................................... 50

4.7.1 Monitoreo de sensores ......................................................................................................... 50

4.7.2 Configuración del puerto serie ............................................................................................. 50

4.7.3 Almacenamiento de datos .................................................................................................... 51

4.7.4 Intervalo de almacenamiento de datos .............................................................................. 51

4.7.5 Visualización .......................................................................................................................... 52

4.7.6 Calibración de sensores ....................................................................................................... 52

4.7.7 Longitud de onda ................................................................................................................... 52

4.7.8 Encendido bomba .................................................................................................................. 52

4.7.9 Herramientas adicionales ..................................................................................................... 53

4.8 Posición longitud de onda ........................................................................................................... 53

4.9 Accionamiento de válvulas .......................................................................................................... 54

CAPÍTULO 5 ........................................................................................................................................ 55

CALIBRACIÓN DE SENSORES ....................................................................................................... 55

5.1 Sensor de temperatura ................................................................................................................ 56

5.2 Sensor de pH ................................................................................................................................. 58

5.3 Sensor de absorbancia ................................................................................................................ 60

CAPÍTULO 6 ........................................................................................................................................ 63

PRUEBAS Y RESULTADOS ............................................................................................................. 63

6.1 Prueba mecánica del biorreactor (decoloración) ..................................................................... 64

6.2 Prueba biorreactor y sensores .................................................................................................... 65

Page 7: Escalamiento biorreactores-Cenidet

iv

6.3 Prueba biorreactor, durante el cultivo y monitoreo de sensores ........................................... 67

CAPÍTULO 7 ........................................................................................................................................ 72

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................................. 72

7.1 Conclusiones ................................................................................................................................. 73

7.2 Recomendaciones ........................................................................................................................ 75

Referencias .......................................................................................................................................... 76

Anexo A Diseño del Biorreactor ..................................................................................................... 78

Anexo B Diseño tarjeta electrónica ............................................................................................... 86

Anexo C Calibración sensor de absorbancia............................................................................... 93

Anexo D Programa Microcontrolador.......................................................................................... 101

Anexo E Archivo con datos de los sensores ............................................................................. 109

Page 8: Escalamiento biorreactores-Cenidet

v

Índice de figuras

Figura 2.1: Trametes Versicolor ......................................................................................................................... 9

Figura 2.2: Pleurotus ostreatus ........................................................................................................................... 9

Figura 2.3: Reactor airlift ................................................................................................................................... 13

Figura 2.4: Electrodo de vidrio .......................................................................................................................... 18

Figura 2.5: Representación de un termopar ................................................................................................... 20

Figura 2.6: Demostración de la absorbancia .................................................................................................. 21

Figura 2.7: Fotorresistencia ............................................................................................................................... 24

Figura 2.8: LEDs ................................................................................................................................................. 25

Figura 3.1: Crecimiento del hongo, en medio solido ..................................................................................... 27

Figura 3.2: Fragmentos de micelio para ser molido ...................................................................................... 28

Figura 3.3: Solución de alginato y biomasa .................................................................................................... 29

Figura 3.4: Inmovilización del hongo ............................................................................................................... 29

Figura 3.5: Caída de la biomasa en el carbonato de calcio ......................................................................... 30

Figura 3.6: Estructura química del colorante naranja II. ............................................................................... 31

Figura 3.7: Espectro de la desaparicion del colorante naranja II con T.v libre. ........................................ 32

Figura 3.8: Evolución de la absorbancia con el hongo T.v y el P.o libre e inmovilizado. ........................ 33

Figura 3.9: Evolución de la absorbancia con el hongo T.v y P.o libre ........................................................ 33

Figura 3.10: Funcionamiento del birreactor .................................................................................................... 34

Figura 4.1: Biorreactor ....................................................................................................................................... 39

Figura 4.2: Difusor de aire interno ……………………………………………………………………………39

Figura 4.3: Difusor de aire externo……………………………………………………………………………40

Figura 4.4: Tamaño de burbuja biorreactor .................................................................................................... 40

Figura 4.5: Estructura para el biorreactor ....................................................................................................... 41

Figura 4.6: Tarjeta electrónica del biorreactor ................................................................................................ 42

Figura 4.7: Módulo electrónico ......................................................................................................................... 42

Figura 4.8: Alineación del led con la fotorresistencia .................................................................................... 44

Figura 4.9: bomba de recirculación .................................................................................................................. 45

Figura 4.10: Caja sensor de absorbancia …………………………………………………………………...46

Figura 4.11: Alineación del tubo………………………………………………………………………………46

Figura 4.12: Circulación de flujo en el medidor de absorbancia .................................................................. 47

Figura 4.13: Electrodo de pH ............................................................................................................................ 49

Figura 4.14: Etiqueta monitoreo de sensores ................................................................................................. 53

Figura 4.15: Etiqueta Posición longitud de onda ........................................................................................... 54

Figura 4.16: Accionamiento de válvula ............................................................................................................ 54

Figura 5.1: Respuesta del termopar ................................................................................................................ 56

Figura 5.2: Regresión lineal termopar ............................................................................................................. 57

Figura 5.3: Calibración de pH ........................................................................................................................... 58

Figura 5.4: Regresión lineal del pH .................................................................................................................. 59

Figura 5.5: Grafica medidor de absorbancia. ................................................................................................. 61

Figura 5.6: Gráfica del espectrofotómetro. ..................................................................................................... 62

Page 9: Escalamiento biorreactores-Cenidet

vi

Figura 6.1: Degradación biológica del colorante naranja II .......................................................................... 64

Figura 6.2: Efecto de la concentración del colorante naranja II sobre la temperatura. ............................ 66

Figura 6.4: Efecto de la concentración del colorante naranja II sobre la absorbancia............................. 67

Figura 6.5: Evolución de la temperatura en el proceso de degradación del colorante naranja II ........... 68

Figura 6.6: Evolución del pH en el proceso de degradación del colorante naranja II .............................. 69

Figura 6.7: Evolución de la absorbancia en el proceso de degradación del colorante naranja II .......... 69

Figura 6.8: a) Reactor al tiempo 0 y b) reactor después de 4 horas ........................................................... 70

Figura 6.9: a) Colorante termino de la prueba b) Colorante al inicio de la prueba. .................................. 70

Figura 6.10: Biomasa ......................................................................................................................................... 71

Page 10: Escalamiento biorreactores-Cenidet

vii

Índice de tablas

Tabla 2.1: Termopares de uso común. ............................................................................................................ 21

Tabla 2.2: Compuestos empleados en la construcción de LED ................................................................... 24

Tabla 4.1: Longitudes de onda de LEDs .......................................................................................................... 44

Tabla 4.1: Calibración termopar más AD594 .................................................................................................. 58

Tabla 5.2: Longitud de onda de colorantes ..................................................................................................... 60

Page 11: Escalamiento biorreactores-Cenidet

viii

Nomenclatura

A Absorbancia

Ag Plata

AgCl Cloruro de plata

C Concentración de sustancia absorbente en el medio

ºC Grados centígrados

cm centímetros

Dd Diámetro del tubo externo

DI Diamtro interno

Dr Diámetro del tubo interno

EH Potencial a través de la membrana de vidrio

Eref Potencial generado por el electrodo de referencia

F Constante de Faraday

Fem Fuerza electromotriz

g Gramos

g/l Gramos sobre litro

gM Gramos mol

HT Altura del cilindro exterior

H Altura total

HL Altura del líquido

I0 Intensidad de la luz incidente

I1 Intensidad de la luz una vez ha atravesado el medio

k Coeficiente de extinción

KLa Coeficiente de transferencia de oxígeno

l Litros

L Distancia que la luz atraviesa por el cuerpo

M Molar

ml mililitro

mM milimolar

MΩ Mega ohm

N Velocidad de agitación

Page 12: Escalamiento biorreactores-Cenidet

ix

Nión Carga del ion

nm Nanómetros

NaH2PO4 Fosfato diácido de sodio

Na2HPO4 Fosfato ácido de sodio

Pg/V Potencia por unidad de volumen

ppm Partes por millón

PSI Libra fuerza por pulgada cuadrada

Pg/V Potencia por unidad de volumen

R Constante de los gases

rpm Revoluciones por minuto

T Temperatura grados Kelvin

V Volumen

Vop Volumen de operación

Vref Voltaje de referencia

Vt Volumen de tapas

VT Volumen total

Vc Volumen del cilindro

α Coeficiente de absorción o la absorbancia molar de la sustancia

λ Longitud de onda del haz de luz

% Por ciento

µV Micro volts

ρ Densidad del fluido

µ Viscosidad dinámica del fluido

Abreviaturas

ADC Convertidor Analógico Digital

BITS Digito Binario

BNC Del ingles Bayonet Neill-Concelman

CEIB Centro de Investigación en Biotecnología

LDR Resistor Dependiente de la Luz

LED Diodo Emisor de Luz

Page 13: Escalamiento biorreactores-Cenidet

x

PCB Tarjeta de Circuitos Impresos

PDA Agar Papa Dextrosa

PIC Controlador de Interfaz Periférico

PN Positivo Negativo

P.o. Pleurotus Ostreatus

PVC Policloruro de Vinilo

T.v. Trametes versicolor

Page 14: Escalamiento biorreactores-Cenidet

xi

Resumen

En el presente trabajo de investigación se diseñó y construyó un biorreactor airlift para tratar

agua contaminada con el colorante sintético Naranja II mediante en hongo Trametes

versicolor. Este hongo participa en la descomposición blanca de la madera debido a que es

capaz de degradar la lignina mediante la generación de un complejo enzimático extracelular,

conocido como sistema ligninolítico. Este complejo enzimático ha sido utilizado para la

biodegradación de una gran variedad de compuestos aromáticos en diversos sistemas de

operación, biorreactores discontinuos y continuos.

El biorreactor es un recipiente cerrado donde se llevan a cabo los procesos de

biodegradación de los compuestos tóxicos contaminantes de agua, que puede operar en

continuo y discontinuo. Para su operación se ha equipado con entradas y salidas de flujo de

materia, así como sistemas de monitoreo de variables fisicoquímicas que permiten el

seguimiento de los procesos biológicos. La complejidad de los sistemas de monitoreo

depende de los procesos biológicos que se pretenden realizar. En general se utilizan

sistemas de monitoreo y almacenamiento de algunas variables importantes como son la

temperatura, pH. No obstante, se requieren de otros parámetros de monitoreo que no son

generales y para ello se deben realizar diseños específicos como la determinación de la

absorbancia. Este parámetro aún no sido implementado en los biorreactores comerciales,

por lo que fue necesario diseñar e implementarlo en un biorreactor de tipo airlift, junto con el

monitoreo de la temperatura y del pH. Debido que durante el proceso de biodegradación del

colorante se presenta una disminución que implica un cambio en la absorbancia. Este

parámetro nos permite cuantificar la concentración del colorante presente durante el proceso

de degradación en continuo.

Para llevar a cabo el monitoreo de las variables, se requirió de conocimiento de los principios

teóricos tanto fisicoquímicos como biológicos de las diferentes variables de medición, así

como su operación específica: Por otra parte, así como conocimientos de mecánica,

Page 15: Escalamiento biorreactores-Cenidet

xii

electrónica y computación para la implementación de los circuitos electrónicos involucrados

en los dispositivos de medición.

El Hardware para el monitoreo de las variables antes mencionadas es una tarjeta de

adquisición de datos donde el elemento principal es el microcontrolador PIC16F877A, donde

es recibida la señal analógica de los sensores después de su acondicionamiento y es

convertida a señal digital, para después poder ser leída por la computadora y

acondicionadores de señales para los sensores de temperatura, pH y absorbancia.

Por otra parte el software para el monitoreo y manejo del usuario, está programado en la

plataforma LabView 8.2.

Page 16: Escalamiento biorreactores-Cenidet

xiii

Abstract

In the present research was designed and built an airlift bioreactor to treat water

contaminated with the synthetic dye Orange II by in fungus Trametes versicolor. This fungus

is involved in the decomposition of the wood white because it is able to degrade lignin by

generating an extracellular enzyme complex, known as ligninolytic system. This enzyme

complex has been used for the biodegradation of a variety of aromatic compounds in various

operating systems, batch and continuous bioreactors.

The bioreactor is a closed vessel which carried out the process of biodegradation of toxic

pollutants from water, which can operate in continuous or discontinuous. For its operation is

equipped with inputs and outputs flow field as well as monitoring systems physicochemical

variables that allow tracking of biological processes. The complexity of monitoring systems

depends on biological processes that have been announced. In general, monitoring systems

are used and storage of important variables such as temperature, pH. However, other

parameters require monitoring that are not general and it should make specific designs such

as the determination of the absorbance. This parameter has not yet been implemented in

commercial bioreactors, so it was necessary to design and implement a type airlift bioreactor,

together with monitoring of temperature and pH. Given that during the process of

biodegradation of the dye is a decrease implies a change in absorbance. This parameter

allows us to quantify the concentration of dye present in the continuous process of

degradation.

To carry out the monitoring of variables, it required knowledge of the theoretical principles

physicochemical and biological variables of different measurement and its specific operation:

On the other hand, as well as knowledge of mechanics, electronics and computers for

implementation of the electronic circuits involved in measurement devices.

The hardware for the monitoring of the aforementioned variables is a data acquisition board

where the main element is the PIC16F877A microcontroller, where the analog signal is

received from the sensors after preparation and is converted to digital, and then can be read

by the computer and signal conditioners for temperature sensors, pH and absorbance.

Page 17: Escalamiento biorreactores-Cenidet

xiv

Moreover, the software for monitoring and management of the user, the platform is

programmed in LabView 8.2.

Page 18: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN

Page 19: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 1 Introducción

2

1.1 Introducción

Un problema grave en la actualidad es la contaminación de las aguas, que puede proceder

de fuentes naturales o de actividades humanas. En la actualidad la más importante, sin

duda, es la provocada por el hombre.

La contaminación se debe a que se han descargado al ambiente compuestos xenobióticos

(que son sintetizados por el hombre) y éstos han causado un desequilibrio ambiental. Entre

ellos se encuentran los colorantes utilizados en industrias para teñir fibras textiles, plásticos,

pieles, cosméticos y alimentos. Se estima que alrededor del 10% de los colorantes aplicados

durante los procesos de teñido no se absorben en las fibras de las telas y son desechados

en los sistemas de tratamiento de aguas residuales o al medio ambiente [1].

Este tipo de colorantes son recalcitrantes a la degradación microbiana, son tóxicos ya que

algunos presentan alta solubilidad y evitan la transmisión de luz en el agua, afectando a la

flora y fauna acuática. Una de las opciones más atractivas es el utilizar hongos de

podredumbre blanca para tratar los efluentes industriales textiles, ya que son económicos,

factibles y eficientes para estos fines.

La finalidad de este trabajo de tesis fue diseñar y construir un biorreactor airlift, en donde se

pudiera llevar a cabo el monitoreo de las variables más importantes del proceso de remoción

de color: temperatura, pH y absorbancia. Esta última variable monitorea en forma continua el

grado de colorante existente en el agua dentro del biorreactor, sin tener que sacar muestra

del fluido con colorante cada determinado tiempo y no tener que utilizar otro equipo

(espectrofotómetro) para medir esta variable.

En el primer capítulo de este documento se describe el fundamento teórico necesario para el

desarrollo del trabajo de tesis.

En el capítulo 2 se muestran resultados de los primeros experimentos realizados con el

hongo Trametes versicolor y Pleurotus ostreatus en matraces y en el reactor airlift con

capacidad de 300 mililitros; además de los pasos realizados para llevar a cabo la

inmovilización del hongo con alginato.

En el capítulo 3 se describen los cálculos, construcción del biorreactor y elementos que lo

conforman, así como el diseño y construcción del módulo electrónico, conformado por una

tarjeta de adquisición de datos compuesta principalmente por el microcontrolador

Page 20: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 1 Introducción

3

PIC16F877A, y acondicionadores de señales para los sensores de temperatura, pH y

absorbancia.

En el capítulo 4 se presenta el método de calibración de los sensores de pH, temperatura y

absorbancia.

En el capítulo 5 se muestran los diagramas de flujo de la programación realizada en el

microcontrolador PIC16F877A para la adquisición de datos de los sensores. También se

muestra la interfaz gráfica realizada en LabView 8.2, y se describen las partes que la

conforman.

En el capítulo 6 se presentan los resultados obtenidos en el biorreactor, con el monitoreo de

variables.

Para terminar, en el capítulo 7 se muestran las conclusiones a las que se llegó después de

terminado el trabajo de tesis y las recomendaciones para trabajos futuros en el biorreactor.

1.2 Planteamiento del problema

Se han propuesto diferentes tipos de procesos de tratamiento para llevar a cabo la

decoloración de las aguas residuales de la industria textil. Estos tratamientos pueden ser de

tipo fisicoquímico, y entre éstos se tienen los procesos de oxidación avanzada (clorinación,

blanqueado, ozonización), electrólisis, coagulación, adsorción, intercambio iónico, filtración

por membranas, etc. Actualmente, el tratamiento de las aguas residuales de la industria

textil, se ha limitado a la utilización de procesos por membrana para la remoción de colorante

y su recuperación; para poder reutilizar el agua en su proceso. Esta tecnología es muy

eficiente pero, su aplicación a nivel industrial, en donde se involucran grandes volúmenes de

agua, lo hace muy costoso. Es por esto que existe un mayor interés por el uso de otras

técnicas para tratar aguas residuales como son los tratamientos biológicos, o una

combinación de ambos dependiendo del tipo de efluente a tratar [1].

El problema que se pretende abordar en este trabajo, consiste por una parte, en

experimentar con la capacidad de degradación de colorante del hongo Trametes versicolor, y

del Pleurotus ostreatus en matraces y con concentraciones de colorante naranja II a 25 ppm,

también de una prueba en biorreactor airlift de 300 ml y por otra, en diseñar y construir un

biorreactor airlift de 3000 ml automatizado, para monitorear y almacenar las variables

involucradas en el proceso de degradación de colorante.

Page 21: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 1 Introducción

4

1.3 Justificación

Entre los compuestos más importantes y que se descargan al medio ambiente están los de

tipo azo. La relevancia de estos compuestos es que son tóxicos para los organismos vivos y

aun así son ampliamente utilizados.

Es por ello que existe el interés de implementar procesos que permitan la eliminación de este

tipo de compuestos de los efluentes.

Si bien existen estudios relacionados con tratamientos biológicos, la mayoría de ellos son

sistemas bacterianos que no han resultado ser satisfactorios a la hora de realizar una

biodegradación de estos compuestos coloreados. Sin embargo se ha investigado desde

hace algunos años la potencialidad oxidativa de otro tipo de microorganismos, como los

denominados hongos de podredumbre blanca, cuya principal característica es la

biodegradación de lignina mediante la generación de un complejo enzimático extracelular,

conocido como sistema ligninolítico.

Las ventajas de este proceso biológico de tratamiento de aguas son:

Su bajo costo con referencia a otros métodos de tratamiento.

Se puede logra una mejor decoloración del agua.

Hongo de origen mexicano.

Las desventajas de este proceso son:

Mayor tiempo para la remoción de color.

Se necesitan cantidades grandes de biomasa, para volúmenes grandes.

1.4 Hipótesis

El uso de hongos del tipo de podredumbre blanca es eficiente para degradar diversos tipos

de colorantes que se encuentren en aguas residuales de origen industrial y conducen a la

reducción de su concentración y de su toxicidad en el medio ambiente.

Page 22: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 1 Introducción

5

Es factible realizar la automatización del reactor para facilitar el proceso de decoloración de

las aguas residuales de origen textil, manteniendo las condiciones óptimas para el desarrollo

y vida de los hongos.

1.5 Objetivo general

Construir un prototipo a nivel laboratorio para el tratamiento biológico de agua residual con

colorantes utilizados en la industria textil.

1.5.1 Objetivos particulares

Establecer las características óptimas de los materiales usados para la construcción

del prototipo.

Medir y monitorear las variables más importantes que intervienen en el proceso.

Diseñar e implementar un sistema de adquisición de datos de las variables del

proceso.

Diseñar y construir un prototipo para el tratamiento biológico.

Realizar pruebas de funcionamiento del prototipo.

1.6 Metas

Lograr un porcentaje de decoloración (medido a través de la absorbancia) entre 40%

y 80% dependiendo del tipo de colorantes en el tratamiento de agua residual de

origen textil.

Tener un reactor con capacidad para 3 litros de agua.

Mantener un pH alrededor de 6.0.

Tener errores pequeños alrededor de +-1% en el monitoreo y control de variables

Page 23: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 1 Introducción

6

1.7 Alcances

El prototipo diseñado y construido sólo tendrá capacidad para flujos a nivel laboratorio y

debe ser capaz de reducir el color del agua de origen residual textil.

El prototipo se evaluará con colorantes que han sido probados anteriormente con los hongos

y su degradación a través de ellos, y por lo tanto existe un registro de datos.

El prototipo final debe ser capaz de monitorear las variables involucradas en el proceso.

Page 24: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 2

MARCO TEÓRICO

Page 25: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

8

2.1 Fuentes de compuestos tóxicos

Los principales componentes del agua residual son las impurezas naturales que se

encuentran en las fibras naturales y los compuestos químicos agregados durante los

procesos empleados para el tratamiento de fibra, hebras o tejidos. Las plantas de

procesamiento textil utilizan una amplia variedad de tintes y otros compuestos químicos,

incluidos los ácidos, bases, sales agentes humedecedores, tintes y otros acabados

auxiliares. Muchos de éstos no permanecen en el producto textil terminado sino que se

desechan después de un uso específico. El efluente combinado de una planta textil, por

tanto, puede contener cualquiera de estos compuestos o todos ellos [1].

Muchos de estos agentes químicos empleados en la industria textil son considerados tóxicos

y peligrosos. La descarga de estas substancias en el medio ambiente puede causar serios

perjuicios a la salud y al bienestar de una comunidad expuesta o al ecosistema afectado.

Estos materiales pueden crear serios peligros para la salud y enfermedades de naturaleza

crónica. Las aguas superficiales y subterráneas, los suelos y el aire pueden contaminarse

todos con substancias peligrosas y tóxicas [1].

2.2 Colorantes

Los colorantes, pocas veces son considerados una forma de contaminación a pesar de los

daños que provocan, Debido a su estructura química, los colorantes absorben luz en el

espectro visible [2].

Durante el tratamiento de un residuo coloreado se debe prestar atención a la reducción o

eliminación del color, contribuyendo de esta forma a reducir el impacto sobre los

ecosistemas donde son vertidos [2].

Existen diferentes tipos de colorantes, y entre el 60% y 70% de los colorantes aplicados en la

industria textil son compuestos de tipo azo, los cuales se caracterizan por la presencia en su

estructura de uno o más grupos azo - N = N –[2].

Page 26: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

9

2.3 Hongo Trametes Versicolor

Hongo que desarrolla cuerpos fructíferos o setas (basidiomas) con sombreros imbricados, de

3 a 6 cm., delgados, de borde ondulado, que carecen de pie y se aplanan prontamente. En la

figura 2.1 se muestra ejemplo del hongo Trametes en su estado natural [3].

Figura 2.1: Trametes Versicolor

2.4 Hongo Pleurotus ostreatus

El Pleurotus es un hongo comestible gastronómicamente de primerísima calidad. Su color es

blanco o castaño, aunque hay variedades azuladas y rosadas. Su carne es compacta en el

sombrero y fibrosa y blanca en el pie con sabor y olor agradable.

Esta especie crece en ambientes naturales sobre troncos de árboles caídos y otras plantas

leñosas en descomposición. Es un hongo semianaeróbico que soporta un 32 % de CO2 y fija

el nitrógeno atmosférico (ver figura 2.2) [22].

Figura 2.2: Pleurotus ostreatus

Page 27: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

10

2.5 Biorreactores

Un biorreactor o fermentador se define como “aquel dispositivo que proporciona un medio

ambiente controlado que permite el crecimiento eficaz de las células y la formación de un

producto”. El medio ambiente adecuado que proporciona un biorreactor, tiene que tener

niveles óptimos de temperatura, pH, sustrato, sales, y oxígeno, para así convertir las

materias primas en productos específicos de interés [4].

2.6 Tipos de biorreactores

Los biorreactores pueden clasificarse de la siguiente forma:

Agitado

Columna

Circulación

Propelas

Airlift

Jet

2.6.1 Biorreactores agitados

Este tipo de biorreactores es muy empleado, en todas las escalas de producción. Consiste

de un cuerpo cilíndrico con tapas elipsoidales, semiesféricas. Generalmente su relación

altura/diámetro es menor a 3 y más comúnmente menor a 2. Cuentan con un motor al que se

acopla la flecha de transmisión que contiene a su vez los impulsores que agitarán el líquido.

Dependiendo del tamaño del reactor, el motor puede colocarse en la tapa superior o en la

inferior, pero invariablemente se requiere de sellos mecánicos para garantizar el trabajo

aséptico. Generalmente la “aireación” se realiza a través de tubos perforados, efectuándose

la dispersión del aire en las zonas cercanas a los impulsores [5].

Page 28: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

11

2.6.2 Biorreactores de columna

Este tipo de biorreactores carece de sistema de transmisión mecánica para mezclar el caldo.

El mezclado se realiza por la inyección de aire en el líquido desde el fondo del recipiente, al

dispersarse el aire en burbujas y al ascender causan la turbulencia del líquido. Generalmente

la relación altura/diámetro es mayor a 3. Si las columnas son grandes se pueden emplear

platos perforados colocados en posiciones intermedias para dispersar las burbujas de gas.

Al carecer de partes móviles tanto la construcción, operación y mantenimiento de este tipo

de biorreactores son más económicos que cualquier otro tipo [5].

2.6.3 Biorreactores de circulación

La denominación de este tipo de biorreactores se debe al patrón de circulación definido del

líquido en el biorreactor. Se clasifican en dos grandes grupos: de circulación externa o

interna. Externa si el liquido es inducido a circular por un lazo lateral conectado al cuerpo

principal del biorreactor en su parte inferior y superior, mientras que es interna si el líquido

circula en forma definida sin salir del cuerpo principal del reactor. Los primeros solo se han

empleado a nivel experimental, mientras que los segundos se han llegado a utilizar a nivel

industrial, generalmente en el tratamiento de aguas residuales alcanzando volúmenes de

hasta 13,600 m3 [5].

2.6.4 Biorreactor airlift

El biorreactor tipo airlift también es un equipo agitado neumáticamente y se caracteriza

porque el suministro de energía para mantener homogeneidad en su interior tiene lugar

mediante la expansión isotérmica del gas introducido. La alimentación de gas permite el

suministro de oxígeno para las operaciones que así lo requieran, y además se mantienen

patrones de flujo internos aproximadamente bien definidos. Los biorreactores Airlift tienen

una gran cantidad de aplicaciones potenciales tanto en procesos químicos y biológicos. En

los reactores Airlift, la fluidización de sólidos no es una consecuencia directa del burbujeo del

gas sino es, más bien, debida a la circulación del líquido dentro del reactor. Debido a lo

anterior, éstos equipos ofrecen la posibilidad de una fluidización de sólidos muy simple, de

Page 29: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

12

alta eficiencia y permiten establecer ambientes internos con esfuerzos de corte

aproximadamente constantes a lo largo del biorreactor, debido a que la distribución de la

energía suministrada para agitación y mezclado se realiza por expansión del gas inyectado y

no se introduce mediante energía cinética de un agitador. Por lo tanto se evitan cambios

morfológicos y metabólicos en las células de cultivo. Entre las configuraciones geométricas

más usadas en biotransformaciones, existen las de circulación interna y las de circulación

externa [6].

Reactores airlift de circulación interna: El cuerpo del reactor se divide en dos zonas, por

medio de un tubo concéntrico o bien por medio de una partición plana colocada en forma

vertical. En éstos reactores solamente una de las regiones se mantiene aireada y la otra

funciona exclusivamente como recirculación [6].

Reactores airlift con circulación externa: Consisten de dos columnas interconectadas en

donde la columna de diámetro mayor es la que se mantiene aireada y los líquidos se

recirculan por la columna más pequeña [6].

Los reactores airlift están comprendidos en cuatro zonas distintas, cada una de estas tiene

su propio patrón de flujo, el cual divide al reactor en dos regiones de flujo: flujo ascendente y

flujo descendente.

Las zonas o canales permiten una recirculación en macro escala del líquido alrededor del

circuito formado.

La primera zona en la que el gas es aspersado se conoce como la zona de ascenso, la

dispersión de gas en el líquido se da generalmente en dos fases en corriente paralela. Esta

sección, tiene la retención de gas más alta en el reactor y es en la que ocurre la mayor parte

de la transferencia de oxígeno.

El líquido que ingresa al domo de la columna entra en una zona de liberación de oxígeno

(zona II) que es un separador gas-líquido en el que algo o la mayoría del oxígeno dispersado

es eliminado.

El líquido libre de gas fluye entonces hacia la zona de descenso (III) y viaja hacia el fondo de

la columna (zona IV), en él cual completa el ciclo y reingresa a la zona de ascenso.

Page 30: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

13

Aunque el biorreactor Airlift presenta algunas de las características de las columnas de

burbujeo convencionales, la circulación del fluido en escala industrial lo diferencía de los

segundos. Esta circulación es un efecto causado por la retención fraccional de oxígeno en la

zona I y la zona III. Así mismo, esto crea una diferencia de presión hidrostática entre el fondo

de la zona I y el fondo de la zona III, que actúa como fuerza impulsora para el movimiento

del fluido (ver figura 2.3) [6].

Figura 2.3: Reactor airlift

Las ventajas principales de los biorreactores airlift con respecto a las columnas de burbujas,

son: mayores capacidades de transferencia de masa, mayores velocidades superficiales de

líquido y gas, y los patrones de flujo bien definidos que se obtienen en ellos, su construcción

es simple debido a que no tienen partes mecánicas móviles para llevar a cabo la agitación.

Otras de las ventajas que implica el uso de estos reactores son: existe un riesgo de

contaminación muy bajo debido a que se tiene un sellado hermético, y su orientación vertical

facilita su limpieza y esterilización, además de ser un reactor en el que se abaten los costos

por suministro de energía, ya que el aire cumple con las funciones de aireación y agitación.

En procesos biológicos, la principal ventaja de los reactores airlift sobre las columnas de

burbujeo y los tanques agitados se debe a que se produce un menor daño celular,

exhibiendo mayores velocidades de transferencias de masa y menores costos energéticos

[6].

Page 31: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

14

Desventajas: En la actualidad, los reactores airlift son menos utilizados que los tanques

agitados debido a que son menos flexibles a los requerimientos de cambios de proceso, por

lo que un reactor airlift es menos flexible en su aplicación a diferentes procesos, por ende,

con diferentes necesidades de transferencia de masa, velocidad del líquido, intensidades de

mezclado, etc. Características que se manejan perfectamente en un tanque agitado.

Actualmente la aplicación de los fermentadores airlift es limitada, aunque recientemente se

han hecho aplicaciones a escala piloto para cultivos celulares tales como diferentes

microorganismos. Se han utilizado biorreactores tipo Airlift con diversos volúmenes de

operación, para la obtención de diferentes productos como proteína unicelular, ácido cítrico.

Este tipo de reactores puede emplearse en casi cualquier tipo de fermentación,

principalmente en fermentaciones aerobias [6].

Se han hecho estudios sobre reactores airlift, principalmente en las siguientes áreas:

1. Cultivos celulares: Enfocado principalmente al estudio de la cinética de crecimiento del

microorganismo en cuestión.

2. Diseño: Se estudia principalmente el efecto producido por la utilización de diferentes

geometrías, y se han intentado descripciones y caracterizaciones de los patrones de

flujo en reactores airlift, así como del efecto de la composición de las corrientes de

entrada y de los aditamentos utilizados.

3. Hidrodinámica: Estudio de los patrones de flujo obtenidos, de ciertas variables que tienen

influencia sobre el comportamiento del reactor como la retención del gas, la velocidad de

circulación del líquido y del gas, y comparaciones de estos estudios realizados en

reactores de tubos concéntricos con reactores de circulación externa.

4. Transferencia de masa: Medición del coeficiente volumétrico de transferencia de masa

global, y obtención de algunas ecuaciones para predecirlo, se estudian los efectos de la

variación de temperatura, carga, etc. sobre el coeficiente de transferencia de masa

global.

5. Escalamiento: Estimación de datos experimentales de reactores airlift de diferentes

dimensiones, y comparación entre ellos.

6. Modelación y control: Se enfoca principalmente a la cinética de crecimiento de

microorganismos en los rectores [6].

Page 32: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

15

Antes de poder encontrar correlaciones universales de diseño y operación para reactores

airlift, es necesario obtener mayor información acerca de la influencia de las propiedades

existentes en las diferentes zonas del reactor, tales como: regímenes de flujo, transiciones

en los regímenes de flujo, desarrollo de ecuaciones y métodos de medición para la

obtención de coeficientes locales de transferencia de masa, entre los más importantes.

También existen carencias en la información disponible de datos experimentales para

transferencia de calor, dispersión de gas en el líquido, y mezclado.

Como se ha podido observar, el actual estado del arte sobre los biorreactores airlift, no

incluye aplicaciones generales de diseño, control y simulación de procesos en un reactor de

ésta clase. [6]

2.7 Escalamiento de biorreactores

El escalamiento involucra el estudio de los problemas asociados a transferir la información

obtenida en el laboratorio (ml) a escala de planta piloto (lt) y desde escala de planta piloto

(lt) a escala industrial (m3).

La selección del criterio de escalamiento dependerá de cuál es la variable más importante

para el crecimiento del microorganismo y para la producción de producto deseado, por

ejemplo:

• Fragilidad del m.o.

• Trasferencia de O2

Generalmente el escalamiento se hace en base de principios de semejanza entre 2

sistemas. Esta semejanza se refiere a similitud entre las 2 escalas. Dichas similitudes

pueden ser:

• Similitudes geométricas: Las razones entre las longitudes correspondientes

deben ser iguales en ambos sistemas.

• Similitudes cinemáticas: Las razones entre las velocidades en puntos

equivalentes deben ser iguales en ambos sistemas.

Page 33: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

16

• Similitudes dinámicas: Las razones entre las fuerzas en puntos equivalentes

deben ser iguales en ambos sistemas.

2.7.1 Criterios de escalamiento

1. Coeficiente de transferencia de oxígeno

Si lo más importante es mantener el nivel de transferencia de oxígeno en el cultivo, se debe

considerar este criterio.

Los pasos a seguir son:

a) Determinar kLa óptimo desde experimentos a nivel de piloto (kLa debe medirse o

estimarse)

b) Relacionar kLa con variables de diseño de la escala a la cual se desea escalar

(kLa) escala1 = (kLa) escala2

2. Potencia por unidad de volumen

Resulta el criterio clásico de escalamiento en Ing. Química, permite mantener el nivel de

agitación. Al momento de aplicarlo se debe tener cuidado de no sobrepasar los límites tanto

de esfuerzo de corte máximo y nivel de trasferencia de oxígeno mínima.

(Pg/V) escala1= (Pg/V) escala2

Dado que siempre se cumple que: Pg/V a N3 Di2, a partir de ello se puede deducir que

(Probarlo):

(N3 Di2) escala 1 = = (N3 Di

2) escala 2

3. Velocidad tangencial de agitación

Page 34: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

17

Permite mantener el nivel de agitación, esta variable deber ser simple evaluada dado que se

puede estar trabajando con microorganismos o micelas que no resistan esfuerzos de corte

mayores que los establecidos.

Al momento de escalar con otros criterios puede ocurrir que se sobrepasen los esfuerzos de

corte máximo aceptable, en ese caso debe prevalecer este criterio.

(N Di) escala 1 = = (N Di) escala 2

4. Mantención del número de Reynolds

Asegura un nivel de agitación adecuado, pero se deben tener en cuenta los mismos puntos

que para el criterio de potencia por unidad de volumen.

(N Di2 ρ/µ) escala1 = (N Di

2 ρ/µ) escala2

5. Velocidad de Bombeo de aire

Asegura una adecuada aireación del sistema, lo cual no asegura una adecuada transferencia

de oxígeno, por lo cual se debe verificar.

Siempre se cumple que la razón de bombeo es proporcional a la velocidad de agitación, F/V

N. Entonces al aplicar este criterio de escalamiento se cumple [23]:

(N) escala 1 = = (N) escala 2

2.8 Variables a medir y monitorear en el biorreactor

A continuación se describen las variables que intervienen en el proceso de degradación del

colorante naranja II en el biorreactor airlift.

Page 35: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

18

2.8.1 El pH

El pH es una medida utilizada por la ciencia, en particular la Química, para evaluar la acidez

o la alcalinidad de una solución. Ácido es toda sustancia que en solución acuosa libera

protones (ácido, según Arrhenius). Las sustancias alcalinas aportan el ión hidroxilo (OH-) al

medio. Por lo tanto, el pH es una medida de la acidez de una solución que depende de la

concentración de H+ [7].

Como cualquier medida, el pH posee una escala propia que indica con exactitud un valor.

La escala va de pH = 0 a pH= 14; el pH 7 es el que simboliza la neutralidad. Si el pH es < 7

la solución es considerada ácida; por el contrario, si el pH es > 7, la solución se considera

alcalina. Mientras más ácida la solución, más cerca del 0 estará; y mientras más básica o

alcalina el resultado se aproximará a 14 [7].

2.8.1.1 Electrodo de vidrio

El electrodo de vidrio (ver figura 2.4) actualmente constituye la pieza fundamental en la

medición electrométrica del pH. Junto con el electrodo de calomel, se encuentran

ampliamente difundidos y a la fecha no existe otro sistema para la medición electrométrica

que tenga la misma versatilidad y precisión. El principio bajo el cual trabaja el electrodo de

vidrio fue descubierto, en forma accidental por McInnes y Dole, cuando observaron que el

vidrio que empleaban en sus investigaciones mostraba cierta sensibilidad a las variaciones

de pH. Una vez hecho su descubrimiento, procedieron a investigar una composición más

adecuada de vidrio, que es la base de los electrodos empleados hoy día [8].

Figura 2.4: Electrodo de vidrio

Page 36: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

19

2.8.1.2 Funcionamiento del electrodo de pH

El método determina el pH midiendo el potencial generado (en milivolts) por un electrodo,

este potencial se compara contra un electrodo de referencia, que genera un potencial

constante e independiente del pH. El electrodo de referencia que se utiliza es el de calomel

saturado con cloruro de potasio, el cual sirve como puente salino que permite el paso de los

milivolts generados hacia al circuito de medición [8].

El sistema actual de medición de pH es, por excelencia, el electrodo combinado. Su nombre

deriva de la práctica inicial en que el electrodo sensor de (H+) estaba separado del electrodo

de referencia; la combinación de ambos en una sola estructura llevó a su nombre actual. Sin

embargo, la práctica industrial sigue utilizando electrodos de referencia y de pH separados,

porque permite señales más confiables y procedimientos de manutención que, en ciertos

casos, resultan más controlables y de menor costo [8].

De cualquier forma, la diferencia de potencial será dada por la ecuación de Nernst [9]:

Donde EH es el potencial (en voltios) detectado a través de la membrana de vidrio, E ref es el

potencial del electrodo de referencia, y (2.3 RT/NF) es el factor de Nernst, que depende de

la constante de los gases (R), la constante de Faraday (F), la carga del ión (Nión), que para el

pH vale 1, y la temperatura en grados Kelvin (T). El comportamiento del electrodo depende

de la temperatura. Por eso es importante que a la hora de calibrar el pH-metro siempre

esperemos a que las disoluciones patrón sacadas de la nevera se pongan a temperatura

ambiente.

Como a 25ºC el factor de Nernst vale aproximadamente 0,0591 y el potencial de referencia

se considera igual a cero, la ecuación de Nernst queda reducida a [9]:

Page 37: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

20

2.8.2 Temperatura

La temperatura es una medida del calor o energía térmica de las partículas en una sustancia.

En resumen, la temperatura es una medida de la energía media de las moléculas en una

sustancia y no depende del tamaño o tipo del objeto que las contenga [10].

2.8.2.1 Termopares

Cuando dos metales se unen, en la unión se produce una diferencia de potencial. Ésta

depende de los metales utilizados y la temperatura de la unión. Un termopar (ver figura 2.5)

es un circuito completo con dos uniones de este tipo. Si ambas uniones están a la misma

temperatura, no existe una fuerza electromotriz (fem) neta. En cambio, si la temperatura es

diferente, si se produce una fem. Por lo general una de las dos uniones se mantiene a 0ºC

[11].

Figura 2.5: Representación de un termopar

En la tabla 2.1 se muestran los termopares de uso más común, los intervalos de temperatura

en los que se usan y sus sensibilidades características. A estos termopares de uso común se

les asigna letras de referencia. Por ejemplo, el de hierro-constantán se conoce como

termopar tipo J [11].

Page 38: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

21

Tabla 2.1: Termopares de uso común.

Referencia Materiales Intervalo en ºC µV/ºC

B Rodio/platino, platino

30%, rodio 6%

0 a 1800 3

E Cromel/constantán -200 a 1000 63

J Hierro/constantán -200 a 900 53

K Cromel/alumel -200 a 1300 41

N Nirosil/nisil -200 a 1300 28

R Platino/platico con

13% rodio

0 a 1400 6

S Platino/platino con

10% rodio

0 a 1400 6

T Cobre/constantán -200 a 400 43

2.8.3 Absorbancia

Es una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una muestra líquida y la

concentración de la sustancia que absorbe la luz. La longitud de onda de la luz incidente y la

naturaleza de la sustancia que la absorbe guardan una dependencia estrecha. Si conocemos

l y α, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz

transmitida (ver figura 2.6) [12].

Figura 2.6: Demostración de la absorbancia

Page 39: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

22

Las unidades de c y α dependen del modo en que se exprese la concentración de la

sustancia absorbente. Si la sustancia es líquida, se suele expresar como una fracción molar.

Las unidades de α son la inversa de la longitud (por ejemplo cm-1). En el caso de los gases, c

puede ser expresada como densidad, en cuyo caso α es una sección representativa de la

absorción y tiene las unidades en longitud al cuadrado (cm2, por ejemplo) [12].

El valor del coeficiente de absorción α varía según los materiales absorbentes y con la

longitud de onda para cada material en particular. Se suele determinar experimentalmente

[12].

Esto se puede expresar de distintas maneras:

lcA lce

I

I 0

1 0

1logI

IA

k4

A es la absorbancia

I0 es la intensidad de la luz incidente

I1 es la intensidad de la luz una vez que ha atravesado el medio

l es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo

c es la concentración de sustancia absorbente en el medio

α es el coeficiente de absorción o la absorbancia molar de la sustancia

λ es la longitud de onda del haz de luz

k es el coeficiente de extinción

2.8.3.1 Espectrofotómetro

Instrumento que expone una muestra a una luz de longitudes de onda definidas y mide la

absorbancia. Distintos tipos de espectrofotómetros actúan en distintos márgenes de longitud

de onda, como el ultravioleta, el visible y el infrarrojo [13].

Page 40: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

23

2.8.3.2 Componentes de un espectrofotómetro

Fuente de luz: La misma ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de

estabilidad, direccionalidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las

fuentes empleadas son lámparas de tungsteno y lámpara de arco de xenón.

Monocromador: Para obtener luz monocromática, constituido por rendijas de entrada y

salida, colimadores y el elemento de dispersión. El monocromador aísla las radiaciones de

longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto [13].

Fotodetectores: en los instrumentos modernos se encuentran una seria de 16

fotodetectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda,

cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida y minimiza las partes móviles

del equipo [13].

2.8.3.3 Utilidad del espectrofotómetro

El espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de una

longitud de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es

absorbida (absorbancia) por dicha muestra. Esto permite al experimentador realizar dos

funciones.

1. Obtener información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos

lograrlo midiendo la absorbancia a distintas longitudes (ʎ) de onda y graficar estos

valores en función del largo de onda, formando un espectrograma.

2. Saber cuánta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra.

La concentración es proporcional a la absorbancia, según la ley de Beer-Lambert

(descrita en la parte de absorbancia); a mayor cantidad de moléculas presentes en la

muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones [13].

2.8.3.4 Fotorresistencia

Una fotorresistencia (ver figura 2.7) es un componente electrónico cuya resistencia

disminuye con el aumento de intensidad de luz incidente. Puede también ser llamado

Page 41: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

24

fotorresistor, fotoconductor, célula fotoeléctrica o resistor dependiente de la luz, cuyas siglas,

LDR, se originan de su nombre en inglés light-dependent resistor. Su cuerpo está formado

por una célula o celda y dos patillas.

El valor de resistencia eléctrica de un LDR es bajo cuando hay luz incidiendo en él (puede

descender hasta 50 ohms) y muy alto cuando está a oscuras (varios megaohmnios) [14].

Figura 2.7: Fotorresistencia

2.8.3.5 LED

Un diodo emisor de luz (ver figura 2.8), también conocido como LED (acrónimo del inglés de

light-emitting diode) es un dispositivo semiconductor (diodo) que emite luz incoherente de

espectro reducido cuando se polariza de forma directa la unión PN del mismo y circula por él

una corriente eléctrica. Este fenómeno es una forma de electroluminiscencia. El color,

depende del material semiconductor empleado en la construcción del diodo y puede variar

desde el ultravioleta, pasando por el visible, hasta el infrarrojo, (ver la tabla 2.2) [15].

Tabla 2.2: Compuestos empleados en la construcción de LED

Compuesto color Longitud de onda

Arseniuro de galio (GaAs) Infrarrojo 940 nm

Arseniuro de galio y aluminio (AlGaAS) Rojo e infrarrojo 890 nm

Arseniuro fosfuro de galio (GaAsP) Rojo, anaranjado y amarillo 630 nm

Fosfuro de galio (GaP) Verde 555 nm

Nitruro de galio (GaN) Verde 525 nm

Seleniuro de zinc (ZnSe) Azul

Nitruro de galio e indio (InGaN) Azul 450 nm

Carburo de silicio (SiC) Azul 480 nm

Diamante (C) Ultravioleta

Silicio (Si) En desarrollo

Page 42: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 2 Marco teórico

25

Figura 2.8: LEDs

Page 43: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 3

DEGRADACIÓN BIOLÓGICA DEL COLORANTE NARANJA II

Page 44: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

27

En este capítulo se presenta, la metodología utilizada para la producción de biomasa de los

organismos utilizados, las condiciones de trabajo y resultados obtenidos en la decoloración

biológica del colorante Naranja II en matraces de 125 ml y en reactores de tipo Airlift de 300

3.1 Preparación de inóculo en medio sólido

Se utilizaron las cepas Trametes versicolor y Pleurotus ostreatus.

Para preparar el inóculo los hongos fueron crecidos en cajas Petri en un medio con PDA

(papa-dextrosa-agar) con una concentración de 39g/l. El medio PDA fue esterilizado a 121°C

y 15 psi por 20 minutos en una autoclave. Posteriormente se inoculó aproximadamente 0.5

cm2 del hongo crecido en medio sólido, se incubó a 25 ºC en oscuridad durante 8 días. (ver

figura 3.1).

Figura 3.1: Crecimiento del hongo, en medio solido

3.2 Preparación del medio líquido para la inoculación del hongo

El medio líquido para el crecimiento de P. ostreatus y T. versicolor se realizó con una

solución buffer de fosfatos (NaH2PO4 como ácido y Na2HPO4) 60 mM, a un pH 6.0 y como

fuente de carbono se utilizo cereal molido (hojuelas de salvado) al 1%. Esto se realiza en

matraces Erlenmeyer de 500 ml. con un volumen total de 100 ml.

Page 45: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

28

Los matraces con el medio se esterilizan a una temperatura de 121°C y 15 psi por 20

minutos en una autoclave. Pasado el tiempo de esterilización se inocula 0.5 mm de micelio el

cual es molido (ver figura 3.2) durante 10 segundos con buffer pH 6 y se coloca en el medio

líquido.

Figura 3.2: Fragmentos de micelio para ser molido

3.3 Inoculación

Se vierten 2 mililitros de preinóculo en los matraces, cada uno con 100 mililitros (previamente

esterilizados) de buffer pH 6, a 60 mM al 1% de la fuente de lignocelulosa. Se toma una

muestra cada 12 horas para medir su actividad enzimática en el espectrofotómetro con el fin

de identificar su fase exponencial para poder inmovilizar al micelio puesto que es la

producción óptima de lacasa.

3.4 Inmovilización del hongo

Para la inmovilización se necesita alginato, las proporciones son de 1 gramo por 100

mililitros de agua destilada, el alginato se va agregando poco a poco en el agua, el agua de

preferencia debe de estar tibia al incorporarse y se deja homogenizar. Cuando esté listo el

alginato se vacía la biomasa, dejando que se mezcle por un tiempo (ver figura 3.3).

Page 46: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

29

Figura 3.3: Solución de alginato y biomasa

Para preparar cloruro de calcio 0.2 Molar, se agregan 22.2 gramos de cloruro de calcio a un

litro de agua destilada, se homogeniza la solución y se almacena a 4°C. (Siempre debe

permanecer frío). Cuando se vaya a inmovilizar se mantendrá en agitación esta solución

durante todo el proceso.

Cuando se tiene todo esto, se conecta una bomba peristáltica por donde circula el alginato

con la biomasa (ver figura 3.4). Se fija una velocidad en la bomba para que el alginato con la

biomasa caiga gota a gota en el carbonato de calcio (ver figura 3.5), para formar las

pelotitas con un diámetro aproximado de 0.4- 0.5 cm., se deja en el cloruro de calcio durante

60 minutos, una vez terminado el tiempo se tamiza y se lava con buffer p H 6.

Figura 3.4: Inmovilización del hongo

Page 47: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

30

Figura 3.5: Caída de la biomasa en el carbonato de calcio

3.5 Preparación de buffer pH = 6

Se realizaron los cálculos necesarios para la utilización de un buffer de fosfato de pH = 6, los

cuales son los siguientes:

Para el ácido se tiene la siguiente relación:

NaH2PO4 = 23+2+31+64 = 120gM

Para la base se tiene la siguiente relación:

Na2HPO4 = 46+1+31+64 = 142 gM

Page 48: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

31

3.6 Colorante Naranja II

El uso de este colorante y de otros se ha incrementado debido a su bajo costo de producción

y su alta estabilidad química (a la luz, temperatura, detergentes y ataque microbiano).

Los colorantes más utilizados en la industria textil so los azo. El grupo azo está unido por un

lado núcleo aromático o heterocíclico, y por otro lado puede estar unido a una molécula

insaturada de tipo carboxilo, heterocíclico o alifático (ver figura 3.6)

Figura 3.6: Estructura química del colorante naranja II. En la figura se presenta el espectro de absorción del colorante al inicio y al final de la

degradación. Donde se puede observar que la longitud de onda dominante es a 450 nm, y

esa misma longitud es la que se mantiene en todo el experimento de degradación (ver figura

3.7).

Page 49: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

32

Figura 3.7: Espectro de la desaparicion del colorante Naranja II con T.v libre.

3.7 Biodegradación del colorante Naranja II en matraces

Los experimentos fueron realizados en matraces de 125 ml con un medio de buffer de

fosfatos pH 6 y el colorante naranja II a 25 ppm, en un volumen final de 20ml. La biomasa

utilizada fue del 10% para ambas condiciones (en forma libre e inmovilizada).

Las condiciones de la biodegradación fueron las siguientes: agitación constante 150 rpm

(agitadora orbital) a temperatura ambiente durante 48 horas de incubación. Se midió la

decoloración en un espectrofotómetro (marca beckman) a una longitud de onda de 450nm.

Los resultados se presentan en la figura 3.8 donde se observa la evolución de la absorbancia

del hongo Trametes versicolor (T.v.) libre e inmovilizado, así como del Pleurotus Ostreatus

(P.o.) libre e inmovilizado.

Se aprecia que el hongo T.v libre tiene una mayor disminución de la absorbancia, por

consiguiente una decoloración mayor del colorante Naranja II, no sucediendo lo mismo con

el hongo P.o que no alcanza los mismos valores de absorbancia que el T.v, por lo tanto tiene

una menor degradación.

En la figura 3.9 se presenta el resultado de la prueba realizada con T.v y P.o con biomasa

libre, en las mismas condiciones antes descritas. Donde se observa un mejor funcionamiento

del hongo T.v para la degradación del colorante Naranja II en 3.5 horas de funcionamiento.

Page 50: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

33

Figura 3.8: Evolución de la absorbancia con el hongo T.v y el P.o libre e inmovilizado. .

Figura 3.9: Evolución de la absorbancia con el hongo T.v y P.o libre

Page 51: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 3 Degradación biológica del colorante Naranja II

34

3.8 Biodegradación del colorante Naranja II en un biorreactor

En el experimento en el biorreactor no se presentan datos de absorbancia debido a que el

medio se contaminó, accidentalmente, ya que el micelio inmovilizado no se lavó antes de

introducirlo al biorreactor, y por lo tanto se contaminó con calcio que se utiliza para la

inmovilización. Es por esto que el colorante se observa turbio (ver figura 3.10).

Figura 3.10: Funcionamiento del birreactor

3.9 Conclusiones experimentación con el hongo

Se puede concluir que el hongo T.v. degrada mejor el colorante Naranja II a 25ppm y esto lo

realiza mejor en forma libre, ya que al inmovilizarlo reduce su actividad. Otro problema al

inmovilizar es el calcio que se queda en las perlitas de alginato y que puede contaminar el

efluente. Por lo que para experimentos posteriores con el biorreactor no se realizarán con

biomasa inmovilizada.

Page 52: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 4 DISEÑO FÍSICO

Page 53: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

36

En este capítulo se presenta el diseño y construcción de los elementos que integran el

prototipo para el tratamiento biológico de colorantes, éstos son:

Dimensionamiento y construcción del biorreactor

Soporte del biorreactor

El módulo electrónico

También se presenta la programación del microcontrolador y de la interfaz gráfica.

4.1 Dimensionamiento y construcción del biorreactor

Para este trabajo se decidió utilizar un reactor airlift para evitar el daño a las células y a las

perlitas de alginato, ya que la agitación se realiza con aire. Y para favorecer la transferencia

de oxígeno, la cual es determinante en los procesos biológicos.

Mucha información relacionada con la construcción de biorreactores tipo airlift tiene origen

empírico, de tal manera que se han recomendado algunas relaciones geométricas que

optimizan el tiempo de mezclado y la transferencia de masa en el fermentador [6].

Es necesario determinar la escala de operación (V) o bien el diámetro del equipo para

calcular el volumen total.

Vop= 0.7 VT__________________________ (1)

Se debe obtener el volumen de tapas de la siguiente manera:

Vt= Dd3/24 para tapas elipsoidales________________________ (2)

Vt= Dd3/12 para tapas hemisféricas_______________________ (3)

Vt= 0 para tapas planas____________________________ (4)

El volumen total se obtiene también de la suma del volumen del cilindro más el volumen de

tapas.

Page 54: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

37

VT= Vc + Vt ____________________________________________________ (5)

Mientras que el volumen del cilindro se calcula por medio de la ecuación:

Vc= HT Dd2/4 __________________________________________________ (6)

La altura total del biorreactor es la suma de HT y Dd.

H= HT + Dd ______________________________________________ (9)

Y la altura del líquido está dada por:

____________________________________________________________________ (10)

El diámetro del tubo interno se recomienda tomarlo como:

Dr= 0.6Dd______________________________________________________ (11)

Para fines de diseño del prototipo a escala piloto, se considera únicamente el escalamiento

por volumen, ya que en los experimentos a escala de laboratorio no se hicieron

consideraciones de: transferencia de oxígeno, Número de Reynolds, velocidad de bombeo

de aire, etc.

Por lo tanto, como los experimentos previos fueron con biorreactores airlift de 0.3 litros, se

propuso escalar 10 veces ese volumen para tener un biorreactor final de 3 litros. Teniendo

en consideración este volumen, se continúa con el cálculo de las dimensiones con las

fórmulas mencionadas anteriormente.

Como ya se conoce el volumen de operación que es de 3 litros o 0.003 m3 entonces se tiene:

Vop= 0.003m3

Page 55: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

38

Despejando VT de la ecuación (1), se obtiene el volumen total del reactor

Para el volumen de tapas (Vt) se toma la ecuación (3) para tapas hemisféricas. Se propone

un diámetro de biorreactor (Dd) que se pueda encontrar de manera comercial, en este caso

se propone el diámetro de 0.1m3.

Para calcular el volumen del cilindro exterior (Vc) se despeja Vc de la ecuación (5).

Vc = VT - Vt =0.004286m3 – 0.000262m3 = 0.004024m3

De la ecuación (6) se despeja HT que es la altura del cilindro exterior.

La altura total del biorreactor se calcula con la ecuación (9):

H= HT + Dd= 0.5123+0.1=0.6123 m

La altura máxima del líquido se calcula con la ecuación (10)

El diámetro del tubo interno se calcula con la fórmula (11).

Dr = 0.6Dd = 0.6 (0.1) = 0.06m

Page 56: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

39

Una vez que se tienen las dimensiones del reactor para un volumen de 3 litros, se construyó

el reactor en tubería de PVC hidráulico (ver figura 4.1) ya que este es más económico que

otros materiales existentes como el acero inoxidable, el acrílico y el vidrio; además es muy

fácil de conseguir. No se utiliza PVC sanitario ya que tiene paredes muy delgadas, la ventaja

de éste es que es más barato que el PVC hidráulico (ver los planos en el Apéndice A).

Figura 4.1: Biorreactor

Para introducir el oxígeno al biorreactor se utilizaron dos piedras difusoras para acuario, una

al interior del biorreactor como se muestra en la figura 4.2 y otra afuera del biorreactor en la

manguera de entrada de aire como se ve en la figura 4.3, al colocar estos dos difusores se

obtiene una burbuja como se muestra en la figura 4.4.

Figura 4.2: Difusor de aire interno Figura 4.3: Difusor de aire externo

Page 57: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

40

Figura 4.4: Tamaño de burbuja biorreactor

4.1.1 Soporte para el biorreactor

Para sujetar el reactor se diseñó y construyó una estructura de cuadrado de fierro, montado

sobre una lámina de fierro (ver figura 4.5). Esta estructura sujeta al biorreactor por medio de

seis tornillos que se ajustan al diámetro del mismo. Debido a su diseño se pueden sostener

biorreactores de distintos diámetros de hasta 150 milímetros (ver planos en el Apéndice A).

Page 58: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

41

Figura 4.5: Estructura para el biorreactor

4.2 Módulo electrónico

Consiste en una tarjeta electrónica (ver figura 4.6) para la adquisición de datos de los

sensores de temperatura, absorbancia y pH; para el control de movimiento del motor de

pasos unipolar, para el encendido de los LEDs, así como para la comunicación serial con la

computadora. Ésta tarjeta es puesta dentro de un gabinete de color negro con dimensiones

22.3 x 14 x 9.2cm, que cuenta por la parte de afuera con 2 conectores BNC hembra, uno

para el sensor de temperatura (termopar) y el otro para el sensor de pH (electrodo de vidrio),

dos conectores jack banana para la fotorresistencia y tres conectores hembra DB9 (ver figura

4.7).

Page 59: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

42

Figura 4.6: Tarjeta electrónica del biorreactor

Figura 4.7: Módulo electrónico

El circuito y el PCB de la tarjeta se diseñaron en PROTEL 2004 y ésta última se mandó a

fabricar en fibra de vidrio con doble cara y acabado en estaño.

La adquisición de estas señales se hace por medio del microcontrolador PIC16F877A [16] de

la empresa de microchip. La resolución proporcionada por es ADC del PIC16F877A a 10 bits

es función de la tensión de referencia Vref, de acuerdo con la fórmula siguiente:

Page 60: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

43

bit

mV

bit

mVVV refref88.4

1023

05000

1023Resolución

Por tanto, a la entrada analógica de 0 V le corresponde una digital de 00 0000 0000 y para la

de 5 V una de 11 1111 1111.

Para alimentar esta tarjeta se utiliza una fuente de poder simétrica de 12V, -12V, 5V, -5V.

Los detalles de esta tarjeta se discuten en el Apéndice B.

4.3 Medidor de absorbancia

Los espectrofotómetros están compuestos básicamente por un emisor de luz, un

monocromador y un detector. Y sirven para medir la cantidad de luz absorbida por una

muestra, él haz debe ser a cierta longitud de onda, dependiendo del tipo de colorante

predominante en la muestra.

Para el medidor propuesto se utiliza el diodo emisor de luz (LED) como emisor de luz y como

monocromador y una fotorresistencia como detector.

4.3.1 Sensor de absorbancia

El sensor de absorbancia está compuesto por una fotorresistencia de 1MΩ, que es el

elemento receptor sensible a la luz. Este dispositivo varia su resistencia de forma

logarítmica, por lo tanto, para acondicionar la respuesta de este sensor a los cambios de

intensidad luminosa y que puedan ser leídos por el Microcontrolador, se utiliza el circuito

diferencial en modo común con el amplificador operacional LM741. Este circuito linealiza la

respuesta de la fotorresistencia, dando a la salida un voltaje lineal con la variación de la

resistencia. (ver Apéndice B) [17].

4.3.2 Rueda de LEDS

La rueda de LEDs contiene 8 elementos emisores de luz (LEDs), cada uno con diferente

longitud de onda emitida dependiendo del dopado del material y por consiguiente él color de

Page 61: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

44

luz. Los LEDs son encendidos por el Microcontrolador dependiendo de la longitud de onda

que se requiera. En la tabla 4.1 se muestran las longitudes de onda de los LEDs utilizados.

Tabla 4.1: Longitudes de onda de LEDs

color Longitud de onda (nm)

Naranja 605

Verde 565

Azul ultra brillante 470

Rojo ultra brillante 625

violeta 420

Amarillo claro 585

Amarillo difuso 590

Para mover y posicionar la rueda se utiliza un motor de pasos unipolar. Sus movimientos son

controlados por el Microcontrolador que proporciona los movimientos (pasos) necesarios que

debe efectuar el motor para posicionar cada LED, de forma que quede alineado con la

fotorresistencia (ver figura 4.8), y se puedan efectuar las mediciones correspondientes de la

absorbancia.

Figura 4.8: Alineación del LED con la fotorresistencia

Page 62: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

45

4.3.3 Bomba de recirculación

Con el fin de poder recircular agua del biorreactor al medidor de absorbancia se utiliza una

bomba de lavadora marca ASKOLL, con alimentación de 127 volts de corriente alterna y un

consumo de corriente de 0.83 amperes, a esta bomba se le adaptaron 2 reducciones de ½” x

¼” y dos espigas de ¼” (ver figura 4.9).

Figura 4.9: bomba de recirculación

4.3.4 Integración de los elementos del medidor de absorbancia

El sensor y la rueda se montan sobre una caja cerrada de metal de color negro mate, esto

para evitar ruido en la medición por reflejo de luz (ver figura 4.10). La caja se perfora de la

parte superior e inferior, para permitir la circulación del fluido con colorante, para esto se

utiliza un tubo especial de vidrio (celda) para evitar la difracción de la luz. Éste pasa

solamente en la parte donde es atravesado el haz del emisor, es decir por la parte central de

donde se encuentran alineados el emisor (LED) y el receptor (fotorresistencia) (ver la figura

4.11), y poder hacer la medición correspondiente de la absorbancia.

La caja cuenta en la parte frontal con tres conectores de salida que son:

Page 63: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

46

Fotorresistencia

Motor de pasos

Rueda de LEDs

Estos se deben conectar al módulo electrónico.

Figura 4.10: Caja sensor de absorbancia Figura 4.11: Alineación del tubo

La bomba está conectada para tener una recirculación como se muestra en la figura 4.12 y

así no tener flujo estático en la parte del medidor de absorbancia, ya que si no existiera

recirculación siempre se estaría midiendo el mismo valor de absorbancia.

El diseño de los elementos de medición de la absorbancia y la recirculación de fluido es un

diseño nuestro cuyos principales objetivos fueron; la precisión necesaria para detectar

pequeñas variaciones en la concentración del colorante y un costo bajo con respecto al de

un espectrofotómetro, así como la posibilidad de hacer mediciones de absorbancia en forma

continua y sin desperdicio de muestras, ya que estas se recirculan al biorreactor.

Esta parte del trabajo de tesis, sin duda es una de las mayores contribuciones.

Page 64: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

47

Figura 4.12: Circulación de flujo en el medidor de absorbancia

4.4 Medidor de temperatura

Para medir esta magnitud física se utiliza un termopar tipo K. Para el acondicionamiento de

la señal se utiliza el circuito integrado de Analog Devices (AD594), específico para

termopares. Éste contiene un amplificador de instrumentación y el circuito de compensación

de punta fría para un termopar tipo J, aunque se puede calibrar para otros tipos de

termopares como es el caso (ver Apéndice B) [18].

Algunas características acerca de este sistema de medida son [18]:

El circuito está calibrado a una temperatura de 25 ºC para un termopar tipo J.

A la temperatura de 25 ºC la sensibilidad del termopar es 51,08 μV/ºC.

A la temperatura de 25 ºC la ganancia del amplificador de instrumentación es 193,34.

A la temperatura de 25 ºC la tensión que el circuito entrega a su salida es de ˜ 10

mV/ºC (51,08 μV/ºC · 193,34).

Page 65: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

48

El circuito integrado introduce un offset en la salida del amplificador de 16 μV, por

tanto, la tensión exacta de salida para 25 ºC es:

AD594output = (Vtermopar + 16 μV) · 193,34

La tensión del termopar tipo J será por tanto:

Vtermopar = (AD594output / 193,34) – 16 μV

La salida del AD594 es conectada a la entrada AN0 del Convertidor Analógico Digital (ADC)

del microcontrolador PIC16f877A, donde se envía el dato digital de forma serial, por medio

de un programa realizado en LabVIEW 8.2, este dato es recibido y se transforma en una

salida de temperatura que el usuario puede visualizar en el panel frontal.

4.5 Medidor de pH

Para la medición de pH se utiliza un electrodo 405 DPAS-SC-K8S/325 (ver figura 4.13) de

mettler Toledo. El rango de medición de este electrodo es de 0 a 12 unidades de pH.

La manera más exacta para la medición del pH, es utilizando un medidor de pH con

electrodo combinado de vidrio. El pHmetro mide la diferencia de potencial entre el electrodo

de referencia (Ag+/AgCl) y el de cristal que es sensible a los iones de hidrógeno.

Para obtener con exactitud el pH de una solución, se debe calibrar el pHmetro con

soluciones llamadas buffer o tampones que mantienen casi invariable el pH de una solución

cuando a ésta se le agrega ácido o base o la solución se diluye. Las soluciones tampones se

pueden preparar con un valor de pH bien definido, y que pueda ser leída por el

microcontrolador. Se utilizaron amplificadores operacionales para construir el pHmetro (ver

Apéndice B) [7].

Page 66: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

49

Figura 4.13: Electrodo de pH

4.6 Programación microcontrolador

El programa del microcontrolador se realizó en lenguaje BASIC [20], con ayuda del programa

MicroCode Studio [21]. El programa cuenta con 4 subprogramas que son:

Absorbancia

ADC

Válvulas_cerradas

Bomba

El primer subprograma sirve para el control de movimiento y posicionamiento del motor de

pasos, para cada longitud de onda; el segundo sirve para accionar el convertidor analógico

digital (ADC) del microcontrolador y enviar por el puerto serie los datos a la computadora, el

tercero sirve para accionar las válvulas solenoides (Esta subrutina quedó para una

modificación a futuro del biorreactor), y el último subprograma sirve para encender y apagar

la bomba de recirculación del medidor de absorbancia.

Page 67: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

50

4.7 Programación interfaz gráfica

Esta interfaz gráfica se realizó en LabView 8.2, y sirve para la comunicación entre el

microcontrolador y la computadora.

La comunicación que se utiliza es serial asíncrona con dato invertido, es decir que un 1

lógico vale 0 Volts, y un 0 lógico vale 5 Volts.

El programa cuenta con tres etiquetas que son:

Monitoreo de sensores

Posición longitud de onda

Accionamiento de válvulas

4.7.1 Monitoreo de sensores

Adquiere, almacena y visualiza numéricamente y gráficamente los valores de las 4 entradas

del ADC del microcontrolador (ver figura 4.14).

Esta etiqueta cuenta con 7 partes principales que son:

Configuración del puerto serie

Almacenamiento de datos

Intervalo de almacenamiento de datos

Visualización

Calibración de sensores

Longitud de onda

Encendido bomba

4.7.2 Configuración del puerto serie

Se configura la transmisión del puerto serie, para esta aplicación se configura de la siguiente

manera:

Page 68: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

51

Velocidad de transmisión: 9600 bits/s

Bits de datos: 8 bits

Paridad: ninguna

Bits de parada: uno

Control de flujo: ninguno

Retardo de lectura: 250 milisegundos

4.7.3 Almacenamiento de datos

En esta parte se configura el almacenamiento de datos como sigue:

Nombre de archivo: Se introduce el nombre con el que el usuario desea almacenar sus

datos.

Extensión: Sirve para diferenciar el tipo de archivo almacenado, se puede utilizar extensión

.dat, .xls, y .txt.

Indicador de archivo: Muestra el nombre del archivo al ejecutarse el almacenamiento de

datos.

Un ejemplo del archivo generado se muestra en el Apéndice E.

4.7.4 Intervalo de almacenamiento de datos

Controla el tiempo y ejecución para el almacenamiento de datos de los sensores, y cuenta

con las siguientes etiquetas de configuración:

Tiempo de trabajo: Es el tiempo que permanecerá en ejecución el programa, de acuerdo a

lo requerido por el usuario.

Intervalo de almacenamiento: Es cada qué intervalo de tiempo se llevará a cabo el

almacenamiento de datos, éste irá cambiando conforme se cumpla el tiempo transcurrido del

guardado de datos (por ejemplo si el usuario pone un intervalo de 10 minutos, se

almacenarán datos cada 10 minutos y se irá incrementando el intervalo a 20 minutos, 30, 40,

etc.).

Page 69: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

52

Tiempo de almacenamiento de datos: Es el tiempo que se mantendrán guardando los

datos en disco duro (por ejemplo si el intervalo de almacenamiento fue de 10 minutos y el

tiempo de almacenamiento de 5 minutos, entonces empezará a almacenar los datos cuando

hayan transcurrido 10 minutos y terminará de almacenar los datos a los 15 minutos).

Se iluminará un indicador en el panel frontal del programa en color verde cuando se active

esta función.

4.7.5 Visualización

Es donde se observa el estado de las 4 entradas del ADC del microcontrolador tanto

gráficamente como numéricamente.

4.7.6 Calibración de sensores

Sirve para introducir lo valores de pendiente e intersección de calibración de los sensores de

Temperatura, pH y adicionalmente se dejo para el sensor de oxígeno disuelto.

4.7.7 Longitud de onda

Para escoger la longitud de onda que se va a utilizar en ese momento. Presionar el botón en

la longitud de onda, este cambiara a color verde cuando esté activo.

4.7.8 Encendido bomba

Cuenta con dos variables “Resta bomba” y Tiempo encendido bomba y un indicador

“Tiempo”.

Resta bomba: El valor de esta variable se resta al valor de la variable intervalo de

almacenamiento, dando como resultado el tiempo en el que se encenderá la bomba.

Tiempo encendido bomba: Es el tiempo que se mantendrá encendida la bomba.

Tiempo: Muestra el tiempo en el que se encenderá la bomba.

Page 70: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

53

4.7.9 Herramientas adicionales

El programa también cuenta con un indicador de tiempo transcurrido, un botón de paro de

emergencia, indicador de buffer de lectura y bytes leídos, un botón para activar o desactivar

el ADC del microcontrolador, un botón para pasar a la etiqueta posición de longitud de onda,

así como un control de buffer de escritura para mandar datos al microcontrolador.

Figura 4.14: Etiqueta monitoreo de sensores

4.8 Posición longitud de onda

Posiciona una longitud de onda determinada, por medio del control del motor de pasos. El

control del motor se realiza por medio de un carácter que es enviado desde la computadora

hasta el PIC, éste lee el carácter y ejecuta una sub-rutina, para posicionar la longitud de

onda escogida por el usuario (ver figura 4.15). El programa cuenta con 16 botones para

activar y desactivar los elementos de generación de longitud de onda (LEDs) para la

Page 71: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 4 Diseño Físico

54

medición de absorbancia, un botón para encender la medición de absorbancia y con un

botón de paro de emergencia.

Figura 4.15: Etiqueta Posición longitud de onda

4.9 Accionamiento de válvulas

Sirve para abrir o cerrar dos válvulas solenoides, cuenta con dos interruptores, dos

indicadores, botón de paro y un botón para regresar al menú principal del microcontrolador

(ver figura 4.16).

Figura 4.16: Accionamiento de válvula

Page 72: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 5 CALIBRACIÓN DE SENSORES

Page 73: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

56

En este capítulo se describe, cómo se llevó a cabo la calibración de los sensores de

temperatura, pH y absorbancia.

5.1 Sensor de temperatura

Para calibrar el circuito de temperatura se utilizó:

Vaso de precipitados

Agua

Termómetro de mercurio

Hielo

Primero se introduce el termopar y el termómetro de mercurio (éste servirá de referencia de

temperatura) a un vaso con agua fría, ésta se enfrió con hielo hasta llegar a los 0 ºC, una vez

que se tienen los 0 ºC se ejecuta el programa y se lee el voltaje generado por el termopar y

el AD594 a esa temperatura, después se calienta el agua a 5 ºC y se vuelve a leer el voltaje

generado, este proceso se repite hasta llegar a los 100 ºC. El aumento de temperatura se

realiza cada 5 ºC, es decir 5, 10, 15, 20, etc. Hasta llegar a los 100 ºC, en la figura 5.1 se

muestra la gráfica del voltaje generado contra temperatura.

Figura 5.1: Respuesta del termopar

Page 74: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

57

Si se toman todos estos puntos de muestra y se aplica un método numérico de aproximación

(regresión lineal de mínimos cuadrados), se llega a una sola ecuación aproximada que

caracteriza el comportamiento del sistema formado por el termopar más el AD594 (ver figura

5.2).Como los puntos discretos siguen más o menos un comportamiento lineal, es por eso

que mediante una regresión lineal es suficiente para calibrar el termopar con el AD594.

Figura 5.2: Regresión lineal termopar

La ecuación aproximada que caracteriza el comportamiento del sistema formado por el

termopar más el AD594: recta especificada por la ecuación siguiente

Temp = 0.12904*VAD594 -7.63732

Donde:

Temp: Temperatura que se desea medir (ºC)

VAD594 = Tensión de salida del AD594

En la tabla 5.1 se muestran los valores obtenidos de la calibración del termopar más el

AD594.

Page 75: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

58

Tabla 4.1: Calibración termopar más AD594

Termopar

offset 7.63732

Grado de calibración 0.12904

error 0.001

Desviación estándar de la forma 0.7369

Coeficiente de correlación 0.999

5.2 Sensor de pH

Para calibrar el sensor se utilizan dos soluciones patrón, una de pH = 4 y otra de pH = 7, ya

que la solución a medir tiene un pH = 6.

Primero se introduce el sensor de pH en la solución de valor de pH = 4 y se deja un tiempo

para su estabilización, después se toma el valor de voltaje generado. En seguida se

introduce el sensor en la solución de pH = 7 de igual forma se deja que se estabilice y se

toma el valor de voltaje generado (ver figura 5.3), como la calibración se realiza por medio de

software y no de hardware, las soluciones patrón se pueden medir de forma indistinta ya sea

primero la solución de pH = 4 o la de pH = 7.

Figura 5.3: Calibración de pH

Page 76: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

59

En la figura 5.4 se muestra la regresión lineal de estos valores de voltaje obtenidos.

Figura 5.4: Regresión lineal del pH

Debido a que el sensor de pH tiene un desgaste por uso y por antigüedad se debe hacer

esto cada vez que se vaya a utilizar el sensor.

Para esta calibración dio la siguiente ecuación:

pH = -60*voltaje_electrodo + 232.9

Donde:

pH: es el pH que se desea medir

Voltaje_electrodo: Es el voltaje generado por el electrodo y que es acoplado por los

amplificadores operacionales.

Page 77: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

60

5.3 Sensor de absorbancia

Para la calibración del medidor de absorbancia, primero se buscan colorantes que tengan

una longitud de onda igual o cercana a la longitud de onda de los LEDS (ver tabla 4.1), para

ello se preparan concentraciones de 100 ppm de cada colorante a analizar, y en seguida se

hacen diluciones a 20ppm, éstas se introducen en un espectrofotómetro para hacer un

barrido en el espectro visible y así encontrar la longitud de onda dominante de cada

colorante. Y poder hacer comparaciones con las longitudes de onda de los LEDS.

Cuando se tienen los colorantes deseados (ver tabla 5.2), se hacen más diluciones a partir

de las concentraciones de 100ppm, estas diluciones son de 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 35ppm.

Tabla 5.2: Longitud de onda de colorantes

color Longitud de onda (nm)

Amarillo vegetal 420

Naranja II 450

Gris 560

Verde oscuro 600

Azul 620

Las concentraciones de cada colorante se introducen una por una en el espectrofotómetro,

para contar con un patrón exacto de medida, y para determinar la absorbancia de cada

dilución (las lecturas se realizan por triplicado). De los resultados de absorbancia se calcula

la media y la desviación estándar, y con la media se realiza una regresión lineal.

Con las mismas concentraciones se realiza el mismo paso anterior, pero con el medidor de

absorbancia construido y se toman los valores de voltaje obtenidos con cada dilución. Los

valores son graficados y se obtiene una regresión lineal. Para obtener una curva de

calibración se utilizó la regresión lineal del espectrofotómetro y del medidor de absorbancia,

para tener una relación absorbancia-voltaje [19].

Page 78: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

61

A continuación se presenta la gráfica de calibración para la longitud de onda de 450nm, con

el medidor de absorbancia (figura 5.5) y con el espectrofotómetro (figura 5.6). Para ello se

utilizó el color naranja II.

Se puede observar que en el cambio de 10 a 20 ppm, corresponde un incremento

proporcional de 10 milivolts. Este pequeño incremento esta dentro de la resolución del ADC

del microcontrolador que es de 4.88 milivolts.

Figura 5.5: Gráfica medidor de absorbancia.

La regresión lineal del voltaje contra la concentración, del medidor de absorbancia es la

siguiente:

V = 0.00102*C + 4.55249

Page 79: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 5 Calibración de sensores

62

Figura 5.6: Gráfica del espectrofotómetro.

La regresión lineal de la absorbancia contra la concentración del espectrofotómetro, es la

siguiente:

A = 0.03706*C + 0.05551

Despejando concentración de la ecuación del medidor de absorbancia se tiene:

Y sustituyendo la concentración en la ecuación del espectrofotómetro, se tiene lo siguiente:

Esta ecuación se introduce en el programa de la interfaz gráfica, para que el usuario

seleccione la ecuación correspondiente a la longitud de onda de trabajo. Las calibraciones

correspondientes a las longitudes de onda de la tabla 3 se pueden revisar en el Apéndice C.

Page 80: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 6

PRUEBAS Y RESULTADOS

Page 81: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

64

En este capítulo se presentan las pruebas realizadas en el biorreactor, así como los

resultados obtenidos de las mismas.

6.1 Prueba mecánica del biorreactor (decoloración)

Esta prueba se realizó con colorante Naranja II con una concentración de 25 ppm en 3 litros

de agua con buffer de pH = 6, con 2.5% de biomasa libre del hongo Trametes versicolor.

Se midió la decoloración por 10 horas, sacando muestra cada hora y midiendo la

absorbancia con el espectrofotómetro del CEIB a 450nm. Debido que pasaba mucha

biomasa al medidor de absorbancia del biorreactor. Las muestras fueron centrifugadas y no

centrifugadas.

Los resultados obtenidos de la evolución de la degradación del colorante naranja II se

presentan en la figura 6.1, donde se obtuvo un valor de absorbancia de 1.05 al inicio y uno

de 0.55 al final de la prueba. Se puede observar que la mayor degradación se alcanza

durante las primeras 3 horas.

Existe un pequeño desfasamiento entre la muestra centrifugada y no centrifugada, debido a

las pequeñas partículas de biomasa que se encuentran en el fluido.

Figura 6.1: Degradación biológica del colorante Naranja II

Page 82: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

65

6.2 Prueba biorreactor y sensores

La prueba se realizó utilizando 3 L de colorante artificial, con el colorante Naranja II a pH = 6

y temperatura ambiente. Para evaluar los sensores de temperatura, pH y absorbancia. Se

utilizaron concentraciones de 10 ppm hasta llegar a las 100 ppm. Se utiliza el LED de

longitud de onda de 420nm.

El programa se inicializó para que empezara a guardar datos cada 10 minutos, y que los

almacenara por un minuto. En cada archivo se muestrearon 233 datos por sensor, de estos

datos se calculó el promedio de medición por lote de muestreo (ver Apéndice E) y se

graficaron los promedios de cada sensor.

Bajo las condiciones anteriores el resultado de la prueba biorreactor y sensores se presenta

a continuación.

En la (figura 6.2) se muestra la evolución de la temperatura con respecto a la concentración,

donde se obtuvo un valor mínimo de 25.74 ºC y un máximo de 26.84 ºC, dando una

diferencia de 1.1 ºC. Por lo que se puede decir que la concentración no tiene efecto sobre la

temperatura.

En la (figura 6.3) se observa la evolución del pH con respecto a la concentración, donde se

obtuvo un valor mínimo de 5.80 pH y un máximo de 6.75 pH, con lo que se tiene una

diferencia de 0.95 pH. Teniendo esto en cuenta se puede decir que la concentración no tiene

efecto sobre el pH.

En la (figura 6.4) se presenta la evolución de la absorbancia con respecto a la concentración.

Se observa claramente que la absorbancia se mantiene proporcionalmente con la

concentración y que ha 80 ppm el sensor permite obtener una recta donde la pendiente es

lineal.

Page 83: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

66

Figura 6.2: Efecto de la concentración del colorante Naranja II sobre la temperatura.

Figura 6.3: Efecto de la concentración del colorante Naranja II sobre el pH.

Page 84: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

67

Figura 6.4: Efecto de la concentración del colorante Naranja II sobre la absorbancia.

6.3 Prueba biorreactor, durante el cultivo y monitoreo de sensores

En esta prueba se preparó colorante naranja II con una concentración de 25 partes por

millón (ppm) en 3 litros de agua con buffer de pH = 6. Para favorecer la degradación se

introdujo una carga mayor de biomasa libre del hongo Trametes versicolor de 7.5%, antes

se había usado 2.5%.

En las condiciones de experimentación antes mencionadas durante el cultivo con el hongo.

Se presentan los resultados de la determinación de cada parámetro.

En la (figura 6.5) se presenta la evolución de la temperatura durante el cultivo. Se observa un

incremento en la temperatura de 27.97 ºC a 31.17 ºC, lo que indica que el hongo esta

metabólicamente activo. Ya que un incremento en la cantidad de calor, evaluada como de

temperatura.

En la (figura 6.6) se presenta la evolución del pH. Se observa que en las primeras 3 horas

hay un descenso del pH, que corresponde también al decremento de coloración,

posteriormente se incrementa para permanecer cercano al valor inicial, dado que se introdujo

una solución amortiguada, no obstante, a partir de las 8 horas nuevamente decrece. Siendo

Page 85: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

68

esto cuando se finaliza el proceso de degradación. El valor máximo de pH durante este

prueba fue de 6.82 pH y el valor mínimo de 5.51 pH, dando una diferencia de 1.31 pH.

En la (figura 6.7) se observa la evolución de la absorbancia en el cultivo, siendo la mayor

decoloración a las 3 horas, de una absorbancia de 1.0 a una de 0.41. A las 14 horas se

obtuvo una absorbancia final de 0.035. Las muestras medidas con el espectrofotómetro del

CEIB y el medidor de absorbancia son muy parecidas recordando el desfasamiento que

existe por centrifugar la muestra.

En la figura 6.8a se muestra el colorante con la biomasa dentro del reactor en el tiempo cero

y en la figura 6.8b se observa después de cuatro horas del proceso. También se muestra

una comparación del colorante en el tiempo cero figura 6.9a y a las 24 horas ver (figura

6.9b). Se puede observar la biomasa introducida al biorreactor en la figura 6.10.

Figura 6.5: Evolución de la temperatura en el proceso de degradación del colorante Naranja II

Page 86: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

69

Figura 6.6: Evolución del pH en el proceso de degradación del colorante Naranja II

Figura 6.7: Evolución de la absorbancia en el proceso de degradación del colorante Naranja II

Page 87: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

70

(a) (b)

Figura 6.8: a) Reactor al tiempo 0 y b) reactor después de 4 horas

Figura 6.9: a) Colorante termino de la prueba b) Colorante al inicio de la prueba.

Page 88: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 6 Pruebas y resultados

71

Figura 6.10: Biomasa

Page 89: Escalamiento biorreactores-Cenidet

CAPÍTULO 7 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Page 90: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 7 Conclusiones y recomendaciones

73

7.1 Conclusiones

La experimentación permitió determinar los parámetros más importantes en la degradación

biológica del colorante. Y determinar que el hongo Trametes versicolor degrada 90% en 12

horas aproximadamente, utilizando la biomasa libre, así mismo permitió el diseño del

prototipo.

Para inmovilizar el hongo se requirió de mayor tiempo para preparar al biocatalizador, pero

se tiene la ventaja de incrementar la vida útil del biocatalizador. No obstante se debe

seleccionar otro soporte adecuado evitando que se dañe el hongo durante el proceso y

reducción de sólidos provenientes del soporte.

La inmovilización permitió incrementar el tiempo de uso de la biomasa sin que se dañe,

evitando su remplazo en el corto plazo y se pueden realizar procesos de forma continua.

La estructura diseñada y construida para el biorreactor fue sencilla, de bajo costo, y flexible

para diferentes diámetros de biorreactor.

En cuanto al diseño y construcción del biorreactor airlift fue satisfactorio ya que el material

PVC hidráulico utilizado para la construcción del biorreactor fue económico y funcionó de

forma adecuada para la decoloración del agua coloreada, así como también no hubo

absorción de colorante en sus paredes.

El funcionamiento del módulo electrónico diseñado para la adquisición y el

acondicionamiento de las señales, resultó satisfactorio para los sensores de temperatura, pH

y absorbancia.

El medidor de absorbancia desarrollado y construido fue de bajo costo, ya que funciona por

medio de diodos emisores de luz (LEDs), un motor de pasos unipolar y una fotorresistencia.

En cuanto a la medición de la absorbancia con este dispositivo construido funcionó de forma

adecuada para el colorante naranja II. Pudiendo calibrarse para otro tipo de colorantes que

estén cerca de la longitud de onda de los LEDs utilizados para el diseño del medidor de

absorbancia.

Se desarrolló una interfaz gráfica en LabView 8.2 amigable para el uso de cualquier persona.

Además comunica el módulo electrónico con la computadora para el almacenamiento de

datos proveniente de los sensores mencionados.

Page 91: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 7 Conclusiones y recomendaciones

74

El no usar lenguaje ensamblador en la programación del microcontrolador no afectó el

funcionamiento del mismo, su velocidad de transmisión por el puerto serie fue excelente con

programación en lenguaje de alto nivel (BASIC).

La experimentación con el prototipo permitió conocer que el pH y la temperatura no

dependen de la concentración del efluente, no obstante la absorbancia si es proporcional a

los cambios en la concentración. Teniendo un comportamiento lineal hasta una

concentración de 80 ppm.

Se puede también observar en estos experimentos realizados con el prototipo que existe un

aumento en la temperatura de 4 grados cuando esta el proceso de degradación, lo que

indica que el hongo esta metabólicamente activo. Así mismo existe una variación en el pH

del efluente en las primeras 3 horas, que corresponde a la mayor degradación del colorante.

En cuanto a las mediciones de absorbancia en el biorreactor fueron muy parecidas a las

mediciones realizadas en el espectrofotómetro del CEIB (teniendo en cuenta que las

medicines en el biorreactor no se pueden centrifugar).

Se cumplió con el desarrollo de un equipo mecatrónico como se esperaba, se integraron

conocimientos de mecánica, computación, electrónica y aspectos biológicos.

Page 92: Escalamiento biorreactores-Cenidet

Capítulo 7 Conclusiones y recomendaciones

75

7.2 Recomendaciones

Las recomendaciones que se presentan a continuación, son posibles mejoras al biorreactor

para trabajos a futuro.

Implementar un control a las variables que intervienen en el proceso (pH, temperatura

y absorbancia).

Probar un fotodiodo para espectro visible como elemento detector de intensidad

luminosa para el medidor de absorbancia.

Hacer que el medidor de absorbancia se pueda acoplar a otros biorreactores.

Implementar otras técnicas de filtrado para evitar que la biomasa llegue al medidor de

absorbancia.

Probar el funcionamiento del biorreactor con otros materiales como pueden ser:

Vidrio, acero inoxidable, acrílico y PVC transparente.

Page 93: Escalamiento biorreactores-Cenidet

76

Referencias

[1] Página de Internet: Contaminación textil

Dirección: http://www.monografias.com/trabajos16/contaminacion-textil/contaminacion-textil.shtml. Fecha de consulta: 20 de marzo de 2008.

[2] Uzárraga Salazar, Rafael. Biodegradación de colorantes textiles por hongos y

bacterias y su potencial uso para el tratamiento de aguas residuales. Tesis, maestro en biotecnología. Universidad Autónoma del Estado de Morelos, CEIB, Marzo 2006.

[3] Página de Internet: Trametes Versicolor

Dirección: http://www.asturnatura.com/especie/trametes-versicolor.html Fecha de consulta: 20 de marzo de 2008.

[4] Rodríguez Arévalo, A.C., Cabrera Llanos, A.I. Valencia Flores, J.I. Diseño y

construcción de los instrumentos de medición para un biorreactor prototipo. Instituto Politécnico Nacional. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología. Revista Mexicana de Ingeniería Biomédica, Marzo 2003.

[5] Eliane Guevara López. Tesis licenciatura. Diseño, construcción y caracterización

hidrodinámica de un biorreactor multifuncional. Ingeniero en alimentos, Universidad tecnológica la mixteca, Diciembre 2004.

[6] Ordorica Vargas Carlos, Gutiérrez López Gustavo, Sansón Ortega Leticia,

Chanona Pérez Jorge. Diseño y simulación de un fermentador tipo airlift. Instituto Politécnico Nacional. Departamento de Graduados e Investigación en Alimentos.Taller de herramientas de cálculo en ingeniería de alimentos - IV.

[7] Dr. Luis Basáez R. ¿QUÉ ES EL pH?: FORMAS DE MEDIRLO.

Revista Ciencia ahora No 23. Universidad de Concepción Facultad de Ciencias Químicas, 2009.

[8] Lyl M. Ciganda. Electrodos para medir pH Univ. De la República Oriental del Uruguay.

XIII Seminario de Ing. Biomédica. Facultades de Medicina e Ingeniería, Junio 2004. [9] Página de internet: Medida del pH

Dirección: http://www.ehu.es/biomoleculas/ph/medida.htm Fecha de consulta: 13 de noviembre de 2009.

[10] Página de Internet: Temperatura

Dirección: http://es.wikipedia.org/wiki/Temperatura. Fecha de consulta: 14 de noviembre 2009.

Page 94: Escalamiento biorreactores-Cenidet

77

[11] W. Bolton. Mecatrónica, sistemas de control electrónico en la ingeniería mecánica y eléctrica. 3ª edición. Alfa omega, Febrero 2006.

[12] Página de Internet: Absorbancia Dirección: http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert Fecha de consulta: 20 de marzo de 2008. [13] Página de internet: Espectrofotómetro Dirección: www.frlp.utn.edu.ar/grupos/aepeq/equipos.pps Fecha de consulta: 22 de marzo de 2008.

[14] Página de internet: Fotorresistencia Dirección: http://es.wikipedia.org/wiki/Fotorresistencia Fecha de consulta: 3 de enero 2009. [15] Página de internet: LED Dirección: http://es.wikipedia.org/wiki/Diodo_emisor_de_luz Fecha de consulta: 19 de mayo de 2009. [16] Hoja de datos: Microcontrolador PIC16F877A.

Fabricante: Microchip. [17] Página de internet: Puente de Wheatstone con NTC y LDR

Dirección: www.isaatc.ull.es/asignaturas/inst_quimica/.../Practica%201.doc Fecha de consulta: 3 de septiembre 2009.

[18] Hoja de datos: AD594 Fabricante: Analog Devices.

[19] Rodríguez Z., Narvaez R., Quiñones C., Espinosa H., Ramírez D. Desarrollo de un Dispositivo de Bajo Costo para Detección de Luz Visible Utilizando Instrumentación Virtual. Universidad de América. Revista Colombiana de física, vol. 40, No. 2, Junio 2008.

[20] Luis Frino. Compilador PicBasic Pro. [21] Carlos A. Reyes. Aprenda rápidamente a programar microcontroladores

PIC. 2ª edición. Rispergraf.

[22] Aida M. Romero Jiménez, M. Sc. Alina S. Rodríguez García, M. Sc. Ma Rafaela Pérez Marchena. Pleurotus ostreatus. Importancia y tecnología de cultivo. Universidad de Cienfuegos, Grupo de nutrición.

[23] Página de internet: Escalamiento de biorreactores Dirección: https://www.u-cursos.cl/ingenieria/2004/1/BT52A/1/material.../35722. Fecha de consulta: 15 de agosto 2009.

Page 95: Escalamiento biorreactores-Cenidet

78

Anexo A Diseño del Biorreactor

Page 96: Escalamiento biorreactores-Cenidet

79

Page 97: Escalamiento biorreactores-Cenidet

80

Page 98: Escalamiento biorreactores-Cenidet

81

Page 99: Escalamiento biorreactores-Cenidet

82

Page 100: Escalamiento biorreactores-Cenidet

83

Page 101: Escalamiento biorreactores-Cenidet

84

Page 102: Escalamiento biorreactores-Cenidet

85

Page 103: Escalamiento biorreactores-Cenidet

86

Anexo B Diseño tarjeta electrónica

Construcción de la tarjeta electrónica

En este apéndice se describen por separado los circuitos realizados para el monitoreo y/o

control del biorreactor.

Circuito microcontrolador

Para el funcionamiento del microcontrolador PIC16F877A se utiliza la configuración con

oscilador externo de rango medio (XT), con un cristal externo de 4MHz y capacitores de

22pF. Se utiliza un push button para el reset del microcontrolador ver figura C1, la

alimentación se realiza con 5V.

Page 104: Escalamiento biorreactores-Cenidet

87

Figura C1: Circuito microcontrolador

Circuito medidor de temperatura

Para acondicionar la señal de salida del termopar tipo K se utilizo el siguiente circuito

mostrado en la figura C2, donde la parte de amplificación, linealización y compensación de

punta fría la realiza el circuito integrado AD594, la alimentación de este circuito es de 5V, la

salida hacia el ADC del microcontrolador es la unión de los pines 8 y 9 del integrado.

Page 105: Escalamiento biorreactores-Cenidet

88

Figura C2: Circuito medición de temperatura

Circuito medición de absorbancia

Para medir la absorbancia se utilizó una fotorresistencia de 1MΩ como elemento detector de

cambio de luz, para aumentar la sensibilidad y linealización del circuito se construyó una

variante del puente de wheatstone linealizado. Se utiliza el amplificador operacional LM741

en configuración diferencial. Este circuito amplifica la diferencia entre las señales que hay en

sus entradas. En este caso, esta diferencia es lo que se llama Vout del puente. Se utilizan tres

resistencias de precisión de 1KΩ y la resistencia variable es la fotorresistencia que se

conecta en el pin no inversor y la terminal de salida como se muestra en la figura C3.

Page 106: Escalamiento biorreactores-Cenidet

89

Figura C3: Circuito medición de absorbancia

La fórmula de linealización del puente es la siguiente:

Donde V0 es el voltaje de salida.

Como todas las resistencias son iguales la formula queda de la siguiente forma:

Donde ∆R es el cambio de la fotorresistencia a las diferentes intensidades de luz.

Donde 950Ω es el valor de la resistencia con luz total, por lo tanto el voltaje de salida es de.

Page 107: Escalamiento biorreactores-Cenidet

90

Circuito pH

Para el circuito de pH, se utiliza un amplificador con entrada MOSFET (CA3130) y salida

CMOS con una impedancia de entrada de hasta 1.5 TΩ (1.5x10^12Ω), se configura el

amplificador como inversor, esta salida se conecta a un amplificador con entrada JFET

(TL084), donde se utilizan tres seguidores de voltaje para ajustar las impedancias que

entraran al ADC del microcontrolador. Se utiliza filtro paso bajos para disminuir el ruido, el

circuito final para medir pH se muestra en la figura C4.

Page 108: Escalamiento biorreactores-Cenidet

91

Figura C4: Circuito medición de pH

Circuitos complementarios

Se realizaron circuitos complementarios para la medición de absorbancia, como es para el

control de movimiento del motor de pasos, y para encender los leds correspondientes a cada

posición.

Para el control de movimiento del motor de pasos se utilizaron 4 transistores BC548

configurado como interruptor, el microcontrolador satura la base de cada transistor conforme

Page 109: Escalamiento biorreactores-Cenidet

92

se posiciona el motor de pasos, el colector se alimenta con 5V y el emisor se conecta a la

base de transistores TIP141, en el colector de estos se conectan las bobinas del motor de

pasos, y el emisor se conecta a tierra.

Para encender los leds se utilizaron 8 resistencias 150 Ω, conectadas al microcontrolador,

éste manda 5 volts al led que se requiera encender, después del posicionamiento del motor

de pasos.

En la siguiente figura se muestra el circuito general de la tarjeta electrónica.

Figura C5: Circuito general del biorreactor

Page 110: Escalamiento biorreactores-Cenidet

93

Anexo C Calibración sensor de absorbancia

Se muestran las graficas obtenidas para la calibracion del medidor de absorbancia para

diferentes colorantes cercanos a la longitud de onda de los LEDs. Tambien se muestran las

formulas introducidas en la interfaz gráfica.

Gris espectrofotómetro

Figura: Datos de calibración del espectrofotómetro

Page 111: Escalamiento biorreactores-Cenidet

94

Figura: Regresión lineal de la media del espectofotómetro.

Gris medidor de absorbancia

Figura: Datos de calibración medidor de absorbancia.

Page 112: Escalamiento biorreactores-Cenidet

95

Figura: Regresión lineal media del medidor de absorbancia

La ecuación de calibración para el color gris, con una longitud de onda de 560nm, utilizando

los valores del espectrofotómetro y el medidor de absorbancia es.

Page 113: Escalamiento biorreactores-Cenidet

96

Verde espectrofotómetro.

Figura: Datos de calibración del espectrofotómetro.

Figura: Regresión lineal del espectrofotómetro

Page 114: Escalamiento biorreactores-Cenidet

97

Verde medidor de absorbancia

Figura: Datos de calibración medidor de absorbancia

Figura: Regresión lineal de la media del medidor de absorbancia

Page 115: Escalamiento biorreactores-Cenidet

98

La ecuación de calibración para el color verde, con una longitud de onda de 600nm,

utilizando los valores del espectrofotómetro y el medidor de absorbancia es.

Azul espectro

Figura: Datos de calibración del espectrofotómetro

Page 116: Escalamiento biorreactores-Cenidet

99

Figura: Regresión lineal del espectrofotómetro

Azul medidor de absorbancia

Figura: Datos de calibración del medidor de absorbancia

Page 117: Escalamiento biorreactores-Cenidet

100

Figura: Regresión lineal de la media del medidor de absorbancia

La ecuación de calibración para el color azul, con una longitud de onda de 620nm, utilizando

los valores del espectrofotómetro y el medidor de absorbancia es.

Page 118: Escalamiento biorreactores-Cenidet

101

Anexo D Programa Microcontrolador

include "modedefs.bas" define ADC_BITS 10 trisb=%00000010 trisc=%00000000 ADCON1=%10000000 portb=%00000000 portc=%00000000 delay var byte cont var byte delay2 var byte dat var byte dat2 var byte x var byte x1 var byte y var byte y1 var Byte z var byte z1 var byte a VAR BYTE a1 var byte led var portb.2 delay=1000 delay2=5000 goto inicio bomba: high portd.2 serin portb.1,N9600,dat if dat="u" then ADC goto bomba valvulas_cerrada: high portd.0 high portd.1 serin portb.1,N9600,dat if dat="v" then valvulas_abierta if dat="r" then inicio goto valvulas_cerrada valvulas_abierta: low portd.0

Page 119: Escalamiento biorreactores-Cenidet

102

low portd.1 serin portb.1,N9600,dat if dat="r" then inicio if dat="q" then valvulas_cerrada goto valvulas_abierta absorbancia: serin portb.1,N9600,dat if dat="a" then verde_vue if dat="b" then azul_vue if dat="c" then amarillo_vue if dat="d" then violeta_vue if dat="e" then naranja_vue if dat="f" then led1_vue if dat="g" then led2_vue if dat="h" then verde_ida if dat="i" then azul_ida if dat="j" then amarillo_ida if dat="k" then violeta_ida if dat="l" then naranja_ida if dat="m" then led1_ida if dat="n" then led2_ida if dat="o" then ledr_prend if dat="p" then ledr_apag if dat="u" then ADC goto absorbancia ;led verde verde_ida: low portc.0 portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 goto absorbancia verde_vue: pause delay2 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000

Page 120: Escalamiento biorreactores-Cenidet

103

pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 high portc.0 goto absorbancia ;led azul azul_ida: low portc.1 for cont=1 to 3 portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay next goto absorbancia azul_vue: for cont=1 to 3 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay next portb=%00010000 high portc.1 goto absorbancia ;led amarillo amarillo_ida: low portc.2 for cont=1 to 5 portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay

Page 121: Escalamiento biorreactores-Cenidet

104

portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay next pause delay goto absorbancia amarillo_vue: for cont=1 to 5 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay next pause delay high portc.2 goto absorbancia ;led violeta violeta_ida: low portc.6 for cont=1 to 6 portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay next goto absorbancia violeta_vue: for cont=1 to 6 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay next portb=%00010000

Page 122: Escalamiento biorreactores-Cenidet

105

high portc.6 goto absorbancia ;led naranja naranja_ida: low portc.4 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay goto absorbancia naranja_vue: portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay high portc.4 goto absorbancia led1_ida: low portc.5 for cont=1 to 3 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay next portb=%00010000 pause delay portb=%00100000

Page 123: Escalamiento biorreactores-Cenidet

106

pause delay portb=%00010000 pause delay goto absorbancia led1_vue: for cont=1 to 3 portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay next portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 pause delay high portc.5 goto absorbancia led2_ida: low portc.3 for cont=1 to 4 portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%10000000 pause delay next portb=%00010000 pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%01000000 pause delay goto absorbancia led2_vue: pause delay2 for cont=1 to 4 portb=%10000000 pause delay portb=%01000000

Page 124: Escalamiento biorreactores-Cenidet

107

pause delay portb=%00100000 pause delay portb=%00010000 pause delay next portb=%10000000 pause delay portb=%01000000 pause delay portb=%00100000 Pause delay high portc.3 pause delay2 goto absorbancia ledr_prend: high portc.7 pause delay2 goto absorbancia ledr_apag: low portc.7 pause delay2 goto absorbancia ADC: LOW portb.3 low portd.2 high led Pause 100 Goto inicio_adc getad: Pauseus 50 ADCON0.2 = 1 Pauseus 50 Return getx: ADCON0=%01000001 Gosub getad x1= ADRESL x = ADRESH Return gety: ADCON0=%01001001 Gosub getad y1=ADRESL y = ADRESH

Page 125: Escalamiento biorreactores-Cenidet

108

Return getz: ADCON0=%01010001 Gosub getad z1= ADRESL z = ADRESH Return getzz: ADCON0=%01011001 Gosub getad a1= ADRESL a = ADRESH Return inicio_adc: serin portb.1,N9600,dat if dat="r" then inicio if dat="w" then bomba Gosub getx serout portb.0,N9600,[x1] serout portb.0,N9600,[x] Gosub gety serout portb.0,N9600,[y1] serout portb.0,N9600,[y] Gosub getz serout portb.0,N9600,[z1] serout portb.0,N9600,[z] Gosub getzz serout portb.0,N9600,[a1] serout portb.0,N9600,[a] Pause 175 pauseus 450 Goto inicio_adc inicio: portb=%00000000 low led serin portb.1,N9600,dat if dat="s" then absorbancia if dat="t" then ADC if dat="q" then valvulas_cerrada goto inicio end

Page 126: Escalamiento biorreactores-Cenidet

109

Anexo E Archivo con datos de los sensores

Tabla de datos generada por el programa realizado en LabView 8.2, la primera columna es el

tiempo, la segunda la Temperatura, la tercera el pH, la cuarta quedo abierta para medición

de oxigeno disuelto y la ultima mide la absorbancia.