Ermittlung des Überdauerungs- und Austragspotenzials von gentechnisch veränderten

Agrobakterien nach Einsatz in der "floral dip" - Methode zur Erzeugung gentechnisch

veränderter Pflanzen im Gewächshaus

Regina Becker und Andreas Ulrich

Auftragnehmer: Leibniz-Zentrum für Agrarlandschaftsforschung (ZALF) e.V.

Institut für Landschaftsbiogeochemie

Eberswalder Str. 84, 15374 Müncheberg

Projektleiter: Dr. Andreas Ulrich

Tel.: 033432/82345, Fax: 033432/82344, E-mail: aulrich@zalf.de

Kooperationspartner: Johann Heinrich von Thünen-Institut (vTI)

Bundesforschungsinstitut für ländliche Räume, Wald und Fischerei

Institut für Forstgenetik

Dr. Dietrich Ewald

Eberswalder Chaussee 3a, 15377 Waldsieversdorf

Auftraggeber: Land Brandenburg, vertreten durch das Landesamt für Umwelt, Gesundheit

und Verbraucherschutz

Müncheberg, den 23.10.2012

2

Inhaltsverzeichnis

1. Zielstellung ............................................................................................................... 3

2. Material und Methoden ............................................................................................. 3

2.1. Bakterienstämme und Plasmide................................................................................. 3

2.2. E. coli Transformation............................................................................................... 3

2.3. Konjugationen........................................................................................................... 4

2.4. Pflanzentransformation ............................................................................................. 4

2.5. Probenahmen ............................................................................................................ 6

2.6. Bakterienkultivierung und -screening ........................................................................ 6

2.7. Real-time PCR .......................................................................................................... 7

2.8. Statistik..................................................................................................................... 7

3. Ergebnisse................................................................................................................. 7

3.1. Überprüfung des Agrobacterium-Transformationsstammes ....................................... 7

3.2. Herstellung transgener Arabidopsis-Pflanzen über die floral dip-Methode................. 8

3.3. Nachweis rekombinanter Agrobakterien nach der Pflanzentransformation............... 10

4. Diskussion .............................................................................................................. 13

5. Zusammenfassung und Schussfolgerungen.............................................................. 15

Referenzen .............................................................................................................. 16

3

1. Zielstellung

Die floral dip-Methode ist ein vereinfachtes und effizientes Verfahren zur Erzeugung

transgener Pflanzen über den Agrobacterium-vermittelten Gentransfer. Bei dieser Methode,

die sich bei Pflanzen mit Kapazität zur Bildung zahlreicher, meist sehr kleiner Samen (z.B.

Arabidopsis, Raps, Kartoffel) durchgesetzt hat, werden die Blütenstände zur Transformation

lediglich kurzzeitig in eine Agrobakteriensuspension getaucht. Der Gentransfer kann so direkt

in den Eiapparat erfolgen. Der Vorteil dieser Methode besteht im Wegfall der Gewebekultur

zur Regeneration der transformierten Pflanzen. Dies bedeutet auch den Verzicht auf die

Selektion gegen die Agrobacterium-Stämme mit entsprechenden Antibiotika nach der

Transformation.

Ziel des Projekts war es, zu prüfen, inwieweit die floral dip-Methode eine Persistenz der

verwendeten Agrobakterien und ggf. einen Gentransfer in die autochthone Bakterienflora der

Pflanzen ermöglicht. Hierzu wurden über einen gebräuchlichen binären Vektor (pGWB633-

AtFBL3 (Nakamura et al., 2010) transgene herbizidresistente Arabidopsis thaliana-Pflanzen

erzeugt und in unterschiedlichen Entwicklungsstadien über einen kulturabhängigen Ansatz

sowie mittels SybrGreen real-time PCR auf das Vorhandensein von rekombinanten

Agrobakterien untersucht. Für den Nachweis eines von den rekombinanten Agrobakterien

ausgehenden Gentransfers in die authochtone Bakterienflora wurden darüber hinaus

potentielle Transkonjuganten auf antibiotikahaltigen R2A-Medium gescreent.

2. Material und Methoden

2.1. Bakterienstämme und Plasmide

Zur Transformation der Arabidopsis thaliana Pflanzen wurde der Stamm Agrobacterium

tumefaciens1 GV3101 pMP90 pGWB633-AtFBL3 benutzt. In Tabelle 1 sind die zur

Konstruktion verwendeten Stämme und Plasmide aufgelistet.

2.2. E. coli Transformation

Die Herstellung kompetenter Zellen und die Transformation erfolgte nach Standardprotokoll

(Sambrook et al., 1989).

1 Die geänderte taxonomische Zuordnung ist Rhizobium radiobacter. Aus Verständnisgründen wird jedoch weiterhin Agrobacterium tumefaciens verwendet.

4

Tab. 1 Bakterienstämme und Plasmide

Stamm / Plasmid Relevante Merkmale, Antibiotikaresistenzen a Referenz

Escherichia coli K12 DH5α hsdS3, recA56, rpsL20, proA2 Bolivar & Backman (1979) DH5α-1 pRK2013 Spontane Smr Mutante von DH5α,

pRK2013: Helferplasmid für die Mobilisierung, Kmr

Figurski & Helinski (1979)

Agrobacterium tumefaciens

GV3101 pMP90 C58C1; Rif r, pMP90: pTiC58 (∆ T-DNA), Gmr

Koncz & Schell (1986)

GV3101 pMP90 pGWB633-AtFBL3

pGWB633-AtFBL3: GUS, bar, Spcr; Nakamura et al. (2010)

diese Arbeit

a Antibiotika-Konzentrationen (µg/ml): Gm: Gentamycin - 25, Km: Kanamycin - 50, Rif: Rifampicin - 30, Sm: Streptomycin - 40, Spc: Spectinomycin - 100

2.3. Konjugationen

Anlehnend an Simon (1984) wurden Donor-, Helfer- und Rezipientenzellen in

Flüssigkulturen ausgehend von einer Übernachtkultur bis zum Erreichen der logarithmischen

bzw. Transient-Phase angezogen. Donor, Helfer und Rezipient wurden getrennt

abzentrifugiert (45 sec, 8000 rpm), in Medium aufgenommen und in Eppendorf-Tubes

gemischt. Alternativ kann auch die Anzucht zur logarithmischen Phase ohne Antibiotika

erfolgen. In diesem Fall kann die Mischung der Eltern direkt erfolgen.

Bei der Kreuzung erfolgte die Mischung der Bakterienkulturen im Verhältnis 1:1:1. Donor,

Helfer, Rezipient und das Gemisch wurden für 16 h auf YEB Agarplatten inkubiert. Danach

wurden die Zellen in 0,3% NaCl resuspendiert, entsprechende Verdünnungen auf

Selektivmedium (Rif, Spc, Gm) ausplattiert und bei 26°C inkubiert. Neben den Trans-

konjuganten wurden ebenso Donor, Helfer und Rezipient zur Kontrolle auf Selektivmedium

ausplattiert. Zur Bestimmung der Konjugationsfrequenz wurde der Titer von Donor und

Rezipient (incl. Transkonjugant) im Gemisch über geeignete Kultivierung und Selektion

ermittelt.

2.4. Pflanzentransformation

In der S1-Anlage des vTI in Waldsieversdorf wurden in Minigewächshäusern (Vermiculite,

Befeuchtung mit Schenk-Hildebrand-Medium, halbkonzentriert) angezogene Arabidopsis-

Sämlinge (Ökotyp Col-0) pikiert und bei ∼1 cm Pflanzenlänge in Plastiktöpfe (ø 5 cm) mit

leichter Pflanzerde (Erde-Vermiculit-Mischung) umgesetzt. Die Pflanzen wurden bis zur

Transformation unter Kurztagsbedingungen (12 h, 20°C, 13-15 klux; 12 h, 18°C) bei mäßiger

Wasserversorgung und wöchentlicher Düngung mit 1% Wuxal kultiviert (Abb. 1).

5

Abb. 1 Anzucht von Arabidopsis thaliana zur Pflanzentransformation

Die Transformation der Arabidopsis-Pflanzen erfolgte modifiziert nach Clough & Bent

(1998) an vier Terminen (22.06.11, 30.09.11, 07.10.11, 03.11.11) in folgenden Schritten:

1. Auswahl gesunder blühender Einzelpflanzen, ggf. vorher Abtrennen der ersten

Infloreszenzen zur Förderung mehrerer Sekundärblütentriebe

2. Übernachtkultur des rekombinanten Agrobacterium-Stammes in YEB (26 °C) bis zum

Erreichen der logarithmischen Phase

3. Herstellung der Agrobakteriensuspension (200 ml/ Transformation von 10 Einzel-

pflanzen): Abzentrifugieren der Agrobakterien und Aufnahme in 5 % Saccharose-

Lösung mit OD600 ∼0,8; Zugabe von 50 µl Silwet L-77 auf 100 ml Agrobakterien-

suspension (0,05%)

4. Eintauchen der Blütentriebe in Agrobakteriensuspension (2-3 s)

5. Plazieren der behandelten Pflanzen in Plastikschalen unter Abdeckung mit

Plastikhaube (24 h), um ein Austrocknen des Bakterienfilms zu verhindern

6. Überführung der Pflanzen in die Klimakammer (12 h, 20°C, 13-15 klux; 12 h, 18°C),

„normale“ Wasser- und Nährstoffversorgung, Einstellung der Wasserversorgung bei

Erscheinen reifer Schoten

9. Samenernte und -trocknung

6

10. Aussaat und Keimung der Samen im Minigewächshaus mit Vermiculite unter

Befeuchtung mit Schenk-Hildebrand-Medium (halbkonzentriert) und Anzucht bis zu

einer Wuchshöhe von 0,5 cm

11. Selektion der Transformanten durch 3-4 x Sprühen (im Abstand von 3 Tagen) mit

Phosphinothricin-Lösung (6,1 mg/100ml Aqua dest. + 10 µl/100ml Silvet L-77)

12. Umsetzen der transgenen Pflanzen und Überprüfung der Transgenität mittels

Glucuronidase-Aktivitätstest nach Jefferson et al. (1987)

2.5. Probenahmen

Die Probenahmen für die mikrobiologischen Untersuchungen erfolgten in den Entwicklungs-

stadien Rosette, Blüte und Seneszenz an 17 transgenen Einzelpflanzen. Darüber hinaus

wurden die Samen der behandelten Ausgangspflanzen (F1) und der transgenen Pflanzen (F2)

beprobt (Tab. 2). Zum Zeitpunkt der Seneszenz konnte aufgrund des Entwicklungsstandes

von 2 der 17 untersuchten Pflanzen nur Material für die PCR-Analyse entnommen werden.

Tab. 2 Probenahmen an Arabidopsis-Pflanzen nach Einsatz der floral-dip-Methode

Untersuchte Pflanzen Entwicklungsstadium Probematerial

Gedippte Pflanzen a Samenernte Samen (50 Samen/Pfl. bzw. 5 - 40 mg)

Transgene F1-Pflanzen b Rosettenstadium Blatt (20-100 mg)

Blüte / Schotenbildung Blatt (20-100 mg)

Seneszenz Gesamtpflanze (50-200 mg)

Wurzel mit anhaftendem Boden (50 -200 mg)

Seneszenz / Samenernte Samen (5 - 40 mg) a

4 Transformationen à 6-10 Pflanzen b

17 Pflanzen aus 2 Transformationen

2.6. Bakterienkultivierung und -screening

Zum kulturabhängigen Nachweis von rekombinanten Agrobakterien auf den Arabidopsis-

Samen nach dem Dippen wurden pro Transformation von 6 bis 10 behandelten Pflanzen je 50

Samen auf Selektivmedium (TSA mit Rif, Spc) ausgelegt und 5 Tage bei 26 °C inkubiert. Die

Samen, an den Bakterienkolonien gewachsenen waren, wurden ausgezählt und die Bakterien

wiederholt auf Selektivmedium ausgestrichen und über den real-time PCR-Nachweis einer für

den benutzten Transformationsvektor spezifischen Sequenz überprüft (siehe 2.7).

Zur Untersuchung der Persistenz lebender Agrobakterien in den transgenen Pflanzen und zum

Screening auf einen potentiellen Gentransfer wurde frisches, mit sterilem Aqua dest.

abgespültes Probenmaterial (Tab. 2) unter Zugabe von 2 ml 0,3 %iger steriler Kochsalzlösung

7

gemörsert, seriell verdünnt und auf antibiotikahaltigem R2A-Medium (Rif, Spc: Nachweis

rekombinanter Agrobakterien; Spc: Screening potentieller Transkonjuganten) bzw. R2A-

Medium (Bestimmung Populationsdichten autochthoner Bakterien) ausplattiert. Die

Nachweisgrenze lag hierbei bei 2 KBE/mg FM. Anschließend wurden die auf antibiotika-

haltigem Medium gewachsenen Kolonien auf das Vorhandensein spezifischer Sequenzen des

rekombinanten Agrobakterienstamms getestet (siehe 2.7).

2.7. Real-time PCR

Die Quantifizierung der rekombinanten Agrobakterien erfolgte mit zwei unterschiedlichen

Primersystemen über SybrGreen real-time PCR. Basierend auf der DNA-Sequenz des Vektors

pGWB633-AtFBL3 wurden Primer aus dem codierenden Bereich des gusA Gens (T-DNA

nahe des Rechten Borders) abgeleitet. Forward (T-DNA-1f: aaccgggtgaaggttatctc) und reverse

Primer (T-DNA-1r: acagttctttcggcttgttg) ergeben ein PCR-Produkt von 396 bp. Die

Quantifizierung wurde als Dreischritt-PCR (95°C 15s, 58°C 40s, 72°C 60s) durchgeführt.

Weiterhin wurde ein PCR-System des virE2 Gens des Helferplasmids pMP90 verwendet (Li

et al., 2005). Als Standard diente Gesamt-DNA des Agrobacterium-Stamms GV3101 pMP90

pGWB633-AtFBL3. Die DNA wurde mit dem Fast DNA Kit (Q-BIOgene) isoliert und mit

dem NanoDrop ND-100 quantifiziert.

Zur DNA-Isolierung wurden Samen (5 - 40 mg) bzw. Blätter (20 mg) einzelner Pflanzen mit

dem FastPrep Instrument (MP-Biochemicals) gemahlen und die DNA über ein

miniaturisiertes CTAB-Protokoll (Dumolin et al., 1995) isoliert. Alle Quantifizierungen in der

real-time PCR erfolgten zumindest als Doppelbestimmung. Die Nachweisgrenze lag

entsprechend der Menge eingesetzten Pflanzenmaterials bei etwa 30 Genomen/mg FM.

2.8. Statistik

Die statistische Auswertung der Versuchsdaten erfolgte über einfaktorielle ANOVA bzw.

über den Kruskall-Wallis-Test und anschließendem post-hoc Test nach Dunn bzw. nach

Duncan (SigmaStat, Version 3.5).

3. Ergebnisse

3.1. Überprüfung des Agrobacterium-Transformationsstammes

Zur Transformation der Arabidopsis Pflanzen wurde der binäre Vektor pGWB633-AtFBL3

(Nakamura et al., 2010) ausgewählt. Der Vektor enthält in seiner T-DNA das für die

8

Phosphinothricin (Basta)-Resistenz codierende bar-Gen und ist so einfach nach der Transfor-

mation zu selektieren (Abb. 2). Darüber hinaus müssen zur Selektion keine Antibiotika

eingesetzt werden. Des Weiteren ist in der T-DNA ein gusA (β-glucuronidase)-Gen

vorhanden, das unter Kontrolle eines Arabidopsis-Promotors (des Gens AtFBL3) steht. Somit

sollte der Vektor sowohl eine einfache Transformierbarkeit als auch einen eindeutigen

Nachweis der Transformanten ermöglichen.

Der Vektor wurde zunächst in den E. coli Stamm DH5α transformiert und danach über eine

triparentale Konjugation mit dem Helfer pRK2013 in den Agrobacterium tumefaciens Stamm

GV3101 pMP90 übertragen. Dieser Stamm wurde über die Antibiotikaresistenzen des binären

Vektors und des Helferplasmids pMP90 sowie über eine PCR spezifisch für den binären

Vektor (Bereich innerhalb der T-DNA in der Nähe des Right Borders) und das Helferplasmid

(Bereich innerhalb von virE2) überprüft.

pGWB633-AtFBL311.6 kbp

Pnos:bar:Tnos

GUS

aadA1 (specR/strpR)

Tnos

pVS1-sta

pBR322 bom site

PAtFBL3

pBR322 oripVS1-rep

LB

RB

Abb. 2 Plasmidkarte des Vektors pGWB633-AtFBL3.

3.2. Herstellung transgener Arabidopsis-Pflanzen über die floral dip-Methode

In der Studie wurden vier Pflanzentransformationen durch ein- bis zweimaliges „Dippen“ von

je 6-10 blühenden Arabidopsis-Pflanzen in Agrobakteriensuspension durchgeführt. Die

Samen der behandelten Pflanzen wurden 2-3 Wochen nach dem Dippen geerntet, an der Luft

getrocknet, 2-8 Wochen bei Raumtemperatur gelagert und zur Selektion auf Phosphinothricin-

Resistenz im Minigewächshaus ausgesät. Bei der ersten Transformation wuchsen aus 100

9

eingesäten und 92 gekeimten Samen 2 herbizidresistente Einzelpflanzen auf. Bei beiden

Pflanzen wurde die Transgenität über den GUS-Phänotyp bestätigt. Bei den nachfolgenden

Transformationen erwiesen sich von ~400 bis zu ~3000 ausgebrachten Samen 3 bis 23

Keimlinge als transgen, womit Transformationsraten von annähernd 1% erreicht wurden

(Abb. 3, Tab. 3).

Abb. 3 Selektion transgener Arabidopsis thaliana-Pflanzen über Phosphinothricin-Applikation

Tab. 3 Nachweis transgener Einzelpflanzen über Phosphinothricin-Resistenz und GUS-Phänotyp nach Transformation von Arabidopsis thaliana über die floral dip-Methode

Transformation (Termine)

1

22.06. / 01.07. c

2

30.09. / 07.10.

3

07.10.

4

03.11.

ausgesäte Samen a 100 2000 400 3000

selektierte transgene Pflanzen 2 18 3 23

- überlebende Pflanzen

- untersuchte Pflanzen

0

0

15

12

0

0

22

5

Transformationseffizienz b 2 % 0,9 % 0,75 % 0,77 %

a Samenzahl bei 2.- 4. Transformation geschätzt aus Samengewicht (40 mg = 2000 Samen) b selektierte transgene Pflanzen / Anzahl ausgesäter Samenzahl c Bei der Transformation 1 und 2 wurden die Pflanzen zweimal in Abstand von 1 Woche gedippt.

10

Nach Überführung der Pflanzen in Erdkultur wurden insgesamt 17 für die Untersuchungen

geeignete Jungpflanzen ausgewählt (Abb. 4).2

Abb. 4 Über floral dip erzeugte transgene Arabidopsis thaliana Pflanzen (2. Transformation: 30.09./ 07.10.11)

3.3. Nachweis rekombinanter Agrobakterien nach der Pflanzentransformation

Samen der gedippten Pflanzen. Das Vorhandensein rekombinanter Agrobakterien wurde

zunächst an den Samen der gedippten Ausgangspflanzen untersucht. Die Tests erfolgten nach

einer Lagerung der trockenen Samen von 2 bis 8 Wochen an Samenproben von 6 bis 10

Einzelpflanzen pro Transformation. Über Kultivierung auf rifampicin- und spectino-

mycinhaltigem Medium und nachfolgendem PCR-Nachweis des virE2 und des gusA Gens

konnte im Durchschnitt der vier Transformationen bei etwa 80 % der inokulierten Pflanzen

ein Besatz mit lebenden Agrobakterien nachgewiesen werden. Die Anteile der kontaminierten

Samen variierten bei den vier Transformationen im Mittel der untersuchten Pflanzen zwischen

4 und 12 % (Abb. 5A). Der tendenziell höchste Besatz war bei der zweiten Transformation zu

verzeichnen. Abweichend von den anderen Transformationen wurden die Samen vor

Testbeginn hier nur 2 anstelle von 4 bis 8 Wochen trocken gelagert, wodurch offensichtlich

häufiger überlebende Agrobakterien detektiert werden konnten.

2 Einige transgene Pflanzen wiesen Wachstumsstörungen auf, die teilweise zum Absterben führten (vgl. Tab. 3)

11

Im real-time PCR-Nachweis, bei dem nicht zwischen lebenden und abgestorbenen Zellen des

Transformationsstammes unterschieden werden kann, wurden basierend auf dem virE2-Gen-

Nachweis hohe Dichten des rekombinanten Stammes festgestellt (Abb. 5B). Insgesamt ergab

sich eine Schwankungsbreite von 1 x 102 bis 5 x 105 Genomen pro Samen. Vergleichsweise

höhere Dichten traten nach den ersten beiden Transformationen auf, bei denen die Pflanzen

zweimal in die Agrobakteriensuspension getaucht wurden (Abb. 5B).

Abb. 5 Nachweis rekombinanter Agrobakterien auf Arabidopsis-Samen 4-10 Wochen nach der Pflanzentrans-formation über die floral dip-Methode mittels Kultivierung (A) und SybrGreen real-time PCR (B)

Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler aus der Untersuchung von 6-10 Einzelpflanzen. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen signifikante Differenzen (p<0,05). Das durchschnittliche Samengewicht beträgt 20 µg.

Transgene F1-Pflanzen. Für die Tests der transformierten Arabidopsis-Pflanzen auf

persistierende Agrobakterien war auszuschließen, dass die zu untersuchenden Bakterien bei

der Selektion der Transformanten durch die Phosphinothricin-Applikation abgetötet wurden.

Hierzu wurde zu Projektbeginn die Toleranz des verwendeten Agrobakterienstammes

gegenüber unterschiedlich hohen Phosphinothricinkonzentrationen (5 - 20 mg/l) getestet. Die

Ergebnisse zeigten auch für die höchste geprüfte Konzentration eine vollständige Resistenz

des Stammes, so dass durch die Phosphinothricinanwendung im Selektionsprozess (6 mg/l)

von keiner Schädigung der Agrobakterien auszugehen ist. Die Überdauerung der rekombi-

nanten Agrobakterien wurde danach im Rosetten-, Blüh- und Abreifestadium anhand von 17

Einzelpflanzenproben untersucht.

Im Ergebnis der Kultivierung auf Selektivmedium (R2A mit Rif, Spc) waren in den im

Rosettenstadium und zur Blüte entnommenen Blattproben in keinem Fall rekombinante

Agrobakterien nachweisbar. Auch die Untersuchung der Blatt- und Sprossteile in der

Endphase der Pflanzenentwicklung ergaben keinen positiven Befund. Bei den ebenfalls zu

Vegetationsende beprobten Wurzeln konnten in einer von 15 getesteten Proben rekombinante

Agrobakterien mit einem im Bereich der Nachweisgrenze liegenden Titer von 2,5 KBE/mg

12

FM festgestellt werden (Tab. 4). Der Nachweis des virE2-Gens bestätigte die Identität der auf

dem Selektivmedium gewachsenen Bakterien als Transformationsstamm GV3101 pMP90

pGWB633-AtFBL3.

Neben den Agrobakterien wurde über Kultivierung die Abundanz autochthoner (endo- und

epiphytischer) Bakterien als mögliche Rezipienten für einen Gentransfer ermittelt. Die

Besiedlungsdichten lagen bei den transgenen Pflanzen ebenso wie bei den Kontrollen im

gesamtem Zeitraum mit 103 bis 104 KBE/mg FM auf annähernd gleichem Niveau. Etwas

höhere Populationsdichten mit bis zu 105 KBE/mg FM waren bei der letzten Probenahme an

der Wurzel zu verzeichnen (Tab. 4).

Tab. 4 Kulturabhängige Untersuchung transgener F1-Arabidopsis-Pflanzen auf persistierende Agrobakterien und potentielle Transkonjuganten nach Einsatz der floral dip-Methode

Populationsdichten (KBE/mg FM ± Standardfehler) Arabidopsis

Stadium / Probematerial

Anzahl Testpflanzen

Transgen -T Kontrollen - K

Autochthone

Bakterien

Agro-

bakterien a

Trans-konjuganten b

Rosette / Blatt T 17 2,0 x 104 ± 8,5 x 103 n.d. n.d.

K 2 7,6 x 103 ± 5,2 x 103 n.d. n.d.

Blüte / Blatt T 17 8,3 x 103 ± 4,3 x 103 n.d. n.d.

K 1 5,2 x 104 n.d. n.d.

Seneszenz / Blatt, Spross T 15 2,7 x 103 ± 2,1 x 103 n.d. n.d.

K 1 2,0 x 103 n.d. n.d.

Seneszenz /Wurzel T 15 5,6 x 104 ± 2,0 x 104 n.d. - 2,5 a n.d.

K 2 1,2 x 105 ± 4,2 x 104 n.d. n.d.

a Nachweis des Transformationsstamms in einer der 15 Pflanzen über Rifampicin- und Spectinomycinresistenz sowie über positivem virE2- PCR-Nachweis; NWG: 2 KBE/mg FM

b Test auf potentielle Transkonjuganten über Spectinomycinresistenz und PCR-Nachweis gusA Gen

n.d. - nicht nachgewiesen

Für die Untersuchung eines vom Transformationsstamm ausgehenden Gentransfers in die

pflanzenassoziierte Mikroflora wurden die autochthonen Bakterien auf spectinomycin-

haltigem Medium selektiert und unter gleichen Bedingungen wiederholt ausgestrichen.

Repräsentative Isolate (gruppiert nach phänotypischen Merkmalen) wurden danach mittels

real-time PCR auf das Vorhandensein des vektorspezifischen gusA Gens getestet. Die

Überprüfung der Isolate ergab generell negative Befunde, so dass ein Gentransfer in die

pflanzenassoziierte Mikroflora nicht beobachtet werden konnte (Tab. 4).

In der real-time PCR-Analyse wurden neben den F1-Pflanzen (Blatt-, Spross- und

Wurzelproben) auch die an den transgenen Pflanzen gebildeten F2-Samen getestet. Bei der

Untersuchung der Blattproben im Rosetten- und Blühstadium konnte der Transforma-

13

tionsstamm in jeweils einer von 17 getesteten Pflanzen in Dichten von 72 bzw. 61

Genomen/mg FM nachgewiesen werden. Die in beiden Fällen knapp über der Nachweis-

grenze (30 Genome/mg FM) liegenden positiven Befunde ergaben sich für die betreffenden

Einzelpflanzen nur an jeweils einem Probenahmetermin. In keinem Fall nachweisbar war der

Transformationsstamm dagegen im Pflanzenmaterial zur Zeit der Abreife. Ebenso wurden alle

untersuchten F2-Samen negativ getestet (Tab. 5).

Tab. 5 SybrGreen real time-PCR Test transgener F1-Arabidopsis-Pflanzen auf persistierende Agrobakterien nach Einsatz der floral dip-Methode

Arabidopsis

Stadium / Probematerial

Anzahl Testpflanzen Transgen -T

Kontrollen -K

Agrobakterien – Transformationsstamm

Genome/mg FM a

Rosette / Blatt T 17 n.d. -72 a

K 2 n.d.

Blüte / Blatt T 17 n.d. - 61 a

K 2 n.d.

Seneszenz / Blatt, Spross T 17 n.d.

K 2 n.d.

Seneszenz /Wurzel T 17 n.d.

K 2 n.d.

Seneszenz /Samen (F2) T 17 n.d.

K 2 n.d.

a Nachweis des Transformationsstamms über das virE2-Gen des Helferplasmids pMP90

in jeweils einer von 17 Proben; NWG: 30 Genome/mg FM

4. Diskussion

Mit der floral dip-Methode konnten im Projekt unter Verwendung des binären Vektors

pGWB633-AtFBL3 (Nakamura et al., 2010) transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen mit den

in der Literatur (Clough & Bent, 1998, Martinez-Trujillo et al., 2004) beschriebenen

Transformationsraten von 1-2% erzeugt werden. Die durchgeführten Transformations-

experimente bestätigten somit die Effizienz und besondere Eignung der Methode zur

Pflanzentransformation unter geringen laborativen Voraussetzungen. Ungeklärt war bisher

jedoch die Persistenz der im Dip-Verfahren benutzten rekombinanten Agrobakterien. Im

Projekt wurden hierzu die Samen der gedippten Ausgangspflanzen sowie 17 transgene F1-

Arabidopsis-Pflanzen in drei Entwicklungsstadien (Rosette, Blüte, Seneszenz) mittels

Kultivierung und SybrGreen real-time PCR-Analyse auf das Vorhandensein des

rekombinanten Transformationsstammes untersucht. Der kulturabhängige Test der F1-Samen

14

ergab basierend auf 4 Transformationen bei 80% der untersuchten Einzelpflanzen einen

Besatz mit lebenden Agrobakterien. Der Anteil der kontaminierten Samen lag im Mittel der

untersuchten Pflanzen bei 4 - 12%. Entsprechend wurden in der real-time PCR-Analyse, bei

der auch abgestorbene Zellen erfasst werden, hohe Zelldichten der Agrobakterien mit bis zu

105 Genomen pro Samen gefunden. Im Unterschied zu den Samen der gedippten

Ausgangspflanzen erwiesen sich die transgenen F1-Pflanzen meist „Agrobakterien-frei“.

Lediglich in 1-2 von 64 bzw. 68 getesteten Einzelproben (Kultivierung bzw.

PCR) wurden rekombinante Agrobakterien mit Abundanzen im Bereich der Nachweisgrenze

gefunden. Die Untersuchung der an den transgenen Pflanzen gebildeten F2-Samen ergab

generell keinen positiven Befund, so dass kein Anhaltspunkt bestand, dass Agrobakterien

über die F1-Generation hinaus an bzw. in den Arabidopsis-Pflanzen persistieren können.

Insgesamt lagen somit auch keine adäquaten Voraussetzungen zur Detektion eines von den

rekombinanten Agrobakterien ausgehenden Gentransfers in die autochthone Mikroflora der

Arabidopsis-Pflanzen vor (Ulrich et al., 2006), was durch die Analysen bestätigt wurde.

Durch die zuvor überprüfte Phosphinothricintoleranz des Transformationstamms ist das

„Verschwinden“ der rekombinanten Agrobakterien nicht durch die Herbizidapplikation

während der Selektion der Transformanten zu erklären. Die zur Transformation benutzten

Agrobakterien waren offensichtlich nicht in der Lage, längerfristig auf bzw. in den

Arabidopsis-Samen und Keimlingen zu überdauern und sich hierüber in den aufwachsenden

Pflanzen zu etablieren. Zum einen scheinen die Agrobakterien eine längere Lagerung der

trockenen Samen kaum bzw. nur bei einem starkem Abfall des Titers zu überleben.

Andererseits ist zu vermuten, dass auch bei der Keimung der Arabidopsis-Samen, die

verbliebenen Agrobakterien aktiv durch das Ausscheiden von bakteriziden Substanzen

abgetötet werden.

Das Absterben von Bakterien auf Samen ist auch als Risikofaktor aus der Praxis der

Sameninokulation zur Ertragssteigerung durch wachstumsfördernde Bakterien bekannt

(Deaker et al., 2004). Inokulationsversuche an Lupinensamen mit Bradyrhizobien zeigten

beispielsweise 4 Stunden nach Inokulation einen Rückgang des Bakterientiters auf 4,8% und

nach 22 Stunden Lagerung im Boden einen Rückgang auf 0,83% (Roughley et al., 1993). Bei

allen bekannten Inokulationstechniken wird das geringe Überleben von Rhizobien auf die

Hauptfaktoren ungünstige Lagerungstemperatur, Austrocknung und Samentoxizität

zurückgeführt (Deaker et al., 2004). Speziell die Samenexsudate von Leguminosen enthalten

verschiedene Gruppen von Inhaltsstoffen, die das Wachstum von Rhizobien und anderen

Bakterien hemmen (Bowen, 1961, Materon & Weaver, 1984). Antimikrobielle Substanzen

wurden auch in Samen anderer Pflanzen (z.B. Zea mays, Amaranthus caudatus) gefunden und

15

hinsichtlich ihrer Wirkungen auf bakterielle Parameter untersucht (Broekaert et al., 1992,

Duvick et al., 1992, Emmert et al., 1998, Carvalhais Costa, 2010). Auch für unsere Studie ist

daher anzunehmen, dass die auf den Arabidopsis-Samen unmittelbar vor der Aussaat noch

lebenden Agrobakterien wahrscheinlich ebenfalls durch toxische Effekte im Keimprozess

abgetötet worden sind.

Generell sollte bei der Einordnung der Ergebnisse aber auch die Vielzahl der Studien

berücksichtigt werden, die eine Persistenz und systemische Ausbreitung pathogener und

endophytischer sowie rekombinanter Agrobakterien in unterschiedlichen Pflanzen belegen

(Cubero & López, 2004, Cubero et al., 2006). Dabei wurden nichtpathogene Agrobakterien

auch als natürliche Besiedler von Rapssamen nachgewiesen (Weller et al., 2002).

Hervorzuheben ist insbesondere die über 30 Jahren praktizierte wirtschaftliche Nutzung

nichtpathogener Agrobakterienstämme (z.B. Agrobacterium rhizogenes K84, K1026) in der

biologischen Kontrolle pathogener tumorbildender Agrobakterien. Die bacteriocinprodu-

zierenden Agrobakterien gelangen hierbei ähnlich wie im floral dip-Verfahren über das

Eintauchen von Samen, Keimpflanzen oder Stecklingen in die Agrobakteriensuspension in die

zu behandelnden Pflanzen (New & Kerr, 1972, Kerr, 1980, Ryder & Jones, 1991, Gupta et

al., 2010). Hauptsächlich unter diesen Aspekten scheint die Etablierung rekombinanter

Agrobakterien ein komplexes, von mehreren Einflussfaktoren abhängiges Phänomen zu sein,

das auch stark von der Pflanzenart abhängt. Unsere Ergebnisse können daher nur für

Arabidopsis thaliana gelten. Die Frage der Überdauerung und des Austragspotenzials der

Agrobakterien nach der Transformation anderer Pflanzen wie zum Beispiel Raps bleibt offen.

5. Zusammenfassung und Schussfolgerungen

Zur Untersuchung des Überdauerungs- und Austragspotenzials von gentechnisch veränderten

Agrobakterien nach Einsatz in der floral dip - Methode wurden unter Verwendung des binären

Vektors pGWB633-AtFBL3 in vier Versuchsanätzen transgene Arabidopsis-Pflanzen mit

Transformationsraten von 1-2% erzeugt. Basierend auf der vektorvermittelten Phosphino-

thricinresistenz erfolgte die Selektion der Transformanten im Minigewächshaus durch

mehrmaliges Sprühen der Keimpflanzen mit Phosphinothricin. Im anschließenden Test auf

GUS-Aktivität wurde die Transgenität überprüft. Aus zwei von vier Transformationen wurden

insgesamt 17 transgene Einzelpflanzen für die Tests ausgewählt.

Das Vorhandensein rekombinanter Agrobakterien wurde zunächst an den Samen der

gedippten Ausgangspflanzen untersucht. Zwei bis acht Wochen nach Lagerung der Samen

konnte über Kultivierung auf Selektivmedium ein starker Besatz mit lebenden Agrobakterien

16

nachgewiesen werden. Entsprechend ergaben sich in der real-time PCR-Analyse hohe

Abundanzen von bis zu 105 Genomen pro Samen. Die Persistenz der rekombinanten

Agrobakterien wurde anschließend in der aus den Samen aufgewachsenen transgenen F1-

Generation anhand von insgesamt 68 Einzelpflanzenproben aus den Entwicklungsstadien

Rosette, Blüte und Seneszenz untersucht. Im Gegensatz zu den zuvor getesteten F1-Samen

konnte der Transformationsstamm hier lediglich kulturabhängig in einer Wurzelprobe sowie

über real-time PCR in zwei Blattproben jeweils im Bereich der Nachweisgrenze detektiert

werden. In keinem Fall war der Transformationsstamm auf bzw. in den F2-Samen

nachweisbar. Als mögliche Ursache für das „Verschwinden“ der Agrobakterien in den F1-

Pflanzen können ausgehend von Befunden bei einigen anderen Pflanzenarten toxische Effekte

bei der Samenkeimung bzw. die Austrocknung während der Lagerung angenommen werden.

Im Ergebnis der Studie ist somit nicht von einer über die F1-Generation hinausgehenden

Persistenz der rekombinanten Agrobakterien und eines damit verbundenen Austrags

rekombinanter DNA nach Anwendung der floral dip Methode bei Arabidopsis auszugehen.

Daher sollten die in den gentechnischen Anlagen gegenwärtig praktizierten Verfahren zur

Entsorgung behandelter Arabidopsis-Pflanzen und des mit ihnen in Kontakt stehenden Erd-

und Topfmaterials (Autoklavieren bis F1-Generation, Dämpfen in Folgegenerationen)

ausreichend sein.

Die Ergebnisse der Studie gelten ausschließlich für das floral dip Verfahren bei Arabidopsis

thaliana. Da eine von Samen ausgehende Etablierung von Agrobakterien bei verschiedenen

Kulturarten in der Literatur bekannt ist und auch über Sameninokulationsverfahren wirtschaft-

liche Anwendung erfährt, bleibt grundsätzlich offen, ob und inwieweit zur Pflanzentrans-

formation genutzte Agrobakterien bei der floral dip-Behandlung anderer Pflanzen als

Arabidopsis thaliana persistieren und in die Umwelt ausgetragen werden können.

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