EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus … · 2017-12-18 · Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian ekstrak metanol ... cisplatin dan 5-flurourasil

EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.)

SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS

(HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Lela Francisca Adi Liana

NIM : 138114154

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

HALAMAN JUDUL

EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.)

SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS

(HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Lela Francisca Adi Liana

NIM : 138114154

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017


ii


iii


iv


v


vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

Saya persembahkan skripsi ini untuk:

Tuhan Yesus Kristus

Kedua orang tuaku

Sahabat dan teman-teman

Angkatan farmasi 2013

Dan Almamaterku, Universitas Sanatha Dharma


vii

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala berkat, serta

penyertaan yang dilimpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis

L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS

(HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2” sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan

gelar sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

Penyeleseaian skripsi ini tentunya tidak lepas dari bantuan berbagai pihak,

baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu penulis hendak

mengucapkan terimakasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata

Dharma.

2. Ibu Dr. Riris I. Jenie, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing utama atas segala

bimbingan, waktu dan kesabaran yang telah diberikan untuk memberi

masukan, dukungan, saran, dan motivasi kepada penulis dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D.,

Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan masukan dan saran

yang sangat berharga dalam penyusunan skripsi ini.

4. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. dan Bapak Florentinus Dika Octa

Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing akademik penulis atas

pendampingan, bimbingan, arahan serta dukungan kepada penulis selama ini.

5. Dr. Dewi Setyaningsih S.Si., Apt., M.Sc. yang telah memberikan ijin dalam

penggunaan laboratorium dan fasilitas guna menunjang penelitian.

6. Bapak Wagiran selaku laboran Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas

segala bantuan dan dukungan yang diberikan serta dinamika di laboratorium

selama melakukan penelitian.

7. Prof. dr. Supargiyono, Ibu Atin selaku supervisor dan teknisi Laboratorium

Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

yang telah membantu dan membimbing selama melakukan penelitian.


viii

8. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta atas ilmu serta bimbingan yang dibagikan.

9. Keluarga terkasih, Bapak, Ibu, adek yang selalu mendoakan, mendukung, dan

memberi semangat dalam setiap proses perjalanan penulis sehingga penulis

dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu.

10. Saudara dan saudari saya yang terkasih Mbak Viona dan Mbak Antik yang

selalu mendukung dan menyemangati penulis.

11. Sahabat seperjuangan dalam penelitian Bcl-2: Fira Elsa Septiana dan Maria

Nareswari atas segala dinamika, kebersamaan, dukungan serta semangat agar

dapat mengenakan toga bersama tepat waktu.

12. Sahabat-sahabat penulis Abraham, Upik, Lala, Kak Tika, Futuristic (Reny,

Ivan, Rosa, Galih), Geng metropolitan, atas kebersamaan, dukungan, dan selalu

menjadi tempat berbagi suka dan duka bagi penulis.

13. Teman – teman FSM D 2013 dan FKK C 2013, serta angkatan 2013 atas

kebersamaan yang indah.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, maka

penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak yang membangun sehingga

membuat karya yang lebih baik. Penulis mohon maaf atas segala kesalahan dan

kekurangan yang terdapat dalam skripsi ini. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat

bagi semua pihak.

Yogyakarta, 28 Januari 2017

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ..................................................... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... iv

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI .................................................. v

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. vi

PRAKATA .................................................................................................. vii

DAFTAR ISI ............................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ....................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xii

ABSTRAK .................................................................................................. xiii

ABSTRACT .................................................................................................. xiv

PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ............................................................................ 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 7

KESIMPULAN ........................................................................................... 14

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 15

LAMPIRAN ................................................................................................ 18

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 29


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode flowcytometry ..................... 12

Tabel II. Perhitungan Ekspresi Bcl-2 ........................................................... 14

Tabel III. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Cisplatin .. 23

Tabel IV. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Ekstrak

Metanol Daun Rosemary ............................................................... 23


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis ............... 9

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin

pada sel kanker serviks HeLa ..................................................... 9

Gambar 3. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam

menginduksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa ................ 11

Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam

menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker serviks HeLa .............. 13

Gambar 5. Tanamanan rosemary dan serbuk daun rosemary ....................... 21

Gambar 6. Ekstraksi dengan refluks dan pemekanatan dengan vaccum

rotary evaporator ........................................................................ 21

Gambar 7. Ekstrak metanol daun rosemary .................................................. 21


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun rosemary . 19

Lampiran 2. Surat ethical clearance ........................................................ 20

Lampiran 3. Ekstrak metanol daun rosemary dan alat yang digunakan .. 21

Lampiran 4. Seri konsentrasi cisplatin dan ekstrak ................................. 22

Lampiran 5. Tabel viabiltas sel kanker serviks HeLa .............................. 23

Lampiran 6. Hasil analisis flowcytometry ................................................ 24

Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa . 27


xiii

ABSTRAK

Kanker serviks memiliki karakter ekspresi protein Bcl-2 berlebih sehingga

dapat menghambat proses apoptosis. Salah satu pengobatan standar pada kanker

serviks dengan menggunakan cisplatin, namun dewasa ini, meningkatnya resistensi

cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Salah satu tanaman yang

sudah banyak diteliti di berbagai sel kanker dan memiliki aktivitas antikanker adalah

daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) yang diekstraksi menggunakan metanol.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian ekstrak

metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa. Penelitian awal dilakukan

untuk mengetahui penghambatan viabilitas sel dengan menggunakan metode MTT,

dilanjutkan dengan uji flowcytometry untuk mengetahui potensi ekstrak metanol daun

rosemary dalam menginduksi apoptosis. Ekspresi protein Bcl-2 dianalisis

menggunakan metode imunositokimia. Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak

metanol daun rosemary memiliki efek sitotoksik lemah dengan nilai IC50 sebesar 320

µg/mL, dan jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak

metanol daun rosemary mampu menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji

flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia

menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menekan kuat ekspresi

protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan induksi apoptosis

diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks. Berdasarkan

hasil tersebut, perlu penelitian lebih lanjut mengenai potensi kemoprevensi ekstrak

metanol daun rosemary dalam meregulasi protein lainnya pada induksi apoptosis.

Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Rosmarinus officinalis L., Sel HeLa.


xiv

ABSTRACT

Cervical cancer has a character of Bcl-2 protein over expression that can be

inhibit apoptosis. The standard treatment for cervical cancer using cisplatin, yet

nowaday, the increase of cisplatin resistence often lead to the failure of

chemotherapy. One of plants that has been widely studied in various cancer cells and

having anticancer activity is the leaves of rosemary (Rosmarinus officinalis L.)

which is extracted using methanol. The aim of this study was to determine the effect

of rosemary leaves methanol extract against HeLa cervical cancer cells. The initial

research was conducted to determine cell viability using MTT, followed by a test

using a flowcytometry to detect cells undergo apoptosis. The expression of the Bcl-2

protein was analyzed using immunocytochemistry. The cell viability assay results

shows that methanol extract of rosemary leaves have a lower cytotoxic effect on 50%

inhibitory concentration (IC50) of 320 µg/mL, the cell death pathway on ½ IC50

shows the amount of apoptotic cells are 27% using a flowcytometry with 24 hours

incubation period. Immunocytochemistry showed that the methanol extract of

rosemary leaves potentially suppress the expression of the Bcl-2, so the possibility

induction of apoptosis mediated by suppress the expression of the Bcl-2 protein in

cervical cancer cells. Based on this result, further research is needed on the

chemoprevention potential of rosemary leaves methanol extract on the regulation of

other proteins in inducing apoptosis.

Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Rosmarinus officinalis L., HeLa cells.


1

PENDAHULUAN

Kanker menjadi salah satu penyebab kematian yang utama di seluruh dunia.

Jumlah kasus baru terkait kanker diperkirakan akan meningkat menjadi 70% selama dua

dekade ini. Kanker serviks merupakan jenis kanker paling umum kedua yang terjadi pada

wanita di Indonesia (IARC, 2015).

Kanker serviks sebagian besar disebabkan oleh human papillomavirus (HPV),

penyebaran infeksi oleh virus tersebut sebagian besar melalui hubungan seksual. Ibeanaum

(2011) mengatakan bahwa DNA onkogenik ditemukan dalam 95% HPV penyebab kanker

serviks. Infeksi HPV pada sel kanker serviks HeLa berikatan dengan tumor suppressor

protein p53, dimana p53 ekspresinya tertekan (Goodwin dan DiMaio, 2000). Penekanan

p53 akan menginduksi protein anti-apoptosis B cell lymphoma-2 (Bcl-2) sehingga jumlah

protein anti-apoptosis berlebih dan menyebabkan kemampuan sel untuk apoptosis menurun

sehingga memicu terjadinya kanker. Dengan demikian, Bcl-2 dapat menjadi salah satu

target molekuler dalam penemuan pengobatan kanker serviks.

Usaha pengobatan kanker sudah banyak dilakukan, namun sampai saat ini belum

ditemukan obat yang mengatasi kanker secara memuaskan. Kemoterapi menggunakan

cisplatin dan 5-flurourasil (5-FU) adalah salah satu strategi untuk pengobatan kanker

serviks (American Cancer Society, 2015). Pengobatan tersebut memiliki keterbatasan yaitu

dewasa ini penggunaan cisplatin sudah resisten. Resistensi cisplatin menyebabkan

kegagalan pada kemoterapi, dan peningkatan dosis cisplatin tidak terbukti efektif karena

pasien akan mengalami dose-dependent toxicity (Leisching, dkk., 2015). Menurut

Hemaiswarya dan Doble (2013), pengobatan mengunakan 5-FU belum cukup efektif

dalam melawan kanker serviks. Oleh karena itu, dibutuhkan agen kemoprevensi yang

selektif terhadap kanker serviks.

Kemoprevensi merupakan suatu langkah untuk mencegah, menunda, ataupun

melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintetik, atau

kombinasi dari keduanya. Mekanisme utama dalam menghambat karsinogenesis yaitu

dengan menghambat aktivasi karsinogen dan induksi sitokrom. Dari studi yang telah

dilakukan selama empat dekade terahir ini, banyak target molekul yang terbukti dihambat

oleh agen kemopreventif. Salah satu target molekul yang dihambat yaitu protein anti-

apoptosis seperti Bcl-2 (Sharma, 2012).

Daun rosemary yang diekstraksi menggunakan metanol mengandung berbagai

senyawa kimia antara lain asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat, yang


2

mempunyai khasiat sebagai antikanker (Abe, dkk., 2002). Ekstrak metanol daun rosemary

telah ditemukan untuk menghambat proliferasi sel kanker seperti kanker paru-paru dengan

nilai IC50 sebesar 24,08 μg/mL, kanker payudara dengan nilai IC50 sebesar 20,42 μg/mL,

dan kanker hati dengan nilai IC50 sebesar 22,88 μg/mL (Yesil-Celiktas, dkk., 2010).

Menurut Anggraeni (2015) ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik

pada sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 13,95 μg/mL dan mampu menginduksi

apoptosis 19,68%. Asam betulinat pada sel kanker serviks HeLa juga memiliki aktivitas

antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar 30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis

(Xu, dkk., 2014). Menurut Yim dkk. (2006) asam ursolat sebesar 15 μM mampu

menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa, serta menginduksi apoptosis.

Berdasarkan data diatas, maka menarik untuk diteliti lebih lanjut mengenai pengembangan

daun rosemary sebagai agen kemopreventif pada kanker serviks HeLa.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak metanol daun rosemary

terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan

pengaruh terhadap regulasi protein Bcl-2 yang merupakan agen anti-apoptosis. Sel kanker

serviks HeLa dipilih karena bersifat immortal dan produktif sehingga banyak digunakan

dalam berbagai penelitian ilmiah (Capes, dkk., 2010). Karakteristik sel kanker serviks

HeLa memiliki ekspresi p53 dalam jumlah yang kecil, dan overekspresi Bcl-2. Uji aktivitas

sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa dengan metode

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT). Uji flowcytometry

dengan menggunakan staining Annexin V Flous untuk mengetahui sel yang mengalami

apoptosis, dan metode imunositokimia terhadap ekspresi protein Bcl-2. Dengan demikian

diharapkan hasil penelitian ini dapat memberikan tambahan informasi mengenai agen

kemopreventif pada kanker serviks.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel kanker serviks HeLa yang

didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, dan

tanaman rosemary dibeli dari Dipokusumo Farm yang ditanam di kebun Malang. Bahan

kimia yang digunakan adalah metanol absolut, metanol 60%, media kultur medium

DMEM, Tripsin EDTA 0,025%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium Dodecyl

Sulfate) 10% dalam HCl 0.01 N, DMSO (Merck) dengan konsentrasi tertinggi 0,16%,


3

akuades, reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) mengandung 100 mL buffer (2 mL

of 2 mL Annexin V and Propidium Iodide), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary

monoclonal antibody mouse anti-human Bcl-2 Oncoprotein (Dako), biotinylated universal

secondary antibody (Biocare), substrat DAB, cisplatin 10 mg/10 mL yang didapatkan dari

Kalbe Farma.

Alat Penelitian

Alat–alat gelas steril (Pyrex), waterbath (Memmert), rotary evaporator (Buchi

Labortechnik AG CH-99230), oven, 96 well-plate (Iwaki), 6 well-plate (Iwaki), sentrifuge

tube, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air flow cabinet

(Labconco), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera

digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus),

flowcytometer (FACS Calibur).

Pembuatan serbuk daun rosemary kering

Tanaman rosemary dibeli dari Dipokusumo Farm yang ditanam di kebun Malang,

dan dideterminasi di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah

Mada (Lampiran 1). Bagian tanaman yang digunakan adalah daun. Daun yang akan dipilih

yaitu daun tua yang segar yang terletak bagian tengah pada tanaman antara cabang daun ke

lima dari bagian atas tanaman dan daun ke lima dari bawah tanaman, bentuk masih utuh,

dan berwarna hijau pekat. Daun rosemary dipisahkan dari batang dan akarnya, serta

pengotor lainnya seperti tanah yang menempel pada daun. Pencucian daun rosemary

dilakukan dengan menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali. Kemudian dilakukan

pengeringan menggunakan oven suhu 40-50oC. Daun rosemary yang telah kering tersebut,

kemudian diblender hingga hancur dan diperoleh serbuk halus simplisia daun rosemary.

Pembuatan ekstrak metanol daun rosemary

Serbuk simplisia daun rosemary sebanyak 7,3 g dimasukkan dalam labu alas bulat

500 mL, dan ditambahkan 30 mL metanol absolut, direfluks pada suhu 60oC selama 30

menit. Proses refluks diulang sampai pelarut tidak berwarna dengan menggunakan pelarut

yang baru, dan terhadap hasil refluks dilakukan penyaringan, digabungkan, dan dipekatkan

menggunakan rotary evaporator sampai metanol menguap, kemudian dilanjutkan dengan

menggunakan waterbath pada suhu 80oC sampai mencapai bobot tetap. Residu serbuk

diambil sebanyak 0,5 g dan ditambahkan metanol 60% sebanyak 10 mL, kemudian

divortex selama 1 menit. Setelah divortex, larutan disentrifugasi selama 15 menit dengan

kecepatan 3000 rpm, disaring dan diambil endapan yang terbentuk. Endapan ditambahkan


4

10 mL metanol absolut, disaring, dan cairan dipekatkan menggunakan waterbath pada

suhu 80oC sampai mencapai bobot tetap (Abe, dkk., 2002; Anggraeni, 2015).

Pembuatan larutan uji

Sampel (Ekstrak metanol daun rosemary)

Ekstrak kering daun rosemary ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan

kedalam 100 μl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000

μg/mL. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi sebesar 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL,

62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL, 15,625 μg/mL.

Kontrol positif (Cisplatin)

Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10 mL, kemudian dibuat larutan stok dengan

konsentrasi 1.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi sebesar 78 μg/mL, 39 μg/mL,

20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL.

Panen Sel

Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga konfluen 80% yang

terlihat monolayer di bawah mikroskop, kemudian media kultur DMEM dibuang terlebih

dahulu menggunakan mikropipet. PBS ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci,

kemudian dibuang dan ditambahkan tripsin 0,025% secara merata dalam cawan petri.

Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas.

Pindahkan ke dalam ke conical tube, tambahkan PBS 10 mL, dan disentrifuge selama 10

menit. PBS dibuang, endapan diberi media kultur DMEM 2 mL, disuspensi dan dicuplik

sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel

yang diperlukan selama pengujian. Perhitungan jumlah sel :

1 2 3 4

4

(Nobakht, dkk., 2014; CCRCd, 2009).

Uji Sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary pada sel HeLa

Sel sebanyak 1x106 sel/mL yang telah diinkubasi selama 24 jam dan didapati

sudah konfluen dapat segera diberi perlakuan. Media kultur dibuang terlebih dahulu. Pada

sumuran 96 well-plate diberi 100 μL seri konsentrasi sampel dan seri konsentrasi cisplatin.

Kolom kontrol sel hanya diberi media kultur, dan kolom kontrol media hanya dikosongkan

tanpa diberi media kultur, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2.

Setelah diinkubasi selama 24 jam, media kultur dibuang, kemudian tambahkan 100 μL

larutan MTT 5 mg/mL yang telah disiapkan dan diinkubasi selama empat jam di dalam

x 104/mL x faktor pengenceran


5

inkubator CO2. Setelah empat jam, tambahkan 100 μL reagen stopper SDS 10% dalam

0,1N HCl. Plate dibungkus menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat yang

gelap (suhu ruangan) selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan pembacaan absorbansi

dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm yaitu pada daerah

cahaya tampak (Xu, dkk., 2014; CCRCc, 2009).

Uji apoptosis dengan metode flowcytometry

Sel dengan populasi 1 x 106/mL ditanam pada 6 well-plate, dan diinkubasi selama

24 jam. Setelah diinkubasi, tiap lubang diberi sampel ekstrak konsentrasi ½ IC50 dan

cisplatin konsentrasi ½ IC50 sebanyak dua mL, dan diinkubasi selama 24 jam dalam

inkubator CO2. Setelah inkubasi selama 24 jam, media dipindahkan dalam conical tube

dengan menggunakan mikropipet. Well-plate dicuci dengan menggunakan PBS sebanyak

satu mL, kemudian diambil dan dipindahkan ke dalam conical tube. Pada well-plate diberi

tripsin 0,025% sebanyak satu mL, diinkubasi selama 3 menit, dan ditampung lagi ke

dalam conical tube. PBS ditambahkan hingga 10 mL dan conical tube disentrifuge selama

10 menit. Supernatan dibuang, sisa endapan ditambahkan PBS dingin sebanyak satu mL.

Resuspensi dilakukan dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan ke dalam micro

tube 1 mL, disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan dibuang

dan disisakan endapan yang terbentuk, ditambahkan 100 μL reagen Annexin V Fluos ke

dalam endapan sampel. Inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap. Buffer 300 μL

ditambahkan di dalam micro tube kemudian hasil dibaca menggunakan flowcytometer

FACS Calibur (Huang, dkk., 2015; CCRCb, 2009).

Uji Imunositokimia

Sel HeLa dengan populasi 2 x 105 ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi

cover slip. Setelah inkubasi 24 jam dan sel telah konfluen, media kultur dibuang. Sel diberi

perlakuan dengan menambahkan 1 mL sampel konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi

IC50, diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2. PBS ditambahkan ke cover slip, lalu

dibuang. Penambahan PBS dilakukan sebanyak dua kali dan difiksasi menggunakan

metanol 300 μL dengan tujuan untuk mempertahankan morfologi sel, diinkubasi selama 10

menit, lalu dibuang. Cover slip diambil dan dipindahkan ke kaca preparat, kemudian cover

slip ditambahkan larutan hidrogen peroksida (H2O2) sebanyak 1 mL untuk menghambat

peroksidase endogen, diinkubasi selama 10 menit, lalu dibuang. Cuci cover slip dengan

akuades sebanyak 1 mL. PBS 1 mL ditambahkan pada cover slip, dan didiamkan selama 5

menit, lalu dibuang. Cover slip diberi larutan blocking 20 μL selama 10 menit untuk


6

mencegah ikatan tidak spesifik antibodi sekunder, lalu dibuang, diberi antibodi primer 50

μL didiamkan selama 1 jam, setelah itu dibuang dan diberi PBS diulang sebanyak dua kali.

Kemudian cover slip diberi antibodi sekunder 30 μL diinkubasi selama 20 menit, lalu

dibuang dan diberi PBS didiamkan selama 2 menit dan diulang 2 kali. Reagen yang berisi

kompleks streptavidin sebanyak 30 μL untuk memperjelas pewarnaan dan diinkubasi

selama 10 menit, lalu ditambahkan PBS inkubasi 2 menit, lalu dibuang, dan diulang 2 kali.

Cover slip diberi larutan diaminobenzidin (DAB) sebagai pewarna coklat sebanyak 50 μL

diinkubasi selama 7 menit, dan ditambahkan akuades lalu dibuang. Larutan

MayerHaematoxylin ditambahkan dan diinkubasi selama 3 menit yang berguna untuk

memberikan kontras warna atau membedakan warna sel, lalu ditambahkan akuades dan

dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset dan digenangi etanol, lalu cover slip

dikeringkan. Cover slip diletakkan di atas object glass, dan ditetesi dengan lem (mounting

media), kemudian ditutup dengan cover slip kotak. Pengamatan dilakukan dengan

mikroskop cahaya (Guimaraes, dkk., 2005; CCRCa, 2009).

Analisis Hasil

Analisis nilai IC50

Data absorbansi pada setiap sumuran dari uji MTT diperlukan untuk dikonversi

menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung

menggunkan rumus:

Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi

linear konsentrasi versus persen viabilitas sel menggunakan program Microsoft Excel

(Setiawati, Handika, & Utami, 2016; CCRCc, 2009).

Analisis Apoptosis Sel

Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang

terhubung dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan,

kemudian dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Warna hijau menunjukkan sel

hidup (Annexin-/PI

-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis

(Annexin+/PI

-), merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin

+/PI

+)

(Hingorani, dkk., 2011), dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin-

/PI+) (Nurzijah, dkk., 2012).


7

Analisis Uji Imunositokimia

Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna

coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu menunjukkan tidak terdapat

ekspresi protein Bcl-2.

Pengamatan secara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan

data dilakukan dengan bantuan tiga orang responden (blind reader) untuk menghitung

jumlah sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap

preparatnya.

Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan :

a. 0 : kurang dari 5% (Sangat kuat)

b. 1+ : 6% - 25% (Kuat)

c. 2+ : 26% - 50% (Sedang)

d. 3+ : 51% - 75% (Lemah)

e. 4+ : 76% - 100% (Sangat lemah)

(Zang, dkk., 2002).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan ekstrak daun rosemary pada penelitian ini dilakukan dengan metode

refluks menggunakan pelarut metanol. Refluks merupakan cara ekstraksi menggunakan

pemanasan. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus mampu melarutkan senyawa

yang diharapkan, dan memiliki titik didih lebih rendah dibandingkan dengan senyawa

target, dengan hal tersebut kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metanol merupakan

pelarut yang mampu menyari senyawa bersifat polar maupun nonpolar, sehingga

diharapkan senyawa target dalam daun rosemary mampu tersari dengan baik. Ekstraksi

yang dilakukan pada penelitian ini dengan metode refluks menggunakan pelarut metanol

didapatkan rendemen sebesar 12%.

Berdasarkan penelitian Abe dkk. (2002), diketahui bahwa daun rosemary yang

diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol mampu menyari senyawa aktif seperti

asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Metode refluks dapat digunakan pada

metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik didih yang tinggi

% Ekspresi Bcl-2 :

x 100%


8

yaitu asam betulinat sebesar 295-298oC, asam oleanolat sebesar 300

oC, asam ursolat

sebesar 284oC, dan pelarut metanol yang digunakan memiliki titik didih 64,5

oC. Pada

penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan senyawa ekstrak metanol daun rosemary,

namun diperkirakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antikanker

oleh adanya senyawa-senyawa tersebut. Penelitian lain menggunakan asam betulinat pada

sel kanker serviks HeLa memiliki aktivitas antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar

30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis Xu, dkk., 2014 . Menurut Yim dkk. 2006)

asam ursolat sebesar 15 μM mampu menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa.

Asam oleanolat sebesar 40 μM memiliki efek sitotoksik dan mampu menginduksi apotosis

pada sel kanker hati HepG2 (Wang, dkk., 2013).

Perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, cuaca, dan kondisi lingkungan

menyebabkan kandungan senyawa aktif dalam daun rosemary berbeda-beda, namun

dengan menggunakan metode ekstraksi yang sama pada penelitian sebelumnya oleh Abe

dkk. (2002) diharapkan senyawa yang tersari sama dengan penelitian tersebut. Menurut

Yesil-Celiktas dkk. (2010), menyatakan bahwa ada beberapa kandungan senyawa aktif

lainnya yang diidentifikasi dari daun rosemary antara lain asam carnosic, dan asam

rosmarinic. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi

kandungan senyawa dalam ekstrak metanol daun rosemary.

Uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT)

merupakan uji yang digunakan untuk mengukur viabilitas sel. MTT masuk ke dalam sel

dan direduksi oleh enzim suksinat dehydrogenase menjadi formazan berwarna ungu yang

tidak larut dan pada mitrokondria (Riss, dkk., 2013). Sel HeLa yang hidup ditandai dengan

terbentuknya kristal formazan berwarna ungu, sehingga metode ini dapat digunakan untuk

mengukur viabilitas sel. Formazan tersebut dapat larut setelah ditambahkan stopper (SDS),

sehingga dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan ELISA reader dan dapat

mengetahui IC50 dari ekstrak.

Aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks

HeLa memberikan pengaruh pada morfologi sel setelah 24 jam perlakuan. Pada kelompok

kontrol sel, sel berbentuk poligonal dan menempel pada plate (Gambar 1A). Pada

kelompok perlakuan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi 62,5 μg/mL (Gambar 1B),

morfologi sel HeLa terlihat mengkerut yang ditandai dengan sel berbentuk bulat, tidak

menempel pada plate, serta kepadatan sel berkurang, begitu juga pada kelompok perlakuan

cisplatin (Gambar 1C).


9

Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah perlakuan

dengan ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. (A) Morfologi kontrol

sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak metanol daun rosemary dengan konsentrasi 62,5 μg/mL.

(C) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 μg/mL. Keterangan : menunjukkan

sel menjadi mengkerut (berbentuk bulat), menunjukkan sel hidup dengan bentuk sel poligonal.

Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin pada sel kanker serviks HeLa. Sel

HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri

konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan

metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary selama 24 jam.

(B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam.

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 600

Via

bil

itas

sel

(%)

Ekstrak metanol daun rosemary (µg/mL)

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60 80 100

via

bil

itas

sel

(%)

Cisplatin (µg/mL)

A B C

A

B


10

Hasil yang didapatkan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary

memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320

µg/mL (Gambar 2A) dan nilai IC50 cisplatin yaitu sebesar 36 µg/mL (Gambar 2B).

Semakin tinggi konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary yang diberikan, sel HeLa yang

hidup semakin berkurang. Secara umum efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary

menunjukkan fenomena dose-dependent. Cisplatin adalah first line agen kemoterapi yang

dalam pengobatan kanker serviks. Oleh karena itu cisplatin dapat dijadikan sebagai kontrol

positif dalam pengembangan agen kemoprevensi.

Potensi suatu ekstrak dikatakan sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga

kategori yaitu agen sitotoksik kuat apabila nilai IC50 < 20 µg/mL, sedang apabila memiliki

nilai IC50 < 50 µg/mL dan lemah apabila nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey, dkk., 2014).

Menurut Machana dkk. (2011), menyatakan bahwa ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai

antikanker apabila nilai IC50 >500 µg/mL. Berdasarkan kriteria tersebut maka dapat

dikatakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik atau memiliki aktivitas

antikanker yang lemah terhadap sel kanker serviks HeLa.

Ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks

HeLa, namun tetap dapat dijadikan agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat pada obat

kemoterapi cisplatin memiliki kelemahan yaitu tidak selektif terhadap sel kanker, cisplatin

bersifat toksik pada sel kanker dan sel normal sehingga muncul efek samping (Dasari dan

Bernard, 2014). Oleh karena itu, dengan ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik

terhadap sel kanker serviks HeLa, maka diharapkan tidak bersifat toksik terhadap sel

normal, namun tetap diperlukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan aktivitas

sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal.

Ekstrak metanol daun rosemary memiliki efikasi pengobatan yang rendah yang

disebabkan efek sitotoksik lemah pada sel kanker serviks, sehingga untuk meningkatkan

efikasi pengobatan ekstrak metanol daun rosemary dapat dikombinasikan dengan agen

kemoterapi yang sudah ada seperti cisplatin. Kombinasi tersebut bertujuan untuk

meningkatan efikasi dengan mengurangi efek toksik cisplatin pada sel atau jaringan normal

dan resistensi (Hemaiswarya dan Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan

untuk mengetahui efek sinergis dari kandungan ekstrak metanol daun rosemary dan obat

kemoterapi.


11

Jenis kematian sel dibagi menjadi dua yaitu melalui apoptosis dan nekrosis.

Apoptosis adalah kematian sel yang terprogram, hal ini memicu fagositosis oleh makrofag,

tanpa menimbulkan inflamasi (Hanahan dan Weinberg, 2000). Metode flowcytometry

digunakan dalam penelitian ini untuk mengetahui jenis kematian sel dan menampilkan data

secara kuantitatif.

Sel- sel normal bersifat hidrofobik dan memiliki membran fosfolipid. Pada bagian

luar lipid bilayer terdapat fosfatidilkolin dan sfingomielin, sedangkan pada bagian dalam

terdapat fosfatidilserin. Ketika sel tersebut mengalami apoptosis, fosfatidilserin akan

menuju ke bagian luar dan Annexin V akan berikatan secara spesifik dengan

fosfatidilserine dibantu oleh ion Ca2+

(Hingorani, dkk., 2011). Sel yang mengalami

kerusakan membran reagen propidium iodida akan berikatan dengan DNA, dan dapat

memberikan data jumlah sel yang mengalami nekrosis (Vermes, dkk., 1995).

Gambar 3. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menginduksi apoptosis pada sel kanker

serviks HeLa. Sel HeLa (1x 106/mL) yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian

diberi ekstrak metanol daun rosemary 160 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan

diwarnai dengan reagen annexin V dan propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A)

Kontrol sel kanker serviks HeLa. (B) Sel kanker serviks HeLa yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel

kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL).

Hasil uji apoptosis menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol sel, sel yang

masih hidup sebanyak 88,28%. Pada sel HeLa yang diberi cisplatin konsentrasi ½ IC50,

menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 2,69%, sel yang mengalami

apoptosis total sebanyak 36,06%, dan sel yang masih hidup sebanyak 61,80%. Pada sel

HeLa yang diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate

Tota l Events: 20000

Region % Gated % Total

R1 88.28 88.28

R2 3.55 3.55

R3 2.58 2.58

R4 5.67 5.67

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate


Quad % Gated % Total

UL 5.05 5.05

UR 2.50 2.50

LL 88.72 88.72

LR 3.74 3.74

R2

R3R4

R1

File: cisplatin HeLa.006

Gate: No Gate



R1 61.80 61.80

R2 25.44 25.44

R3 10.62 10.62

R4 2.69 2.69


Gate: No Gate



UL 2.54 2.54

UR 10.54 10.54

LL 61.02 61.02

LR 25.91 25.91

R2

R4

R1

File: rosemary HeLa.003

Gate: No Gate



R1 54.09 54.09

R2 11.82 11.82

R3 15.20 15.20

R4 19.55 19.55


Gate: No Gate



UL 18.71 18.71

UR 15.10 15.10

LL 53.87 53.87

LR 12.31 12.31

R2

R4

R1

A B

C


12

menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 19,55%, sel yang mengalami

apoptosis total sebanyak 27,02%, dan sel yang masih hidup sebanyak 54,09% (Tabel I).

Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary menginduksi kematian sel

melalui apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Pada kelompok sel yang mengalami

nekrosis, nekrosis tersebut yaitu nekrosis sekunder karena dalam penelitian secara in vitro

yang dilakukan tidak ada peristiwa fagositosis oleh makrofag. Tahap kelanjutan dari

peristiwa apoptosis akan terdeteksi sebagai nekrosis sekunder (Demoy, dkk., 2000). Pada

penelitian yang dilakukan yaitu dengan waktu inkubasi 24 jam, peristiwa apoptosis

sebelum terdeteksi sebagai nekrosis sekunder belum teramati. Oleh karena itu, perlu

dilakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis sebelum 24 jam.

Tabel I. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode Flowcytometry

Apoptosis dibagi menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik. Jalur

ekstrinsik yaitu melalui aktivasi caspase-8 oleh ligan yang berikatan dengan reseptor

tumor necrosis factor (TNF) seperti Fas atau TNFR1. Jalur intrinsik disebabkan oleh

peristiwa seperti kerusakan DNA sehingga berpengaruh terhadap ekspresi dari family

protein Bcl-2 seperti Bax, Bcl-2, dan Bad (Weyhenmeyer, dkk., 2012).

Sel kanker serviks Hela memiliki karakteristik ekspresi p53 dalam jumlah yang

kecil dan overekspresi Bcl-2. Overekspresi protein Bcl-2 menghambat pelepasan

sitokrom–c dari mitokondria. Sitokrom-c tidak akan mengikat apoptotic protease-

activating factor 1 (Apaf-1), kemudian tidak terbentuk kompleks teraktivasi dari (d)ATP,

sehingga caspase-3 tidak teraktivasi dan menyebabkan terjadiya penghambatan apoptosis

(Weyhenmeyer, dkk., 2012). Uji imunositokimia digunakan untuk mengetahui aktivitas

ekstrak metanol daun rosemary terhadap ekspresi protein Bcl-2.

Pada uji imunositokimia, perubahan warna yang terjadi akibat perubahan DAB

dapat dijadikan penanda adanya kompleks antigen dan antibodi pada sel (Uhlen, dkk.,

2016). Warna coklat pada sitoplasma menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu

Total Sel (%)

Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4

Sel Hidup Early Apoptosis Late Apoptosis Nekrosis

Kontrol Sel 88,28 3,55 2,58 5,67

Cisplatin 61,80 25,44 10,62 2,69

Ekstrak Metanol

Daun Rosemary 54,09 11,82 15,20 19,55


13

menunjukkan tidak terdapat ekspresi protein Bcl-2. Uji imunositokimia merupakan uji

kualitatif, namun dapat dijadikan uji semikuantitatif, dengan pengambilan tiga lapang

pandang dari tiap preparat. Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader.

Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan

dengan cisplatin konsentrasi IC50 dan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50

mampu menekan ekspresi dari Bcl-2 (Gambar 4). Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 pada

kelompok perlakuan dengan cisplatin adalah bernilai 0 (sangat kuat). Pada kelompok

perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary level ekspresi Bcl-2 adalah 1+ (kuat)

(Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary dalam induksi

apoptosis pada sel kanker serviks HeLa salah satunya diperantarai oleh penekanan ekspresi

protein Bcl-2. Perhitungan ekspresi Bcl-2 dalam uji imunositokimia dalam penelitian ini

hanya bersifat semikuantitatif, oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut dengan

menggunakan metode lain untuk mendeteksi adanya suatu protein Bcl-2 secara kuantitatif.

Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker

serviks HeLa. Sel HeLa (2 x 105/mL) ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi

selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin

konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan

antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL).

(D) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). Pengamatan dilakukan di bawah

mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Keterangan : sel tidak mengekspresikan Bcl-2,

sel mengekspresikan Bcl-2.

Apoptosis yang terjadi akibat aktivasi caspase-3 tidak hanya diperantarai oleh

penghambatan protein Bcl-2. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Yim dkk. (2006)

menyatakan bahwa dengan meningkatkan ekspresi Fas, akan mengaktivasi caspase-8 dan

A B

C D


14

mengaktivasi caspase-3, kemudian memicu fragmentasi dan akhirnya terjadi apoptosis

pada sel kanker serviks HeLa. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk

mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan

ekspresi Bcl-2.

Tabel II. Perhitungan Ekspresi Bcl-2

Lapang Pandang

Ekspresi

Bcl-2 Level

Kontrol Sel Tanpa

Antibodi

1 (n = 90) 0 (0%) 0

2 (n = 85) 0 (0%) 0

3 (n = 107) 0 (0%) 0

Kontrol Sel

dengan Antibodi

1 (n = 105) 105 (100%) 4+

2 (n = 97) 97 (100%) 4+

3 (n = 106) 106 (100%) 4+

Cisplatin

1 (n = 128) 1 (0,78%) 0

2 (n = 125) 3 (2,4%) 0

3 (n = 107) 0 (0%) 0

Ekstrak Metanol

Daun Rosemary

1 (n = 271) 23 (8,49%) 1+

2 (n = 257) 31 (12,06%) 1+

3 (n = 296) 23 (7,77%) 1+

KESIMPULAN

Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak metanol daun rosemary memiliki efek

sitotoksik lemah terhadap sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL,

namun tetap memiliki potensi sebagai agen kemopreventif. Jalur kematian sel pada

konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu

menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam.

Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu

menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan

induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks.

Saran untuk penelitian berikutnya yaitu dilakukan identifikasi senyawa aktif

dalam ekstrak metanol daun rosemary, mengetahui efek sitotoksik ekstrak metanol daun

rosemary terhadap sel normal, melakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis

sebelum 24 jam, mendeteksi adanya suatu ekspresi protein Bcl-2 secara kuantitatif, serta

mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan

ekspresi Bcl-2.


15

DAFTAR PUSTAKA

Abe, F., Yamauchi, T., Nagao, T., Kinjo, J., Okabe, H., Higo, H., dan Akahane, H., 2002.

Ursolic acid as a Trypanocidal Constituent in Rosemary. Biological &

Pharmaceutical Bulletin, 25 (11), 1485–1487.

American Cancer Society, 2015. Treatment Options for Cervical Cancer, by Stage,

http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguidecervicalcancer-treating-

targeted-therapy diakses pada tanggal 1 April 2016.

Anggraeni, C. D., 2015. Aktivitas Sitotoksik Ekstrak metanolik Daun Rosemary

(Rosmarimus officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi

Ekspresi Reseptor Estrogen-α ERα . Skripsi, Universitas Sanata Dharma,

Yogyakarta.

Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Pengamatan Ekspresi

Protein dengan Metode Immunositokimia, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta,

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf,

diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerb, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel

untuk Flowcytometry, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta,

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf,

diakses pada tanggal 1 April 2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerc, 2009. Prosedur Tetap: Uji Sitotoksik Metode

MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-

content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April

2016.

Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Panen Sel, Unversitas

Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-

content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016.

Capes, D., Theodosopoulos G., & Atkin, I., 2010. Check Your Cultures! A List of Cross-

Contaminated or Misidentified Cell Lines. Int J Cancer, 127 (1): 1–8.

Dasari, S., dan Bernard, P., 2014. Cisplatin in cancer therapy :

Molecular mechanisms of action. European Journal of Pharmacology,

1–15.

Demoy, M., Minko, T., & Kopeckova, P. 2000. Time- and concentration-dependent

apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymer-bound doxorubicin in

human ovarian carcinoma cells, 69, 185–196.


http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguidecervicalcancer-treating-targeted-therapy

http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguidecervicalcancer-treating-targeted-therapy

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf

http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf

16

Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., & Meyer, D., 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme

inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and

Alternative Medicine, 14, 77.

Guimaraes, M.C.M., dkk., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4a

and bcl-2

According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial

Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4), 509–16.

Goodwin, E.C., and DiMaio, D., 2000. Repression of Human Papillomavirus Oncogenes in

Hela Cervical Carcinoma Cells Causes the Orderly Reactivation of Dormant Tumor

Suppressor Pathways. Biochemistry, Vol.97, no.23.

Hanahan, D., dan Weinberg, R.A., 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell., 100, 57-70.

Hemaiswarya, S., dan Doble, M., 2013. Combination of Phenylpropanoids with 5-

Fluorouracil as Anti-Cancer Agents against Human Cervical Cancer (HeLa) Cell

Line. Phytomedicine, 20(2), 151–58.

Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., & Mittar, D, 2011. Detection of Apoptosis

Using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM

System. BD

Biosciences, 1–12.

Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C.,

2015. Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a

p53-dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494–

1502.

Ibeanau, O.A., 2011. Molecular Pathogenesis of Cervical Cancer. Cancer Biology &

Therapy,11(3), 295- 306.

International Agency for Research on Cancer WHO (IARC), 2015. Estimated Cancer

Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam www.http://globocan.iarc.fr/,

diakses tanggal 5 April 2016.

Leisching, G., Loss, B., Botha, M., Engelbrecht, A., 2015. Bcl-2 Confers Survival in

Cisplatin Treated Cervical Cancer Cells: Circumventing Cisplatin Dose-Dependent

Toxicity and Resistance. J Transl Med, 13, 328.

Machana, S., dkk., 2011. Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the

human hepatocarcinoma (HepG2) cell line. Chin Med, 6(1), 1-8.

Nobakht, G. M., Kadir, M. a, Stanslas, J., & Charng, C. W., 2014. Cytotoxic effect of

Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31),

1021–1024.

Nurzijah, I., Putri, D. D. P., Rivanti, E., & Meiyanto, E., 2012. Secang (Caesalpinia

sappan L.) Heartwood Ethanolic Extract Shows Activity as Doxorubicin Co-


http://www.http/globocan.iarc.fr/

17

chemotherapeutic Agent by Apoptotis Induction on T47D Breast Cancer Cells.

Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, 3(2), 377–384.

Riss, T.L., Richard, A.M., Andrew, L.N., Helene, A.B., Tracy, J.W., Lisa, M., 2013, Assay

Guidance Manual: Cell Viability Assays,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/, diakses pada tanggal 8 April

2016.

Setiawati, A., Immanuel, H., & Utami, M. T., 2016. The inhibition of Typhonium

flagelliforme Lodd. Blume Leaf Extract on COX-2 Expression of WiDr Colon

Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6(3), 251–255.

Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Cancer

Science Therapy, S3:e001.

Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilsson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., dkk., 2016,

Immunocytochemistry, http://www.proteinatlas.org/learn/method/,

immunocytochemistry, diakses pada tanggal 22 April 2016.

Vermes, I., Clemens, H., Helga, S., dan Chris, R., 1995, A Novel Assay for Apoptosis

Flow Cytrometric Detection of Phospatidylserine Expression on early Apoptic Cells

Using Flourescein Labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 184: 39-

51.

Wang, X., dkk., 2013. Inhibitory effect of oleanolic acid on hepatocellular carcinoma via

ERK–p53-mediated cell cycle arrest and mitochondrial-dependent apoptosis.

Carcinogenesis, 34(6)1323-1330.

Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., & Murphy, B. M., 2012. Targeting the

Anti-apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer. Experimental

Oncology, 34(3), 192–199.

Xu, T., dkk., 2014. Proteomic Investigation into Betulinic Acid-Induced Apoptosis of

Human Cervical Cancer HeLa Cells. PLoS ONE, 9(8), 1–11.

Yesil-Celiktas, O., SevimLi, C., Bedir, E., & Vardar-Sukan, F., 2010. Inhibitory Effects of

Rosemary Extracts, Carnosic acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various

Human Cancer Cell Lines. Plant Foods for Human Nutrition, 65(2), 158–163.

Yim, E. K., dkk., 2006. Antiproliferative and Antiviral Mechanisms of Ursolic Acid and

Dexamethasone in Cervical Carcinoma Cell Lines. International Journal of

Gynecological Cancer, 16(6), 2023–2031.

Zhang, H., Ph, D., Sun, X., & Ph, D., 2002. Overexpression of Cyclooxygenase-2

Correlates With Advanced Stages of Colorectal Cancer. Am J Gastroenterol, 97(4),

1–5.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/

http://www.proteinatlas.org/learn/method/immunocytochemistry

18

LAMPIRAN


19

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun rosemary


20

Lampiran 2. Surat ethical clearance


21

Lampiran 3. Ekstrak metanol daun rosemary dan alat yang digunakan

Gambar 5. Tanamanan rosemary dan serbuk daun rosemary

Gambar 6. Ekstraksi dengan refluks dan pemekatan dengan vaccum rotary evaporator

Gambar 7. Ekstrak metanol daun rosemary


22

Lampiran 4. Seri konsentrasi cisplatin dan ekstrak

Ekstrak metanol daun rosemary

10 mg + 100 µL DMSO = 100.000 µg/mL

Intermediet = 2000 µg/mL (16 µL bulk + 784 µL /MK)

Konsentrasi Sampel MK

1000 µg/mL (C1) 400 µL intermediet 400 µL

500 µg/mL (C2) 400 µL C1 400 µL

250 µg/mL (C3) 400 µL C2 400 µL

125 µg/mL (C4) 400 µL C3 400 µL

62,5 µg/mL (C5) 400 µL C4 400 µL

31,25 µg/mL (C6) 400 µL C5 400 µL

15,625 µg/mL (C7) 400 µL C6 400 µL

Cisplatin

10 mg/10 mL = 1000 µg/mL

Konsentrasi Sampel MK

156,25 µg/mL (C1) 125 µL 675 µL

78 µg/mL (C2) 400 µL C1 400 µL

39 µg/mL (C3) 400 µL C2 400 µL

20 µg/mL (C4) 400 µL C3 400 µL

10 µg/mL (C5) 400 µL C4 400 µL

5 µg/mL (C6) 400 µL C5 400 µL

2,5 µg/mL (C7) 400 µL C6 400 µL


23

Lampiran 5. Tabel viabiltas sel kanker serviks HeLa

Tabel III. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Cisplatin

Konsentrasi

Cisplatin

(µg/mL)

Viabilitas sel (%)

SD 1 2 3 Rata-rata

0 100 100 100 100 0

5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053

10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357

20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,62

39 31,159 31,834 37,402 33,465 3,426

78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979

Tabel IV. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun

Rosemary

Konsentrasi

ekstrak (µg/mL)

Viabilitas sel (%) SD

1 2 3 Rata-rata

0 100 100 100 100 0

15,63 90,757 92,167 91,854 91,593 0,74

31,25 86,527 89,191 82,924 86,214 3,145

62,5 81,044 83,238 79,948 81,410 1,675

125 76,345 81,514 75,561 77,807 3,234

250 55,352 59,269 61,149 58,590 2,958

500 32,637 22,454 24,334 26,475 5,419


24

Lampiran 6. Hasil analisis Flowcytometry

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate



R1 88.28 88.28

R2 3.55 3.55

R3 2.58 2.58

R4 5.67 5.67

File: KS HeLa.001

Gate: No Gate



UL 5.05 5.05

UR 2.50 2.50

LL 88.72 88.72

LR 3.74 3.74

R2

R3R4

R1


25


Gate: No Gate



R1 61.80 61.80

R2 25.44 25.44

R3 10.62 10.62

R4 2.69 2.69


Gate: No Gate



UL 2.54 2.54

UR 10.54 10.54

LL 61.02 61.02

LR 25.91 25.91

R2

R4

R1


26


Gate: No Gate



R1 54.09 54.09

R2 11.82 11.82

R3 15.20 15.20

R4 19.55 19.55


Gate: No Gate



UL 18.71 18.71

UR 15.10 15.10

LL 53.87 53.87

LR 12.31 12.31

R2

R4

R1


27

Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa

A. Kontrol sel tanpa antibodi

B. Kontrol sel dengan antibodi

C. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin


28

D. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak metanol daun rosemary


29

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Ekstrak Metanolik Daun Rosemary

(Rosmarinus officinalis L.) sebagai Agen Kemopreventif terhadap

Sel Kanker Serviks (HeLa) melalui Regulasi Bcl-2” memiliki

nama lengkap Lela Francisca Adi Liana. Anak pertama dari

pasangan Bapak Risman Adi dan Ibu Dwi Istiyani. Penulis lahir

di Jepara, 4 Maret 1995. Pendidikan formal yang ditempuh

penulis dimulai di TK Ester 1 Bondo (2000-2001). Pendidikan

dilanjutkan ke SD Negeri 4 Bondo (2001-2007), setelah itu

dilanjutkan ke SMP Negeri 2 Jepara (2007-2010), pendidikan

menengah atas di SMA Negeri 1 Jepara (2010-2013). Kemudian pendidikan dilanjutkan

hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat

dalam keorganisasian dan kepanitian di dalam kampus, antara lain menjadi anggota seksi

pubdekdok Pharmacy Performance Road to School (2014), anggota Media Farmasi

(2015), anggota seksi acara Donor Darah JMKI (2015), anggota seksi pubdekdok Sidang

Terbuka Pengambilan Sumpah Apoteker (2016). Selain itu, penulis juga pernah menjadi

asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler (2015 dan 2016).


Documents

EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus … · 2017-12-18 · Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian ekstrak metanol ... cisplatin dan 5-flurourasil