InhoudsopgaveInhoudsopgave............................................................................................................................11 Inleiding...................................................................................................................................2

1.1 Longcarcinomen...........................................................................................................31.2 EGFR Protocol.............................................................................................................41.3 Immunohistochemie.....................................................................................................41.4 Mutatieanalyse.............................................................................................................51.5 DISH.............................................................................................................................6

1.5.1 CISH.....................................................................................................................71.5.2 Centromeer probe..................................................................................................8

1.6 Doel en opzet van het onderzoek.................................................................................82 Materiaal en methode.............................................................................................................10

2.1 EGFR procedure.............................................................................................................102.2 Immunohistochemie........................................................................................................102.3 Mutatieanalyse................................................................................................................112.4 CISH...............................................................................................................................11

3 Resultaten...............................................................................................................................143.1 Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaal..........................................................14

3.1.1...................................................................................................................................143.1.2...................................................................................................................................143.1.3...................................................................................................................................143.1.4...................................................................................................................................143.1.5...................................................................................................................................143.1.6...................................................................................................................................143.1.7...................................................................................................................................153.1.8...................................................................................................................................153.1.9...................................................................................................................................153.1.10.................................................................................................................................153.1.11.................................................................................................................................153.1.12.................................................................................................................................15

3.2 Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal.....................................................163.2.1...................................................................................................................................163.2.2...................................................................................................................................16

3.3Patiënten materiaal...........................................................................................................164 Conclusie en discussie...........................................................................................................17Bijlage 1....................................................................................................................................18

EGFR CISH Methode VUmc...............................................................................................18Bijlage 2....................................................................................................................................19Zymed EGFR CISH protocol....................................................................................................19Bijlage 3....................................................................................................................................20

Zytovision EGFR CISH protocol..........................................................................................20

1

1 Inleiding

Bij de ontwikkeling van moderne anti-kanker therapieën is het de trend om middelen te gebruiken die specifiek inwerken op kankercellen. Receptor eiwitten zijn daarvoor zeer geschikt, op voorwaarde dat deze specifieke eiwitten aanwezig zijn op de tumorcellen. Bij deze therapieën wordt gebruik gemaakt van proteïne kinases, in de meeste gevallen tyrosine kinase. Deze spelen een belangrijke rol in het reguleren van de meeste celfuncties, zoals celdeling/celcyclus, celoverleving/celdood (apoptose) en DNA reparatie.Tyrosine kinase remmers zorgen ervoor dat de receptoren geen signalen meer kunnen geven doorgeven aan de aan de cel waardoor de functie van de tyrosine kinase verhindert word.(1)

Gefitinib/erlotinib is een Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) tyrosine kinase remmer die gebruikt wordt bij de behandeling van bepaalde tumoren, waaronder longtumoren. EGFR komt voor in de epitheliale cellen van het lichaam. De EGF receptor behoort tot de tyrosine kinase glycoproteïnes. EGFR bestaat uit een buiten de celgelegen gedeelte (extracellulair) waaraan eiwitten zich kunnen binden, een in het membraan gelegen gedeelte, en een in de cel gelegen gedeelte (intracellulair) dat onder andere bestaat uit tyrosine kinase. EGF en TGFα kunnen zich binden aan het extracellulaire gedeelte van het EGFR waardoor het tyrosine kinase gedeelte gefosforyleerd wordt. Door deze fosforylatie worden er drie pathways

geactiveerd, de AKT pathway, de RAS/ERK pathway en de STAT pathway. Deze pathways geven een signaal door aan de kern waarin ze zorgen voor gentranscriptie. De AKT pathway remt de apoptose, de RAS/ERK pathway zorgt voor celdeling en de STAT pathway zorgt voor bloedvatvorming en voor de migratie, adhesie en invasie van cellen in het omliggende weefsel.(2)

Normaal gesproken wordt het EGFR voor een korte tijd geactiveerd, waardoor deze cellen kort tot deling worden aangezet. Hierna worden de receptoren gerecycled of afgebroken.Een verhoogde EGFR activiteit kan verschillende oorzaken hebben.

1. Een verhoogd aantal EGF receptoren op het celoppervlak als gevolg van een verhoogt aantal EGFR genen in het DNA (gen amplificatie).

2. een gestegen aantal EGFR gen transcripties en translaties, waardoor er een overexpressie ontstaat van mRNA, met als gevolg een verhoogt aantal EGF receptoren.

Gefitinib/erlotinib zorgt dat de receptoren niet meer gefosforyleerd kunnen worden, hierdoor worden geen signalen meer naar het cytoplasma en de kern doorgeven. Dit zorgt ervoor dat de celproliferatie geremd wordt en de apoptose inducerende pathway in gang gezet kan worden.Alleen als het aantal receptoren verhoogd is door een EGFR gen amplificatie zorgt de Gefitinib/erlotinib therapie voor een duidelijke vermindering van de hoeveelheid signalen dat

2

Figuur 1: Schematische weergave van de pathways die EGFR activeert.(3)

doorgegeven word aan de kern. De bijwerkingen van deze therapie kunnen de gezondheidstoestand van de patiënt, die al slecht is door de tumor, verergeren. Om deze redenen is het belangrijk dat er amplificaties kunnen worden aangetoond.

Figuur 2: Gefitinib/erlotinib zorg ervoor dat de receptoren niet meer gefosforyleerd kunnen worden, hierdoor word geen signaal meer naar het cytoplasma en de kern doorgegeven. Dit zorgt ervoor dat de celproliferatie geremd wordt en dat de apoptose inducerende pathway in gang gezet kan worden. (4)

1.1 LongcarcinomenGefitinib/erlotinib wordt gebruikt om longcarcinomen met een EGFR amplificatie te behandelen. Longcarcinomen zijn tumoren die ontstaan uit de bedekkende (epitheliale) laag van de longen en bronchiën. Deze worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen

Het kleincellig longcarcinoom Het niet-kleincellig longcarcinoom

Ongeveer 20% van de longcarcinomen behoord tot het kleincellige type. Deze worden zo genoemd doordat de cellen zeer klein zijn en weinig cytoplasma bevatten. Om deze rede worden ze soms verwart met lymfocyten. De groep niet-kleincellige longcarcinoom bestaat uit 3 verschillende typen:

plaveiselcelcarcinoom adenocarcinoom grootcellig carcinoom

3

A B C

Figuur 3 A: plaveiselcelcarcinoom B: Adenocarcinoom C: kleincellig carcinoom

Deze worden samen gegroepeerd omdat ze alle drie op dezelfde manier behandelt kunnen worden. Het plaveiselcelcarcinoom is het meest voorkomende type van longcarcinomen. Het plaveiselcelcarcinoom ontwikkeld zich vanuit de cellen die de bronchiën van de long bedekken (plaveiselcellen) en wordt vaak in de kern van de long gevonden.Het adenocarcinoom ontwikkeld zicht uit de slijmvormende cellen die zicht in de luchtwegen bevinden. Vaak bevinden de tumoren zich in de buitenste gedeelten van de long. Tumoren waarbij het niet duidelijk is of het een plaveiselcelcarcinoom of een adenocarcinoom is worden ze ingedeeld in de groep grootcellige carcinomen. Hiermee wordt duidelijk gemaakt dat de tumor niet kleincellig is en dus behandeld moet worden als een niet-kleincellig longcarcinoom. (5)

1.2 EGFR Protocol

In het VUmc is bij de pathologie een procedure gestart voor EGFR bepalingen op longcarcinomen waarmee kan worden bepaald of patiënten een EGFR amplificatie hebben waardoor ze behandeld kunnen worden met Gefitinib/erlotinib. Hierbij worden er een aantal testen gedaan op paraffinecoupes.

1. EGFR eiwit expressie. hierbij wordt gekeken naar het patroon en mate ven eiwitexpressie van EGFR op de tumorcellen.

2. Een EGFR en K-ras mutatieanalyse. Hierbij wordt gekeken naar de aanwezigheid van mutaties op het DNA.

3. Een EGFR genkopie bepaling. Hiermee wordt het aantal EGFR genkopieën per cel geteld.

4. TTF1 expressie. Deze kleuring kleurt de longtumoren altijd positief aan bij een mutatie is in het EGFR gen, dit is niet het geval bij K-ras mutaties

5. ALK-1 expressie. Indien de ALK-1 aankleurt is het het al zeker dat het geen EGFR mutatie is.

Het plan is om dit ook te gaan doen op cytologisch materiaal. Het verkrijgen van cytologisch materiaal is minder ingrijpend dan het nemen van een biopt. Dit komt doordat de patient niet geopereerd hoeft te worden om weefsel te verkrijgen.

Deze testen worden gedaan bij patiënten die voldoen aan de volgende criteria: Een vrouwelijke patiënt die nooit heeft gerookt heeft waarbij voor het eerst een

longcarcinoom is geconstateerd Een patiënt die een recidief heeft van een adenocarcinoom die behandeld is geweest

met chemotherapie of straling.

1.3 Immunohistochemie

Als onderdeel van de immunohistologische kleuringen van het EGFR protocol worden de TTF-1(Thyroid transcription factor-1), EGFR en ALK-1 (anaplastic lymphoma kinase-1) gedaan.Het TTF-1 eiwit komt voor inde kern en wordt gebruikt om normaal schildklierweefsel aan te kleuren, maar waarvan is gebleken dat het ook longtumoren aankleurt. De TTF-1 is in

4

Figuur 4 TTF-1 kleuring

het EGFR protocol opgenomen omdat is gebleken dat deze altijd positief is bij een EGFR amplificatie. Het EGFR eiwit komt voor in het membraan van de cel en kleurt het intrinsieke gedeelte van het EGF receptor aan. Bij de aanwezigheid van grote hoeveelheden receptoren komen deze ook in het cytoplasma voor en wordt ook het cytoplasma aangekleurd. De EGFR kleuring zorgt voor het zichtbaar maken van de receptoren, maar laat niet zien of het een EGFR gen mutatie is of een andere mutatie in een ander gen. De coupes worden beoordeeld met behulp van een scoringsschema. Deze gaat van 0, negatief, tot 3+, sterk positief. Hierbij wordt gekeken naar de cytoplasmatische aankleuring en de membraan aankleuring (figuur 3)

Figuur 6 EGFR immunohistochemische scoring . a) score 0 b) score 1+ c) score 2+ d) score 3+

het ALK-1 eiwit komt voor in de kern en het cytoplasma en wordt normaal gebruikt om een translocatie aan te tonen in grootcellige anaplastische lymfomen om er zo achter te komen welk type lymfoom het is. Uit recent onderzoek is gebleken dat deze mutatie ook kan voorkomen in longcarcinomen. Het blijkt dat de aanwezigheid van deze mutatie aangeeft dat EGFR mutaties niet aanwezig zijn.

1.4 Mutatieanalyse

Een ander onderdeel van het EGFR protocol is de mutatieanalyse. Met behulp van een mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden opgespoord. Bij de EGFR mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen als op het K-ras gen. Als een mutatie op het K-ras gen aanwezig is, is het zeker dat de Gefitinib/erlotinib therapie niet zal werken, omdat het dan geen mutatie zit in de EGF receptor. Voor mutaties in het EGFR gen wordt een mutatieanalyse gedaan op exon19, exon20 en exon21 en voor mutaties op het

5

Figuur 5. ALK-1 aankleuring (7)

K-ras gen op exon1, al deze bevinden zich op chromosoom 7. De meest voorkomende EGFR mutaties zitten op exon19 (45%) en exon21 (40-45%), een klein gedeelte van de mutaties zitten op exon18 (5%) en exon20 (5%). Niet alle mutaties die voorkomen reageren op de Gefitinib/erlotinib therapie. De meeste mutaties die niet reageren op de Gefitinib/erlotinib therapie zitten op exon20, om deze rede is de exon20 wel opgenomen in het protocol en exon18 niet. Als uit verdere testen blijkt dat een EGFR mutatie aanwezig zou moeten zijn wordt alsnog een exon18 mutatieanalyse aangevraagd.

Figuur 7 schematisch weergave van de verschillende EGFR mutaties in niet kleincellige longtumoren en hun gevoeligheid voor Gefitinib/erlotinib therapie. (8)

1.5 DISH

In Situ Hybridisatie (ISH) is een techniek waarbij je specifieke sequenties DNA(DISH) of mRNA (RISH) met behoud van morfologie kan zichtbaar maken. RISH wordt meestal toegepast voor de detectie van virussen indien RNA meer voorkomt dan DNA (bijv. het veel voorkomende EBER bij EBV geïnfecteerde cellen) of voor de lokalisatie van het mRNA van interesse in de cellen. DISH daarentegen wordt gebruikt om grove fouten, zoals translocaties, deleties en amplificaties van complete genen, in het DNA op te sporen. Dit wordt gedaan met behulp van probes. Probes bestaan uit kleine specifieke stukjes dubbelstrengs DNA die dezelfde nucleotidevolgorde (sequentie) hebben als het te detecteren stukje DNA. Deze probes zijn voorzien van een label om hybridisaties zichtbaar te maken. De label kan direct door fluorescentie (FISH) of indirect door een enzymatische reactie (CISH) zichtbaar worden gemaakt. Er zijn verschillende typen probes die ieder hun eigen hybridisatie- eigenschappen hebben, die gebasseerd zijn op de sterkte van de binding van de probe aan het DNA. Probes die sterk binden moeten stringenter gewassen worden na incubatie met probe. Stringent wassen wordt

6

gedaan in een zoutoplossing bij een hoge temperatuur. Bij de zoutconcentratie geld de regel hoe lager de zouconcentratie hoe stingenter het wast, en bij de temperatuur geld de regel hoe hoger de wastemperatuur hoe stringenter. Een DISH kan worden gedaan op formaline gefixeerd, in paraffine ingebed weefsel waarvan coupes van 5μm dik zijn gesneden, ook kan het toegepast worden op cytologisch materiaal.

1.5.1 CISH

Om het aantal genkopieën per cel te bepaling is een EGFR DNA In Situ Hybridisatie nodig Binnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van CISH. Dit omdat CISH een aantal voordelen heeft ten opzichte van FISH. Het belangrijkste voordeel is dat de coupes te archiveren zijn, dit omdat het signaal niet uitdooft na verloop van tijd, waardoor later nog terug kan worden gekeken naar de coupe. Een ander voordeel is dat de morfologie van de cellen kan worden beoordeeld, dit omdat CISH onder een normale lichtmicroscoop beoordeelt kan worden. Een ander voordeel is dat er geen autofluorecentie kan optreden die het signaal kan verstoren. Het laatste voordeel is dat CISH gevoeliger is dan FICH, dit omdat er bij de CISH versterkingsstappen zijn waardoor het signaal sterker zichtbaar kan worden gemaakt.De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om aspecifieke hybridisatie op andere chromosomen/genen te voorkomen. CISH probes binden sterker aan homologe DNA sequenties dan conventionele DNA probes.Bij de beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties) per kern. Deze worden onderverdeeld in: Normaal 1-2 stippenPolysomie 3-5 stippenLichte amplificatie 6-10 stippenAmplificatie >10 stippen of clusters

7

Figuur 8. Beoordeling EGFR CISH. A. geen amplificatie B. polysomie C. lichte amplificatie D. Amplificatie/clustervorming

Hierbij worden normaal en polysomie niet beschouwd als amplificatie.De resultaten van de CISH worden vergeleken met de immunohistochemische kleuringen en de mutatieanalyse. Aan de hand hiervan wordt besloten of de patiënten met Gefitinib/erlotinib behandeld gaan worden.

1.5.2 Centromeer probe

Centromeer probes zijn probes die gericht zijn tegen het centromeer regio. Met behulp van deze probes kan worden uitgevonden hoeveel kopieën van een chromosoom aanwezig zijn.Deze probes binden minder sterk aan het DNA dan een CISH probe. Dit komt doordat dit gedeelte van het chromosoom voornamelijk bestaat uit repeterende gedeeltes. Deze bevatten veel A-T verbindingen, deze zijn minder sterk dan de G-C bindingen. Hierdoor kunnen deze er eerder afspoelen. Hierdoor was je deze probes minder sterk dan een normale CISH probe. Met behulp van een centromeer probe kan zichtbaar gemaakt worden hoeveel chromosomen in de cel aanwezig zijn.

1.6 Doel en opzet van het onderzoek

Momenteel wordt een CISH voorschrift gebruikt voor ingebed patiënten materiaal dat nog niet optimaal is voor al het materiaal. Regelmatig is de morfologie te slecht geworden om nog te beoordelen en de signalen zijn zwak of niet zichtbaar of bevat teveel aspecifieke achtergrond.

Het is belangrijk om het CISH protocol te optimaliseren zodat aan de hand hiervan kan worden besloten om de therapie te starten of aan te passen. Bij dit optimaliseren wordt gebruik gemaakt van: een long adenocarcinoom als doeltumor met een open chromatine patroon , een long plaveiselcelcarcinoom als doeltumor met een dicht chromatinepatroon en een tonsil als milde fixatie en een dicht chromatinepatroon. Het chomatinepatoon is belangrijk omdat het bepaald hoe toegankelijk het DNA is voor de probe. Hoe dichter het chomatinepatroon hoe minder toegankelijk het DNA wordt voor de probe. De tonsil wordt meergenomen als voorbeeld van een biopt die milder gefixeerd worden dan grotere stukken weefsel. Voor het optimaliseren worden verschillende manieren van voorbehandelen getest, hierbij wordt gevarieerd met de manier van koken en gebruik van digestiemiddel. Bij de beoordeling wordt gekeken welke methode het beste signaal geeft en waarbij de morfologie ook nog goed te beoordelen is. Verder wordt ook gevarieerd in detectiemethode om zo te kijken welke het sterkste signaal geeft zonder teveel achtergrondkleuring. Als het protocol voor paraffinecoupes optimaal is zal de EGFR CISH worden uitgevoerd op de te onderzoeken patiëntengroep.

De resultaten van de CISH zullen worden vergeleken met de resultaten van de EGFR eiwit kleuring en de mutatieanalyse met behulp van een zelf ontworpen database. Hierbij is gekozen voor een Access database, omdat hierbij geen dubbele records kunnen voorkomen en dat het hierbij gemakkelijker is om gegevens in te voeren en later te analyseren.

Tevens zal worden getest of EGFR CISH kan worden gedaan op cytologisch materiaal. Als testmateriaal wordt gebruik gemaakt van een A431 cellijn. De A431 cellijn is een humane plaveiselcelcarcinoom van de huid. De A431 cellijn heeft een EGFR mutatie die voor een amplificatie zorgt en is hierdoor een goede positieve controle. Het gebruik van cytologisch materiaal heeft al voordeel dat het nemen van puncties minder belastend is voor de patiënt dan

8

het nemen van biopten. Verder wordt onderzocht of de EGFR immunokleuring van het protocol werkt op cytologisch materiaal. De mutatieanalyse zal niet optimaal werken op cytologisch materiaal doordat je niet kunt bepalen welke cellen je wil gebruiken, maar de volledige suspensie moet gebruiken waar ook normale cellen in voorkomen. Hierdoor zal in veel gevallen het percentage tumorcellen laag zijn (< 50%)

9

2 Materiaal en methode.

2.1 EGFR procedureDe EGFR procedure wordt door de patholoog aangevraagd waarna deze wordt gestart.Als de procedure is gestart worden een reeks van coupes gesneden van verschillende diktes en geplakt op glaasjes. Voor en na het snijden van de reeks worden coupes opgevangen voor een standaard HE kleuring. De patholoog bepaald welke gedeelte van het weefsel gebruikt moet worden voor de mutatieanalyse en bepaald het percentage tumorcellen. De twee HE coupes worden gebruikt om te kunnen kijken waar de tumor zit in de coupe en of in beide nog tumorcellen zitten. Dit is belangrijk omdat het anders mogelijk is dat de uitslagen vals negatief zijn en de patholoog bepaald de locatie in de coupe voor mutatie analyse. Voor de reeks bestaat uit de volgende coupes:

Eerst worden 4 coupes van 3μm gesneden die gebruikt worden voor de TTF-1, EGFR en ALK-1 kleuringen. Bij deze dikte word voorkomen dat de coupes uit meerdere cellagen bestaan waardoor het signaal of achtergrond te sterk of onduidelijk wordt om te bepalen welke cel aankleurt.

Hierna worden 4 coupes van 10μm gesneden die gebruikt worden voor de EGFR en K-ras mutatieanalyse. Coupes van 10μm bestaan uit ongeveer 2 cellagen, hierdoor zitten in 1 coupe meer tumorcellen en is de opbrengst per coupe hoger. Dikkere coupes zijn niet mogelijk doordat de coupes dan tijdens het snijden gaan brokkelen.

Waarna nog 6 coupes van 5μm gesneden worden. Coupes van 5μm bestaan uit ongeveer 1 cellaag. Dit zorgt ervoor dat de cellen in de coupes bijna de gehele kern bevatten en voorkomt het dat een te groot gedeelte van het DNA mist waardoor deze vals negatief kan worden voor de DNA In Situ Hybridisatie.

2.2 ImmunohistochemieBij de immunohistochemie worden de TTF-1, EGFR, ALK-1 kleuring uitgevoerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van het PowerVision-HRP Detection System van Immunologic. PowerVision is een tweestaps detectiemethode waarmee antigenen in paraffinecoupes van weefsels zichtbaar gemaakt kunnen worden. Eerst worden de coupes gedeparaffineerd via alcohol naar water, endogene peroxidase geremd en voorbehandeld om de antigenen beter bereikbaar te maken voor het antilichaam. Nu wordt het weefsel geïncubeerd met het specifiek primaire antilichaam (TTF-1, EGFR of ALK-1). Na spoelen wordt het weefsel geincubeerd met Post-antibody blocking, dit is een antilichaam dat bind aan het primaire antilichaam als een tussenstap. Waarna het wordt geincubeerd met PowerVision-HRP complex. Dit zijn dextraansulfaatmoleculen met daaraan gekoppelde

antilichaamen en peroxidase. Deze binden aan de Post-antibody blocking antilichamen. De visualisatie vind plaats door toevoeging van substraat/chromogeen-oplossing (DAB). (figuur 5) Voor het volledige protocol zie bijlage 1.

10

Figuur 9. schematische weergave van dePowerVision Detection System.

Deze immunologisch kleuringen alleen geven niet aan of er een EGFR mutatie met amplificatie heeft, maar heeft een ondersteunende rol. Om deze rede worden er nog andere testen gedaan zoals de EGFR en K-ras mutatieanalyse.

2.3 MutatieanalyseMet behulp van een mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden opgespoord. Bij de EGFR mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen als op het K-ras gen.De mutatieanalyse wordt uitgevoerd op paraffine gefixeerd materiaal waarvan coupes van 10μm worden gesneden. Aan de hand van de HE- kleuring en/of het aanvraagformulier wordt bepaald welk gedeelte van de coupe wordt gebruikt voor de mutatieanalyse. Dit gedeelte wordt verwijdert en gebruikt voor de mutatieanalyse. De eerste stap van de procedure is het behandelen van het weefsel met een mix van Proteïnase K, TrisHCl en SDS. Deze stap verwijdert de DNases uit het weefsel. Na deze stap wordt door verhitting het paraffine uit het weefsel verwijdert en de cellen in suspensie gebracht. Deze suspensie wordt gelyseerd met lysisbuffer zodat de cellen kapot gaan en het DNA vrijkomt. Daarna wordt een genestelde PCR gedaan die bestaat uit twee PCR reacties. De eerste wordt gedaan met primers die zich buiten het doel DNA bevinden. De tweede wordt gedaan met primers die specifiek het doel DNA vermeerdert (figuur 4). Hierdoor wordt het monster zeer zuiver. Dit wordt afzonderlijk gedaan voor alle exonen.Hierop volgt een PCR sequence-reactie. Deze maakt het mogelijk om de specifieke aminozuur volgorde in de exonen zichtbaar te maken. Door deze te vergelijken met de aminozuur volgorde van het wildtype EGFR gen kunnen mutaties worden vastgesteld. Van veel mutaties is bekent welk effect de Gefitinib/erlotinib therapie op de tumor heeft. Waardoor men eenvoudiger kan besluiten of de therapie gestart kan worden. Hoe hoger de percentage tumorcellen in de begincoupe hoe groter de kans is dat een eventuele mutatie wordt gevonden. Als het percentage lager dan 50% is de kans groter dat mutaties niet worden gevonden. Als dit het geval is moeten de mutaties met behulp van andere technieken worden gedetecteerd. Zoals in de VUmc met behulp van CISH. De mutatieanalyse op cytologisch materiaal gebeurt bijna op dezelfde manier. Alleen kunnen hierbij niet de tumorcellen worden geselecteerd van de rest van de cellen.

2.4 CISHBinnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van de CISH.De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om aspecifieke hybridisatie te voorkomen.

11

Figuur 10 schematisch weergave van de genesteldePCR-reactie.(10)

Bij de CISH moeten de paraffine coupes eerst gedeparaffineerd worden, waarna zowel de paraffine coupes als de cytologische preparaten worden gekookt (b.v. >95°C bij paraffinecoupes in kookbuffer) en gedigesteerd met een mild digestiemiddel om zo het DNA toegankelijk te maken. Tijdens het hybridiseren zal de gelabelde EGFR-CISH-probe zich binden aan gedeelte van DNA dat complementair is aan het DNA van de probe. Hierna wordt de aspecifieke gebonden probe weggespoeld door het weefsel stringent te wassen. Hierna wordt het weefsel geïncubeerd met muis-anti-digoxigenin of muis-anti-biotim dat bind aan het label, waarna het geïncubeerd wordt door anti-muis-HRP- polymeer (polymeer met daaraan peroxidase) welke zich bind aan het muis-anti-digoxigenin. Waarna het ontwikkeld wordt met DAB chromogeen, licht tegengekleurd met Haematoxyline en afgedekt. Hierna worden de coupes beoordeelt met behulp van een lichtmicroscoop. Bij de beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties) per kern. Bij normale cellen worden 1-2 stippen per cel gevonden, bij tumorcellen met een verhoogd aantal chromosomen (polysomie) worden er 3-5 stippen per cel gevonden. In beide gevallen wordt er geen amplificatie gevonden. Bij lichte amplificatie worden er 6-10 stippen per cel gevonden en bij amplificatie worden er meer dan 10 stippen of grote genclusters gevonden per cel. Bij beide is er amplificatie. Het resultaat wordt vergeleken met de immunohistochemische kleuringen en de mutatieanalyse, aan de hand hiervan wordt beoordeeld welke mensen worden behandeld met Gefitinib/erlotinib en welke niet.

Bij de optimalisatie wordt begonnen met het huidige protocol van het VU medisch Centrum (VUmc), zie bijlage 1. Het protocol wordt getest op 3 soorten weefsel. Twee typen longcarcinomen, een adenocarcinoom voor licht gefixeerd materiaal met open chromatine patroon en een plaveiselcelcarcinoom voor sterk gefixeerd materiaal met gesloten chromatine patroon, en een tonsil voor licht gefixeerd materiaal met een gesloten chomatinepatroon. Van elk weefsel wordt het representatieve gedeelte uitgekozen, uit de coupe gesneden en alle drie op een objectglaasje geplakt zodat ze alle drie onder een dekglaasje van 24x40 mm passen. Eerst wordt de testcoupe gekleurd met behulp van het VUmc protocol. In het VUmc protocol wordt gebruik gemaakt van de Zymed® probe. Aan de hand van de resultaten van deze kleuring wordt besloten welke variaties gedaan worden. Ook worden ze vergeleken met de Zymed protocol (bijlage 2) en de ZytoVision protocol (bijlage 3)De verschillende variaties die per onderdeel getest kunnen worden zijn te zien in tabel 1.

Tabel 1: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH paraffine protocolKookvloeistof Kook-

methodeDigestiemiddel digestietijd Denatureren Probe wassen detectie Detectie

methodeTris/EDTA pH9 Magnetron Pepsine 0,01

/0,05 /0,1% bij 37ºC

0, 2, 5, 10, 20, 30, 40 minuten

10min. 80ºC Zymed probe

75-80ºC 5 min

Sigma Muis-anti-digoxigenin

PV+

Zymed kookvloeistof

Waterbad Zymed digestie-middel KT of 37ºC

5min. 95ºC Zytovision probe

70 ºC5 min

Zymed Muis-anti-digoxigenin

EV

Zytovision bekerglas Zytovision Zytovision

12

Figuur 11. schematische weergave van de EGFR CISH detectie

kookvloeistof digestie-middel KT of 37ºC

Muis-anti-digoxigenin

Tevens wordt onderzocht of het mogelijk is om de EGFR procedure uit te voeren op cytologisch materiaal. Hiervoor worden cytologische preparaten gemaakt volgen drie verschillende methodes, de TTF-1 methode (bijlage 4), Pelillycet (bijlage 5) en de ThinPrep methode (bijlage 6). Als materiaal voor de testen wordt de cellijn A431 gebruikt waarvan bekend is dat deze een EGFR mutatie en amplificatie bevat. De variaties die gestest kunnen worden zijn te zien in tabel 2. Ook worden A431 cellen doorgevoerd en ingebed om de positieve controle te dienen.

Tabel 2: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH cytologie protocolkookvloeistof Kookmethode Digestiemiddel digestietijd Probe detectieZymed kookvloeistof

Niet koken Zymed digestie-middel KT of 37ºC

0, 2, 5, 10 min Zymed probe Sigma Muis-anti-digoxigenin

Zytovision kookvloeistof

Waterbad Zytovision digestie-middel KT of 37ºC

Zytovision probe

Zymed Muis-anti-digoxigenin

2xSSC bekerglas Zytovision Muis-anti-digoxigenin

Het geoptimaliseerde EGFR CISH protocol wordt dan gebruikt om de EGFR CISH bepaling die nog open staan van het EGFR protocol uit te voeren. Deze worden beoordeeld op de morfologie, aankleuring en op de aanwezigheid van genamplificaties om zo de kwaliteit van de hybridisaties te bepalen. De gegevens worden ook gebruikt om de effectiviteit van het geoptimaliseerde protocol is. De resultaten worden vergeleken met de andere testen van het EGFR protocol. Hiervoor wordt een Access database gemaakt om alle gegevens te verzamelen. De database gaat bestaan uit verschillende tabellen die onderling verbonden worden. De tabellen worden onderverdeeld in verschillende onderdelen, een hoofdtabel met de basis gegevens, een tabel met de immunohistochemische gegevens, een met de mutatieanalyse gegevens en een tabel met de EGFR CISH gegevens.

13

Figuur 12 Schematische weergave relaties in Access database

14

3 Resultaten

3.1 Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaal

3.1.1

Als beginpunt van de resultaten zijn deze van het VUmc protocol. De coupes zijn slecht te beoordelen door een bruine achtergrond in de gehele kern waardoor het signaal niet goed beoordeelbaar is. De morfologie is bij alle weefsels goed. Alleen bij de adenocarcinoom en de plaveiselcelcarcinoom is nog enigsinds een signaal detecteerbaar.

3.1.2

Bij het vervolg werden de digestie aangepast met 0,01% en 0,1% pepsine in een waterbad bij 37°C. Ook werd een nieuwe batch digoxin gebruikt en een blanco meegenomen. Bij beide aanpassingen werd geen signaal gedetecteerd. De morfologie is redelijk bij beide en geen achtergrond gedetecteerd bij de plaveiselcelcarcinoom.

3.1.3

Als aanpassing werden toen de denaturatie temperatuur aangepast tot 95°C. Ook werd gevarieerd in digestietijd, 7,5; 15 en 30 minuten. Alleen bij de tonsil werd signaal waargenomen bij alle digestietijden en denaturatie temperaturen. Het signaal was sterker bij de bij 95°C gedenatureerde tonsil. De morfologie van de tonsil en de adenocarcinoom wordt beduidend minder hoe langer de digestietijd, na 30 minuten digesteren is de morfologie slecht en moelijk te zien. Bij de adenocarcinoom is nog altijd veel achtergrond

3.1.4

Nu werd de 0,01% en 0,1% pepsine en de zymed voorbehandeling uitgetest en werden ze voor de detectie geincubeerd met normaal geit serum tegen de achtergrond. Bij de zymed voorbehandeling werd bij alle weefsel signalen waargenomen. De morfologie was overal goed en alleen bij de adenocarcinoom was nog steeds achtergrond zichtbaar.

3.1.5

De 0,01% en 0,1% pepsine en de zymed voorbehandeling word nu uitgetest met de chromosoom 1 probe. Bij alle weefsel bij alle voorbehandelingen was het signaal zeer sterk en de morfologie goed. Ook is bij geen van de weefsel achtergrond zichtbaar.

3.1.6

Testen werden nu gedaan met zowel de egfr probe als de chromosoom 1 probe. Als voorbehandeling werden de coupes 2, 5,10 minuten gedigesteerd met de zymed voobehandeling en 7,5 en 15 minuten met 0,05% pepsine. Nu werd nergens signaal waargenomen. En bij de tonsil was bij de EGFR probe achtergrond zichtbaar

15

3.1.7

Nu werd het volledige zymed protocol getest met 5 en 10 min digestie. Ook werd deze getest met eigen nemarini anti-digoxigenin en de EGFR probe. De chomosoom 1 probe werd nu ook getest met de zymed methode aangevuld met de powervision methode. De tonsil had bij alle behandelingen signaal. De andere weefsels hadden geen signaal. Alleen bij de nemarini detectie had de adenocarcinoom achtergrond. Bij de chromosoom 1 probe werd overal signaal waargenomen. Bij zowel de plaveiselcelcarcinoom als de adenocarcinoom was achtergrond zichtbaar.

3.1.8

De zymed methode werd nu getest bij 10 en 15 minuten digestie met detectie met zymed digoxigenin, zymed digoxigenin met powervision en sigma digoxigenin. Bij de tonsil werd signaal gedetecteerd bij zymed digoxigenin en zymed digoxigenin met powervision. Voor de rest geen signaal gedetecteerd. En bij de adenocarcinoom met sigma achtergrond zichtbaar.

3.1.9

De zymed methode werd nu getest door te koken in waterbad of bekerglas, 10 minuten te digesteren. De detectie gebeurd 1 keer normaal en 1 keer versterk met de powervision detectie. Signaal was duidelijk zichtbaar bij tonsil in alle gevallen en bij de adenocarcinoom bij bekerglas en normale detectie. Morfologie is overal duidelijk en bij de powervision detectie is bij alle weefsels sterke achtergrond zichtbaar.

3.1.10

Testen Zytovision EGFR probe. Volledig zytovision protocol, zymed protocol met zytovision probe en zymed met zymed probe. Bij de zytovision protocol en de zymed protocol met zytovision probe was bij alle weefsels een duidelijk signaal detecteerbaar, was de morfologie goed en was geen achtergrond zichtbaar. De zymed protocol met zymed probe gaf alleen met de tonsil en adenocarcinoom reactie.

3.1.11

Testen zymed protocol met 20 min. Digestie en koken in bekerglas. En zymed protocol met zytovision probe. Zymed protocol met zytovision probe gaf goed signaal bij alle weefsels en de zymed protocol met 20 min digestie gaf zwak signaal bij tonsil en adenocarcinoom.

3.1.12

Testen zytovision protocol met zymed probe op testweefsels en biopten met 5 en 10 minuten digestie. Signaal is goed bij de testweefsels bij 10 minuten en bij biopten bij zowel 5 als 10 minuten. Het signaal bij de testweefsels is bij 5 minuten zwak bij de adenocarcinoom en plaveiselcelcarcinoom en bij de tonsil goed. Bij de biopten is de morfologie bij 10 minuten slecht.

16

Figuur 13. Uitlagen EGFR CISH optimalisatie A. adenocarcinoom VUmc protocol B. plaveiselcelcarcinoom VUmc protocol C. tonsil VUmc protocol D. adenocarcinoom optimaal zymed protocol E. plaveiselcel-carcinoom optimaal zymed protocol F tonsil optimaal zymed protocol G. adenocarcinoom optimaal zytovision protocol H. plaveiselcelcarcinoom optimaal zytovision protocol I. tonsil optimaal zytovision protocol.

3.2 Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal

3.2.1

Testen TTF1 coupes die 1 dag, 2 dagen 3dagen en 4 dagen gefixeerd zijn.

Tabel 3. Uitslagen ttf1 1dag gefixeerd

digestie signaal morfologie achtergrond0 min Geen Goed Geen1 min Goed Goed Licht2 min goed redelijk licht

Tabel 4 uislagen 2 dagen digestie

digestie signaal morfologie achtergrond0 min Geen Goed Geen1 min zwak Goed Licht2 min zwak redelijk licht

Tabel 5 Uitslagen 3 dagen gefixeerd

Digestie signaal morfologie achtergrond10 min kt Redelijk Goed Geen10 min 37°C Sterk Goed Licht

17

20 min sterk redelijk licht

Tabel 6 Uitslagen 4 dagen gefixeerd

digestie signaal morfologie achtergrond2 min kt Geen Goed Geen2 min 37°C geen Goed Licht10 min geen redelijk licht

3.2.2

3.3Patiënten materiaalDe resultaten van de EGFR CISH bepalingen tezamen met de andere uitkomsten van het CISH protocol zijn te zien in tabel 7. Voor een volledig overzicht van de resultaten zie bijlage 7.Tabel 7. Overzicht van de resultaten van de EGFR CISH bepaling tezamen met de andere gegevens van het EGFR protocol.

Type tumor Totaal Ttf1 pos

EGFR imh Mutatieanalyse EGFR CISHEGFR K-

RASCluster/ amplificatie

Lichte amplificatie

polysomy normaal

1+ 2+ 3+ Exon19 exon20 Exon21 Exon1Adenocarcinoom 25 25 6 7 8 5 1 1 8 3 1 3 13Plaveiselcelcarcinoom 5 - - 2 1 - - - - - 1 1 2Kleincellig carcinoom 2 1 1 - - - - - - - - - 2Grootcellig carcinoom

11 5 4 1 3 - - 1 1 2 - 5 2

4 Conclusie en discussieUit deze optimalisatie is gebleken dat de EGFR probe van zymed niet optimaal is om het EGFR gen in het DNA aan te kleuren is hierdoor beter niet als standaard gebruikt dient te worden. De EGFR probe van zymed is naar grote waarschijnlijkheid niet goed gelabeld waardoor deze zeer weinig label bevat en dus weinig aankleuring geeft. De Zytovision probe daarentegen kleurt goed aan in de meeste omstandigheden. De optimale digestietijd is voor weefsels 10 minuten en voor biopten 5 minuten. Uit het kleuren van aanvragen is gebleken dat enkele weefsels moeilijk aan te kleuren zijn dit kan komen doordat deze te lang gefixeerd zijn waardoor de probe niet meer bij het DNA kan komen. Dit kon worden opmerken bij de cytologie. De 1 en 2 dagen ttf1 fixeren waren nog goed zichtbaar te maken met hooguit 5 min digesteren en bij 3 dagen bij 20 minuten. De 4 dagen moesten nog langer fixeren. Hieruit kan worden vastgesteld dat hoe langer het gefixeerd is hoe moeilijker het is om het DNA toegankelijker te maken.

18

Literatuur verwijzingen

Sholl LM, John Iafrate A, Chou YP, Wu MT, Goan YG, Su L, Huang YT, Christiani DC, Chirieac LR.;Validation of chromogenic in situ hybridization for detection of EGFR copy number amplification in nonsmall cell lung carcinoma.; Modern Pathology 2007 nr.20, blz1028-35;

Suzuki S, Dobashi Y, Sakurai H, Nishikawa K, Hanawa M, Ooi A., Protein overexpression and gene amplification of epidermal growth factor receptor in nonsmall cell lung carcinomas. An immunohistochemical and fluorescence in situ hybridization study.; Cancer 2005 103, blz. 1265-73;

Vocaturo A, Novelli F, Benevolo M, Piperno G, Marandino F, Cianciulli AM, Merola R, Donnorso RP, Sperduti I, Buglioni S, Mottolese M.; Chromogenic in situ hybridization to detect HER-2/neu gene amplification in histological and ThinPrep-processed breast cancer fine-needle aspirates: a sensitive and practical method in the trastuzumab era.; Oncologist. 2006 11: blz.878-86.

Gallegos Ruiz MI, Floor K, Vos W, Grünberg K, Meijer GA, Rodriguez JA, Giaccone G.; Epidermal growth factor receptor (EGFR) gene copy number detection in non-small-cell lung cancer; a comparison of fluorescence in situ hybridization and chromogenic in situ hybridization.; Histopathology. 2007 51(5):blz. 631-7.

3. http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:EGFR_signaling_pathway.png 4. http://www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment127.pdf 2. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1395807 7. http://www.atlasantibodies.com/datasheet/HPA007982

19

Bijlage 1

EGFR CISH Methode VUmc A-specifieke achtergrond in de kern ontstaat bij overdigestie.Powervision Plus i.p.v. Envision: sterkere achtergrond

Stap Voorbewerking Tijd 1. Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken bij 60C2. Coupes deparaffineren 2x 10 min3. Spoel met alcohol absoluut 2x 10 min4. Spoel met Leidingwater5. Kook met 1 mM EDTA /TRIS pH9 in een magnetron 10 min6. Laat de coupes afkoelen en was daarna de coupes met leidingwater 2x 3 min7. Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 0,1%

pepsine/0,2N HCl bij 37C op een stoof van 37°C, 100µl/coupe onder dekglaasjes en afgedekt door kap

5 min

8. Was de coupes met leidingwater 3x 2 min9. Dehydreer de coupes met Alc. 70% -85% -95% -100%10. Droog de coupes aan de lucht

Denatureren en hybridiseren11. Breng een druppel probe op een dekglaasje en dek de coupe af

Sluit de randen af met rubbercement 10µl voor een glaasje van 22x22mm 15µl voor een glaasje van 24x32mm

12. Denatureer bij 80C op een hete plaat, afgedekt met een kap 10 min13. Plaats de coupes in een vochtige bak bij 37C 16-24 uur

Stringent wassen14. Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een

cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur15. Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80C in waterbad

Verhoog voor elke coupe meer de temperatuur met 1C tot 80°C5 min

16. Was de coupes met PBS/ 0,05% Tween 20 bij kamer temperatuur 3x 2 minDetectie

17. Rem endogene peroxidase met 3%H2O2/PBS 10 min18. Spoel de coupes goed met PBS 10 min19. Incubeer met Muis anti-Digoxin (Sigma) 1:100 **) 60 min20. Was met PBS/ 0,05% Tween 20 2x 3 min21. Incubeer met EnvisionHRP Dako 30 min22. Was met PBS/ 0,05% Tween 20 2x 3 min23. DAB Envision 10 min24. Spoel met leidingwater25. Kleur tegen met Haematoxylin 30 sec26. Spoel met leidingwater27. Dehydreer in oplopende alcohol reeks 28. Xyleen29. Afdekken

20

Bijlage 2

Zymed EGFR CISH protocolTabel 3

Stap Voorbewerking Tijd1 Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat bij

65°C

2 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10 min3 Spoelen met alcohol absoluut 2x 10 min4 Spoel in leidingwater5 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min6 Was de coupes in leidingwater 2x 3min

7 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes

10 min

*)8 Was de coupes met leidingwater 3x 2min9 Dehydreer met alcohol absoluut10 Droog de coupes aan de lucht

Denatureren en hybridiseren11 Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.

10μl voor een glaasje van 22x22mm15μl voor een glaasje van 24x32mm Sluit de randen af met rubbercement

12 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min13 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24 uur

Stringent wassen14 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een cuvet

met 0,5xSSC bij kamertemperatuur

15 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C

5 min

16 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2minDetectie

17 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min18 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min19 Incubeer met blocking oplossing bij KT 10 min20 Afgieten van blocking oplossing21 Incubeer met species-anti-label bij KT 30 min22 Was met PBS/tween 2x 3min23 Incubeer met anti-label-HRP polymeer bij KT 30 min24 Was met PBS/tween 2x3min25 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min26 Spoel met leidingwater 2min27 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec28 Spoel met leidingwater29 Dehydreer met alcohol absoluut30 Xyleen31 Afdekken

21

22

Bijlage 3

Zytovision EGFR CISH protocol

Stap Voorbewerking Tijd32 Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat bij

65°C

33 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10 min34 Spoelen met alcohol absoluut 2x 10 min35 Spoel in leidingwater36 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min37 Was de coupes in leidingwater 2x 3min

38 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes

10 min

*)39 Was de coupes met leidingwater 3x 2min40 Dehydreer met alcohol absoluut41 Droog de coupes aan de lucht

Denatureren en hybridiseren42 Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.

10μl voor een glaasje van 22x22mm15μl voor een glaasje van 24x32mm Sluit de randen af met rubbercement

43 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min44 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24 uur

Stringent wassen45 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een cuvet

met 0,5xSSC bij kamertemperatuur

46 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C

5 min

47 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2minDetectie

48 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min49 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min50 Incubeer met blocking oplossing bij KT 10 min51 Afgieten van blocking oplossing52 Incubeer met species-anti-label bij KT 30 min53 Was met PBS/tween 2x 3min54 Incubeer met anti-label-HRP polymeer bij KT 30 min55 Was met PBS/tween 2x3min56 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min57 Spoel met leidingwater 2min58 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec59 Spoel met leidingwater60 Dehydreer met alcohol absoluut61 Xyleen62 Afdekken

*) Standaard is 10 minuten, Biopten 5 minuten

23