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ECOLOGIA MICROBIANA APLICADA AL SECTOR DE LA GESTIÓN DEL CÉSPED DEPORTIVO Dr. Marc Viñas (PhD Biology; Environmental Microbiology) [email protected] Webinar : 28 de Abril 2016

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ECOLOGIA MICROBIANA APLICADA AL SECTOR DE LA GESTIÓN DEL CÉSPED

DEPORTIVO

Dr. Marc Viñas (PhD Biology; Environmental Microbiology)

[email protected] Webinar: 28 de Abril 2016

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ESQUEMA DEL SEMINARIO

LOS MICROORGANISMOS Y SU RELACIÓN EN BIOPROCESOS DE INTERÉS EN LA GESTIÓN DE CÉSPEDES DEPORTIVOS

• EL MICROBIOMA DEL SUELO Y LA RHIZOSFERA, UN NUEVO CONCEPTO• GESTIÓN DEL NITRÓGENO Y FERTILIZACIÓN (ORGÁNICA/INORGÁNICA)• GASES DE EFECTO INVERNADERO Y HUELLA DE CARBONO (N2O, NO, CH4, CO2)• RESISTENCIA A FITOPATÓGENOS (INCREMENTAR LA DIVERSIDAD MICROBIANA DEL SUELO-

RHIZOSFERA ES FUNDAMENTAL)

HERRAMIENTAS DE ECOLOGÍA MICROBIANA Y SU POTENCIAL APLICACIÓN EN CÉSPEDES DEPORTIVOS

• CLASICAS DEPENDIENTES DE CULTIVO• BIOLOGÍA MOLECULAR (DNA/RNA): PCR, q(RT)PCR, DGGE, NGS

EJEMPLOS DE ESTUDIOS REALIZADOS EN NUESTRO LABORATORIO• FILTRO ARENA + CONSTRUCTED WETLAND HORIZONTAL. Agua de viveros hortícolas• CONSTRUCTED WETLAND VERTICAL. Agua residual urbana

ANALÍSIS DE ECOLOGÍA MICROBIANA OFERTADOS DESDE EL IRTA

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Estrategias metabólicas que encontramos en los microorganismos del suelo

Aerobio (mineralización N y MORG , nitrificación)

Desnitrificante (GHG)

Ferro(metalo)-reductor

Sulfatoreductor

Metanogénico(GHG)

Fermentador

AnaerobioM. ORG

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-240

-290-430

CO2/CH4

CO2/acetatCO2 formiat

CO2

-230SO42-/HS-SO4

2-

-200 a +300Àcids húmics

-1842,6-AQDS/2,6-ADHS2,6-AQDS

0Fe3+/Fe2+Fe3+ sòlid

+33Fumarat/succinatFumarat

+59Fe(OH)3/Fe2+Fe(OH)3

+380MnO2/Mn2+Mn4+

+430NO2-/N2NO2

-

+740NO3-/N2NO3

-

+770Fe3+/Fe2+Fe3+ soluble

+820O2/H2OO2

Potencial Redox (mV)Pareja redoxAceptor de electrones

ClO3-/ Cl- ClO−/Cl−; E0 = +1.31 V,

ClO2− /ClO− E0 = +1.28 V),ClO2

− /Cl− E0 = +1.08 VN2O)/N2 (E0 =+1.36 V),

Estrategias metabólicas que encontramos en los microorganismos del suelo

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Microbiologia y ciclo del Nitrógeno

1. Fijación N (+). Industrial /Simbiontes/Libres2. Mineralización (+) 60-80 lb N/acre año3. Nitrificación (GHE ??)

Amonio-oxidación (+)Nitrito-oxidación (+)

4. Desnitrificación (-) (GHE??)5. Volatilización (-) a pH alcalinos6. Inmovilización (-)7. Lixiviación (-)

Obtención N en planta: (preferible NO3- en

césped en crecimiento) (+++)

1

1

GHG

EL CICLO DEL NITRÓGENO Y LA MICROBIOLOGÍA DEL SUELO

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Cabello et al., 2004; DOI 10.1099/mic.0.27303-0

EL CICLO DEL NITRÓGENO Y LA MICROBIOLOGÍA DEL SUELO

nosZ

nor nir

nap/naramoA

nifH

AOBAOA

NOB

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POBLACIONES MICROBIANAS CLAVE EN EL CICLO DEL NITRÓGENO

Fertilización inorgánica: Incentivar nitrificación (en caso de N-NH4)Evitar desnitrificación y sulfatoreducciónEvitar generación de GHG (N2O y CH4) (anòxia + MORG)

Fertilización orgánica (compost/agua regenerada/urea): Incentivar mineralización + nitrificaciónEvitar desnitrificación y sulfatoreducciónEvitar generación de GHG (N2O y CH4) (anoxia + MORG)

Futuro

Presente

Incentivar la fijación biológica de de N2 atmosféricoIncentivar procesos de nitrificaciónMonitorizar la diversidad microbiana del suelo (NGS)Estudiar evolución de la composición de la comunidad microbiana

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POBLACIONES MICROBIANAS CLAVE EN EL CICLO DEL NITRÓGENO

Amonificación: Bacterias/Hongos saprófitos (Heterótrofos)

Fijadores de Nitrógeno (Eubacterias Simbiontes o libres): N2 (g) R-NH2/NH4

Simbiontes:Rhizobium (alpha-proteobacterias leguminosas simbionte)Bradyrhizobium (alpha-proteobacteria)Azospirillum (alpha-proteobacteria con gramineas)Frankia (Actinobacteria/Actinomicaetales)

Libres: Azospirillum (alpha-proteobacteria con gramineas)

Azotobacter (gamma-proteobacteria libre)Bacillus (Firmicutes)Clostridium (Firmicutes)Klebsiella (gamma-proteobacteria/Enterobacteriales)Frankia (Actinobacteria/Actinomicetale libres)Cianobacterias Podemos monitorizar las poblaciones mediante

NGS y qPCR (sondas/primers específicos)

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Proceso de Nitrificación (esencial en fertilización orgánica): 1. Amonio-oxidación (NH4

+ a NO2-)

2. Nitrito-oxidación (NO2- a NO3

-)

Eubacterias Amonio-oxidantes (AOB): (gen amoA eubacterias):Nitrosomonas: β-proteobacteria (Nitrosomonadales)Nitrosospira: β-proteobacteria (Nitrosomonadales)Nitrosococcus: β-proteobacteria (Nitrosomonadales)Nitrospira: Nitropirae (Chromatiales)

Arqueas Amonio-oxidantes (AOA): (gen amoA arqueas)Nitrosopumilus (Chrenarchaeota/Thaumarchaeota)Nitrososphaera (Chrenarchaeota/Thaumarchaeota)Cenarchaeum (Chrenarchaeota/Thaumarchaeota)

Eubacterias Nitrito-oxidantesNitrobacter α-proteobacteria (Rhizobiales)Nitrospira Nitrospirae (Chromatiales)

POBLACIONES MICROBIANAS CLAVE EN EL CICLO DEL NITRÓGENO

Podemos monitorizar las poblaciones mediante NGS y qPCR (sondas/primers específicos 16S y amoA)

Es un bioproceso aerobio

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PREGUNTAS CLAVE HABITUALES EN EL ESTUDIO POBLACIONES MICROBIANAS

•Qué tipo de microorganismos/comunidad microbiana tenemos en una matriz ambiental/bioproceso?

•Qué cantidad (población) de microorganismos totales o específicos tenemos?

•Cuáles y cuantos de ellos están activos en el proceso de interés? Amonio-oxidación/nitrito-oxidación, desnitrificación , sulfatorreducción, metanogénesis. Eubacteria, Arqueas, Hongos?

•Cómo están activos (Función)?

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REVISIÓN MICROBIOLOGÍA EN SUELO DE CÉSPED(SHI ET AL 2007 )

????

- +

????

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Hongo: Sphaerobolus stellatusDescomposición masiva de M. ORG. Depresión local de la superficie del césped ("thatch collapse“)Movimiento de la pelota poco predecible en el green .

Enfermedad del “Thatch collapse”

Image: Penn State College of Agricultural Scienceshttps://www.gcsaa.org/gcm/2016/march/thatch-collapse-in-golf-course-turf

Como podemos evitar, o tener una mayor resistencia a patógenos?

Tendència: Incrementar la diversidad microbiana del microbioma del suelo

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EL MICROBIOMA DEL SUELO Y LA RHIZOSFERA, UN NUEVO CONCEPTO

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Microbiología del Compost

Cepas aisladas: Pseudomonas (28%), Serratia (20%), Klebsiella (11%), Enterobacter (5%), BacillusHongos??NGS??

Muestran actividad proteolítica (29% aislados).

(% ) cepas aisladas de compost muestran suppresión patógenos:

Sclerotinia homeocarpa (52% de las cepas bacterianas del compost) Pythium graminicola (31%)Typhula ishikariensis (32%)Microdochium nivale (19%)

Applicación de compost maduro al suelo para incrementar diversidad microbiana y combatir fitopatógenos

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LA DIVERSIDAD MICROBIANA

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Habitat Cultivables (%) Referencias

Ecosistema marino 0.001-0.1 (Kogure et al., 1980; Ferguson et al., 1984)

Aguas continentales 0.25 (Jones, 1977)

Lago mesotrófico 0.1-1 (Staley y Konopka, 1985)

Estuarios 0.1-3 (Ferguson et al., 1984)

Lodos activados 1-15 (Wagner et al., 1993; Wagner et al., 1994)

Sedimentos 0.25 (Jones, 1977)

Suelo 0.3 (Torsvik et al., 1990)

Microorganismos cultivables: 0,0001% - 1%

Técnicas dependientes de cultivo

Técnicas independientes de cultivo

Aislamiento en placa, NMP, medios

selectivos, BiologTM

PCR, qPCR, PLFA, ARDRA,

DGGE, TGGE, SSCP, T-RFLP. FISH,

NGS (454, Ion torrent, MiSeq )

LA DIVERSIDAD MICROBIANA PREDOMINANTE NO ÉS CULTIVABLE

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•Culture-dependent methods :(quantifying microbial populations of interest, microcosm assays, tailored media for isolation of degraders/enrichment, production of inocula)

•Culture-independent methods: (DNA/RNA-based studies, microbial communitystructure (PCR-DGGE, NGS), molecular identification (DNA sequencing), microbialquantification (qPCR))

MÉTODOS PARA EL ESTUDIO DE COMUNIDADES MICROBIANAS Y MICROORGANISMOS DIANA

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Principal Objetivo:

UTILIDAD Y OBJETIVOS DE LA ECOLOGÍA MICROBIANA

•Estudios para la detección, identificación, y potenciales interacciones de “microbialkey players” y comunidades microbianas complejas.

•Diagnóstico de fisiología y grupos microbianos activos en las condiciones in-situ ambientales .

M2047R1C1

M2048R1C1

M2049R1C1

M2050R1C1

M2051R1C1

M2052R1C1

M2053R1C1

M2054R1C1

M2055R1C1

M2056R1C1

M2057R1C1

OTU_1

OTU_5

OTU_7

OTU_8

OTU_9

OTU_10 OTU_14

OTU_16

OTU_22

OTU_23

OTU_24

OTU_25

OTU_27

OTU_28

OTU_29

OTU_30

OTU_35

OTU_43

OTU_45

OTU_47

OTU_50

OTU_51

OTU_53

OTU_57

OTU_58

OTU_64

OTU_65

OTU_68

OTU_69

OTU_70

OTU_71

OTU_72

OTU_80OTU_84

OTU_85

OTU_88

OTU_91

OTU_99

OTU_129

OTU_138

OTU_172

OTU_177

OTU_196

OTU_208

OTU_223

OTU_241

OTU_309

OTU_343

OTU_390

OTU_405

OTU_433

OTU_435

OTU_455

OTU_466

OTU_508

OTU_521

OTU_528OTU_535OTU_574

OTU_585

OTU_659

OTU_704

OTU_718

TAN

VFA

HRT

SRT

-2,5

-1,5

-0,5

0,5

1,5

-2,5 -1,5 -0,5 0,5 1,5 2,5

F2 (1

4,4

6 %

)

F1 (77,78 %)

CCA analyisis cDNA 16S Archaea (>0,01%) Without Singletons Gráfico ACC / Simétrico(ejes F1 y F2: 92,24 %)

Canonical Correspondence Analysis (CCA) : cDNA 16S rRNA Archaea

R1 and R2 TAN>3

R1 and R2 TAN<3

MethanosarcinaMethanocculeus

Methanobacterium

TAN

VFA

SRT

HRT

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CW/HSSFWater samples (0,2 µm filtrate)

Soil/Sand/Gravel samples

Nucleic Acid extraction Culture-dependent methods

Pathogen detection/monitoringFusarium Pythium

PhytophthoraPseudomonas syringae

qPCR methods

16SrRNAamoAnosZmcrA

16SPathogens

NGS454/MiSeq

16SrRNA/ITS

DGGE/Clone libraryFunctional genes

nosZ/nirK/SKey players?

Data analysisQIIME/MOTHURMVA : PCA, CA

Biota Pathogens?Key players?GH emitters? New Monitoring Data

MPN/culturingmethods

Caracterización global de las poblaciones microbianasen muestras ambientales

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Métodos no dependientes de cultivo para el estudio de comunidades microbianas

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Caracterización de poblaciones microbianas totales y activasen muestras ambientales

Total DNA + RNA (-80ºC)

Samples from Bioreactors/Environment

Biomass Pellet -80ºCSimultaneous

DNA + RNA extraction

Total DNA + cDNA (-80ºC)

RT (PrimeScript)

qPCR(Quantitative assessment)

16S rRNA genes (DNA + cDNA)mcrA genes (DNA + cDNA)

Other functional genes

NGS (MiSeq/454/Ion Torrent) (Qualitative assessment)

16S rRNA (Eubacteria)16Sr RNA (Archaea)

Centrifuging step (4ºC)

Extremophiles WorkshopTorre Marimon 2015 July 3th

Raw data (sff/fastq)

QIIME/MothurBioinformatics

SILVA/greengenesalignment

Pick OTUs

OTUs distribution

Diversity indicesTaxonomy (RDP)

PCA/CA/CCA New targets. Inocula

Lifeguard/RNA later

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De 1 copia de DNA generamos 236

copias de la región de interés (un gen)

En 2 horasTaq DNA polimerasa termoestable

MÉTODOS INDEPENDIETES DE CULTIVO PCR DEPENDIENTES

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Cuantificación de genes y microorganismos diana mediante qPCR

Sondas TaqMan Química SybrGreen

Emisión de fluorescencia positiva cuando existe amplificación de la región diana de DNA a estudiar Curvas de calibración de qPCR

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Shokralla, et al., 2012

Estudio de comunidades microbianas complejas mediante secuenciación masiva (NGS)

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Estudio de comunidades microbianas complejas mediante secuenciación masiva (NGS).

Cuantificando la diversidad

OTUsinv.

simpson chao shannon

Top-Gravel (T0) 452 3,9 1467 2,2

Intermediate -Gravel (T0) 1585 129,5 2085 5,9

Bottom-Gravel (T0) 1333 181,5 2113 6

Effluent CW (T0) 1084 187,9 1811 5,9

Effluent CW (T1) 1015 4,2 1404 3,1

Top-Gravel (T1) 831 18,3 1830 4,1

Intermediate -Gravel (T1) 1401 101,4 1964 5,8

Bottom-Gravel (T1) 1465 69,8 2117 5,6

Figure S1: Microbial community assessment by NGS (MiSeq). CW (Cabrils) T0-T1. Rarefaction curves, number of

OTUs, diversity and richness indexes.

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Emisión de gases de efecto invernadero (GEI) . Huella del carbono condicionada por las comunidades

microbianas del suelo

N2

N2CO2

Gases efecto invernadero(CH4, N2O, CO2)

Microbiota

Gases acidificantes (SO2, NOx, H2S, NH3)

Origen emisiones gaseosas: antropogénico, vulcanismo y microbianas

Metanógenos

Nitrificantes

Desnitrificantes

Microbiota

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Filtro horizontal arena

Constructed Wetland

Emisión de gases efecto invernadero y actividades de nitrificación-desnitrificación en filtro de arena y

Constructed wetland. Proyecto Cleanleach

Objetivo: Tratamiento de lixiviados ricos en nitratos en viveros hortícolas. Buscando la máxima sostenibilidad del proceso.

Filtro de arena horizontal

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GHG: Cabrils (IRTA) (May 2014-Feb 2015)

Emisión de gases efecto invernadero y actividades de nitrificación-desnitrificación en filtro de arena y Constructed

wetland. Proyecto Cleanleach

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Reducción de 3-4 ordenes de magnitud la población fúngica del inflow

Eubacterias (Clase en RDP)

arenaInflow outflow

Comunidad microbiana en el Filtro horizontal de arena

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T1: antes de aplicar C. ORG.T3: después de aplicar C.ORGBiofilm

Estable

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100% others

methanosarcina

aciduliprofundum

methanothermobacter

methanimicrococcus

halobacterium

halorubrum

methermicoccus

methanobacterium

methanothermococcus

methanococcus

candidatus nitrososphaera

thermococcus

methanobrevibacter

nitrososphaera

methanosaeta

methanotorris

candidatus nitrosoarchaeum

cenarchaeum

Gradiente poblacionesaerobias-anaerobias

Eubacterias (Filum)

Arqueobacterias (Filum)Inestable

Evolución de poblaciones microbianas antes y despuésde aplicar C. ORG en el Constructed Wetland

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Potencial desnitrificante en el biofilm del CW (qPCR gen nosZ): gen nosZ elevado en todas las profundidades

Incremeo de nosZ superfície después de añadir NO3y C ORG

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

Infraestructura Room 1: DNA/RNA extraction and PCR-q(RT)PCR room1. Vertical flow cabinet1. Nanodrop 1 Spectrophotometer1. Incubator 1- Optical microscopy1. Gradient PCR Mastercycler(PCR) (Eppendorff)1. qPCR equipment (Mx3000P)1. Autoclave (clean materials)2. Refrigerator/ 1Freezer -20ºC2. Centrifugue (RT/4ºC)

Room 2: Classical microbiology, Cloning, electrophoresis1. Vertical flow cabinet1. Cabinette for VOCs-chemicals2. Horizontal electrophoresis1. DGGE (CBS-4001)1. Gel imaging1. Autoclave Freezer -80ºC/-20ºC

Environmental shaker

Room 3:

Bioinformatics: QIIME/MOTHUR

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Tipos de actividades y colaboraciones

• Tasks in comprehensive on-going research projects at GIRO

• Scientific collaboration with other programs IRTA and other national and international research groups (contract research and funded projects)

• Private contract research with national and international companies (Biotechnological Services)

Current fields of application

• Research in environmental bioprocesses and bioreactors:

Wastewater treatment

Soil-water systems (Bioremediation, Biodeterioration , denitrification) n,

Constructed wetlands

Anaerobic digestion,

Biolectrochemical systems

• Applied research for environmental engineering companies and technological centers

LABORATORY OF MICROBIAL ECOLOGY

Strategic plan 2016-2020 (GIRO)

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LABORATORY OF MICROBIAL ECOLOGY

Detail of most common analyses

Microbial community analysis (DGGE/NGS (454/Illumina, Ion Torrent):• Total Eubacteria (16SrRNA gene)• Total Archaea (16SrRNA gene)• Total Fungi (ITS1rRNA gene)• Denitrifyers (nosZ gene)

Quantifying functional genes (qPCR and RT-qPCR):•Ammonia oxidizers : Nitrification (amoA eub and amoA arch)•Denitrification (nosZ)• Methanogens (mcrA)

•Syntrophic oxidizing bacteria SAO (fhs)

•Anammox (hzo)•Hydrocarbon biodegradation (tod, alkB, bssA)• Reductive dehalogenation (vcrA, bvcB, tceA)•Target species: Dehalococcoides, Methanosaeta, Methanosarcina

Hydrocarbon/Chlorinated VOCs degraders by MPN(Het, Hydrocarbons/ETBE/DCM degraders)

DNA/cDNA

DNA/cDNA

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ACHIEVEMENTS (sct)

LABORATORY OF MICROBIAL ECOLOGY

Activity of Microbial Ecology

Projects 2012-2015: (12): 8 on going projects

Classical Anaerobic Digestión (3): PROGRAMO (INIA) , ADAW (SME) , ORION (SME)

Bioelectrochemical systems (2): MFC-SWINE (MINECO), INBENT (INIA)

Constructed wetlands (1): CLEANLEACH : (UE) ECO/12/332862

Bioremediation/Biodegradation (2): IMOTEC-BOX, BIOPLANT (FP7 EU)

Deep litter in dairy cows (1): COWCOMPOST (MINECO)

Wastewater and Pathogens (1) : AQUATEST (Indigo FP7)

Gut Microbiome in Rabbits: (1): FEED A GENE (H2020)

Green House emissions in paddy rice field (1) : LIFE ADMICLIM-EBRO . ENV/ES/001182 LIFE

(EU).

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2. Sotres, A., Cerrillo, M., Viñas, M., Bonmatí, A. (2015) Nitrogen removal in a two-chambered microbial fuel cell: establishment of a nitrifying-denitrifying microbial community on an intermittent aerated cathode. The Chemical Engineering Journal. DOI: 10.1016/j.cej.2015.08.100

3. Corbella, C.; Guivernau, M.; Viñas, M.; Puigagut, J. (2015). Operational, design and microbial aspects related to power production with microbial fuel cells implemented in constructed wetlands. Water Research DOI: In Press doi:10.1016/j.watres.2015.06.005

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8. Lladó, S.; Covino, S.; Solanas, A.M.; Petruccioli, M.; D'Annibale, A.; Viñas, M. (2014). Pyrosequencing reveals the effect of mobilizing agents and lignocellulosicsubstrate amendment on microbial community composition in real industrial PAH-polluted soil. Journal of Hazardous Materials 283 :35-43

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10. Lladó, S.; Covino, S.; Solanas, A.M.; Viñas, M.; Petruccioli, M.; Annibale, A. (2013). Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil. Journal of Hazardous Materials 248-249 :407-414

11. Lladó, S.; Gràcia, E.; Solanas, A.M.; Viñas, M. (2013). Fungal and bacterial microbial community assessment during bioremediation assays in an aged creosote-polluted soil. Soil Biology & Biochemistry 67 :114-123

12. Sotres A, Diaz-Marcos J, Guivernau M, Illa J, Magrí A, Prenafeta-Boldú FX , Bonmatí A, Viñas M (2014). Microbial community dynamics in two-chamberedmicrobial fuel cells: effect of different ion exchange membranes. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 90(8):1497–1506

13. Prenafeta-Boldú FX, Summerbell RC, De Boer W, Boschker HTS, Gams W (2014). Biodiversity and ecology of soil fungi in a primary succession of a temperatecoastal dune system . Nova Hedwigia 99(3-4):347-372

14. Isola D, Selbmann L, de Hoog GS, Fenice M, Onofri S, Prenafeta-Boldú FX, Zucconi L (2013). Isolation and screening of black fungi as degraders of volatile aromatichydrocarbons. Mycopathologia 175:369-379

15. Bonmatí A, Sotres A, Mu Y, Rozendal R, Rabaey K (2013). Oxalate degradation in a bioelectrochemical system: Reactor performance and microbial communitycharacterization Bioresource Technology 143:147–153

16. Prenafeta-Boldú, F.X.; Guivernau, M.; Gallastegui, G.; Viñas, M.; De Hoog, G.S.; Elías, A. (2012). Fungal/bacterial interactions during the biodegradation of TEX hydrocarbons (toluene, ethylbenzene and p-xylene) in gas biofilters operated under xerophilic conditions. FEMS Microbiology Ecology 80 (3 ):722-734

List of Publications (2012-2015)

ACHIEVEMENTS (sct)

LABORATORY OF MICROBIAL ECOLOGY

Activity of Microbial Ecology

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