Istraživački rad za natjecanje iz biologije

29.siječnja 2014.

DOROTEA ŠUŠAK, 3. RAZRED

DOROTEA ŠUŠAK, 3. RAZRED

Mentor: MIRTA PRIŠLIN, MAG.BIOL.EXP; NASTAVNIK BIOL.

MENTOR LABORATORIJSKOG RADA: IZV. PROF. DR. SC. IVAN KOSALEC, FARMACEUTSKO-BIOKEMIJSKI FAKULTET SVEUČILIŠTA U ZAGREBU

Mikrobiološka analiza zraka u različitim životnim

prostorima

Opća privatna gimnazija

Petrinjska ulica br. 7/I, Zagreb info@opg.hr

(01) 48 12 079 Grad Zagreb

2

Istraživački rad za natjecanje iz biologije

29.siječnja 2014.

Treći (3.) razred

Treći (3.) razred

Mikrobiološka analiza zraka u različitim životnim

prostorima

3

SADRŽAJ

1. UVOD......................................................................................................................4-5 1.1. ŠTO JE TO ZRAK?............................................................................................4 1.2. ŠTO UZROKUJE ONEČIŠĆENJE ZRAKA?...................................................4 1.3. UTJECAJ BIOONEČIŠĆENJA ZRAKA NA LJUDSKO ZDRAVLJE........4-5 1.4. ISTRAŽIVANJE KVALITETE ZRAKA..........................................................5

2. OBRAZLOŽENJE TEME.......................................................................................5-6 3. MATERIJAL I METODE RADA.........................................................................7-10

3.1. PLAN I TIJEK ISTRAŽIVANJA.....................................................................7-8 3.2. LOKACIJE ISTRAŽIVANJA..........................................................................8-9 3.3. PRIBOR I MATERIJALI KORIŠTENI TIJEKOM ISTRAŽIVANJA..........9-10

4. REZULTATI........................................................................................................11-19 4.1. REZULTATI OKOLIŠNIH UVJETA.............................................................11 4.2. REZULTATI POREDBENE MIKROBIOLOŠKE ANALIZE 1.................12-15 4.3. REZULTATI POREDBENE MIKROBIOLOŠKE ANALIZE 2....................15 4.4. REZULTATI POREDBENE MIKROBIOLOŠKE ANALIZE 3.................16-19

5. RASPRAVA.........................................................................................................19-20 6. ZAKLJUČCI...........................................................................................................21 7. SAŽETAK...............................................................................................................21 8. POPIS LITERATURE.............................................................................................22 9. ZAHVALA...............................................................................................................22

4

1. UVOD 1.1. Što je to zrak?

Zrak je jedna od esencija života. Sa znanstvenog aspekta zrak je smjesa plinova bez mirisa, okusa i boje. 78,90% zraka čini dušik, 20,93% kisik, a ostalo otpada na plemenite plinove (0,94%) i ugljikov dioksid (0,03%). Sva živa bića udišu kisik, a izdišu ugljikov dioksid. Biljke bez ugljikovog dioksida ne bi mogle vršiti proces fotosinteze. Kada govorimo o ljudskim bićima, čovjek udahne otprilike 12 puta u minuti, odnosno 20000 puta tijekom dana i pritom unese 12000 litara zraka u pluća da bi pribavio kisik, neophodan za život i sve životne procese. Meñutim, činjenica je kako postoji izvjesna razlika udišemo li svježi šumski zrak ili naprotiv, zrak zatvorenih prostora u kojima provodimo 90% našega vremena gdje je kvaliteta zraka najlošija. Zrak u zatvorenim prostorima sadrži do 20 milijuna čestica u jednome kubnom metru što je razina dvadeset puta veća od one nañene u zraku na gustome prometnom raskršću, i do dvjesto tisuća puta veća od one u morskome zraku.

Slika 1. Izražen broj čestica po kubnome metru zraka

1.2. Onečišćenje zraka

Uopćeno rečeno, onečišćenje je ispuštanje nepoželjnih tvari u tlo, atmosferu, rijeke i oceane, a koje ometaju prirodne procese na Zemlji. Date tvari nazivamo onečišćivačima ili polutantima. Shodno tematici moga rada, ograničavam se na onečišćivače zraka. Polutanti mogu biti u krutom, tekućem ili plinovitom stanju, a onečišćivače zraka možemo podijeliti na kemijske i biološke. Meñu kemijskim zagañivačima važnu ulogu imaju plinovi ugljikov monoksid, ugljikov dioksid, plinovi dušika, formaldehid, hlapljivi organski spojevi, azbest i druga mineralna vlakna, radon i drugi. Dok su tipični biološki onečišćivači: bakterije, plijesan, virusi, strugotine životinjske dlake, slina, grinje i polen, koji se mogu razviti i razmnožavati u odvodima, ovlaživačima zraka, klima ureñajima, ventilacijskim kanalima, vlažnim zidovima, stropovima i drugdje.

1.3. Utjecaj biološkog onečišćenja zraka na ljudsko zdravlje

Primarni biološki onečšćivači zraka, koji imaju direktan utjecaj na ljudsko zdravlje su bakterije i virusi, plijesni te grinje. Bakterije i virusi egzistiraju u svim zatvorenim i svim otvorenim prostorima. Posebnu pažnju treba usmjeriti ka gram negativnim bakterijama, koje nalazimo u kontaminiranim ventilacijskim sustavima i klima ureñajima, čiji endotoksini

5

djeluju na respiracijski sustav. Mogu uzrokovati prehlade, gripu, razna druga virusna oboljenja, respiratorne infekcije i infekcije oka. Smatra se da je za 90% svih prehlada koje se javljaju u ljudi odgovoran zrak zatvorenih prostora, dok se samo 10% slučajeva pripisuje vanjskom zraku (Cailland et al., 2013.; Toloba et al., 2013). Plijesni klasificiramo kao gotovo najopasnije zagañivače zraka zatvorenih prostora, ali opasnost mogu predstavljati i u otvorenim prostorima, zbog čega i postoji pojam sindroma bolesnih zgrada (Nielsen et al., 2003.). Gdje god ima vlage (relativna vlažnost viša od 50%) bilo zbog zidova, glačanja, kuhanja, čišćenja, kupanja i sličnih poslova, tamo ima i razvoja plijesni (gljivica). Spore gljivica povoljno se razvijaju u sustavima grijanja i hlañenja, u kupaonicama, podrumima, posebice u jesen i proljeće. Spore različitih vrsta plijesni sastavni su dio bioaerosola otvorenih i zatvorenih prostora. Ove aerogene čestice mogu prouzročiti različite bolesti dišnoga sustava (alergije, rinitis, bronhitis, astma, hipersenzitivna pneumonija, aspergiloza), ovisno o vrstama plijesni, koncentraciji njihovih spora i vremenu izloženosti, posebice u zatvorenim prostorima. Najznačajnije alergogene vrste plijesni su pripadnici rodova Cladosporium, Alternaria, Penicillium i Aspergillus. Grinje su zapravo uzrok većega dijela kućne prašine. One žive i hrane se mrtvim česticama ljudske i životinjske kože. U jednom gramu prašine može živjeti 2 000 pa čak i do 20 000 grinja. Mogu biti odgovorne za iritacije i infekcije očiju, uha, grla i nosa, napade astme, alergije, umor, depresije (Wright et al., 2014.; Phipatanakul et al., 2014.). O mikrobiološkim parametrima, koje sam proučavala svojim istraživačkim radom, nešto više u poglavlju obrazloženje teme. 1.4. Istraživanje kvalitete zraka O važnosti praćenja kvalitete zraka svjedoče svjetske direktive te programi, koji pokušavaju kvalitetu zraka u urbanim sredinama dovesti na razinu prihvatljivu ljudskom okolišu (Željko Dominis; 2006.). Zagañenje zraka uzrokuje raniju smrtnost više od 350 000 Europljana godišnje. Prema rezultatima istraživanja Svjetske zdravsvene organizacije (World Health Organization, WHO, 2003.) sitne, lebdeće čestice, ozon i dušični dioksid razorne su komponente zagañenja zraka koje ozbiljno ugrožavaju zdravlje povećavajući broj kardiovaskularnih i respiratornih bolesti, kao i rak pluća. No, od jednake je važnosti pratiti i mikrobiološku sliku zraka koja je takoñer važan aspekt procjenjivanja pogodnosti okoliša po ljudsko zdravlje. U Hrvatskoj se na institucionaliziranoj razini istraživanjem kvalitete zraka bavi i Državni hidrometeorološki zavod te Državna mreža za trajno praćenje kvalitete zraka na 23 različite mjerne postaje. Činjenica kako znanstvene publikacije o kakvoći zraka različitih segmenata ljudske okoline nastaju na svakodnevnoj bazi samo dodatno potvrñuje činjenicu kako se radi o topikalnom području.

2. OBRAZLOŽENJE TEME

S obzirom na činjenicu da sam se u svom istraživačkom radu bavila mikrobiološom slikom zraka, valja i o mikroorganizmima (općenito te specifično o onim koje sam u radu pratila) reći koju riječ više. Mikroorganizmi su dio ekološkoga sustava ljudskog okoliša, ali se nalaze i

6

endogeno u čovjeku. Mikrobne vrste u okolišu mogu biti izvor zaraznih bolesti za čovjeka, razgrañuju (kvare) hranu ili razgrañuju neživu okolinu. U zraku se mogu naći plijesni (filamentozne gljivice iz carstva gljiva) i bakterije (prokarioti) koji su u neprestalnim interakcijama s našim imunološkim sustavom. Inhalirajući spore plijesni i bakterije, dolazi do njihovog uništenja nespecifičnim ili specifičnim dijelovima imunološkog sustava. No, plijesni mogu biti i alergeni pa čak i sadržavati toksine u sporama (konidijama). Brojnost mikroorganizama u našem okolišu, kao i prisutnost odreñenih mikrobnih vrsta, ovisi o nizu čimbenika: izvoru supstrata za njihov rast (npr. kompost, cvijeće u kući, namirnice i dr. ), o vlazi u zraku, vjetru, prisutnosti kućnih ljubimaca, primjeni dezinfekcijskih metoda i drugima. S obzirom na činjenicu da odreñene mikrobne vrste prisutne u čovjekovu okolišu mogu, kako sam već i navela, uzrokovati različite zarazne bolesti te s obzirom na činjenicu da brojnost datih mikroba ovisi o različitim čimbenicima i parametrima, kvalitetu i kvantitetu dotičnih mikrobnih vrsta potrebno je pratiti i evidentirati. Praćenje mikrobiološke slike zraka, nije samo znanstvena, već i zdravstvena nužnost bez koje se ne može osigurati zdravstvena ispravnost ovoga aspekta čovjekove okoline. Stoga sam si postavila sljedeće pitanje: postoje li razlike u kvantiteti (broju mikroba) i kvaliteti (prisutnosti ili odsutnosti odreñenih mikrobnih vrsta) u pet različitih, životnih prostora (osnovnoškolska učionica, mjesto stanovanja, javni otvoreni prostor te dvije «kontrolne» lokacije – Jarun i Sljeme) tijekom dva različita vremenska intervala, odnosno rano u četvrtak (jutro) i kasno u četvrtak (večer)? Cilj moga rada jest praćenje mikrobioloških parametara poredbenom analizom. Mikrobiološki parametri koji sam pratila ovom poredbenom analizom su: ukupan broj gljivica, ukupan broj bakterija (mezofilnih i aerobnih) i ukupan broj gram-negativnih bakterija u m3 zraka. Poredbena mikrobiološka analiza dala je podatke o tome postoji li razlika izmeñu različitih prostora na početku i na kraju dana kroz tri mikrobiološka parametra. Nakon dobivanja podataka, metodologijom izraženom u poglavlju «materijali i metode», cilj je bio napraviti statističku analizu, koja ima za ishod zoran prikaz realnoga stanja mikrobiološke slike datih prostora pod različitim, jasno odreñenim parametrima. Nakon definiranja postojeće mikrobiološke slike zraka navedenih prostora, valjalo je donijeti zaključke o uzrocima, posljedicama te eventualnim vidovima «poboljšanja» date mikrobiološke slike zraka s ciljem unaprjeñenja kvalitete čovjekove životne okoline. Hipoteza, odnosno pretpostavka rezultata mikrobiološke slike zraka u odnosu na zadane parametre jest slijedeća: očekivao se porast sva tri mikrobiološka parametra, praćena poredbenom analizom u bilo kojemu zatvorenom prostoru u odnosu na otvoren prostor, odnosno javnu površinu. Veće su se vrijednosti takoñer očekivale u prostoru u kojemu dnevno boravi te prolazi veća količina ljudi (prostor osnovne škole u odnosu na mjesto stanovanja) te su se veće vrijednosti očekivale u ustajalim prostorima u kojima svakodnevno boravi odreñena količina ljudi (razlika izmeñu vremena u datom danu). Veća se brojnost očekivala i u prostorijama veće vlage ili većega izvora supstrata te drugih čimbenika, dok se najmanja kvantiteta promatranih parametara očekuje u antropogenim područjima. Data se pretpostavka primarno odnosila na kvantitativan aspekt mikrobiološke slike.

7

3. MATERIJAL I METODE RADA

3.1. Plan i tijek istraživanja Na osnovu postavljene hipoteze i cilja mikrobiološke analize zraka načinjen je plan uzorkovanja zraka. Zrak se je uzorkovao automatskim uzorkivačem naziva AirSampler ECO (Merck, Njemačka) i to 5 x po 100 L (u razini usta osnovnoškolaca odnosno na približno istoj visini na javnim otvorenim površinama) za svaku od tri skupine mikrobioloških podloga (ukupno 15 puta na svakom području) na pet različitih lokacija u dva različita vremena tijekom radnoga dana, odnosno ujutro i navečer 27.2.2014., četvrtak. S obzirom da se zrak uzorkovao na pet različitih lokacija, interval jutarnjega uzorkovanja objedinjuje vrijeme od 7:30h do 10:30h, dok večernji interval uzorkovanja objedinjuje vrijeme od 19:30h do 22:30h. Bitno je naglasiti kako je razlika izmeñu jutarnjeg i večernjeg uzorkovanja, upravo ono što rad čini reprezentativnim. Naime, tijekom vremenskog intervala koji objedinjuje vrijeme od kraja jutarnjeg do početka večernjeg uzorkovanja dolazi do izmjene niza parametara, koji mogu imati direktnu implikaciju na rezultate. Proces izmjene datih parametara odvija se na svakodnevnoj bazi prema sličnom obrascu, zbog čega je bilo bitno vidjeti razliku izmeñu jutra i večeri. Parametri koji se izmjenjuju tijekom dana jesu: količina vjetra, količina vlage u zraku, količina insolacije i shodno tome temperatura zraka, količina prometnosti kroz vid saobraćaja, ali i prometa ljudi te različitih ljudskih djelatnosti i drugo. Promjena datih parametara vidljiva je u rezultatima. Zrak se uzorkovao na tri selektivne sterilne krute mikrobiološke podloge (u petrijevim zdjelicama promjera 90 mm) i to a) triptikaza sojin agar s dodatkom inhibitora porasta gljivica cikloheksimidom s ciljem selektivne izolacije termofilnih i aerobnih bakterija, b) McConkeyev agar koji je selektivna i diferencijalna mikrobiološka podloga za izolaciju gram-negativnih bakterija te c) dikloran-glicerolni agar (DG18) koji omogućuje selektivnu izolaciju gljivičnih vrsta.

Slika 2. A) TSA + C agar Slika 3. B) MCA agar Slika 4. C) DG18 agar Nakon uzorkovanja zraka, označene mikrobiološke podloge inkubirale su se aerobno na 25°C tijekom 5 dana u mikrobiološkom laboratoriju Zavoda za mikrobiologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta. Broj poraslih kolonija bilježio se nakon petodnevne inkubacije, a uz pomoć mentora su se statistički obradili podaci primjenom analize varijance ANOVA uz Dunettov post-test, te su se uz Studentov t-test (p<0,05) usporedili podaci broja mikroba na početku i na kraju radnoga dana u pet različitih prostora. Posebno su se razdvojili podaci za ukupan broj gljivica, ukupan broj bakterija te za gram-negativne bakterije. Rezultate sam uz mentorovu pomoć obradila statistički te prikazala grafički i tablično, s posebnim prikazom statistički značajnih skupina. Sve mikrobiološke podloge korištene tijekom analize uništile su se u mentorovom zavodu autoklaviranjem (134°C/ 15 minuta) te neškodljivo uklonile.

8

Slika 5. Mikrobiološki laboratorij FBF-a Slika 6. Mikrobiološki laboratorij FBF-a 3.2. Lokacije istraživanja Uzorkovanje zraka prema planu iskazanom u potpoglavlju 3.1. provedeno je na pet različitih lokacija. Od datih pet lokacija prve su dvije klasificirane kao «zatvoreni», unutrašnji sustavi: prva lokacija je prostorija koja predstavlja boravište, odnosno razred osnovnoškolske populacije u jednoj zagrebačkoj osnovnoj školi, dok je druga prostorija dječja soba unutar stana četveročlane obitelji bez kućnih ljubimaca, lociranog u centru grada Zagreba. Treća lokacija predstavlja javnu površinu, odnosno otvoren sustav urbanog života, preciznije, radi se o prometnom raskršću Zelenog vala na sjecištu Hebrangove i Gundulićeve ulice. Četvrta i peta lokacija, uvedene prema sugestiji biološkog povjerenstva (potreba za referentnom skupinom) se klasificiraju kontrolnim, odnosno referentnim antropogenim sustavima te ujedno otvorenim prostorima. Precizirano, četvrta lokacija predstavlja Jarun dok peta lokacija predstavlja Sljeme (podsljemenska zona). Ciljane su skupine odabrane kako bi se pokazala jasna raznolikost izmeñu različitih sustava s aspekta mikrobiološke slike zraka te specifičnost datih sustava. Osim svoje raznolikosti zadane lokacije predstavljaju i reprezentativnu važnost kada je riječ o procjeni zdravstvene ispravnosti čovjekove okoline. Čak 90% svoga vremena čovjek provede u stanu/kući te školi/poslu. Put do tih lokakacija, kada govorimo o urbanim sredinama, čine upravo nizovi prometnih raskršća, a nažalost se tek u rijetkim situacijama imamo priliku opuštati na lokacijama poput Jaruna ili Sljemena. Na sljedećim su fotografijama prikazane točne pozicije «unutar» lokacija na kojima je uzorkovan zrak.

Slika 7. Osnovnoškolski razred Slika 8. Dječja soba stana

9

Slika 9. Zeleni val (gore navedeni ugao ) Slika 10. Jarun

Slika 11. Podsljemenska zona 3.3. Pribor i materijali korišteni tijekom istraživanja Izuzev 150 korištenih mikrobioloških podloga (50 TSA+C pločica agra, 50 MCA pločica agra, 50 DG18 pločica agra), već prikazanih u potpoglavlju 3.1. (slike 2,3,4), u izradi ovog istraživačkog rada korišteni su: automatski uzorkivač zraka naziva AirSampler ECO, mjerač vlage i temperature Boneco korišten za mjerenje datih parametara na lokacijama uzorkovanja, mobilna aplikacija «GPS Status» za odreñivanje GPS koordinata mjesta na kojima je zrak uzorkovan, potrošni materijal poput vodootpornih markera, ljepila te škara za označavanje te osiguravanje petrijevih pločica prije te nakon uzorkovanja zraka. U «drugom» dijelu istraživanja korišten je laboratorijski inkubator (vidljiv na slici 6. u potpoglavlju rada 3.1.) za petodnevnu inkubaciju mikrobioloških podloga te u krajnjem trenutku računalni programi za statističku obradu dobivenih podataka i za njihovo iznošenje. Iz javno dostupnih izvoda Državnog hidrometeorološkog zavoda Grič u Zagrebu (http://meteo.hr) uzeti su podaci o smjeru te jačini vjetra kroz dan uzorkovanja. Na sljedećim je fotografijama moguće vidjeti prikaz važnijeg pribora i materijala bez kojih izrada ovoga istraživačkoga rada ne bi bila moguća.

10

Slika 12. Uzorkivač zraka - AirSampler ECO Slika 13. Jedan od koraka korištenja ureñaja

Slika 14. Mjerač vlage i temperature Slika 15. Mobilna aplikacija «GPS Status»

Slika 16. Potrošni materijal (markeri, ljepilo, škare...)

11

4. REZULTATI 4.1. Rezultati okolišnih uvjeta Kako je već i u obrazloženju teme navedeno, mikrobiološka slika zraka ovisi o mnogim okolišnim čimbenicima te je upravo zbog težnje za što objektivnijim istraživanjem važno pratiti i te parametre kako bismo dobili potpunu sliku. Parametri okolišnih uvjeta koje sam mjerila na svim uzorkovanim lokacijama bili su vlaga i temperatura te, zbog specifiziranja mjesta uzorkovanja, obradila sam i GPS koordinate dotičnih pet lokacija u dva različita vremena odnosno ujutro i navečer 6.3.2014. Rezultate sam prikazala tablično. Tablica 1. Rezultati vlage i temperature i GPS koordinate uzorkovanih lokacija

VLAGA TEMPERATURA GPS KOORDINATE

OŠ jutro 22% 21°C širina-45.811; dužina-15.970 OŠ večer 29% 21.1°C širina-45.811; dužina-15.970 Stan (d.s.) jutro 21% 20.5°C širina-45.806; dužina-15.976 Stan (d.s.) večer 27% 21.4°C širina-45.806; dužina-15.976 Zeleni val jutro 30% 11.9°C širina-45.809; dužina-15.972 Zeleni val večer 38% 10°C širina-45.809; dužina-15.972 Jarun jutro 31% 10.9°C širina-45.782; dužina-15.925 Jarun večer 40% 10°C širina-45.782; dužina-15.925 Sljeme jutro 41% 9.3°C širina-45.858; dužina-15.972 Sljeme večer 44% 4°C širina-45.858; dužina-15.972 S obzirom na činjenicu kako su vremenski uvjeti, a pritom poglavito vjetar, od izuzetnog utjecaja na kvantitetu praćenih parametara mikrobiološke slike zraka, važno je bilo zabilježiti i smjer te jačinu vjetra, koji je puhao na dan uzorkovanja zbog potencijalnog utjecaja na rezultate.

Tablica 2. Smjer i količina vjetra na dan uzorkovanja

Vrijeme u danu Smjer i količina vjetra 7h SSI; 5 Bf 14h SI; 3 Bf 21h SI; 4 Bf

12

4.2. Rezultati poredbene mikrobiološke analize 1 Na svakoj od pet uzorkovanih lokacija (i ujutro i navečer) korišteno je po pet podloga od svake grupacije agra (ukupno 15) u 100 L zraka u svakom uzorkovanju. Praćeni mikrobiološki parametri bili su ukupan broj bakterija (mezofilnih i aerobnih (TSA+C agar)), ukupan broj gram-negativnih bakterija (MCA ) i ukupan broj gljivica (DG18 agar) u m3 zraka. Prva grupacija rezultata poredbene mikrobiološke analize pripada aerobnim mezofilnim bakterijama izraslim na triptikaza sojinom agru. Prvenstveno je važno prikazati uopćen – ukupan broj izraslih bakterijskih kolonija na svim ispitivanim lokacijama, što je i prikazano u grafu koji slijedi:

OŠJOŠVDSJDSVZVJZVV JU JV SU SV

0

50

100

150

200

250

300

*p<0,05

CFU/100L Xsr, minimalni-maksimalan broj

Slika 17: Usporedni prikaz ukupnog broja aerobnih mezofilnih bakterija na svim

ispitivanim lokacijama (Legenda za sliku 17: OŠJ=Osnovna škola jutro; OŠV=Osnovna škola večer;

DSJ=Dječja soba jutro; DSV=Dječja soba večer; ZVJ=Zeleni val jutro; ZVV=Zeleni val večer; JU=Jarun ujutro; JV=Jarun večer; SU=Sljeme ujutro; SV=Sljeme večer)

Izuzev prikazivanja rezultata ukupnoga broja aerobnih mezofilnih bakterija na ispitivanim lokacijama, važno je takoñer napraviti specifičnu usporedbu izmeñu jutra i večeri na svakoj od ispitivanih lokacija kako bi se utvrdilo postoji li bilo kakva značajna razlika izmeñu ta dva termina. Usporedba kvantitative jutra i večeri na svim lokacijama slijedi ispod teksta.

13

OŠJ

OŠV

0

500

1000

1500

2000p>0,05

ukupan broj AMB (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

DSJ

DSV

0

1000

2000

3000p>0,05

ukupan broj AMB (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

Slika 18. AMB u osnovnoj školi (jutro i večer) Slika 19. AMB u dječjoj sobi (jutro i večer)

ZVJ

ZVV

0

100

200

300

400

500

p>0,05

ukupan broj AMB (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

JJ JV

0

50

100

150

200

p>0,05

uku

pan

broj AMB (CFU/m

3 ), Xsr±± ±±SD

Slika 20. AMB na Zelenom valu (jutro i večer) Slika 21. AMB na Jarunu (jutro i večer)

SJ SV

0

100

200

300

400

p>0,05

ukupan broj AMB (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

Slika 22. AMB na Sljemenu (jutro i večer)

14

Kako bih što zornije prikazala rezultate uzorkovanja i inkubacije u slučaju aerobnih mezofilnih bakterija, prilažem po jednu fotografiju (od pet) svake grupacije TSA+C agra na svakoj od lokacija u oba vremena.

Slika 23. AMB Osnovna škola jutro Slika 24. AMB Osnovna škola večer

Slika 25. AMB Dječja soba jutro Slika 26. AMB Dječja soba večer

Slika 27. AMB Zeleni val jutro Slika 28. AMB Zeleni val večer

15

Slika 29. AMB Jarun jutro Slika 30. AMB Jarun večer

Slika 31. AMB Sljeme jutro Slika 32. AMB Sljeme večer 4.3. Rezultati poredbene mikrobiološke analize 2 Druga grupacija promatranih parametara poredbene mikrobiološke analize bile su gram negativne bakterije na MCA agru. Nakon uzorkovanja te inkubacije datih 50 podloga sa pet različitih lokacija u dva različita vremena nije izrasla pa samim time nije ni zabilježena niti jedna kolonija gram negativnih bakterija.

16

4.4. Rezultati poredbene mikrobiološke analize 3 Treća grupacija promatranih parametara poredbene mikrobiološke analize bile su gljivice na DG18 agru. Prvenstveno je važno prikazati uopćeno – ukupan broj izraslih gljivičnih kolonija na svim ispitivanim lokacijama što je i prikzano u grafu koji slijedi:

OŠJ

OŠV D

SJDSV ZV

JZVV JJ JV SJ SV

0

50

100

150

200*p<0,05

ukupan broj gljivica (CFU/m

3 ), Xsr, minimum-maksimum broja

Slika 33. Usporedni prikaz ukupnog broja gljivica na svim ispitivanim lokacijama (Legenda za sliku 33: OŠJ=Osnovna škola jutro; OŠV=Osnovna škola večer;

DSJ=Dječja soba jutro; DSV=Dječja soba večer; ZVJ=Zeleni val jutro; ZVV=Zeleni val večer; JJ=Jarun jutro; JV=Jarun večer; SJ=Sljeme jutro; SV=Sljeme večer)

Izuzev prikazivanja rezultata ukupnog broja gljivica na ispitivanim lokacijama, bitno je napraviti specifičnu usporedbu izmeñu jutra i večeri na svakoj od ispitivanih lokacija kako bi se utvrdilo postoji li bilo kakva značajna razlika izmeñu ta dva termina. Usporedba kvantitative (gljivica) jutra i večeri na svim lokacijama slijedi ispod teksta:

17

OŠJ

OŠV

0

50

100

150

200

p>0,05ukupan broj gljivica (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

DSJ

DSV

0

10

20

30

40

p>0,05

ukupan broj gljivica (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

Slika 34. Gljivice u osnovnoj školi(jutro i večer)Slika 35. Gljivice u dječjoj sobi(jutro i večer)

ZVJ

ZVV

0

50

100

150

p>0,05

ukupan broj gljivica (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

JJ JV

0

20

40

60

80

p>0,05

ukupan broj gljivica (CFU/m

3 ), Xsr±± ±±SD

Slika 36. Gljivice na Zelenom valu (jutro i večer) Slika 37. Gljivice na Jarunu (jutro i večer)

SJ SV

0

20

40

60p>0,05

ukupan broj gljivica (CFU/m

3), Xsr±± ±±SD

Slika 37. Gljivice na Sljemenu (jutro i večer)

18

Kako bih što zornije prikazala rezultate uzorkovanja i inkubacije u slučaju gljivica, prilažem po jednu fotografiju (od pet) svake grupacije DG18 agra na svakoj od lokacija u oba vremena:

Slika 38. Gljivice - Osnovna škola jutro Slika 39. Gljivice – Osnovna škola večer

Slika 40. Gljivice – Dječja soba jutro Slika 41. Gljivice – Dječja soba večer

Slika 42. Gljivice – Zeleni val jutro Slika 43. Gljivice – Zeleni val večer

19

Slika 44. Gljivice – Jarun jutro Slika 45. Gljivice – Jarun večer

Slika 46. Gljivice – Sljeme jutro Slika 47. Gljivice – Sljeme večer

5. RASPRAVA Nakon dobivenih rezultata i tablično-grafičke obrade istih, došla sam do odreñenih zapažanja i spoznaja koje ću u ovomu poglavlju pokušati definirati, elaborirati te usporediti. Prvi rezultati rada odnosile su se na one okolišne meñu kojima najvažniju ulogu u ovom slučaju dakako ima vlaga. Naime, izrazito suh zrak porazan je za ljudsko zdravlje te poguduje razvitku i razmnožavanju kvantitativno većeg broja bakterija i virusa dok izrazito vlažan zrak pogoduje razvitku plijesni i grinjama, koje su takoñer opasne po ljudsko zdravlje. Iz istih je razloga važno održavati optimalnu količinu vlage u zraku. U mom je istraživanju najmanji prosječni postotak vlažnosti zabilježen u stanu (dječjoj sobi), nakon čega slijedi osnovnoškolski razred, potom raskršće Zelenog vala, Jarun te u konačnici Sljeme. Prema znanstvenim procjenama o optimalnim vrijednostima vlažnosti zraka možemo zaključiti kako (http://www.serviceexperts.com/air-quality/humidification.aspx) stan, osnovna škola te

20

Zeleni val pripadaju intervalu presuhog, dok Jarun i Sljeme pripadaju optimalnom intervalu vlažnosti zraka. Rezultati temperatura uobičajeni su za ovaj dio godine te meñusobno ne odskaču, zbog čega ne zahtjevaju daljnji komentar. Smjer i količina vjetra dana 6.3.2014. bila je iznadprosječna u odnosu na ostatak dana u tjednu. U jutarnjem razdblju (7h) SSI vjetar imao je jakost 5 beauforta što iznosi 36 km/h i klasificira se kao jak vjetar. U popodnevnom je razdoblju SI vjetar imao jakost 3 beauforta, što iznosi 20 km/h i klasificira se umjerenim vjetrom. U večernjem je razdoblju SI vjetar imao jakost 4 beauforta odnosno 27 km/h te se klasificira blago jakim vjetrom (http://www.windfinder.com/wind/windspeed.htm). Zbog relativno značajne jačine vjetra toga dana, može se pretpostaviti kako su vanjski rezultati, a poglavito oni uzeti na Zelenom valu, biti umjereniji, umanjeni zbog naleta čistoga zraka – bure. Rezultati poredbene mikrobiološke analize 1, što je posebno vidljivo te uočljivo na slici 17., pokazuju značajnu razliku (p<0,05) u ukupnom broju aerobnih mezofilnih bakterija u osnovnoškolskom razredu te dječjoj sobi u odnosu na značajno manji broj aerobno mezofilnih bakterija na ostalim ispitivanim lokacijama (Zeleni val, Jarun i Sljeme). Ovaj rezultat zapravo većinski afirmira moju hipotezu i pokazuje kako se u zatvorenim prostorima, a poglavito u onim u kojima boravi veća količina ljudi, javlja kvantitativno veća količina aerobno mezofilnih bakterija. No, ono što je važno primjetiti jest činjenica kako ne postoji niti jedna značajna razlika izmeñu uzorkovanog jutra i večeri u ukupnom broju AMB-a. Činjenica, kako rezultatima poredbene mikrobiološke analize 2 nije utvrñena niti jedna gram-negativna bakterija, izrazito je pozitivna zbog njihove patogenosti i djelovanja na zdravlje. Mnoge gram-negativne bakterije su ujedno i multirezistentne (Zaidi et al; 2013) što ih čini posebno problematičnima za ljude. Rezultati poredbene mikrobiološke analize 3, što je posebno uočljivo na slici 33., pokazuju značajnu razliku (p<0,05) izmeñu večernjeg uzorkovanja osnovnoškolske učionice u odnosu na dječju sobu u oba termina. Naime, učionica broji kvantitativno najveći broj gljivica, a dječja soba najmanji. Mikromorfološki su se u svim uzorcima mogli primjetiti i kvasci i različite vrste plijesni. Osim navedenih specifičnosti, u ostalim uzorcima nema značajnih razlika u vremenima uzorkovanja. Prema provedenom istraživanju o prisustvu specifičnih vrsta plijesni u Zagrebu tijekom različitih godišnjih doba (Kosalec, Klarić, Pepeljnjak; 2005), veće se vrijednosti plijesni mogu zabilježiti tijekom jeseni i zima, a manje tijekom proljeća i ljeta. Date činjenice takoñer idu u prilog mom istraživanju s obzirom na činjenicu da prema temperaturama, a uskoro i kalendarski, ulazimo i službeno u razdoblje proljeća. Empirijske spoznaje te shvaćanje njihovih uzroka dovele su me i do zaključka o potrebi poboljšanja kvalitete zraka. Naime, zatvorene prostorije, u kojima boravimo veći dio našega života, trebalo bi redovito provjetravati, dezinficirati, smanjiti unos štetnih kemikalija i tvari kao što je dim cigarete i slično, dok na ventilacijske i klimatizacijske sustave treba obratiti posebnu pažnju, redovito ih servisirati uz svijest da ponekad isti mogu donijeti više štete nego koristi.

21

6. ZAKLJUČCI

1. Okolišni uvjeti poput vjetra, vlage i izvora supstrata mogu imati značajan utjecaj na mikrobiološku sliku zraka.

2. Temeljni mikrobiološki parametri, koje usporedno možemo pratiti, su aerobno mezofilne bakterije (koje rastu na TSA+C agru), gram negativne bakterije (koje rastu na CMA agru), gljivice (koje rastu na DG18 agru).

3. Kvantitativno najviše AMB-a može se pronaći u zatvorenim prostorima (učionica i dječja soba) dok se zatim njihov broj smanjuje redom – Zeleni val, Jarun te naposlijetku Sljeme, što potvrñuje postavljenu hipotezu.

4. Gram-negativne bakterije nisu pronañene na uzorkovanim lokacijama. 5. Kvantitativno najviše gljivica može se pronaći u osnovnoškolskoj učionici i to

ponajviše u večernjim satima, u odnosu na dječju sobu u kojoj sam ih detektirala najmanje.

6. Izuzev iznimaka ne postoje značajne razlike izmeñu jutarnje i večernje kvantitete praćenih mikroba.

7. Zatvorene prostorije u kojima boravimo veći dio našega svakodnevnog života trebalo bi redovito provjetravati, dezinficirati, smanjiti unos štetnih kemikalija i tvari, kao što je dim cigarete i slično, dok na ventilacijske i klimatizacijske sustave treba obratiti posebnu pažnju, redovito ih servisirati uz svijest da ponekad isti mogu donijeti više štete nego koristi.

7. SAŽETAK Zrak i njegova kvaliteta imaju važnu ulogu u procjeni zdravstvene ispravnosti čovjekove okoline. Kao što postoje kemijski, tako postoje i biološki polutanti koji smanjuju kakvoću zraka kojeg udišemo. Detaljnije zanimanje za ovo subpodručje oformilo je cilj moga rada koji je bio praćenje sljedećih mikrobioloških parametara poredbenom analizom: ukupan broj gljivica, ukupan broj bakterija (mezofilnih i aerobnih) i ukupan broj gram-negativnih bakterija u m3 zraka. Lokacije koje sam odlučila uzorkovati bile su: stan (dječja soba), osnovnoškolska učionica, Zeleni val, Jarun i Sljeme. Rezultati istraživanja su pokazali kako se kvantitativno najviše aerobno mezofilnih bakterija može pronaći u zatvorenim prostorima (učionica i dječja soba), dok se njihov broj smanjuje redom – Zeleni val, Jarun te Sljeme. Pokazali su kako gram-negativnih bakterija na datim lokacijama u trenutku uzorkovanja nije bilo te kako se kvantitativno najviše gljivica može pronaći u osnovnoškolskoj učionici, a najmanje u dječjoj sobi.

22

8. POPIS LITERATURE Popis udžbenika i znanstvenih radova:

1. Smilja Kalenić, MEDICINSKA MIKROBIOLOGIJA; Medicinska naklada - Zagreb, 2003.

2. Smilja Kalenić, MEDICINSKA MIKROBIOLOGIJA I MIKOLOGIJA; Udžbenik za studente medicine, 2. izd. Zagreb: Merkur A.B.D.; 2001.

3. J. Clin. Pharm. Ther. 2014 Mar 5. doi: 10.1111/jcpt.12138. 4. Acta Pharm. 55 (2005) 375-364 (Kosalec, Klarić, Pepeljnjak) 5. Fungal Genetics and Biology 39 (2003) 103-117 (Nielsen) 6. Science of the Total Environment 408 (2010) 4285-4295 (Cabral) 7. Health impact of exposure to pollens: A review of epidemiological studies (2013) 142-

149 (Cailland et al; Toloba) 8. Environmental remediation in the treatment of allergy and asthma: latest updates

(2013) 419 (Wright; Phipatanakul) 9. Posljedice stupanja na snagu protokola iz Kyota (2006) vol.53 No.3-4 (Dominis)

Popis internetskih stranica:

http://www.serviceexperts.com/air-quality/humidification.aspx http://www.windfinder.com/wind/windspeed.htm http://www.ekologija.com.hr/oneciscenje-zraka/ http://www.epa.gov/air/urbanair/ http://degenia-velebitica.com.hr/zdravlje/klima-uredaji/bolesti-vezane-uz-klima-uredaje/0/

9. ZAHVALA Ovim se putem želim zahvaliti svima onima bez čije podrške ovaj rad ne bi bio moguć. Svake godine radim na nekoliko, što natjecateljskih što projektnih istraživačkih radova i svjesna sam činjenice koliko podrška okoline te kvalitetan mentor mogu mijenjati stanje u pozitivnom pravcu. Stoga želim zahvaliti prvenstveno prof. dr. sc. Ivanu Kosalecu na nesebičnom dijeljenju svoga znanja, ali i velikog entuzijazma te mikrobiološkom zavodu Farmaceutsko biokemijskog fakulteta na ustupanju laboratorija i potrebite opreme. Veliko hvala mojoj profesorici i mentorici Mirti Prišlin na voñenju kroz proces izrade ovoga rada te čitavoj mojoj školi i njenom stručnom kadru na beskrajnom razumijevanju. Takoñer, hvala mojim roditeljima bez čije bi se podrške bilo teško, već treću godinu, upuštati u ovakav oblik rada koji mi neizmjerno puno znači.

# Napomena: rad broji točno 20 stranica ukoliko se ne ubrajaju dvije naslovne stranice.