DNA RECOMBINANTE

DNA Recombinante: Una molécula de DNA formada por la unión de segmentos de

DNA de distintos orígenes. Los DNAs recombinantes son utilizados en el clonamiento

de genes, en la modificación genética de organismos y como herramienta general en

biología molecular.

Algunas técnicas utilizadas:

• Corte de DNA en secuencias específicas por endonucleasas de

restricción (enzimas de restricción)

• Hibridización o Hibridación de ácidos nucleicos: permite encontrar una

secuencia específica de DNA o RNA sobre la base de la

complementariedad de bases

• Clonamiento de DNA: una molécula de DNA puede ser copiada para

generar muchas copias idénticas de ella

• Amplificación de segmentos de DNA por la reacción en cadena de la

polimerasa o PCR.

Analisis de DNA

• Southern blot • PCR • RFLP

Existen 3 tipos de enzimas de restricción:

Tipo I y Tipo III: Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). Cortan a cierta

distancia de la secuencia de reconocimiento

Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río

abajo.

Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.

Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de

reconocimiento hasta el sitio del corte.

Tipo II: Sólo tienen actividad de restricción.

Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.

Sólo requieren Mg++ como cofactor.

No necesitan ATP.

Endonucleasas o Enzimas

de Restricción

Permiten generar un mapa o patrón de restricción

Análisis de DNA Digerido con Enzimas de Restricción

Aplicaciones de las enzimas de restricción:

1.- Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

2.- Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.

3.- Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”

y “Northern” blotting.

4.- Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados,

creación de DNA recombinante.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) es diferentes

secuencias de DNA homólogos que pueden ser detectadas por la

presencia de fragmentos de diferentes longitudes luego de la

Digestión de muestras de DNA con especificas Endonucleasas de

restricción.

Para ello se utilizan combinaciones de Enzimas de Restricción

Además del clásico plasmidio (utilizado para clonar),

existen diferentes sistemas de Expresión.

Yeast Artificial Chromosome (YAC)

Vectores de Expresión

Vectores Retrovirales

Vectores Lentivirales

Hibridacion

• La hibridación de Ac. Nucleicos es fundamental en estudios moleculares. Utiliza la capacidad natural de union entre DNA o RNA para formar dsDNA o dsRNA.

• Es una propiedad utilizada en muchas tecnicas de biologia molecular (diagnostic tests).

Southern blot

Nitrocelulosa

5’ ACTGCTCGATGCTCTCGGATCGCTCTGATTCG 3’

DNA unido a la membrana

3’ ACCAGAGCCTAGC 5’

sonda

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Componentes: Template • Pureza, origen, concentracion

• DNA genómico ~ 100-250 ng

• DNA plasmidial ~ 20 ng

Buffer • Necesario el MgCl2 • (0.5mM to 3.0mM 1.5mM default)

dNTP’s • Concentración Final 200M Polimerase • Grado de error y condiciones requeridas Primer(s) • tamaño (typically 18-30 nt) • G+C content (40-60%)

Parametros Criticos: Annealing Temperature • Cerca de 5-7°C bajo la Tm Annealing Time • Regla de 1kb por minuto Primer Design

El primer ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias específicas de DNA. El

DNA aislado de células es calentado para separar

sus hebras complementarias. Estas

hebras son hibridizadas a dos fragmentos de DNA

de hebra simple (oligonucleótidos), que han sido sintetizados

químicamente. Estos dos oligonucleótidos sirven

como partidores específicos para la

síntesis de DNA por la DNA polimerasa, la cual

copia el DNA que se encuentra entre las

regiones de unión de los partidores.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (polymerase chain reaction)

Hebras de DNA complementarias separadas por calor

Partidores definidos

Síntesis de DNA

Región amplificada

Cada ciclo tiene 3 etapas: denaturación (separación de hebras), hibridización (unión de partidores al templado) y elongación (polimerización de

desoxirribonucleótidos para sintetizar DNA sobre el templado).

PARTIDORES

DENATURACIÓN: HIBRIDACIÓN:

PARTIDORES

ELONGACIÓN:

La cantidad de DNA producido se duplica en cada ciclo, lográndose una amplificación

exponencial del fragmento deseado, a partir de poca cantidad de DNA. La enzima utilizada

para amplificar DNA en el PCR es la de la bacteria Thermus aquaticus (Taq Polimerasa).

Este organismo vive en ambientes de temperaturas muy altas (géiseres), lo cual permite

que su DNA polimerasa resista las temperaturas requeridas para la amplificación por PCR

Linear Ground Phase

CT

Log-Linear Phase

Early Exponential Phase

Real-Time PCR

Existen tres métodos generales para la detección cuantitativa: 1. Reactivo que se une al DNA (SYBR Green) 2. Hidrolisis de sondas (TaqMan, Beacons, Scorpions) – utiliza la actividad

exonucleasa de la DNA Pol

M 10fg 100fg 1pg 10pg 100pg 1ng 10ng control

• SYBR Green I binds dsDNA

• SGI fluorescence increases when bound to dsDNA

• As dsDNA accumulates, more SGI binds the DNA and the fluorescence increase

l

l

l

l

PCR

Reaction Progression

l

l

l

l l

l

l

l l

l l

l

RT-PCR EN TIEMPO REAL (SYBR Green)

• Target specific hybridization probe

• 5’ reporter and 3’ quencher

• Utilizes FRET quenching

R

Q

Reporter

Quencher R Q

* heat for BHQs

Energy

Light* Light

RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)

Taq Taq

R Q Q

l

R Q R

Q

1. During PCR, probe hybridizes

to target sequence

2. Probe is partially

displaced during extension

3. Probe cleaved by 5’- 3’

nuclease activity of polymerase

4. Illuminated free reporter

exhibits unquenched fluorescence

RT-PCR EN TIEMPO REAL (TaqMan)

HeLa, -actin

iScript qRT-PCR Standard Curve Comparison:

cDNA serial dilution vs. total RNA serial dilution

Log Starting Quantity (femtograms of input RNA)

Note: 1/10th of cDNA reaction used for PCR

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Cycle Threshold Num

be

T )

5

10

15

20

25

30

35

40

cDNA Standard Curve Total RNA Standard Curve

cDNA total

RNA Slope -3.394

-3.382 Corr. Coef. 0.999

0.999 Intercept 38.91

38.09 PCR efficiency 97.1% 97.6%

Método RFLP para la Prueba de Paternidad por ADN