جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

1 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

DNA Ligation ربط قطع الدنا

ان عممية ربط تمك القطع من الخطوات الاساسية والميمة التي تجري طبيعيا في الخلايا الحية او DNAخلال تجارب اليندسة الوراثية، وذلك بألاعتماد عمى قدرة الانزيمات اللاحمة )الانزيمات الرابطة

ligasesمية التضاعف ( الموجودة ضمن الانزيمات المشاركة في عمreplication واصلاح الاخطاء.

بين phosphodiester bond يسترحيث تتمتع ىذه الانزيمات بالقدرة عمى بناء الاصرة الفوسفاتية ثنائية الا رمتجاو النيوكميوتيد ( لمP-5النيوكميوتيدات ومجموعة الفوسفات )( لاحدى OH-3مجموعة اليدروكسيل )

عدة كائنات حقيقية بعد عزل ىذا الانزيم من لقدرة في تجارب اليندسة الوراثية ، وقد استثمرت ىذه ا(1)الشكلوبدائية النواة وكذلك الفيروسات وجميعيا تشترك بقابميتيا عمى اصلاح الكسور الموجودة في الخيوط المفردة

لكلا النوعين من النيايات اللاصقة او المستوية.

يسترة الابناء الاصرة الفوسفاتية ثنائي :1الشكل

، وممخص T4ومن العاثي E.coli بكترياتركزت الدراسات حول الانزيمين المعزولين من دالتون كما ان حاجة 67777دالتون اما الثاني فقد بمغ 74777خصائصيما ان الوزن الجزيئي للاول يبمغ

، اما آلية عمميما ATPاما الثاني فيحتاج لمعامل +NADالاول لمعوامل المساعدة تركزت بوجود العامل

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

2 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

الذي يرتبط بالثممة )الكسر( AMPفانيما يتشابيان حيث ينشطر العامل المساعد ليكون معقدا من الانزيم و من العممية. AMP( ليقوم باعادة تكوين الاصرة ومحررا P-5( و )OH-3الحاممة لممجموعتين )

لقابميتو عمى ربط قطع الدنا ذات النيايات T4الا ان الافضمية تتجو نحو الانزيم المعزول من العاثي اساسا عمى ربط النيايات اللاصقة، فانو يعمل E.coli بكترياالمستوية واللاصقة عمى حد سواء بينما انزيم

، ولاجل تسريع وتسييل عممية T4مصابة بالعاثي E.coliاصلا من خلايا T4عزل الانزيم من العاثي لمسؤل عن انتاجو في احد نواقل العاثي لامدا الذي ادخل فيما بعد الى بكتريا الحصول عميو تم كمونة الجين ا

E.coli عمى شكل عاثي اوليprophage وبيذا اصبح ممكنا الحصول عمى كميات كبيرة من ىذا الانزيم ،تعمل الحاوية عمى العاثي اليجين لامدا، ويتوفر الان تجاريا وباسعار مناسبة ويسE.coli وبسيولة من بكتريا

بشكل واسع في تجارب لبيندسة الوراثية.

Sticky Ends Ligationربط قطع الدنا ذات النهايات اللاصقة: -1

الكمونة، يجب اولا اختيار انزيم التقييد المناسب لقطع ناقل الكمونة عند الشروع في اي تجربة من تجارب نزيم المستعمل من النوع الذي ينتج قطع ويفضل عادة ان يكون الا وجزيئة الدنا الغريبة المرغوب كمونتيا،

.DNA ligaseدنا ذات نيايات لاصقة متكاممة لسيولة ربط مثل ىذه القطع بواسطة انزيم

تتحد النيايات اللاصقة اولا عن طريق ارتباط قواعدىا النيتروجينية المتكاممة بواسطة الاواصر جة الكافية لحمل قطعتي الدنا معاً بصورة ثابتة ولكنو الييدروجينية، الا ان ىذا الاتحاد لا يكون قوياً بالدر

يسيل عمل انزيم لايجيز الدنا الذي يضاف فيما بعد لاصلاح الكسرين الباقيين في العمود الفقري يبعدان عن بعضيما ببضعة ازواج قاعدية، وذلك عن طريق تكوين الاواصر الفوسفاتية لمخيطين، المذان

الى تكوين جزيئة دنا ىجينة مستقرة يمكن ادخاليا فيما DNA ligaseنزيم ثنائية الايستر. يؤدي عمل ا . transformationبعد الى خمية المضيف الملائم باتباع احدى الطرق الملائمة مثل التحول

ومن الجدير بالذكر ان مناطق ارتباط النيايات اللاصقة المتكاممة ستكون حساسة لنفس الانزيم الذي ر، وبيذا سيكون من السيولو استخلاص قطعة الدنا الغريبة المكمونو وذلك بمعاممة الجزئية انتجيا او الام

اليجينة بنقس الانزيم.

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

3 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

: ربط قطعة الدنا الغريبة الى ناقل كمونة مناسب. 2الشكل

ان ىدف الكمونة ىو ربط قطعة الدنا الغريبة )المرغوبة( الى ناقل كمونة مناسب، في انبوبة الاختبار، . ولكن يجب عمى (2)الشكل ليتسنى فيما بعد ادخال الجزيئات اليجينة الناتجة الى الخلايا المضيفة

الباحث وضع في حساباتو ان تكوين الجزيئات اليجينة ليس الاحتمال الوحيد الناتج من عممية الربط نيايتا ترتبط ، وانما ىناك احتمالات اخرى يمكن حدوثيا في خميط التفاعل فقدDNA ligaseبواسطة

بدون الارتباط بقطعة circularizationناقل الكمونة مع بعضيا مما يؤدي الى تدوير الناقل عمى نفسو( dimerالدنا الغريبة، كما يمكن ارتباط جزيئتين من ناقل الكمونة مع بعضيا لتكوين ناقل ثنائية) دايمر

لاتحتوي عمى قطعة دنا غريبة.

بدون شك الى اختزال كفاءة عممية الكمونة ، وذلك لان كثير من الخلايا تؤدي مثل ىذه الارتباطاتالمتحولة ستحتوي عمى نواقل الكمونة فقط بدون قطعة الدنا الغريبة. لذا يتوجب تييئة كافة الظروف

عمى افضل النتائج من خلال الحصول عمى جزيئات الملائمة التي من شأنيا زيادة احتمالية الحصول قميل من الارتباطات الاخرى.ىجينة والت

ان احد العوامل الميمة التي تساعد عمى زيادة تكوين الجزيئات اليجينة ىي اجراء التفاعل بوجود تركيز الدنا الغريبة في وقد اوضحت الدراسات ان نسبة تركيز جزيئات الناقل الى تركيز عالي من قطع الدنا.

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

4 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

ممية الربط والحصول عمى جزيئات ىجينة، وليذا تتم خميط التفاعل ليا دور ميم في زيادة كفاءة ع تفاعلات الربط في الغالب بخمط جزيئات الناقل والدنا بنسبة ثلاثة الى واحد.

انزيم طريقة اخرى تستخدم لزيادة كفاءة الكمونة ىي معاممة نواقل الكمونة )وقبل خمطيا مع الدنا الغريبة( بالمعزول من البكتريا او العجول الذي يعمل عمى ازالة alkaline phosphataseالفوسفاتيز القاعدي

)الشكل لمنيايات اللاصقة مما يمنع تدور النواقل او ارتباطيا مع بعضيا 5مجاميع الفوسفات من الطرف 3).

معاممة نواقل الكمونة بانزيم الفوسفاتيز القاعدي :3الشكل

الانزيم ىي ربطيا مع قطعة دنا غريبة غير معاممة ان الطريقة الوحيدة لتدوير النواقل المعاممة بيذافي ىذه الحالة سيعمل انزيم طرفية في كل من منطقتي الارتباط، بالانزيم، التي ستوفر مجموعة فوسفات

DNA ligase عمى اصلاح الكسرين الحاويين عمى مجموعة فوسفات، في حين يبقى كسر واحد في كل. الا ان بقاء ىذين الكسرين لايؤثر كثيرا عمى (4)الشكل تصميحبدون (Nick) من منطقتي الارتباط

بحيث يمكن ادخاليا الى خلايا المضيف التي تعمل عمى اصلاحيا فيما بعد استقرار الجزيئة اليجينة بواسطة اجيزة الاصلاح التي تحتوييا ىذه الخلايا.

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

5 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

.ون تصميح( بدNick) كسر واحد في كل من منطقتي الارتباط : بقاء4الشكل

ىناك عوامل اخرى تؤثر عمى كفاءة تفاعلات الربط مثل درجة حرارة التفاعل، عمى الرغم من ان درجة . الا ان تفاعلات ربط قطع الدنا ذات النيايات ˚م 37ىي DNA ligaseالحرارة المثمى لفعالية انزيم

تربط القواعد المتكاممة لمنيايات اللاصقة لا تجري في مثل ىذه الدرجة لان الاواصر الييدروجينية التي اللاصقة لا تكون مستقرة في مثل ىذه الدرجة العالية، لذا تجرى ىذه التفاعلات بدرجة حرارة تضمن التوزان بين فعالية الانزيم واستقرار الاواصر الييدروجينية، وغالبا ما تتراوح درجة الحرارة المستعممة بين

.˚م 15 -˚م17

Blunt Ends Ligationلنهايات المستوية: ربط قطع الدنا ذات ا -2

بالنظر لسيولة وكفاءة عممية ربط قطع الدنا ذات النيايات اللاصقة فانيا تستخدم بشكل واسع في تجارب الكمونة، الا ان ذلك لا يعني عدم استعمال قطع الدنا ذات النيايات المستوية في مثل ىذه التجارب

د الملائم الذي ينتج نيايات لاصقة.وخاصة في حالة عدم توفر انزيم تقيي

القادر عمى ربط T4لاجل ربط قطع الدنا ذات النيايات المستوية لابد من استعمال انزيم لايجيز الدنا ، ولكن نظرا لطبيعة النيايات المستوية فان عممية ربطيا اقل كفاءة واكثر بطأً من عممية ىذه النيايات

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

6 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

ة، فقد وجد ان عممية ربط قطع الدنا ذات النيايات اللاصقة اسرع ربط قطع الدنا ذات النيايات اللاصقبحوالي مئة مرة من عممية ربط قطع الدنا ذات النيايات المستوية ويعود السبب في ذلك الى عدم قدرة النيايات المستوية عمى الاتحاد الاولي مع بعضيا )كما في حالة النيايات اللاصقة( لتسييل عمل لايجيز

كي يقوم لايجيز الدنا بربط النيايات المستوية لابد من التقاء ىذه النيايات اولا بحيث تصبح الدنا. فممتقابمة وقريبة من بعضيا ليتسنى للانزيم ربطيا معا. وبما احتمال التقاء النيايات المستوية بيذا الشكل

ن لفترة زمنية قصيرة جدا، فان تركيز الدنا في خميط التفاعل في محمول التفاعل قميل جدا، وان حدث يكو يجب ان يكون اعمى من التركيز المستعمل في ربط النيايات اللاصقة وذلك لزيادة فرص التقاء النيايات

ربط قطع الدنا ذات النيايات المستوية يحتاج، في الاقل، الى المستوية مع بعضيا. ويعتقد ان تفاعل ، واحدة تعمل عمى حمل النيايتين المستويتين في موضع متقابل، T4يم لايجيز الدنا جزيئتين من انز

وتعمل الاخرى عمى تكوين الاواصر الفوسفاتية ثنائية الايستر بين النيايتين لاتمام عممية الربط. لذا فان كيز الانزيم مرة من تر 37-17المستعمل في مثل ىذا التفاعل يكون اكثر بحدود T4تركيز لايجيز الدنا

المطموب لمحصول عمى نفس معدل الارتباط باستعمال النيايات اللاصقة. بما ان تفاعلات ربط قطع الدنا ذات النيايات المستوية لاتعتمد عمى اتحاد النيايات بواسطة الاواصر الييدروجينية، فان درجة

يات اللاصقة، وعموما تترواح درجة الحرارة لا تمعب نفس الدور المؤثر الذي تمعبو في تفاعلات ربط النيا .˚م 27-25الحرارة المستعممة في تفاعلات ربط النيايات المستوية بين

ذكرنا ان احد الشروط الاساسية لربط النيايات اللاصقة ىو ان تكون ىذه النيايات منتجة بنفس انزيم اممة الجزيئة اليجينة بنفس التقييد. وبيذا سيكون ممكنا استخلاص الدنا المكمونة بسيولة عن طريق مع

ناقل الكمونة. اما في حالة ربط قطع الدنا ذات النياياتانزيم التقييد المستعمل في قطع الدنا الغريبة و المستوية فان العممية ممكنة سواء كانت ىذه النيايات منتجة بنفس الانزيم او بانزيمين مختمفين. وفي

اتج غير حساس لكلا الانزيمين مما يعني عدم امكانية الحالة الثانية سيكون موضع الارتباط الناستخلاص الدنا المكمونة من جزيئة الناقل وىذا يمثل مشكمة كبيرة في تجارب الكمونة، ولاجل تجاوز ىذه المشكمة استنبطت وسائل يمكن من خلاليا زيادة كفاءة كمونة قطع الدنا ذات النيايات المستوية ومن ثم

Linkerاىم ىذه الوسائل ىي استخدام الجزيئات الرابطة ن ناقل الكمونة.استخلاصيا بسيولة مmolecules الوصيلات ،Adaptors و التذييل بالبوليمرات المتجانسة Homopolymer Tailing.

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

7 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

:Linker molecules:الجزيئات الرابطة 2-1

وكميوتيدات مصنعة ازواج من الني 17-8الجزيئات الرابطة عبارة عن تتابعات قصيرة مكونة من مختبريا بحيث تحتوي عمى موضع حساس لواحد او اكثر من انزيمات التقييد، تستخدم عادة في عمميات

.كمونة قطع الدنا ذات النيايات المستوية بطريقو تسمح باستخلاصيا من الناقل اذا دعت الحاجة لذلك

، EcoRIجزيئة رابطة من نوع كمونة قطع دنا ذات نيايات مستوية باستخدام الشكل ادناهيوضح

في تجارب الكمونة. Linkers: استخدام الجزيئات الرابطة 5الشكل

، اولا الجزيئات الرابطة الى طرفي قطع الدنا EcoRIاي انيا تحتوي عمى موضع حساس لانزيم تمصق الذي EcoRIجة بانزيم ، ثم تعامل القطع النات T4ذات النيايات المستوية بواسطة انزيم لايجيز الدنا

. EcoRIيقطع مواضعو الحساسة في الجزيئات الرابطة لانتاج قطع دنا ذات نيايات لاصقة من نوع

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

8 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

يمكن بعد ذلك كمونة ىذه القطع وبسيولة عن طريق ارتباط نياياتيا اللاصقة مع النيايات اللاصقة لناقل ناتجة ستكون في ىذه الحالة حساسة للانزيم . ان مواضع الارتباط الEcoRIالكمونة المقطوع بالانزيم

EcoRI مما يسمح بأستخلاص الدنا المكمونة عن طريق معاممة الجزيئة اليجينة بالانزيمEcoRI.

:Adaptors: استخدام الوصيلات 2-2

من استخدام الجزيئات الرابطة وبنجاح في الكمونة، الا ان استخداميا لا يكون ممكنا في حالة عمى الرغم تواء قطعة الدنا الغريبة عمى موضع حساس او اكثر لنفس الانزيم الذي يستعمل لقطع الجزيئات اح

. ففي ىذه الحالة ستقطع جزيئة الدنا الغريبة الى قطعتين او اكثر مما يفقدىا ىويتيا المميزه ،الرابطة

.BamHI: كمونة قطع دنا ذات نهايات مستوية باستخدام الوصيلات من نوع 6الشكل

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

9 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

يمكن تجاوز ىذه المشكمة باستخدام انزيم اخر لقطع الجزيئات الرابطة وفي حالة تعذر الحصول عمى الانزيم الملائم لذلك، وخاصة اذا كانت قطع الدنا الغريبة كبيرة الحجم ومحتوية عمى مواضع حساسة لعدد

اخل الدنا الغريبة ليصبح من الانزيمات، فعندئذ يمكن المجوء الى حل اخر وىو تحوير الموضع الحساس دمقاوما لانزيم التقييد. وبما ان عمميات التحوير تتسم بالصعوبة والتعقيد يمجأ عادة الى حل جذري وعام

، وىي عبارة عن قطع صغيرة مصنعة في المختبر Adaptorsليذه المشكمة وىو استخدام الوصيلات يا والطرف الاخر ذات نياية مستوية حاوية تحتوي عمى نياية لاصقة ومنزوعة الفوسفات في احد طرفي

كمونة قطع دنا ذات نيايات مستوية باستخدام الوصيلات من (6 الشكل)يوضح .عمى مجموعة الفوسفات .BamHIنوع

لانتاج قطع دنا T4تربط النيايات المستوية لموصيلات اولا الى قطع الدنا الغريبة باستعمال انزيم لايجيز ، وبما ان ىذه النيايات لا تحتوي عمى مجاميع الفوسفات لا يكون BamHIن نوع ذات نيايات لاصقة م

وقبل كمونة القطع ىناك اي احتمال لارتباطيا مع بعضيا في محمول التفاعل. وبعد اتمام ربط الوصيلاتمن النيايات اللاصقة لتصبح 5الناتجة عن ىذا الارتباط لابد من اضافة مجموعة فوسفات الى الطرف

لناقل الكمونة وتكوين الجزيئة اليجينة. BamHIزة لمكمونة في موضع جاى

:Homopolymer tailing استخدام التذييل بالبوليمرات المتجانسة : 2-3

يقصد بيا انيا خيط دنا مفرد مكون من عدد من الوحدات البنائية)النيوكميوتيدات( المتماثمة، فاذا كان ىذا ، من عدد من النيوكميوتيدات من نوع الادينوسين منقوص الاوكسجين الخيط مكوناً، عمى سبيل المثال

deoxyadenosine dA يطمق عميو اسم متعدد الادينوسين منقوص الاوكسجينpolydeoxyadenosine او متعددdA .للاختصار

لاحد قطع oH-3نيوكميوتيد الى طرفي 47-17يتراوح بين dAتتضمن عممية التذييل اضافة عدد من لمقطعة الثانية التي يراد ربطيا الى القطعة الاولى مما oH-3الى طرفي dTالدنا، واضافة عدد من

.يؤدي الى تكوين قطع دنا ذات نيايات لاصقة متكاممة يمكن ربطيا معا لتكوين جزيئة ىجين دائرية

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

10 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

oH-3الى طرفي dTمن لاحد قطع الدنا، واضافة عدد oH-3الى طرفي dA: التذييل اضافة عدد من 7الشكل

لمقطعة الثانية

يمكن ادخال الجزيئة اليجينة المتكونة الى المضيف الملائم الذي يعمل عمى ممئ الفراغات واصلاح الكسور الباقية في الجزيئة، بواسطة اجيزة الاصلاح الموجودة فيو لتكوين جزيئة ىجينة كاممة ومستقرة.

Terminal deoxynucleotidyl – transferase و انزيم ان الانزيم المسؤول عن تخميق الذيول ى(terminal transferase) الترانسفيريز الطرفي الذي يقوم باضافة النيوكميوتيدات وبصورة متعاقبة الى

منتجا ذيولا متكونة من عدد من النيوكميوتيدات المتماثمة. oH-3النياية

جامعة تكريت/ د.عقيل حسين امعاصي –كلية امعلوم –قسم علوم الحيات –المرحلة امرابعة –وموجي جزيئي وهندسة وراثية باي، 10م

11 1991 -من كتاة مبادئ امهندسة اموراثية نلمؤمف ب .د.غامب حمزت امبكري

مكشوفة oH-3منتجا ذات نهايات 5يوط الدنا من الطرف يعمل عمى هضم خ λ exonuclease: انزيم 8الشكل

ليتسنى لو اضافة النيوكميوتيدات exposedحرة ومكشوفة oH-3يشترط لعمل ىذا الانزيم توفر نياية oH-3فان مجموعة p-5الى ىذه النياية. وبما ان معظم النيايات اللاصقة تكون ناتئة في الطرف

لمنيايات المستوية لا يكون مكشوفا بالدرجة oH-3يم، كما ان الطرف تكون مغطاة مما يعيق عمل الانز λالكافية لاستعمالو من قبل انزيم الترانسفيريز الطرفي. لذا فان حمزونات الدنا غالبا ما تعامل بانزيم

exonuclease منتجا بذلك جزيئات دنا ذات نيايات 5الذي يعمل عمى ىضم خيوط الدنا من الطرف3-oH (8الشكل ) ة وملائمة لعمل انزيم الترانسيفريز الطرفيمكشوف .

تكون ملائمة لعمل انزيم الترانسيفريز PstIمن الجدير بالذكر ان قطع الدنا المنتجة بانزيم تقييد مثل .oH-3لانيا تحتوي عمى نيايات ناتئو في الطرف λ exonucleaseالطرفي بدون معاممتيا بانزيم