D:\kosmos\Kosmos 3-2002\3-2002.VP

$Page 1: D:\kosmos\Kosmos 3-2002\3-2002.VP$
MIROS£AWA W£ODARCZYK

Zak³ad Genetyki Bakterii

Instytut Mikrobiologii

Uniwersytet Warszawski

Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa

[email protected]

RÓ¯NORODNOŒÆ CECH FENOTYPOWYCH BAKTERII KODOWANYCH PRZEZPLAZMIDY

W zale¿noœci od wielkoœci cz¹steczki, pla-zmidy nios¹ geny koduj¹ce od kilku do kilkusetró¿nych bia³ek. Jednak¿e, jak ju¿ wspomnia³amw poprzednim artykule, produkty genów o pla-zmidowej lokalizacji nie s¹ niezbêdne do wzro-stu komórki w standardowych (normalnych)warunkach. Na plazmidach nie znajdziemywiêc genów koduj¹cych polimerazê RNA, pod-jednostki rybosomów, enzymów cyklu Krebsaitp. W rzadkich przypadkach, gdy na plazmi-dzie stwierdzamy obecnoœæ tego typu genów,lub gdy nie jesteœmy w stanie usun¹æ replikonuuznawanego za plazmid z komórki, mamy pod-stawy do podjêcia rozwa¿añ czy istotnie mamydo czynienia z plazmidem, czy te¿ jest to repli-kon niezbêdny do ¿ycia komórki, a wiêc chro-

mosom. Przypominam, ¿e od modelowej zasa-dy, i¿ jedna komórka bakteryjna zawiera jedenchromosom s¹ wyj¹tki; przyk³adem mog¹ byæniektóre gatunki Rhizobium i Paracoccus.Geny o lokalizacji plazmidowej daj¹ bakteriomselekcyjn¹ przewagê w pewnych specjalnychwarunkach, czêsto wrêcz umo¿liwiaj¹c imprze¿ycie. Powstaje zatem pytanie, dlaczegogeny te nie s¹ po prostu czêœci¹ chromosomu,tak aby wszystkie bakterie w sytuacjach niety-powych mog³y odnosiæ korzyœæ z ich obecno-œci. Dyskusja tego problemu zostanie podjêtana koñcu artyku³u, po przedstawieniuprzegl¹du ró¿norodnoœci funkcji fenotypo-wych kodowanych przez geny plazmidowe.

TYPY GENÓW OBECNYCH NA PLAZMIDACH

Wœród genów obecnych na plazmidachmo¿emy wyró¿niæ dwa ich podstawowe typy.Pierwszy, to geny absolutnie niezbêdne dlafunkcjonowania plazmidu jako autonomiczne-go replikonu i obecne w ka¿dym plazmidzie, awiêc geny i sekwencje (np. oriV), niezbêdnedo replikacji i stabilnego utrzymywaniacz¹steczki plazmidu w komórce. Drugi typ, towszystkie pozosta³e geny stanowi¹ce „dodat-kowe wyposa¿enie” plazmidu, od których zale-¿y ró¿norodnoœæ fenotypów kodowanychprzez plazmidy, lecz które nie s¹ niezbêdnymelementem sk³adowym ka¿dego plazmidu. Na

Ryc. 1 w schematyczny sposób przedstawionoz³o¿onoœæ struktury plazmidu, wyró¿niaj¹c wobrêbie jego cz¹steczki kilka umownych mo-du³ów strukturalno-funkcjonalnych (THOMAS2000).

Plazmid zawieraj¹cy tylko „modu³ replika-cyjny”, bêdzie spe³nia³ kryteria definicji pla-zmidu, lecz jego obecnoœæ nie bêdzie nadawa³akomórce gospodarza ¿adnych specjalnych fe-notypowych w³aœciwoœci odró¿niaj¹cych j¹ odkomórki bezplazmidowej. Bêdzie to wiêc pla-zmid sensu stricto kryptyczny. Zwracam uwa-gê, ¿e mianem plazmidu kryptycznego okreœla-

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 241–254

my te¿ zwyczajowo plazmid zidentyfikowanypoprzez wykrycie w komórce fizycznej obec-noœci DNA plazmidowego, lecz którego obec-noœci nie kojarzymy (na tym etapie analizy) zokreœlon¹ cech¹ fenotypow¹ komórki gospo-darza. Geny warunkuj¹ce replikacjê cz¹steczkiplazmidu s¹ zazwyczaj skupione na jednymfragmencie DNA plazmidowego, który w du-¿ych plazmidach stanowi niewielki procentca³ego genomu. Identyfikacja takiego fragmen-tu i wyposa¿enie go w marker selekcyjny po-zwala na konstrukcjê pochodnej plazmidu za-wieraj¹cej tylko modu³ replikacyjny. Taki mini-malny replikon jest niezwykle przydatny w mo-lekularnej analizie systemu replikacyjnego pla-zmidu macierzystego.

Kolejny wyró¿niony zespó³ genów to genyodpowiedzialne za horyzontalny transfer pla-zmidów (autotransfer drog¹ koniugacji lubtransfer „wspomagany” obecnoœci¹ innego pla-zmidu, tzw. mobilizuj¹cego). S¹ one bardzo wa-¿ne dla mo¿liwoœci rozprzestrzeniania siê pla-zmidów w œrodowisku, lecz ich brak nie powo-duje zaburzeñ w funkcjonowaniu plazmidu wkomórce.

Modu³ zaznaczony na schemacie jako „se-kwencje insercyjne” to okreœlenie umowne; se-kwencje IS nie s¹ oczywiœcie zgrupowane wjednej czêœci genomu plazmidowego, stanowi¹jednak sk³adnik bardzo wa¿ny, odpowiedzial-ny g³ównie za wszelkiego rodzaju przegrupo-wania genów w obrêbie cz¹steczki plazmiduoraz ich transfer miêdzy ró¿nymi replikonamiw komórce. Czêsto sekwencje IS ograniczaj¹inne zespo³y genów (np. opornoœciowych)tworz¹c du¿e, z³o¿one elementy mobilne,transpozony. O istotnym znaczeniu sekwencjiinsercyjnych w funkcjonowaniu i ewolucji pla-zmidów œwiadczyæ mo¿e ich stosunkowo du¿a(w porównaniu do chromosomów) zawartoœæw plazmidach (MAHILLON i wspó³aut. 1999).

Na schemacie najwiêkszy obszar zajmujemodu³ grupuj¹cy geny zwi¹zane z ró¿nymi ce-chami fenotypowmi gospodarza, zwykle meta-boliczno-fizjologicznymi, wynikaj¹cymi zobecnoœci plazmidu. W konkretnych plazmi-dach takich genów mo¿e byæ ró¿na liczba, awielkoœæ obszaru tego modu³u ma raczej obra-zowaæ ogólny ogromny zakres ró¿norodnoœcitych cech. W ka¿dym plazmidzie wystêpujepewna frakcja sekwencji DNA, których funkcjinie znamy, pozostaje to prawdziwe nawet wodniesieniu do plazmidów o kompletnie po-znanej sekwencji nukleotydowej. Ten obszaroznaczono jako rejon „cichy” (ang. silent).

CECHY FENOTYPOWE BAKTERII DETERMINOWANE PRZEZ GENY PLAZMIDOWE

Cech takich jest niezwykle du¿o, dlategote¿ dla zwiêkszenia przejrzystoœci opisu w Ta-beli 1 zgrupowano je w kilka powszechnie wy-ró¿nianych typów, aby nastêpnie, na wybra-nych przyk³adach omówiæ niektóre z nich bar-dziej szczegó³owo.

OPORNOŒÆ NA ANTYBIOTYKI ICHEMIOTERAPEUTYKI

Cecha opornoœci bakterii, zw³aszcza choro-botwórczych, na antybiotyki jako najbardziej

bezpoœrednio „dotykaj¹ca” cz³owieka, by³a oddawna i wci¹¿ jest przedmiotem bardzo inten-sywnych badañ naukowców na ca³ym œwiecie.Cecha lekoopornoœci jest te¿ fenotypem bakte-rii najpowszechniej kojarzonym z obecnoœci¹w nich plazmidów z grupy tzw. opornoœcio-wych (plazmidy R), chocia¿ nale¿y pamiêtaæ,¿e geny warunkuj¹ce opornoœæ bakterii na an-tybiotyki mog¹ byæ te¿ zlokalizowane w chro-mosomie komórki. Jednak opornoœæ kodowa-na plazmidowo istotnie jest przedmiotemszczególnego zainteresowania, co wynika z kil-

242 MIROS£AWA W£ODARCZYK

Rejon replikacyjny

Genyzwi¹zane

z transferemkoniugacyjnym

Sekwencjeinsercyjne

Rejon“cichy”

Geny zwi¹zanez warunkowanymprzez plazmid

fenotypem

Ryc. 1. Typy genów wystêpuj¹ce w cz¹steczceplazmidowej.

Rejon replikacyjny to modu³ absolutnie niezbêdny wplazmidzie, pozosta³e grupy genów mog¹ lecz niemusz¹ byæ obecne.

ku powodów. Po pierwsze, bardzo czêsto pla-zmidy nios¹ genetyczne determinanty oporno-œci na wiêcej ni¿ jeden antybiotyk równocze-

œnie, co a priori stwarza utrudnienie w terapii,po drugie, w naturalnych plazmidach oporno-œciowych genetyczne determinanty opornoœci

Ró¿norodnoœæ cech fenotypowych bakterii kodowanych przez plazmidy 243

Tabela 1. Przyk³ady fenotypów zale¿nych od obecnoœci plazmidów

Fenotyp Plazmid Naturalny gospodarz

Opornoœæ na antybiotyki i inne leki

Tetracyklina

StreptomycynaChloramfenikolPenicylinaErytromycynaSulfamidy

RP4NR1R6KR938R6KpIP1527pSa

Pseudomosnas aeruginosa

Shigella flexneri

Proteus rettgeri

Serratia marcescens

Proteus rettgeri

Escherichia coli

Shigella sp.

Opornoœæ na jony metali ciê¿kich

Rtêæ

Kadm, cynk, kobaltMiedïArsen

NR1(Tn21)pI258pMOL30pRJ1004R773

Shigella flexneri

Staphylococcus aureus

Ralstonia eutropha

Pseudomonas syringae

Escherichia coli

Produkcja antybiotyków i bakteriocyn

MetylenomycynaKolicyna E1Kloacyna DF13Megacyna BII

pSCP1ColE1CloDF13pSE203

Streptomyces coelicolor

Escherichia coli

Enterobacter cloaceae

Bacillus megaterium

Katabolizm toksycznych zwi¹zków

Toluen(inne przyk³ady — patrz Tabela 2)

TOL (pWWO) Pseudomonas putida

Patogennoœæ bakterii

Produkcja hemolizyny

Czynnik wirulencji

Antygen kolonizacyjny

Adhezyna YadA

Wirulencja

pJH1pX01pK88pYVpMYSG6000

Streptococcus faecalis

Bacillus anthracis

Escherichia coli

Yersisnia spp.

Shigella flexneri 2a

Interakcje z roœlinami

Rakowate guzy roœlinKêdzierzawoœæ korzeniTworzenie brodawek korzeniowychWi¹zanie azotu

pTipRipPN1pIJ1007

Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium rhizogenes

Rhizobium leguminosarum

Rhizobium leguminosarum

Zdolnoœæ do koniugacji

FRK2NR1pAD1pSCP1

Escherichia coli

Klebsiella aerogenes

Shigella flexneri

Enterococcus fecalis

Streptomyces coelicolor

Inne w³aœciwoœci

Tworzenie pêcherzyków gazowychPigmentacjaFermentacja laktozyWykorzystywanie sacharozy

pHH1pPL376pLM3601CTnscr94

Halobacterium sp.Erwinia herbicola

Streptococus cremoris

Salmonella senftenberg

na antybiotyki s¹ czêsto czêœci¹ sk³adow¹ ru-chomych elementów genetycznych, transpo-zonów. Ponadto plazmidy opornoœciowe s¹zwykle zdolne do koniugacyjnego transferuswego DNA. Wszystkie te cechy sprzyjaj¹ nie-bezpiecznemu rozprzestrzenianiu siê cechyopornoœci na antybiotyki w œrodowisku (tak¿eszpitalnym!).

Poniewa¿ problemowi plazmidowo kodo-wanej opornoœci na antybiotyki poœwiêconyjest oddzielny artyku³ (patrz art. J. PORTYKUS wtym zeszycie KOSMOSU), w tym miejscu po-przestanê na podkreœleniu kilku wa¿nych ogól-nych aspektów tego zagadnienia. Najogólniejmówi¹c antybiotyki mo¿na podzieliæ na kilkakategorii w zale¿noœci od mechanizmu ichdzia³ania: takie które (i) oddzia³uj¹ na syntezêœciany komórkowej bakterii (�-laktamy), (ii)naruszaj¹ce integralnoœæ b³ony cytoplazma-tycznej (polimyksyna), (iii) hamuj¹ce metabo-lizm kwasów nukleinowych (kwas nalidykso-wy, aktynomycyna D) lub (iv) hamuj¹ce synte-zê bia³ek (chloramfenikol, streptomycyna).Bakterie wykszta³ci³y szlaki opornoœci tak ró¿-norodne, ¿e potrafi¹ one zapobiec skuteczne-mu dzia³aniu ka¿dego z wymienionych mecha-nizmów. Opornoœæ na antybiotyk wynikaæmo¿e na przyk³ad z: (i) detoksyfikacji lub inak-tywacji antybiotyku, (ii) zmniejszenia poziomupobierania antybiotyku lub jego aktywne usu-wanie z komórki, (iii) nadprodukcji komórko-wego celu dzia³ania antybiotyku (tzw. tarczy),lub z jej modyfikacji, (iv) wytworzenia zastêp-czego wobec zahamowanego przez antybiotykkompletnego szlaku metabolicznego lub tylkojego zablokowanego etapu, czyli tzw. mecha-nizm „bypass”. Tylko niektóre z dróg zyskiwa-nia opornoœci na antybiotyk mog¹ wynikaæ zpojedynczej mutacji istniej¹cego w komórcegenu. W wiêkszoœci przypadków wymaganejest uzyskanie nowego genu (lub kilku genów),

co, podobnie jak w sytuacji pojawiania siê wie-lorakiej opornoœci jest najczêœciej zwi¹zane zwprowadzeniem do komórki plazmidu opor-noœciowego. Oczywiœcie nie wyjaœnia to „pier-wotnego” Ÿród³a genów determinuj¹cychopornoœci niesionych przez plazmid. Aktual-nie powszechnie akceptowana jest hipoteza, i¿

genów te pochodz¹ od mikroorganizmów pro-dukuj¹cych antybiotyki, u których stanowi¹one naturalne zabezpieczenie przed zabój-czym dzia³aniem w³asnego metabolitu.

OPORNOŒÆ NA JONY METALI CIÊ¯KICH

Obecnoœæ w œrodowisku kationów metaliciê¿kich (rtêci, niklu, o³owiu, kadmu, bizmutu,antymonu czy srebra) oraz niektórych anio-nów (arsenianów, boranów, chromianów) niejest rzadka w okolicach uprzemys³owionych.S¹ to zwi¹zki wysoce toksyczne dla wszystkichorganizmów ¿ywych, tak¿e dla wiêkszoœci bak-terii. Jednak z gleb i wód zanieczyszczonychtymi zwi¹zkami izolowane s¹ bakterie opornena ich dzia³anie, a najczêœciej opornoœæ ta wa-runkowana jest obecnoœci¹ plazmidów. W wie-lu przypadkach mechanizmy opornoœci najony metali ciê¿kich zosta³y poznane bardzodok³adnie. Szczególnie ciekawy jest system ge-netyczny warunkuj¹cy opornoœæ bakterii najony Hg2+ oraz organiczne zwi¹zki rtêci. Enzy-my uczestnicz¹ce w detoksyfikacji tychzwi¹zków tworz¹ tzw. operon mer i s¹ najczê-œciej zlokalizowane na transpozonach (najle-piej poznane to Tn501 z Pseudomonas aerugi-

nosa i Tn21 z plazmidu NR1 Shigella flexneri).Najistotniejsz¹ cech¹ mechanizmu opornoœcibakterii na jony rtêci jest wytworzenie wysocespecyficznego systemu transportu zwi¹zkówrtêci do wnêtrza komórki, gdzie s¹ one, zudzia³em reduktazy rtêcianowej, prze-kszta³cane w mniej toksyczn¹ i lotn¹ formêHg0. W przypadku organicznych zwi¹zków rtê-ci, system wyposa¿ony jest w dodatkowy en-zym, liazê, uwalniaj¹cy rtêæ w formie jonowejprzed jej redukcj¹ do formy Hg0 (MISRA 1992).Genetyczna organizacja operonu mer pokaza-na jest na Ryc. 2.

Na ca³kowicie innych zasadach opiera siêmechanizm opornoœci na Ca2+, Co2+ i Zn2+

(NIES 1992). W tym przypadku, obecne w œro-dowisku toksyczne jony wnikaj¹ do wnêtrzakomórki niespecyficznie lub przez systemytransportuj¹ce jony Mg2+. Je¿eli w komórceobecny jest jeden z plazmidów koduj¹cych


merR OP merT merP merA merD

Ryc.2. Genetyczna organizacja operonu mer (Tn501) warunkuj¹cego opornoœæ na jony rtêci.

Geny merT i merA odpowiadaj¹ za transport jonów Hg2+ do wnêtrza komórki, gen merA koduje reduktazê rtêcia-now¹, a geny merR i merD pe³ni¹ funkcje regulacyjne, OP — to rejon operatora i promotora.

tzw. system CZC, to jony które wniknê³y do ko-mórki ulegaj¹ specyficznemu transportowi nazewn¹trz. Jednym z najdok³adniej scharaktery-zowanych plazmidów odpowiedzialnych zaopornoœæ bakterii na jony kadmu, kobaltu icynku jest bardzo du¿y (238 kb) plazmidpMOL30 zidentyfikowany w Ralstonia eu-

tropha (MERGEAY i wspó³aut. 1985). Rycina 3ilustruje zasadê opornoœci tej bakterii na jonykadmu, cynku i kobaltu warunkowan¹ obecno-œci¹ plazmidu pMOL30.

Czytelników zainteresowanych problema-mi plazmidowo kodowanej opornoœci na solemetali ciê¿kich odsy³am do poœwiêconegotemu tematowi ca³ego numeru specjalistyczne-go czasopisma „Plasmid” 1/1992 oraz do arty-ku³ów przegl¹dowych (SILVER i MISRA 1988,SILVER 1996, SILVER i PHUNG 1996).

PRODUKCJA BAKTERIOCYN

Zdolnoœæ pewnych bakterii do produkcjiantybakteryjnych czynników zdolnych do zabi-jania jedynie szczepów blisko spokrewnio-nych, lecz niezdolnych do produkcji tych¿eczynników opisana zosta³a ju¿ w 1925 r. przezbelgijskiego mikrobiologa Andre Gratia jakotzw. „principle V” (ang. virulence, gdy¿ produ-cent tego czynnika by³ jednoczeœnie wirulent-ny w stosunku do œwiñ). Czynniki te okreœlaneobecnie ogólnie mianem bakteriocyn (lub koli-cyn, je¿eli producentami s¹ szczepy Escheri-

chia coli) syntetyzowane s¹ najczêœciej pod

kontrol¹ genetyczn¹ genów zlokalizowanychna plazmidach, które jednoczeœnie nios¹ gene-tyczne determinanty opornoœci (ang. immuni-ty) producenta na dzia³anie obecnej w œrodo-wisku bakteriocyny (BAREFOOT i wspó³aut.1992, JOERGER i wspó³aut. 2000). Pod wzglê-dem chemicznym bakteriocyny to substancjebia³kowe o masie 20–90 kDa, chocia¿ znane s¹te¿ tzw. mikrocyny o masie <1 kDa. Mechanizmdzia³ania bakteriocyn na komórki obejmuje za-burzenia struktury i funkcji membran, tzw. de-polaryzacjê (np. kolicyna E1), uszkodzeniaDNA (np. kolicyna E2 dzia³aj¹ca jako niespecy-ficzna endonukleza), lub hamowanie syntezybia³ek poprzez inaktywacjê rybosomowegoRNA (kolicyna E3 i kloacyna DF13). Bakterio-cyny, jako substancje antybakteryjne o bardzow¹skim (w odró¿nieniu od „prawdziwych” an-tybiotyków) spektrum dzia³ania, nie znalaz³yszerszego zastosowania praktycznego. Zasad-niczo jedynie produkowana przez Lactococcus

lactis nizyna (która jest jednak kodowanaprzez geny chromosomowe) znalaz³a prawnieusankcjonowanie zastosowanie jako konser-want ¿ywnoœci. Próby stosowania bakteriocynw medycynie weterynarii s¹ wci¹¿ w stadiumniezbyt zaawansowanym.

Systemy genetyczne determinuj¹ce pro-dukcjê bakteriocyn (np. kolicyny E1 kodowa-nej przez plazmid ColE1 czy kloacyny kodowa-nej przez plazmid CloDF13) s¹ jednak niezwy-kle ciekawe w swojej organizacji i regulacji ichoæby z tego powodu wzbudzaj¹ du¿e zainte-resowanie badaczy (LURIA i SUIT 1992). Zespó³genów stanowi¹cych „kasetê kolicynow¹” pla-zmidu ColE1 przedstawiony jest na Ryc. 4. Cie-kaw¹ cech¹ systemu jest to, ¿e wytwarzanie ko-licyny jest zabójcze dla producenta, gdy¿ uwol-nienie produktu genu cea do œrodowiskazwi¹zane jest z liz¹ komórki przy udziale pro-duktu genu kil. Jednak ca³y ten zlokalizowanyna plazmidzie system jest w stanie represji wy-nikaj¹cej z zablokowania g³ównego promotora(Pcol) przez komórkowe bia³ko LexA, i prak-tycznie w populacji nie wiêcej ni¿ 10-3 komó-rek na generacjê produkuje aktywnie kolicynêi w wyniku „samobójczego aktu” wydziela j¹ doœrodowiska. Komórki nie produkuj¹ce aktual-nie kolicyny, lecz nios¹ce plazmid ColE1, s¹chronione przed dzia³aniem egzogennej koli-cyny dziêki funkcji produktu genu imm, (ule-gaj¹cemu ekspresji tak¿e z w³asnego promoto-ra, patrz Ryc. 4), natomiast eliminacji ze œrodo-wiska ulegaj¹ pokrewne bakterie bezplazmido-we. Wszelkie sytuacje powoduj¹ce zniszczenie


plazmidpMOL30

CzcD CzcABC

Mg

Co Zn Cd

2+

2+ 2+ 2+

Co Zn Cd2+ 2+ 2+

Mg2+

Co Zn Cd2+ 2+ 2+

Ryc. 3. System opornoœci Ralstonia eutropha nakobalt, cynk i kadm warunkowanej przezpMOL30. Zasady funkcjonowania — w tekœcie.

represora (bia³ka LexA), a wiêc indukuj¹ce ko-mórkowy system SOS uruchamiaj¹ jednocze-œnie lawinow¹ produkcjê kolicyny przez ca³¹populacjê nios¹cych plazmid bakterii. Biolo-giczny sens zjawiska bakteriocynogenii rozwa-¿any jest g³ównie w aspekcie roli tego zjawiskaw œrodowisku, w którym bakterie dysponuj¹cetakim „egzotycznym” mechanizmem zyskuj¹przewagê selekcyjn¹ nad wspó³istniej¹cymibakteriami bezplazmidowymi (RILEY i GOR-DON 1999).

Zjawisko bakteriocynogenii jest doœæ po-wszechne wœród ró¿nych grup bakterii i w wiê-kszoœci przypadków jest zwi¹zane z obecno-œci¹ plazmidów. Najlepiej poznane s¹ plazmidywarunkuj¹ce syntezê kolicyn. Wyró¿niamy wœ-ród nich dwie grupy; ma³e plazmidy niekoniu-gacyjne (ColE1, CloDF13) oraz du¿e plazmidykoniugacyjne, które czêsto determinuj¹ pro-dukcjê wiêcej ni¿ jednej kolicyny, a tak¿e nios¹geny opornoœci na antybiotyki oraz geny wiru-lencji (ColIb, ColIa, ColV).

Co ciekawe, najpopularniejszy plazmid ko-licynogenny, opisany wy¿ej ColE1, sw¹ „s³awê”zawdziêcza nie tyle zjawisku kolicynogenii, ilemo¿liwoœci prostego dostosowania jegocz¹steczki do roli wektora do klonowania ge-nów. System replikacyjny typu ColE1 obecnyjest w wielu wektorach, zarówno ogólnego(np. pBR322), jak i specjalistycznego (pUC18 ,pBluScript, pTZ19U itp.) zastosowania.

BIODEGRADACJA TOKSYCZNYCH ZWI¥ZKÓWORGANICZNYCH (PLAZMIDY KATABOLICZNE)

Ogólnie znana jest nieograniczona wrêczrola bakterii w procesach biodegradacji gro-madz¹cej siê w œrodowisku materii organicz-nej w wyniku wykorzystywania tych¿ezwi¹zków jako Ÿróde³ wêgla i energii. Jednakwiele naturalnych lub syntetyzowanych w pro-wadzonych przez cz³owieka procesach prze-

mys³owych zwi¹zków to substancje toksyczne.Z bakterii ¿yj¹cych w zanieczyszczonych gle-bach, wodach i osadach dennych izolowanoplazmidy nios¹ce geny koduj¹ce szlaki metabo-liczne odpowiedzialne za degradacjê zarównoprostych zwi¹zków organicznych, jak np. alifa-tyczne (oktan), jednopierœcieniowe aroma-tyczne (fenol, toluen) wêglowodory, zwi¹zkiaromatyczne wielopierœcieniowe (naftalen, bi-fenyl) i heterocykliczne (nikotyna) jak równie¿licznych, bardzo toksycznych ich chloropo-

chodnych (WALLACE i SAYLER 1992, TOP iwspó³aut. 2000, HAY i wspó³aut. 2000). Plazmi-dy takie okreœlamy ogóln¹ nazw¹ plazmidówdegradacyjnych lub katabolicznych, aprzyk³ady degradowanych z ich udzia³emzwi¹zków przedstawione s¹ w Tabeli 2.

Szlaki kataboliczne prowadz¹ce do prze-kszta³cenia toksycznych substancji w metaboli-ty poœrednie, które mog¹ byæ nastêpnie wpro-wadzone do tzw. metabolizmu podstawowegos¹ zwykle doœæ skomplikowane i mo¿e w nichuczestniczyæ nawet kilkanaœcie enzymów ko-dowanych przez geny o plazmidowej lokaliza-cji. Ogólne wyobra¿enie o roli plazmidów de-gradacyjnych w katabolizmie toksycznychzwi¹zków organicznych daje schemat naRyc. 5. Widaæ tu jednoczeœnie, ¿e w wielu przy-padkach wa¿nym metabolitem poœrednim jestkatechol, który dalszym przemianom mo¿e ule-gaæ w dwojaki sposób: wed³ug szlaku meta-kodowanego przez geny plazmidowe lub orto-kodowanego przez geny chromosomowe. Jed-nym z najlepiej scharakteryzowanych szlakówdegradacji fenolu jest plazmidowo kodowanysystem obecny w Pseudomonas sp.CF600. Naplazmidzie pVI150 obecnym w tym szczepie zi-dentyfikowano 16 genów zorganizowanych wjeden operon dmp, poznano produkty tych ge-nów, ich funkcje i sposób regulacji (PAW-LOWSKI i SHINGLER 1994).

Nale¿a³oby wspomnieæ, ¿e pierwszym zi-dentyfikowanym w 1974 r. plazmidem degra-


cea imm kil

Pcol

Pimm

Ryc. 4. Schemat „kasety kolicynowej” plazmidu ColE1.

Gen cea — koduje bia³ko kolicyny ColE1, imm — bia³ko „immunity”, kil — bia³ko lityczne, uwalniaj¹ce kolicynê zkomórki. Pcol — indukcyjny promotor ca³ego systemu, Pimm — niezale¿ny promotor genu imm.

dacyjnym by³ plazmid TOL (117 kb) z Pseudo-

monas putida, któremu nastêpnie nadanosymbol pWWO i sta³ siê on prototypem du¿ejgrupy plazmidów „TOL” odpowiedzialnych zadegradacjê toluenu i jego pochodnych. Pierw-sza czêœæ szlaku katabolizmu toluenu (tzw. gór-ny operon), prowadz¹ca do przemiany tolu-enu do katecholu, jest przedstawiona na

Ryc. 6. Geny koduj¹ce enzymy szlaków degra-dacyjnych zgrupowane w operony s¹ czêstozlokalizowane na transpozonach, co pozwalana ich efektywny transfer miêdzy obecnymi wkomórce replikonami, a tak¿e na horyzontalne

rozprzestrzenianie siê w œrodowisku nawet je-¿eli plazmid bêd¹cy pierwotnym noœnikiemtranspozonu nie mo¿e replikowaæ siê w no-wym gospodarzu (TAN 1999). Przyk³ady trans-pozonów katabolicznych to Tn4651 (zpWWO), Tn4655 (z plazmidu NAH7), Tn5280

(z pP51 — degradacja chlorokatecholu),Tn4371 (obecny w wielu plazmidach IncP1).

Plazmidy kataboliczne s¹ niezmiernie wa-¿ne z praktycznego punktu widzenia. Znajduj¹one szerokie zastosowanie w procesach biore-mediacji. Wiele z nich pos³u¿y³o do konstruk-cji chronionych patentami systemów wyko-rzystywanych w profesjonalnych urz¹dze-niach usuwaj¹cych zanieczyszczenia ze œcie-ków, gleby wokó³ zak³adów przemys³owych iinnych ska¿onych miejsc.

CECHY ZWI¥ZANE Z PATOGENNOŒCI¥ BAKTERIIWOBEC CZ£OWIEKA I ZWIERZ¥T

Genetyczna determinacja zjawiska pato-gennoœci bakterii (czyli ich zdolnoœci dowywo³ywania chorób) to problem bardzoz³o¿ony. Wiele spoœród czynników odpowie-dzialnych za patogennoœæ bakterii, czyli tzw.czynników wirulencji, jest kodowanych przezgeny umiejscowione na plazmidach. Nale¿yjednak zdaæ sobie sprawê, ze czynników któremo¿emy uwa¿aæ za zwi¹zane z chorobotwór-


Tabela 2. Przyk³ady toksycznych zwi¹zków (naturalnych i syntetycznych) degradowanych pod kon-trol¹ genów plazmidowych

Nazwa degradowanego zwi¹zku Plazmid Szczep bakterii

Oktan, dekanNiecykliczne izoprenoidySalicylanBenzenAnilinaStyrenBifenylNikotynaDibenzotiofenChlorobenzenKwas 3-chlorobenzoesowy (3CBA)Kwas para-toluenosulfonowyPolichlorobifenyle (PCBs)

Oligomer nylonuParationKwas dichlorofenoksyoctowy (2,4-D)

OCTpSRQ50SAL1pWW174pCIT1pEGpWW100NICpDBT2pP51pBR60pTSApSS60pKF1pOAD2pCS1pJP4

Pseudomonas oleovorans PpG6Pseudomonas putida PPU2Pseudomonas putida R1Acinetobacter calcoaceticus

Pseudomonas sp. CIT1Pseudomonas putida STPseudomonas sp. CB406Pseudomonas convexa PclPseudomonas alcaligenes DBT2Pseudomonas sp. P51Alcaligenes sp. BR60Comamons testosteroni T-2Achromobacterium sp.Arthrobacter sp.Flavobacterium sp.Pseudomonas diminuta

Ralstonia eutropha

METABOLIZM PODSTAWOWY

szlaki zale¿neod genów chromosomowych

szlaki zale¿neod genów plazmidowych

kamfora

benzen

katechol

naftalentoluen

salicylan

p-krezol

Ryc. 5. Schematyczne przedstawienie roli pla-zmidów katabolicznych w szlakach degradacjizwi¹zków toksycznych.

czoœci¹ jest wiele. Jednym z omawianych ju¿czynników jest chocia¿by cecha opornoœcibakterii na antybiotyki. Oczywiœcie brak tej ce-chy nie zmienia zdolnoœci patogenu dowywo³ania choroby, ale jej wystêpowaniestwarza ogromne problemy w terapii. Wœródczynników bezpoœrednio zaanga¿owanych wproces wywo³ywania choroby, kodowanychprzez geny plazmidowe, mo¿emy wyró¿niæzdolnoœæ do adhezji do powierzchni odpo-wiednich komórek atakowanej tkanki i ewen-tualnej penetracji do wnêtrza komórki, roz-przestrzenianie siê miêdzy komórkami (czyliinwazyjnoœæ patogena), zdolnoœæ do produkcjiró¿nego typu toksyn, opornoœæ na antybakte-ryjne czynniki obecne w surowicy (ang. serumresistance) itp.

Dla zilustrowania roli plazmidów w proce-sach patogenezy bardzo spektakularne (aczkol-wiek dobrane zupe³nie arbitralnie) s¹ zjawiskazwi¹zane z „wirulencyjnymi” plazmidami po-pularnych enteropatogenów takich jak Salmo-

nella i Shigella, a tak¿e rola plazmidów w „uzja-dliwianiu siê” szczepów nieszkodliwego ko-mensala, mieszkañca naszego jelita, czylipa³eczki okrê¿nicy, E. coli (BAHRANI- MOUGEOTi DONNENBERG 2000).

Na przyk³adzie chorobotwórczych szcze-pów Salmonella i Shigella mo¿emy przeœledziæte¿ bardzo ciekawe zjawisko wspó³dzia³aniagenów chromosomowych i plazmidowych wwarunkowaniu zdolnoœci bakterii dowywo³ania kompletnego procesu chorobowe-go. Bakterie z rodzaju Salmonella s¹ jedn¹ znajczêstszych przyczyn zaka¿eñ pokarmowych(dur brzuszny, dur rzekomy) przejawiaj¹cychsiê jako zapalenia jelita cienkiego lub grubego,ale tak¿e s¹ odpowiedzialne za znacznie gro-Ÿniejsze tzw. infekcje systemowe u ludzi izwierz¹t. Wiele genów zwi¹zanych z wirulen-cj¹, zw³aszcza tych wymaganych do adhezji i in-wazji komórek nab³onka, ale tak¿e odpowie-dzialnych za opornoœæ na fagocytozê odnale-ziono w tzw. wyspach patogennoœci (SPI) wchromosomie (MARCUS i wspó³aut. 2000). Jed-nak powszechna jest tak¿e obecnoœæ w ró¿-nych serowarach Salmonella tzw. „plazmidówwirulencji” (ROTGER i CASADESUS 1999). S¹ toplazmidy heterogenne, zazwyczaj du¿e (50 —ponad 200 kb), lecz wiele z nich zawiera kon-serwanty (�8 kb) region, w którym zlokalizo-wany jest operon spv, którego produkty wyma-gane s¹ do kolonizacji g³êbiej po³o¿onych tka-nek. Potwierdza to fakt, ¿e szczepy bezplazmi-dowe wywo³uj¹ objawy zapalne jelita, lecz nies¹ zdolne do infekcji systemowej. Kilka spo-œród plazmidów wirulencji Salmonella (np.pSLT, 94 kb plazmid z S. typhimurium LT2 orazplazmidy pHCM1 i pHCM2 z S. enterica CT18)zosta³o kompletnie zsekwencjonowanych, aponiewa¿ od niedawna znana jest tak¿e kom-pletna sekwencja nukleotydowa chromoso-mów szczepów LT2 i CT18 nale¿y spodziewaæsiê znacznego postêpu w zrozumieniu moleku-larnych mechanizmów wirulencji tego patoge-na, w tym tak¿e roli genów plazmidowych wtym zjawisku.

Tak¿e wiêkszoœæ genów wirulencji odpo-wiedzialnych za chorobotwórczoœæ Shigella

spp. g³ównego czynnika etiologicznego bakte-ryjnych dezynterii, zlokalizowanych jest na du-¿ych, �220 kb plazmidach obecnych we


szlak(plazmidowy)

meta- szlak(chromosomowy)

orto-

aldehyd octowy

pirogronian+ +

acetylokoenzym A

bursztynian

TOLUEN

ALKOHOLBENZYLOWY

KATECHOL

CH3

CH OH2

CHO

COOH

OHOHHOOC

OHOH

ALDEHYDBENZYLOWY

BENZOESAN

1-2 DIHYDROKSY-CYKLOHEKSADIENOKARBOKSYLAN

1

2

3

4

5

Ryc. 6. Szlak degradacyjny toluenu determinowa-ny przez geny zlokalizowany na plazmidziepWWO.

Enzymy przeprowadzaj¹ce kolejne reakcje: (1) mono-ksygenaza ksylenowa, (2) dehydrogenaza alkoholubenzylowego, (3) dehydrogenaza aldehydu benzylo-wego, (4) oksygenaza toluenianowa, (5) dehydroge-naza dwuhydroksycykleheksadienokarboksylenowa.

wszystkich chorobotwórczych szczepach Shi-

gella oraz enteroinwazyjnych szczepachE. coli. W 2001 r. poznano kompletn¹ sekwen-cjê nukleotydow¹ jednego z plazmidów wiru-lencji Shigella (pWR501 z S. flexneri, VENKA-TESAN i wspó³aut. 2001); okaza³o siê, ¿e genyzwi¹zane z wirulencj¹ stanowi¹ a¿ 35% jego ge-nomu. Geny te zgrupowane s¹ w funkcjonalnezespo³y. Na przyk³ad na �30 kb fragmencieDNA plazmidowego zlokalizowane s¹ geny ipa

(ang. invasion plasmid antigens) koduj¹cebia³ka niezbêdne do adhezji (IpaD) i inwazji(Ipa A,B,C), oraz geny mxi (10 loci) i spa — ge-netyczne determinanty specyficznego systemusekrecyjnego tych bia³ek. Na innym fragmen-cie plazmidu zgrupowane s¹ geny warun-kuj¹ce miêdzykomórkowe rozsiewanie siêbakterii (icsA i icsB). Natomiast wiele genówregulacyjnych ca³ego systemu mieœci siê wchromosomie. Równie¿ chromosomow¹ loka-lizacjê maj¹ geny koduj¹ce letaln¹ cytotoksynêprodukowan¹ tylko przez S. dysenteriae (tzw.Shiga toxin) odpowiedzialn¹ za wywo³ywanienajciê¿szego przejawu shigellozy, tzw. zespo³uHUS (ang. hemolytic uremic syndrome), pro-wadz¹cego do trwa³ego uszkodzenia nerekoraz powa¿nych symptomów neurologicz-nych. Nieplazmidowa lokalizacja genów ko-duj¹cych tê toksynê jest dla cz³owieka „korzyst-na”, obni¿a bowiem prawdopodobieñstwoprzenoszenia siê tego niebezpiecznego fenoty-pu do szczepów innych enteropatogenów.

Wiele zjadliwych, tzw. enteropatogennych(EPEC) szczepów E. coli, wywo³uje objawy po-dobne do zaka¿eñ Shigella spp.; w nich stwier-dzono obecnoœæ plazmidów (podobnych dowirulencyjnych plazmidów Shigella) odpowie-dzialnych za niektóre objawy chorobowe, innewynikaj¹ z „pojawienia siê” w chromosomiewysp patogennoœci.

Kilka lat temu du¿e zainteresowanie wzbu-dza³ izolowany w 1982 r. enterohemokrwo-toczny (EHEC) szczep E. coli oznaczony sym-bolem O157:H7. Produkuje on dwie groŸnewerotoksyny (STX-1 i STX-2), podobne dowspomnianej wy¿ej toksyny „Shiga toxin”, a za-chorowaæ mo¿na po spo¿yciu pokarmu zaka-¿onego bardzo ma³¹ dawk¹ bakterii (10–100komórek), trudn¹ do wykrycia w czasie rutyno-wej kontroli procesu technologicznego (np.produkcji hamburgerów). Dla analizowanegotematu wa¿na jest informacja, ¿e szczep tenniesie 93 kb plazmid (pO157) koduj¹cy szeregcech zwi¹zanych z patogennoœci¹ swego go-spodarza (BURLAND i wspó³aut. 1998).

Przedstawione przyk³ady nie wyczerpuj¹tematu — moim celem by³o jedynie zasygnalizo-wanie roli plazmidów w tak wa¿nym i bezpo-œrednio dotykaj¹cym cz³owieka temacie jakimjest genetyczna determinacja procesów pato-genezy. Przyk³ady innych plazmidowo-kodo-wanych cech odgrywaj¹cych rolê w zdolnoœcibakterii do wywo³ywania procesu chorobowe-go zamieszczono w Tabeli 1.

INTERAKCJE BAKTERII Z KOMÓRKAMIROŒLINNYMI

Niew¹tpliwie najlepszym modelowymuk³adem do zaprezentowania tematu zawarte-go w tytule rozdzia³u jest analiza roli du¿ych(>200 kb) plazmidów Ti oraz Ri w genetycz-nym uwarunkowaniu procesu powstawaniarakowatych naroœli (ang. crown gall tumors)lub w³osowatoœci/kêdzierzowatoœci korzeni(ang. hairy roots) w wyniku infekcji roœliny(najczêœciej dwuliœciennej) przez szczepyAgrobacterium tumefaciens lub A. rhizogenes.Jest to system bardzo z³o¿ony, wymagaj¹cywspó³dzia³ania wielu genów chromosomo-wych i plazmidowych bakterii, lecz jego efektbiologiczny jest unikatowy — czêœæ genomuplazmidowego, fragment okreœlany jakoT-DNA, zostaje wprowadzony w procesie spe-cyficznego rodzaju koniugacji, warunkowane-go przez zespó³ plazmidowych genów vir dokomórki roœlinnej, aby nastêpnie wnikn¹æ dojej j¹dra komórkowego i trwale wbudowaæ siêdo chromosomowego DNA. Konsekwencj¹ tejintegracji jest indukcja niekontrolowanych po-dzia³ów komórek prowadz¹cych do utworze-nia rakowatego guza u nasady ³odygi roœliny(Ti plazmid), ale tak¿e do syntezy specyficz-nych substancji (typu opin lub nopalin) stano-wi¹cych unikatowe Ÿród³o substancji od¿yw-czych dla bakterii nios¹cych plazmid (Ti lubRi) wyposa¿ony w geny umo¿liwiaj¹ce katabo-lizm tych w³aœnie zwi¹zków.

Naszkicowany tutaj krótki zarys procesujest rozbudowany w odrêbnym artykule (patrzart. A. ZIEMIENOWICZ w tym zeszycie KOS-MOSU), tam¿e mo¿na znaleŸæ odsy³acze do in-nych pozycji literatury z tego tematu. Wspo-mniany artyku³ przedstawia tak¿e drogi mody-fikacji tego naturalnego procesu biologiczne-go dla celów konstrukcji systemu przydatnegow tworzeniu transgenicznych roœlin.

Innym przyk³adem udzia³u genów plazmi-dowych w procesach oddzia³ywania pomiêdzybakteriami a roœlinami jest zale¿noœæ pomiêdzy


zdolnoœci¹ roœlin motylkowych do wi¹zaniaazotu cz¹steczkowego z powietrza a ich sym-biotycznym zwi¹zkiem z bakteriami z rodzinyRhizobiaceae, które dla uproszczenia okreœlamdalej ogólnym terminem „rizobia” (FREIBERG iwspó³aut. 1997) Plazmidy w rizobiach wystê-puj¹ bardzo powszechnie, a niektóre z nich s¹bardzo du¿e, osi¹gaj¹c wielkoœæ nawet 1700 kb(=1,7 Mb), czyli wiêksz¹ ni¿ niektóre bakteryj-ne chromosomy. Nawiasem mówi¹c, to w sto-sunku do tych plazmidów zastosowano pier-wotnie termin megaplazmidy, który nastêpnierozszerzono na inne plazmidy, te¿ bardzo du¿elecz nie przekraczaj¹ce wielkoœci 1 Mb (np. wy-mieniany wy¿ej megaplazmid pMOL30 — 0,24Mb). Rizobia wykszta³ci³y bardzo skompliko-wane symbiotyczne zwi¹zki z korzeniami ro-œlin motylkowych, przejawiaj¹ce siê tworze-niem brodawek korzeniowych, w których na-stêpuje proces enzymatycznej redukcji azotucz¹steczkowego. Lista genów „symbiotycz-nych” zidentyfikowanych w rizobiach liczy po-nad 50 pozycji. Wiele spoœród genów determi-nuj¹cych proces symbiozy mieœci siê na tzw.plazmidach symbiotycznych (pSym), inne wchromosomie. W ró¿nych gatunkach dystrybu-cja tych genów pomiêdzy ró¿ne replikony wkomórce nie jest jednakowa. G³ówne grupy ge-nów to: zespó³ genów odpowiedzialnych zatworzenie brodawek (nod), ich rozwój (ndv),specyficznoœæ wobec gospodarza (hsn), tzw.efektywnoœæ nodulacji (nfe), za syntezê kom-ponentów strukturalnych powierzchni komór-ki takich jak np. egzoopolisacharydy (exo) orazgenów, których produkty zwi¹zane s¹ bezpo-œrednio z procesem wi¹zania azotu: nif (genstrukturalny nitrogenazy), hem (gen struktu-ralny leghemoglobiny chroni¹cej nitrogenazêprzed destrukcyjnym dzia³aniem tlenu) i wieleinnych. Rizobia zawieraj¹ tak¿e liczne plazmi-dy tzw. niesymbiotyczne (MERCADO-BLANCO iTORO 1996), które, chocia¿ nie nios¹ genówbezpoœrednio zaanga¿owanych w proces sym-biotycznego wi¹zania azotu odgrywaj¹ wa¿n¹rolê w adaptacji komórek gospodarza do lokal-nych warunków œrodowiskowych, chocia¿bydziêki kodowaniu enzymów pozwalaj¹cych nakatabolizm ró¿nych nietypowych zwi¹zkówobecnych w ryzosferze (pRtrW14-2c), jak te¿np. tolerancjê niskiego pH (pRtrANU1173b),podwy¿szonego stê¿enia chlorku sodu (pR-trW14-2b) itp., co pozwala przetrwaæ poten-cjalnym symbiontom w okresie tzw. „free-living state” (TOP i wspó³aut. 2000).

INNE WYBRANE W£AŒCIWOŒCI FENOTYPOWE

W tej czêœci, stosuj¹c absolutnie subiektyw-ne kryteria, chcê wskazaæ niektóre kodowaneprzez plazmidy fenotypy, które nie zosta³y za-kwalifikowane do wy¿ej wyró¿nionych grup, awed³ug mojej oceny rozszerzaj¹ i urozmaicaj¹wachlarz kodowanych plazmidowo cech.

I tak na przyk³ad, poza wy¿ej wymienionymitypami opornoœci (opornoœæ na antybiotyki, nasubstancje toksyczne), obecnoœæ plazmidu R46w S. typhimurium lub plazmidu pMK101 w E.

coli powoduje efekt ochronny (a wiêc zwiêkszaopornoœæ) wobec letalnego skutku dzia³aniapromieniowania UV, przy jednoczesnym zwiêk-szonym poziomie jego (UV) mutagennoœci. Wy-daje siê, ¿e obserwowany fenotyp wynika z akty-wacji systemu naprawczego typu „error prone”— czyli powoduj¹cego b³êdy podczas naprawy.Podobny efekt w stosunku do P. aeruginosa

wywo³uj¹ plazmidy R takie jak: pMG1, R2, R931.Tak¿e wiele spoœród genów odpowiedzialnychza niezwyk³¹ w œwiecie ¿ywym opornoœæ napromieniowanie jonizuj¹ce bakterii Deinococ-

cus radiodurans mieœci siê na du¿ym plazmi-dzie pMP1 (177 kb).

Niektóre „proste” w³aœciwoœci metabolicz-ne, u pewnych gatunków bakterii s¹ kodowaneprzez geny plazmidowe. Jako przyk³ady mog¹pos³u¿yæ: fermentacja laktozy przez Streptococ-

cus cremoris (pML3601), dekarboksylacja lizy-ny przez Proteus morgani (pGC1070), wyko-rzystywanie sacharozy przez S. senftenberg

(CTnscr94), produkcja proteazy przez Strepto-

coccus lactis (pLM3001), a tak¿e zdolnoœæ Ral-

stonia eutropha do utleniania wodoru(pHG1).

Plazmidy koduj¹ takie cechy jak: zdolnoœædo produkcji antybiotyków (plazmid pSCP1 uStreptomyces coelicolor), insektocydobójcze-go bia³ka (pHD2 u Bacillus thuringiensis), pig-mentacjê (pPL376 u Erwinia herbicola) orazpêcherzyków gazowych przez halofilnego ar-cheona (pHH1 u Halobacterium sp.). Dalszewyliczanie cech kodowanych przez geny zloka-lizowane w genomach plazmidowych wyd³u-¿a³oby te listê czyni¹c j¹ nu¿¹c¹ dla Czytelnika— a przecie¿ nowe jej pozycje pojawiaj¹ siê nie-ustannie. Na zakoñczenie tego przegl¹duchcia³abym wspomnieæ o nowej, opisanej w2001 r. w³aœciwoœci bakterii E. coli nios¹cychplazmid F. Okaza³o siê, ¿e ten „najstarszy” i nie-mal doskonale scharakteryzowany plazmid(patrz nastêpny rozdzia³) poza zdolnoœci¹ do


koniugacji warunkuje zdolnoœæ komórek dotworzenia b³on biologicznych (GHIGO 2001),

w czym kluczow¹, rolê, niew¹tpliwie odgry-waj¹ pilusy.

ZDOLNOŒÆ BAKTERII DO KONIUGACYJNRGO TRANSFERU DNA

Przenoszenie siê plazmidów z komórki dokomórki, zarówno w œrodowisku naturalnym,jak i w laboratorium, czyli tzw. transfer hory-zontalny, mo¿e nastêpowaæ w wyniku transfor-macji, transdukcji i koniugacji. Jednak jedyniew przypadku koniugacji kluczowe genetycznedeterminanty takiego procesu zlokalizowanes¹ w obrêbie DNA plazmidowego, a plazmidynios¹ce takie determinanty nazywamy plazmi-dami koniugacyjnymi. Koniugacyjny transfermateria³u genetycznego pomiêdzy bakteriamito zagadnienie bardzo obszerne; doczeka³o siêono bardzo wielu opracowañ przegl¹dowych,do których odsy³am zainteresowanych Czytel-ników (np. CLEWELL 1993, FIRTH i wspó³aut.1996, ZATYKA i THOMAS 1998, W£ODARCZYK1998, FROST 2000, ZECHNER i wspó³aut. 2000),a w tym miejscu zwracam jedynie uwagê naniektóre aspekty tego zjawiska.

Prototypem plazmidu koniugacyjnego bak-terii Gram-ujemnych jest plazmid F Escheri-

chia coli. Struktura genetyczna regionucz¹steczki plazmidu F odpowiedzialnego za ko-niugacyjny transfer jego DNA (tzw. region tra

— ang. transfer) zosta³a bardzo dok³adnie po-znana. Region tra plazmidu F obejmuje oko³o33 kb (co stanowi niemal 30% wielkoœci jego

cz¹steczki) i niesie ponad 35 genów. Wœródnich wyró¿niamy du¿¹ grupê genów warun-kuj¹cych syntezê pilusów (tworzenie mate-ria³u budulcowego — piliny i jej montowanie wostateczn¹ formê strukturaln¹) odgrywaj¹cychrolê w tworzeniu par koniugacyjnych, geny ko-duj¹ce bia³ka stabilizuj¹ce pary koniugacyjneoraz geny odpowiedzialne za proces koniuga-cyjnego metabolizmu DNA. W tej ostatniej gru-pie genów bardzo wa¿n¹ funkcjê pe³ni gen traI

koduj¹cy bia³ko o aktywnoœci helikazy (enzy-mu rozwijaj¹cego helisê DNA), lecz tak¿e ak-tywnoœci „nikazy”, wprowadzaj¹cej specyficz-ne naciêcie nici DNA w miejscu oriT (ang. ori-gin of transfer), od którego zaczyna siê procesrozwijania DNA i przekazywania nici o wol-nym koñcu 5’ do komórki biorcy. W obszarzetym znajduj¹ siê tak¿e geny regulacyjne ca³egosystemu tra. Organizacja genetyczna regionutra plazmidu F przedstawiona jest w sposóbuproszczony na Ryc. 7. Plazmidów posiada-j¹cych system tra, homologiczny do opisanegow plazmidzie F jest wœród plazmidów bakteriiGram-ujemnuch bardzo wiele, okreœlamy jezbiorcz¹ nazw¹ plazmidów „F-like”, czyli po-dobnych do F (np. NR1, ColV, R6, pSC50, R386oraz kilkadziesi¹t innych). Na ogólnie podob-


IS2

IS3

Tn1000IS3

RepFIC

RepFIB

RepFIA

oriT

Tra

F

100/0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

JM Y

ALEKB C i W Uc FV

Pdg R N e afinP Qbjf

H G

ST D h I

X

finO

oriT70 80 90 100

F (kb)

a)

b)

Ryc. 7. Uproszczona mapagenetyczna ca³ego plazmiduF (a) oraz jego regionu tra

(b).

Na mapie zaznaczono lokaliza-cjê systemów replikacyjnychplazmidu F (RepF), regionu tra

punktu pocz¹tkowego transfe-ru (oriT) oraz elementów trans-lokacyjnych IS i TN (a), oraz wczêœci (b): 16 genów warun-kuj¹cych syntezê pilusówp³ciowych (wysokie szares³upki), geny koniugacyjnegometabolizmu DNA (M-Y-D-I),geny odpowiedzialne za stabili-zacjê par i wykluczanie po-wierzchniowe (N-S-T-G), orazgeny regulacyjne (J, finO, finP).Pominiêto geny, których funk-cja nie jest w pe³ni jasna.

nej zasadzie (kontakt komórek warunkowanyobecnoœci¹ specyficznych struktur powierzch-niowych, pilusów p³ciowych, syntetyzowa-nych pod kontrol¹ genów plazmidowych)dzia³aj¹ systemy koniugacyjne determinowaneprzez plazmidy z grupy IncP. W odró¿nieniuod bardzo wyspecjalizowanego systemu koniu-gacyjnego warunkowanego przez plazmid F,plazmidy koniugacyjne z grupy IncP umo¿li-wiaj¹ transfer koniugacyjny w obrêbie szero-kiego krêgu niespokrewnionych filogenetycz-nie bakterii (system typu „broad host range”).Czasem plazmid nie niesie pe³nego kompletugenów potrzebnych do przeprowadzenia pro-cesu koniugacji, lecz przy „pomocy” innegoplazmidu, tzw. mobilizuj¹cego, jego DNA mo¿ebyæ przekazany do komórki biorcy. O takichplazmidach mówimy, ¿e s¹ one mobilizowalne(Mob+); przyk³adem plazmidu mobilizowalne-go jest znany nam ju¿ ColE1.

Na zupe³nie innej zasadzie funkcjonuje sys-tem koniugacyjny Gram-dodatniej bakterii En-

terococcus faecalis. W tym przypadku plazmidkoniugacyjny (np. pAD1) jest elementemsk³adowym mechanizmu „odpowiadaj¹cego”na wytwarzane przez szczep biorcy, pod kon-trol¹ genów chromosomowych, feromonyp³ciowe. Warunkuje on syntezê przez komórkêdawcy substancji agregacyjnej (adhezyny), nie-zbêdnej do utworzenia par lub agregatów ko-niugacyjnych.

Jeszcze inny mechanizm odpowiada za ko-niugacyjny transfer u promieniowców (Strep-

tomyces sp.). Plazmidy koniugacyjne promie-niowców mog¹ byæ ma³e (9 kb plazmidpIJ101) lub bardzo du¿e (liniowy plazmidSCP1 — 350 kb). Wiele spoœród tych plazmi-dów wykazuje w³aœciwoœæ CMA (ang. chromo-some mobilizing activity). Genetyczne uwa-runkowanie systemu koniugacyjnego plazmi-dów Streptomyces nie jest tak dok³adnie pozna-ne jak systemów wspomnianych wy¿ej.

Zjawisko zale¿nej od plazmidów koniuga-cyjnej wymiany materia³u genetycznego, którejest mo¿liwe nie tylko miêdzy blisko spokrew-nionymi szczepami (plazmid F), ale tak¿e ga-tunkami bakterii odleg³ymi filogenetycznie(systemy obecne na plazmidach z grupy IncP),a nawet miêdzy ró¿nymi domenami œwiata ¿y-wego (np. bakterie/roœliny), zw³aszcza, ¿emo¿e zachodziæ nie tylko w laboratorium, ale iw œrodowiskach naturalnych, ma zupe³nie nie-wymierny udzia³ w kr¹¿eniu i mieszaniu siêpuli materia³u genetycznego ca³ego œwiata ¿y-wego. W tym momencie nie nale¿y zapominaæ,¿e plazmidy tzw. koniugacyjne zwykle nios¹ ta-k¿e geny determinuj¹ce opisane powy¿ej prze-ró¿ne inne w³aœciwoœci bakterii, które w akciekoniugacji tak¿e przekazywane s¹ nowym go-spodarzom.

PODSUMOWANIE

Problem pochodzenia plazmidów, dróg imechanizmów ich ewolucji to zagadnieniesamo w sobie bardzo ciekawe i z³o¿one i wy-kracza poza przyjête ramy tego rozdzia³u. Pyta-nie, które nasuwa siê jednak niew¹tpliwie pospojrzeniu na wieloœæ i ró¿norodnoœæ funkcjijakie plazmidy mog¹ pe³niæ w komórkach swo-ich gospodarzy to „dlaczego wobec tylu korzy-œci p³yn¹cych z posiadania plazmidów nie s¹one po prostu czêœci¹ chromosomu gospoda-rza, który wtedy w ka¿dej sytuacji móg³by ko-rzystaæ z ich obecnoœci ?” Najbardziej oczywi-ste wyjaœnienie tej sytuacji to koniecznoœæutrzymania wielkoœci chromosomu w„rozs¹dnych granicach” — mniejszy chromo-som replikuje siê szybciej ni¿ du¿y, co w przy-padku bakterii mo¿e stanowiæ wa¿ny czynnikdaj¹cy przewagê selekcyjn¹ poprzez mo¿li-woœæ skrócenia czasu generacji, szybszegonamna¿ania siê i zdominowania jakiejœ niszy

ekologicznej. Plazmidy replikuj¹ce siê jako au-tonomiczne jednostki, niezale¿ne od chromo-somu nie wp³ywaj¹ w znacz¹cy sposób na tem-po wzrostu populacji bakteryjnej. Oczywiœciekoniecznoœæ replikowania dodatkowego DNAw komórce (nawet tego teoretycznie autono-micznego) jest dla niej pewnym obci¹¿eniemmetabolicznym, jednak to obci¹¿enie w mniej-szym stopniu odbija siê na czasie generacji ko-mórki ni¿ gdyby replikacji ulega³a jedna du¿astruktura. Ponadto, poniewa¿ cechy fenotypo-we zale¿ne od konkretnych plazmidów nie s¹komórce potrzebne w ka¿dej sytuacji, w popu-lacji nie poddawanej odpowiedniej presji se-lekcyjnej (czyli gdy nie istniej¹ warunki wyma-gaj¹ce korzystania z tych potencjalnych mo¿li-woœci) plazmidy mo¿e zachowaæ tylko niewiel-ka frakcja bakterii, która w warunkach „za-gro¿enia” zdominuje bakterie bezplazmidowemaj¹c nad nimi przewagê selekcyjn¹.


Innym elementem, który nale¿y potrakto-waæ jako uzasadniaj¹cy funkcjonowanie pla-zmidów w formie jednostek genetycznych od-rêbnych od chromosomów, to w³aœnie fakt, ¿ezawarta w nich olbrzymia pula informacji ge-netycznej mo¿e byæ, poprzez u³atwion¹ (w po-równaniu z pul¹ informacji zawartej w chro-mosomie) wymianê horyzontaln¹ z innymi or-ganizmami. traktowana jako uniwersalny, ogól-nie dostêpny „magazyn genów”.

Na zakoñczenie pozwolê sobie sfor-mu³owaæ myœl, któr¹ kiedyœ u¿y³am jako tytu³swego wyk³adu na Festiwalu Nauki: „BAKTERIEPOTRAFI¥ PRAWIE WSZYSTKO — ALE TYLKODZIÊKI PLAZMIDOM”

Serdecznie dziêkujê Dr Dariuszowi Bartosi-kowi za przygotowanie ilustracji do obu arty-ku³ów mojego autorstwa.

DIVERSITY OF PLASMID ENCODED BACTERIAL PHENOTYPIC TRAITS

S u m m a r y

Preceded by general information on the type ofgenes existing as obligatory or facultative “modules”in plasmid genomes, the range of bacterial phenotypicfunctions depending on plasmid located genes is re-viewed. The plasmid encoded functions are dividedinto several commonly distinguished functionalgroups. Representatives of the individual groups arecharacterized in more detail except for those dealtwith in separate articles of this issue. Special attentionis given to the plasmid-encoded mechanisms of bacte-rial resistance to heavy metal ions (mercury, cadmium,zinc and cobalt) as well as to plasmid-dependent path-

ways of the degradation of natural and man-madetoxic substances. The phenomenon of plasmid de-pendent bacteriocinogeny is presented. Also severalexamples of the role of plasmids in the relationship ofbacteria with eukaryotic organisms are given. The lastsubject covered concerns the plasmid-encoded func-tions involved in the pathogenicity of bacteria to hu-mans as well as the role of rhizobial plasmids in symbi-otic relations with nitrogen fixing plants.

A section presenting a general description of therole of plasmids in conjugational horizontal genetransfer is also included.

LITERATURA

BAHRANI-MOUGEOT F. K., DONNENBERG M.S., 2000. Ente-

ropathogenic bacteria. [W:] Encyclopedia of

Microbiology. LEDERBERG J. (red). Academic Press.Wyd. 2, 187–200.

BAREFOOT S. F., HARMON K. M., GRINSTED D. A. NETTLES C.G., 1992. Bacteriocins, Molecular biology. [W:] En-

cyclopedia of Microbiology. LEDERBERG J. (red.).Academic Press, San Diego, New York, Boston,417–430.

BURLAND V., SHAO Y., PERNA N.T. PLUNKETT G., SOFIA H. J.,BLATTNER F. R., 1998. The complete DNA sequence

and analysis of the large virulence plasmid of

Escherichia coli O157:H7. Nucleic Acid Res. 28,4196–4204.

CLEWELL D. B., 1993. Bacterial Conjugation. Plenum,New York.

FIRTH N., IPPEN-IHLER K., SKURRAY R. A., 1996. Structure

and function of the F factor and mechanism of

conjugation. [W:] Escherichia coli and Salmonel-

la. Cellular and Molecular Biology. NEIDHARDT F.C.(red.). ASM Press, Washington, D.C., 3277–3401.

FREIBERG C., FELLAY R., BAIROCH A., BROUGHTON W. J.,ROSENTHAL A., PERRET X., 1997. Molecular basis of

symbiosis between Rhizobium and legumes. Na-ture 387, 394–401.

FROST L. S, 2000. Conjugation, bacterial. [W:] Encyclo-

pedia of Microbiology. LEDRBERG J. (red). Acade-mic Press, Wyd. 2, 847–862.

GHIGO J. M., 2001. Natural conjugative plasmids indu-

ce bacterial biofilm development. Nature 412,442–445.

HAY A.G., RIPP S., SAYLER G. S., 2000. Plasmids, catabo-

lic. [W:] Encyclopedia of Microbiology. LEDERBERG

J. (red.). Academic Press, Wyd. 3, 730–744.JOERGER R. D., HOOVER D. G., BAREFOOT S. F., HARMON K.

M., GRINSTEAD D. A., NETTLES CUTTER C. G., 2000.Bacteriocins. [W:] Encyclopedia of Microbiology.

LEDREBERG J. (red.). Academic Press, Wyd. 1,383–397.

LURIA S. E., SUIT J. L., 1987. Colicins and Col plasmids.[W:] Escherichia coli and Salmonella. Cellular

and Molecular Biology. NEIETHARDT F. C. (red).ASM Press, Washington, D.C., 1615–1624.

MAHILLON J., LEONARD C., CHANDLER M., 1999. IS ele-

ments as constituents of bacterial genomes. Res.Microbiol. 150, 678–687.

MARCUS S. L., BRUMELL J. H., PFEIFER C. G., FINLAY B. B.,2000. Salmonella pathogenicity islands: big viru-

lence in small packages. Microbes Infect. 2,145–156.

MERCADO-BLANCO J., TORO N., 1996. Plasmids in Rhizo-

bia: the role of nonsymbiotic plasmids. Mol.Plant-Microbe Inter. 9, 535–545.

MERGEAY M., NIES D., SCHLEGEL H. G., GERITS J., CHARLES

P., VAN GIJSEGEM F., 1985. Alcaligenes eutrophus

CH34 is a facultative chemolithotroph with pla-

smid-bound resistancee to heavy metals. J. Bacte-riol. 162, 328–334.


MISRA T. K., 1992. Bacterial resistance to inorganic

mercury salts and organomercurials. Plasmid 27,4–16.

NIES D.H., 1992. Resistance to cadmium, cobalt, zinc,

and nickel in microbes. Plasmid 27, 17–28.PAWLOWSKI J., SHINGLER V., 1994. Genetics and bioche-

mistry of phenol degradation by Pseudomonas sp.

CF600. Biodegradation 5, 219–236.RILEY M. A., GORDON D. M., 1999. The ecological role of

bacteriocins in bacterial competition. TrendsMicrobol. 7, 129 –133.

ROTGER R., CASADESUS J., 1999. The virulence plasmids

of Salmonella. Int. Microbiol. 3, 177–184.SILVER S., 1996. Bacterial resistance to toxic metal ion-

s-a review. Gene 179, 1–9.SILVER S., MISRA T. K., 1988. Plasmid-mediated heavy

metal resistances. Annu. Rev. Microbiol. 42,717–743.

SILVER S., PHUNG L. T., 1996. Bacterial heavy metal resi-

stance: new surprises. Ann. Rev. Microbiol. 50,753–789.

TAN H. M., 1999. Bacterial catabolic transposons.Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 1–12.

THOMAS C. M., 2000. Paradigms of plasmid organisa-

tion. Mol. Microbiol. 37, 485–491.TOP E. M., MÖENNE-LOCCOZ Y., PEMBROKE T., THOMAS C.

M., 2000. Phenotypic traits conferred by plasmids.

[W:] The Horizontal Gene Pool: Bacterial Pla-

smids and Gene Spread. THOMAS C. M. (red). Har-wood Academic Reading, UK, 249–280.

VENKATESAN M. M., GOLGBERG M. B., ROSE D. J., GROTBECK

E. J., BURLAND V., BLATTNER F. F., 2001. Complete

DNA sequence and analysis of the large virulence

plasmid of Shigella flexneri. Infect. Immun. 69,3271–3285.

WALLACE W. H., SAYLER G. S., 1992. Catabolic plasmids

in the environment. [W:] Encyclopedia of Micro-

biology. LEDERBERG J. (red.). Academic Press Wyd.1, 417–430.

W£ODARCZYK M., 1998. Wymiana materia³u genetycz-

nego i rekombinacja u bakterii. Kosmos 47,137–146.

ZATYKA M., THOMAS C. M., 1998. Control of genes for

conjugative transfer of plasmid and other mobile

elements. FEMS Microbiol. Rev. 21, 291–319.ZECHNER E. L., DE LA CRUZ F., EISENBRANDT R., GRAHN

A. M., KORAIMANN G., LANKA E., MUTH G., PANSEGRAU

W., THOMAS C.M., WILKINS B. M., ZATYKA M., 2000.

Conjugative-DNA transfer processes. [W:] The Ho-

rizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene

Spread. THOMAS C. M. (red.). Harwood AcademicReading, UK, 87–174.


Documents

D:\kosmos\Kosmos 3-2002\3-2002.VP