173
SUMAR INTRODUCERE CAPITOLUL I. ASPECTE PRIVIND INTERACŢIUNEA GAZDĂ-PARAZIT: Helianthus annuus L.- Orobanche cumana Wallr. 1.1. Floarea-soarelui – cultură oleaginoasă şi plantă gazdă 1.2. Lupoaia– parazit al florii-soarelui 1.2.1. Taxonomia, răspândirea şi impactul economic al speciilor de Orobanche 1.2.2. Biologia parazitului Orobanche cumana 1.2.3. Ciclul de viaţă şi etapele parazitismului la speciile de Orobanche 1.2.4. Efectul parazitismului Orobanche asupra plantei- gazdă 1.2.5. Metode de control a lupoaiei 1.3. Tipurile de rezistenţă şi mecanismele reacţiei de răspuns a plantelor faţă de agentul patogen 1.3.1. Rezistenţa nespecifică şi indusă 1.3.2. Rezistenţa specifică gazdei. 1.3.3. Mecanisme fiziologo-biochimice de rezistenţă a florii-soarelui la lupoaie 1.4. Aspecte genetice ale rezistenţei plantelor faţă de agentul patogen 1.4.1. Rezistenţa plantelor mediată de genele R- şi reacţia de hipersensibilitate 1.4.2. Genetica rezistenţei florii-soarelui faţă de lupoaie CAPITOLUL II. OBIECTUL ŞI METODELE DE CERCETARE

Dinamica Dezvoltarii Fitoparazitului

Embed Size (px)

DESCRIPTION

floarea soarelui

Citation preview

Dinamica Dezvoltarii Fitoparazitului

SUMAR

INTRODUCERECAPITOLUL I. ASPECTE PRIVIND INTERACIUNEA GAZD-PARAZIT: Helianthus annuus L.- Orobanche cumana Wallr.

1.1. Floarea-soarelui cultur oleaginoas i plant gazd

1.2. Lupoaia parazit al florii-soarelui 1.2.1. Taxonomia, rspndirea i impactul economic al speciilor de Orobanche

1.2.2. Biologia parazitului Orobanche cumana

1.2.3. Ciclul de via i etapele parazitismului la speciile de Orobanche

1.2.4. Efectul parazitismului Orobanche asupra plantei-gazd 1.2.5. Metode de control a lupoaiei

1.3. Tipurile de rezisten i mecanismele reaciei de rspuns a plantelor fa de agentul patogen

1.3.1. Rezistena nespecific i indus 1.3.2. Rezistena specific gazdei.

1.3.3. Mecanisme fiziologo-biochimice de rezisten a florii-soarelui la lupoaie

1.4. Aspecte genetice ale rezistenei plantelor fa de agentul patogen

1.4.1. Rezistena plantelor mediat de genele R- i reacia de hipersensibilitate 1.4.2. Genetica rezistenei florii-soarelui fa de lupoaieCAPITOLUL II. OBIECTUL I METODELE DE CERCETARE

2.1. Obiectul de studiu i condiiile de cultivare

2.2. Metodele de cercetare

2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici2.2.2. Determinarea prezenei peroxidului de hidrogen

2.2.3. Metoda gazometric de determinare a activitii catalazei

2.2.4. Izolarea proteinelor sumare

2.2.5. Determinarea calitativ a proteinelor prin SDS-PAGE

2.2.6. Metoda spectrofotometric de determinare a acizilor nucleici

2.2.7. Izolarea ADN-lui2.2.8. Tehnica PCR de identificare a unor gene de rezisten2.2.9. Analiza statistic a datelor

CAPITOLUL III. REZULTATE I DISCUII

VARIAIA PARAMETRILOR MORFO-FIZIOLOGICI LA PLANTELE DE FLOAREA-SOARELUI LA INTERACIUNE CU PARAZITUL LUPOAIA3.1. Studiul parametrilor morfo-fiziologici, acumularea pigmenilor asimilatori i evaluarea gradului de infecie n procesul de interaciune a florii-soarelui cu lupoaia din regiuni geografice diferite

3.2. Influena temperaturii asupra gradului de infecie al lupoaie la unele genotipuri de floarea-soarelui

3.3. Dinamica dezvoltrii parazitului pe sistemul radicular a plantei-gazd

3.4. Evidenierea gradului de infecie la unele genotipuri din colecia laboratorului

CAPITOLUL IV. ASPECTE BIOCHIMICE ALE INTERACIUNII DIFERITOR GENOTIPURI DE FLOAREA-SOARELUI CU OROBANCHE CUMANA WALLR

4.1. Aspecte ale statutului oxido-reductor la unele genotipuri de floarea-soarelui atacate de lupoaie

4.2. Aspecte moleculare ale metabolismului proteic n patosistemul Helianthus annuus l. Orobanche cumana wallr4.2.1. Analiza proteinelor la nivelul sistemului radicular4.2.1.1. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n cadrul familiei Xenia la nivelul rdcinilor

4.2.1.2 Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul sistemului radicular a genotipurilor familiei Xenia

4.2.1.3. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n cadrul familiei Valentino la nivelul sistemului radicular

4.2.1.4. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul sistemului radicular a genotipurilor care formeaz hibridul Valentino

4.2.1.5. Identificarea proteinelor asociate cu patogenez la diverse genotipuri de floarea-soarelui4.2.2. Modificarea spectrului polipeptidic la nivelul sistemului foliar la diverse genotipuri de floarea soarelui sub aciunea stresului biotic

4.2.2.1Varietatea spectrului polipeptidic a genotipurilor hibridului Xenia i liniilor parentale ale acestuia la nivelul sistemului foliar

4.2.2.2. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul sistemului foliar a genotipurilor hibridului Xenia i liniilor parentale ale acestuia

4.2.2.3. Varietatea spectrului polipeptidic la diverse genotipuri de floarea soarelui n cadrul familiei Valentino la nivelul sistemului foliar

4.2.2.4. Impactul patogenului Orobanche cumana asupra metabolismului proteic la nivelul sistemului foliar a genotipurilor familiei Valentino

CAPITOLUL V. DETERMINISMUL GENETIC A REZISTENII UNOR GENOTIPURI DE FLOAREA-SOARELUI LA LUPOAIE5.1. Analiza cantitativ a acizilor nucleici

5.2. Evidenierea marcherului genetic asociat cu genei Or5 ce confer rezisten la rasa E de lupoaie la unele genotipuri de floarea-soarelui

CONCLUZII

INTRODUCERE

Actualitatea temei. Floarea-soarelui reprezint una din principalele plante oleaginoase cultivate n Republica Moldova, avnd o importan major la nivel att naional, ct i mondial. Aceast cultur are un spectru larg de utilizare, rezolvnd problema aprovizionrii cu ulei vegetal i aducnd o mare contribuie n obinerea produselor alimentare vitaminizate, a substanelor fosfo-organice i minerale. ns, recolta culturilor agricole n agrocenozelor din Republica Moldova, inlusiv cea a florii-soarelui, sufer pierderi considerabile din cauza aciunii nefaste a unor factori de natur abiotici i biotici. Floarea-soarelui este atacat de diferii ageni patogeni, ceea ce actualizeaz problema crerii i selectrii hibrizilor rezisteni la factorii biotici. Pierderi anuale cauzate de boli, pe plan mondial se ridic la circa 33% din volumul produciei poteniale (Burzo I. Toma S., 1999).

Unul din factorii limitativi ai produciei de floarea-soarelui n Republica Moldova este parazitul lupoaia (Orobanche cumana Wallr.), n special zonele centrale i de sud-est (Siminel V. 1998), ct i n regiunea Mediteranean i Europa de Est (Alonso, L. C. 1996, Blbl, A.,1991, Dominguez, J., 1996, Shindrova, P. 1994). Deoarece lupoaia este un parazit angiosperm, lipsit de clorofil, care depinde n totalitate de planta gazd, utiliznd apa, substanele minerale i organice ale florii-soarelui i absorbia acestor substane reduc nu doar producia de semine, dar de asemenea i coninutul uleiului (Szoko G., 1973), atacurile creia sunt deseori devastatoare i pagubele produse de ctre parazit pot duce la scderea produciei cu peste 50% (Aimovi M., 1988, Bucuceanu M. 1998, Dominguez, J., 1996). Controlul acestui parazit este destul de dificil, fiind studiate i implementate diverse metode de combatere a lupoaiei, inclusiv mecanice, biologice i chimice, unde selecia i ameliorarea culturilor de floarea-soarelui cu rezisten genetic se consider cea mai efectiv, economic i fiind o soluie ecologic n acelai timp. Totui, utilizarea formelor rezistente genetic este urmat de apariia de rase noi de lupoaie, mai virulente, care nving barierele existente de rezisten (Dominguez J 1999). Elucidarea mecanismelor fiziologo-biochimice i genetice legate de relaiile existente dintre planta-gazd i parazit, ar contribui la facilitarea procesului de selecie a formelor rezistente, ce reprezint la momentul actual una din preocuprile de baz a cercettorilor din domeniul culturii florii-soarelui. Reieind din aceste considerente scopul prezentei lucrri const n elucidarea particularitilor morfo-fiziologice, biochimice i genetice care caracterizeaz interaciunea dintre planta-gazd i parazit n baza modelului floarea-soarelui i lupoaie.Obiectivele de cercetare

studiul indicilor morfo-fiziologici i biochimici ai genotipurilor de floarea-soarelui n norm i afectate de lupoaie;

evaluarea gradului de infecie la unele genotipuri de floarea-soarelui cultivate pe teritoriul Republicii Moldova, sub influena diferitor regimuri de temperatur;

analiza spectrului polipeptidic a proteinelor sumare solubile la diverse genotipuri homo- i heterozigote de floarea-soarelui infectate cu lupoaie;

identificarea markerului genetic de tip SCAR asociat cu prezena genei Or5 ce confer rezisten la rasa E de lupoaie la 53 genotipuri de floarea-soarelui (linii materne, paterne i hibrizi).CAPITOLUL I. ASPECTE PRIVIND INTERACIUNEA GAZD-PARAZIT: Helianthus annuus L.- Orobanche cumana Wallr.

Problema originii i a evoluiei parazitismului n general, ct i n cazuri particulare constituie obiectul multor cercetri. Interaciunea florii-soarelui i lupoaiei reprezint o form de interrelaii aprut pe parcursul evoluiei acestor dou specii, reprezentnd un important model de studiu de tipul gazd-parazit. Elucidarea mecanismelor care stau la baza acestei interaciuni poart att un caracter fundamental, ct i unul aplicativ.

1.1. Floarea-soarelui cultur oleaginoas i plant gazd

Floarea-soarelui (Helianthus annuus L., 2n=34) este o plant anual a familiei Asteraceae (Schilling & Heiser, 1981), originar din America de Nord. Alogam, entomofil i alloploid (2n=34) aprut n urma ncrucirii a unei specii din genului Vigniera (n=8) cu o specie a genului Helianthus (n=9) nc neindentificat (Heiser, 1961).

De menionat c floarea-soarelui este o plant oleaginoas de mare importan economic i alimentar. Prin coninutul seminelor n substane grase (33-56 %) i calitatea deosebit a uleiului rezultat n urma extraciei, aceasta reprezint una dintre principalele productoare de grsimi vegetale, utilizate n alimentaiei. Ca surs de ulei vegetal, pe plan mondial, floarea-soarelui ocup locul al patrulea, dup soia, palmier i rapi (Roman Gh., 2006). Valoarea alimentar ridicat a uleiului de floarea-soarelui, se datoreaz coninutului bogat n acizi grai nesaturai, reprezentai preponderent de acidul linoleic (44-75%) i acidul oleic (14-43%), ct i prezenei reduse a acidului linolenic (0,2%), componente care-i confer stabilitate i capacitate ndelungat de pstrare, superioare altor uleiuri vegetale. Funcia nutritiv a uleiului de floarea-soarelui este sporit de prezena unor provitamine a vitaminelor liposolubile A, D, E, a vitaminelor B4, B8, K i fosfatidelor. Uleiul mai conine steroli, aproximativ 0,04%, precum i tocoferoli - fraciune antioxidant a uleiului vegetal, cca. 0,07% (Vrnceanu i colab., 1974).

Datorit nsuirilor biochimice valoroase, uleiul de floarea-soarelui este folosit frecvent n scop alimentar, n industria margarinei i a conservelor. De asemenea, produsul este folosit i n industrie, pentru producerea lacurilor speciale i a rinilor, precum i n pictur. Reziduurile rezultate n urma procesului de rafinare, se folosesc la fabricarea spunurilor, la obinerea cerurilor, fosfatidelor, lecitinei i tocoferolilor. Fosfatidele i lecitina extrase din uleiul de floarea-soarelui, sunt utilizate n industria alimentar, panificaie, patiserie, n prepararea ciocolatei i a mezelurilor (Brnaure V.,1991, Popescu V, 1996).

Turtele rezultate n urma procesului de extracie a uleiului (aproximativ 300 kg/t smn), constituie o surs valoroas de proteine pentru rumegtoare, iepuri, porci i psri (Vrnceanu i colab., 1974). Turtele conin protein brut (ntre 33,7 i 47,8 %) i aminoacizi eseniali, cu valori apropiate cu cele de la soia (Hera., 1989), excepie fcnd aminoacidul lizina, care se gsete n cantiti mai mici. Valoarea energetic a turtelor este corelat cu gradul de decorticare a seminelor. Seminele mai puin bogate n ulei, se folosesc direct n consum, ntregi sau decorticate, ct i pentru halva. Tulpinile pot fi folosite ca surs de cldur (local), pentru fabricarea plcilor antifonice sau obinerea carbonatului de calciu (Roman Gh., 2006).

Floarea-soarelui este o excelent plant melifer i poate avea i aplicaii medicinale. Din florile ligulate (care conin quercitrin, anticianin, colin, betain, xantofil, etc.), se obine un extract alcoolic care se folosete n combaterea malariei, iar tinctura - n afeciuni pulmonare (Blteanu Gh.,1993). Din achene, dat fiind coninutul n fitin, lecitin, colesterin, se prepar produse indicate n profolaxia dezenteriei, febrei tifoide i pentru vindecarea rnilor supurate. n medicina popular, uleiul se folosete pentru macerarea plantelor utilizate n tratarea unor rni i arsuri (Hera i colab., 1989).

n ultima perioada se discut tot mai mult folosirea uleiurilor vegetale ca biocarburani (Vrnceanu A.V., 200, Roman Gh., 2006 ). Uleiul din floarea-soarelui, utilizat ca carburant posed avantajul c este uor de pstrat, este stabil, nu este periculos, este puin poluant, nu are risc foarte mare de inflamare i are un indice de evaporare aproape de zero. Uleiul din floarea soarelui conine ntre 10-15% oxigen, ceea ce duce la ameliorarea combustiei i la diminuarea nivelului polurii (Roman Gh., 2006).

Datorit valorii nutritive nalte i capacitii nalte de rezisten la verile secetoase, pentru Republica Moldova, floarea-soarelui reprezint una din culturile de baz i cea mai important surs de ulei vegetal. Acest lucru este reflectat n faptul c recolta din anul 2008 a depit cu 40% nivelul preconizat. Astfel, recolta pe ar a constituit 430 mii tone, ceea ce este cu 120 mii tone mai mult dect s-a prevzut. n anul 2007, recolta de floarea-soarelui a fost grav afectat de secet i a constituit 156 mii tone, de dou ori mai puin ca n 2006, unde aceasta a constituit 379 mii tone iar n 2005 287,5 mii tone respectiv (sursa www.maia.gov.md)

n acelai timp, n afar de factorii abiotici, cultura de floarea-soarelui este una din cele mai des afectate de boli, atacul crora constituind una din cauzele importante ale reducerii productivitii, att n ara noast ct i n alte ri care cultiv aceast plant pe suprafee nsemnate. Rspndirea i intensificarea culturii florii-soarelui pe glob ntr-un timp foarte scurt a fost nsoit de creterea evident a frecvenii i agresivitii patogenilor, n timp ce patrimoniul genetic al florii-soarelui cultivate a rmas la fel de srac n factorii de rezisten ca i la nceputul cultivrii (Vrnceanu i colab., 1974).Cele mai devastatoare boli sunt provocate de atacul ciupercilor fitopatogene cum sunt: Plasmopara helianthi (mana), Sclerotinia sclerotiorum (putregaiul alb), Botrytis cinerea (putregaiul cenuiu) i de fanerogama parazit lupoaia (Orobanche cumana). Pe lng acestea, o serie de boli ca ptarea neagr (Phoma sp), rugina (Puccinia helianthi), vetejirea (Verticillium dahliae), putrezirea rdcinilor i tulpinilor (Macrophomina phaseoli), pot constitui un pericol potenial, semnalate tot mai des n culturile de floarea-soarelui (Vrnceanu i colab. 1978). Reieind din numrul publicaiilor de la Conferinele Internaionale consacrate florii-soarelui (ediiile din 1992, 1996, 2000 i 2004), s-a constatat c Sclerotinia sclerotiorum afecteaz cel mai des, urmat de Plasmopara helianthi i Orobanche cumana (Vear F. 2004).

La moment, intens studiate maladii a florii-soarelui sunt putregaiul alb, mana, fomopsis precum i lupoaia. Ultimul atrage o atenie tot mai mare n ultimul timp, fapt datorat de pagubele economice importante pe care acesta le aduce rilor care cultiv floarea-soarelui. Pn n prezent, lupoaia rmne un parazit important al florii-soarelui n principalele zone de cultur din Comunitatea Statelor Independente. Astfel, amplitudinea pagubelor produse de parazitarea cu lupoaie variaz foarte mult, de la scderi nesemnificative de producie pn la 90% pierderi, n funcie de intensitatea atacului. Astfel, Acimovic (1983 b) a artat c la un atac slab, producia scade cu 5-20%, iar la un atac mediu - 20-50% respectiv (Acimovic (1983 b).

1.2. Lupoaia - parazit al florii-soarelui

Capacitatea plantelor de a parazita pe alte plante a aprut independent n cursul evoluiei angiospermelor i aproximativ 1% din toate plantele cu flori, n prezent, sunt catalogate ca plante parazite (Wrobel and Yoder, 2001). Din totalul de 277 de genuri i 4100 de specii de plante cu flori parazite (Press & Graves, 1995), doar circa 25 de genuri au un impact negativ asupra plantelor de cultur i respectiv, considerate patogene (Nickrent and Musselman, 2004). Multe din aceste specii au o importana pentru botaniti i ecologi (Kuit, 1969), precum sunt Rafflesia spp. sau Viscum spp. ns, printre acestea, patru genuri sunt considerate cele mai periculoase i aduc cele mai semnificative daune: Cuscuta, Arceuthobium, Striga, precum i Orobanche.

1.2.1. Taxonomia, rspndirea i impactul economic al speciilor de Orobanche Genul Orobanche se atribuie la familia Orobanchaceae (, 1986). n acest gen sunt incluse circa 100 de specii (Roman et al ., 2002). Genul se mparte n 4 secii, dintre care seciile Trionychon i Osproleon (cunoscut i ca secia Orobanche) includ specii care provoac cele mai mari pagube economice (Pieterse, 1979).

Genul Orobanche L., n comparaie cu alte genuri din fam. Orobanchaeae, se caracterizeaz printr-o complexitate i o diversitate genetic mare a speciilor. Aceasta se explic prin faptul c speciile genului Orobanche L. paraziteaz att pe plantele din flora slbatic, ct i pe plantele de cultur i buruiene. Cu ct este mai mare numrul de plante-gazd cu att sunt mai variate speciile de plante parazite (Roman et al ., 2002).

n cadrul seciei Trionychon principale specii sunt Orobanche aegyptiaca Pers. i O. ramosa L. care din punct de vedere morfologic, sunt foarte asemntoare, paraziteaz pe aceleai plante, au tulpini ramificate i au acelai numr de cromozomi (2n=24).

Secia Orobanche Wallr. cuprinde aproximativ 50 specii, printre care speciile Orobanche cernua Loefl. (2n=24, 38), O. cumana Wallr., O. crenata Forsk. i O. reticulata Wallr. sunt cunoscute ca fanerogame parazite pe floarea-soarelui i alte culturi agricole, posednd tulpini neramificate i 38 cromozomi (Schneeweiss M., Palomeque T., 2004). Dei O. cernua i O. cumana sunt foarte apropiate, acestea au fost catalogate ca specii aparte (Katzir, 1996, Paran et al., 1997, Joel et al., 1996, 1998, Pujadas & Thalouarn 1998). Orobanche cernua se ntlnete n special n Spania, n provinciile Cienca i Malaga (Diay-Celayeta, 1974; Gonzales-Torres et. al., 1980; Gonzales-Carrascosa, 1992; Melero-Vara i colab., 1996).Pentru sistematizarea speciilor de lupoaie pot fi utilizate diferite metode, precum cele morfologice (Musselman, 1986), microscopie electronic a gruncioarelor de polen (Abu Sbaih et al., 1994), metodele chimiotaxonomice de msurare a coninutului de compui fenolici (Andary, 1994; Georguieva and Edreva, 1994) i a acizilor grai (Velasco et al., 2000) a seminelor de Orobanche.

ns, aceste metode sunt insuficiente pentru efectuarea unei sistematici mai aprofundate, inclusiv la nivel de taxoni inferiori speciei, pentru care pot fi aplicate metodele de biologie molecular. n literatura de specialitate este puin informaie privind variabilitatea genetic n baza markerilor moleculari, reprezentai de izoenzime i markerii ADN. Verkleij et al. (1986, 1989, 1991) a folosit izoenzime pentru a studia variabilitatea genetic n populaiile din cadrul speciilor O. crenata i O. aegyptiaca rspndite n Siria i n Spania, iar Paran et al. (1997) a folosit secvenele polimorfice amplificate ADN (markerii RAPD) pentru a studia variabilitatea din cadrul i dintre principale specii de lupoaie din Israel. De asemenea, metoda RAPD a fost utilizat pentru studiul variabilitii genetice a 20 de specii din genul Orobanche. n urma reaciilor PCR cu utilizarea a cinci primeri arbitrari au fost identificai 202 ampliconi i identificai markeri specifici de specie (B. Romn, C. Alfaro, A. M. Torres, 2003).

Cercetarea i cunoaterea evoluiei din cadrul populaiilor de lupoaie este crucial pentru organizarea unor programe eficiente de ameliorare a plantelor la rezisten. Din aceast perspectiv, variabilitatea genetic a populaiilor de O. cumana din Bulgaria, Romnia, Turcia i Spania, este studiat folosind RAPD markeri. S-a stabilit c aceast plant parazit este autogam i se caracterizeaz printr-o variabilitate intrapopulaional mic, iar structura genetic a populaiilor din zone geografice diferite este foarte omogen. Populaiile sunt foarte bine structurate i organizate n dou grupe distincte. Din prima grup fac parte populaiile din rile Euroei de Sud-Est Bulgaria, Romnia i Turcia, n a doua grup sunt incluse populaiile din Spania, ce au o origine monofiletic. Aceste rezultate sunt puse n discuie i prezint interes n contextul utilizrii markerilor RAPD pentru a determina tipul raselor de lupoaie din cadrul populaiilor de O. cumana. (Gagne et al., 1998)Speciile genului Orobanche cauzeaz pagube mari de recolt i reduc semnificativ calitatea produciei la un spectru larg de culturi dicotiledonate (Nickrent et al. 1998; Molau, 1995; Riches and Parker, 1993; Keyes et al., 2001). Pagubele provocate de aceti patogeni variaz ntre 5 i 95% (Mesa-Garca & Garca-Torres, 1986; Bayaa et al., 2000; Sauerborn, 1991).

Spectrul gazdelor lupoaiei este larg. Speciile Orobanche paraziteaz doar plantele dicotiledonate, din familiile Solanacae (tomatul, tutunul, cartoful, ptlgeaua vnt), Fabaceae (bobul, mazrea, lintea, lucern, trifoi), Cucurbitaceae (castravetele, pepenele galben, pepenele verde,bostanul i dovleacul), Compositae (lptuca, floarea-soarelui), Cruciferae (varza, mutarul, rapia) i Umbelliferae (morcovul, elina, pstrnacul), ns, principala plant-gazd a lupoaiei rmne a fi floarea-soarelui (Parker and Riches, 1993).

Orobanche sunt nite plante lipsite de clorofil i n totalitate depind de metabolismul carbonului i azotului, regimul de ap a gazdei (Joel et al., 2006). Unele specii sunt ngust specializate n spectrul de gazde, aa ca O. cumana ce paraziteaz floarea-soarelui i O. creanata ce paraziteaz doar legumele pe cnd altele, ca de exemplu O. aegyptiaca i O. ramosa posed un spectru variat de gazde (Parker & Riches, 1993; Press & Graves, 1995). Actualmente, reprezentanii genului Orobanche se ntlnesc n 58 de ri, n special cele din Europa de Est, n rile bazinului Mrii Mediteraneene, n Orientul Mijlociu, n Africa de Nord i de Est, n Asia de Vest i Sud (Joel et al ., 2006; Shindrova et al., 1998; Parker and Ritches, 1993; Alonso et.al., 1996). n Orientul Mijlociu i Asia, O. aegyptiaca (rasa Egiptean) atac fasolele, cruciferele, solanaceele, asteraceile etc. (Parker & Riches, 1993). O. foetida rspndit n zona Mediteranian paraziteaz un spectru larg de plante erbacee din genurile Anthyllis, Astragalus, Ebenus, Lotus, Medicago, Ononis, Scorpiurus i Trifolium (Pujadas-Salv, 1999; 2002). n Tunis, acest parazit provoac pagube de 66-83% (Kharrat et al., 1992; Kharrat, 1999), atacnd Lathyrus odoratus, L. sativus, Trifolium alexandrinum, Medicago truncatula and V. sativa ssp. amphicarpa (Kharrat, 2002). Alte specii de Orobanche, precum O. minor provoac pagube mai mici, atacnd doar leguminoasele cultivate n Oregon, SUA (Osterbauer & Rehms, 2002; Eizenberg et al., 2004b)

n bazinul Mrii Mediteraniene i Asia de Vest cca. 16 mln. ha, care reprezint aproximativ 1,2 % din suprafaa total de pmnt arabil din lume, sunt atacate de speciile genului Orobanche (Sauerborn et al., 2002). Dup Garcia-Torres et al. (1994), speciile de Orobanche au infectat aproximativ 100 mii ha i 350 mii ha n regiunile centrale i de sud ale Spaniei, respectiv.

n afar de Spania, lupoaia a provocat importante pagube i n alte regiuni. Astfel, n fosta Iugoslavia, n urma atacurilor semnturilor de floarea-soarelui de ctre O. cumana, suprafaa cultivat de floarea-soarelui s-a redus cu 37% (Sauerborn et al., 2002).

Reducerea recoltei cauzat de Orobanche depinde de severitatea infectrii semnturilor cu aceti fitopatogeni i poate varia de la 5 % pn la 100%, unde Orobanche cumana Wallr., O. ramosa L., O. aegyptiaca L. i O. crenata Forssk. cauzeaz nsemnate pagube n fitotehnie (Linke et al.,1989; Bulbul et al.1991; Barker et al., 1996; Dominques et.al., 1996; Blamey et al., 1997; Hibberd et al., 1999).

Cel mai mare interes prezint ns O. cumana care produce semnificative daune. Una dintre primele descrieri a O. cumana ca specie a fost efectuat de Wallroth (1825), colectat de la plantele din zonele de deert a Asiei de sud-vest i n Europa sud-est. Iniial, O. cumana parazita exclusiv Artemisia ssp. (Venko & Bozoukovv, 1994), ns dup introducerea culturii florii-soarelui n Europa, lupoaia a fost depistat pentru prima data parazitnd aceast cultur n nord-estul Bulgariei, n anul 1935 (Encheneva & Shindrova, 1994). n Rusia, lupoaia (Orobanche cumana Wallr.) a fost descris pentru prima dat, la sfritul secolului XX. Din regiunile sudice ale Rusiei i Ucrainei, adiacente Marii Negre, parazitul s-a extins, odat cu rspndirea culturii florii-soarelui i n celelalte ri riverane Romnia i Turcia. n Romnia, Orobanche cumana Wallr. a fost semnalat pentru prima dat atacnd culturile de floarea-soarelui n anii 1940-1941, de ctre Svulescu i colab. (Dumitra i esan (1988). 1.2.2. Biologia parazitului Orobanche cumana WallrOrobanche cumana Wallr. reprezint o plant anual, lipsit de clorofil, holoparazit ce se reproduce prin semine. Tulpinile sunt robuste, nalte de 40-65 cm i groase de 5-8 mm, la baz puin ngroate, sub forma unui bulb, neramificate, de culoare glbuie, glanduloase, striate, acoperite cu frunze transformate n scuame. Acestea din urm se dezvolt la suprafaa solului n jurul plantelor parazite, solitare sau n mnunchi (fig.1.). Inflorescena este un spic sau racem alungit, cilindric de 15-30 x 2,5-3 cm, uneori dens la vrf, cu flori erecte-patente, cu cte o bractee egal cu floare. Caliciul de 7-9 mm este prevzut cu dou lacinii bidinate sau ntregi, glbui sau albastre. Corola de 19-22 mm lungime, este ngustat la mijloc, la baz puin umflat, spre vrf recurbat, liliachie, scurt-glandulos-proas sau glabrescent. Staminele de 6-10 mm lungime, 4 la numr, sunt fixate puin mai jos de mijlocul tubului corolei, cu filamente glabre i antere obovate, glabre sau puin proase la baz. Anterele sunt albe, de 1,4-1,6 mm lungime. Ovarul este ovoidal, iar stilul recurbat. Florile de lupoaie sunt protogine, adic gineceul se matureaz naintea androceului astfel nct autopolenizarea este exclus, aceasta fcndu-se numai cu ajutorul insectelor. Fructul reprezint o capsul de 8-10 mm lungime i conine cte 1500-2000 semine mici (masa a 1000 semine fiind 0,001 g), cu dimensiuni de 0,35-0,45 mm, elipsoidale, cenuii nchise, cu suprafaa reticulat. O singur plant de lupoaie produce pn la 60-80 mii semine. Seminele rmase n sol i pstreaz facultatea germinativ timp de 5-8 ani (Buia, 1961; Iliescu, 1974; Dumitra i Sean, 1988, Kukin, 1982, Pujadas-Silva A.J. 2000).

Fig. 1. Lupoaia (Orobanche cumana Wallr) (Nickrent and Musselman, 2004)

1.2.3. Ciclul de via i etapele parazitismului la speciile de Orobanche

Ciclul de via a Orobanche este specializat la parazitism i necesit o interaciune strns cu planta gazd. Specificul interaciunii i relaia dintre planta-parazit i planta-gazd este determinat de schimbul i recunoaterea semnalelor moleculare de ctre parteneri(Boone et al., 1995).

Ontogeneza O. cumana poate fi divizat n dou etape bine separate att n timp ct i n spaiu: subteran i aerian (; Rispail et al., 2007, Echevarria-Zomeno., 2006). Faza subteran a dezvoltrii parazitului se caracterizeaz prin cteva stadii principale de interaciune cu planta-gazd: germinarea, inducerea haustoriei, penetrarea gazdei i maturizarea parazitului (Estabrook and Yoder, 1998 Echevarria-Zomeno., 2006).n endospermul seminelor de lupoaie exist un centru celular care particip la iniierea germinrii i la reglarea procesului de cretere a germenului. (Teryokhin, 1992). Pentru germinare, seminele de lupoaie necesit un semnal al prezenei gazdei, reprezentat de compui chimici, numii factori de germinare, care sunt secretai de ctre rdcinile plantei atacate (Boone., 1995; Easterbrook and Yoder, 1998; Bouwmeester, 2003). Cea mai comun clas de substane produse de rdcinile plantelor-gazd care stimuleaz germinarea seminelor de Orobanche i alte specii de plante parazite, sunt strigolactonele (Wigchert and Zwanenburg, 1999). Primul factor de germinare SXSg, a fost izolat de la genul Striga i reprezint o dihidrochinon, rapid autooxidat ntr-o chinon activ, numit sorgoleone (Fate and Lynn, 1996).

De asemenea, germinarea seminelor de lupoaie este favorizat de terenurile srace, uoare i uscate, cu pH-ul neutru sau slab acid i umiditate nefavorabil. n terenurile cu stratul fertil adnc i umed, parazitul se dezvolt, dar plantele parazitate, fiind mai viguroase, sufer mai puin (Georgieva i Bozoukov, 1995). Maric i Masierevic (1988) consider ca secreiile rdcinilor de floarea-soarelui conin unii acizi care contribuie la schimbarea reaciei pH-lui solului, (pH sub 6,5) favoriznd astfel dezvoltarea parazitului Orabanche cumana.

ns, pe lng stimulatori, exist i factori biologici i chimici care contribuie la inhibarea germinrii seminelor de lupoaie. Astfel, Al-Menoufi i col. (1996) au constat c extractele de radicel de schinduf (Trigonella phoenum graecum), lupin (Lupinus termis), coriandru (Coriandrum sativum) i rapi slbatic (Brassica rapa) reduc semnificativ efectul stimulatorului sintetic GR24 (Al-Menoufi i col. 1996). Peroxidul de hidrogen, hipocloritul de sodiu i sulful muiabil, de asemenea diminueaz germinaia seminelor de Orobanche spp (Al-Menoufi i colab. 1996).Dup germinarea seminelor de lupoaie se formeaz un filament subire, a crui extremitate radicular, venind n contact cu rdcina plantei-gazd, se ngroa, lund forma unui bulb cu suprafaa prevzut cu o serie de proeminene, care apoi ader la rdcin. Acest organ ataat se numete apresorium (Musselman and Dickison, 1975; Stewart and Press, 1990).Toate plantele parazite dezvolt haustorium organ multicelular, care invadeaz esuturile plantei-gazd i reprezint o punte dintre parazit i plant (Kuijt, 1969; Musselman and Dickison, 1975; Stewart and Press, 1990; Press and Graves, 1995; Riopel and Timko, 1995). Astfel, la urmtoarea etap, Orobanche dezvolt un haustorium (con de ptrundere) care strbate, n punctul de contact cu rdcina gazdei, zona cortical pn la fasciculele libero-lemnoase. Orobanche spp. sunt holoparazii care atac la nivel de rdcin, conectndu-se la sistemul vascular al gazdei prin haustorii care le permit obinerea apei, nutrienilor organici (Press & Graves, 1995; Hibberd et al., 1999), hormonilor (Suzuki et al., 1994), toxinelor (Rank et al., 2004), precum i altor componente necesare modului parazitar de trai, inclusiv a genelor (Mower et al., 2004).

Pentru dezvoltarea haustorului este necesar prezena altei clase de substane sintetizate de ctre planta-gazd factori de inducere a haustoriei HIFs (de la haustorial inducing factor) (fig.2 nr.2). De menionat c majoritatea HIFs sunt de natur fenoli (MacQueen, 1984; Smith et al., 1996). Primii derivai ai HIFs sunt xenognosin A (fig.3 nr.3) i xenognosin B (fig.3 nr.4), izolai din extractele foliare ale Astragalus gummifer (Lynn et al., 1981). Ulterior, din rdcinile de sorg a fost izolat un alt factor, factorul dimitilbenzochinon (DMBQ) (fig.3 nr.7) (Chang and Lynn, 1986). n afar de compuii menionai mai sus, n procesul de formare a haustorilor particip flavonoizi, -hidroxiacizi, kinone i citokinine (Lynn i Chang, 1990) (fig.2.). Primele trei grupe sunt fenoli structural nrudii, derivai dintr-un component comun Phe (Smith i al., 1996) ce sugereaz c aceste molecule induc haustoria printr-un mecanism redox comun (Smith i al., 1996).

Timp de o or dup aplicarea HIF, la rdcinile parazite se ncepe expansiunea radial i diviziunea celular care are loc n celulele corticale n apropierea vrfului rdcinii. Elongarea celulelor se oprete dup ce radicelele ajung la esutul plantei-gazd, apoi de-a lungul esutului se acumuleaz amidon cu secreii mucilaginoase. Stratul extern al radicelei se difereniaz apoi ntr-un strat de celule papilate care reprezint un substrat adeziv pentru formarea unor coronie n jurul celulelor apicale, ce rmn nepapilate, din care se formeaz partea central a conului de ptrundere (Joel and Losner-Goshen, 1994). Ataarea parazitului la gazd este uurat prin producerea a unei substane mucilaginoase de periorii haustoriei (Baird i Riopel, 1983), ce provoac degradarea enzimatic a esuturilor sub aciunea substanelor ca: pectin-metilesterazele, poligalacturonazele i endocelulazele (Shomer-Ilan, 1993; Ben-Hod., 1993, Losner-Goshen, 1998). Dup ataare, celulele conului de ptrundere a haustorului cresc printre celulele epidermale i cortexul plantei-gazd. Apoi, parazitul formeaz conexiuni cu sistemul vascular al gazdei prin haustoriu, care reprezint o punte pentru consumul de ap i elemente nutritive. Parazitul capteaz resursele plantei-gazd prin stabilirea unui potenial osmotic sczut n raport cu gazda, prin biosinteza unor astfel de alcooli polihidrici cum ar fi manitolul (Harloff and Wegmann, 1993; Robert et al., 1999). Dup conexiunea cu gazda, parazitul crete rapid i dezvolt rdcini care de asemenea sunt capabile s formeze noi haustori (Keyes, 2001; Joel., 2006), care creeaz un deficit mare de ap i substane nutritive pentru plant. n partea superioar a bulbului se dezvolt un mugure acoperit de solzi, care apoi se alungete i strbate solul ieind la suprafa, formnd tulpina florifer a parazitului pe care se vor forma capsule cu semine (Pancenco, 1975; Pancenco i Antonova, 1978, Sukno 1999). (Fig. 3.).

Din momentul ptrunderii filamentului parazitului, rezultat n urma germinrii seminelor, n tegumentul rdcinii plantei-gazd, pn la apariia tulpinii florifere la suprafaa solului, decurg circa dou luni, timp n care planta-gazd este epuizat, iar ca planta parazit s poat fi vzut (Vrnceanu 1974, Pujadas-Silva A.J. 2000).

n condiii de cmp, plantele de lupoaie apar la suprafaa solului, de obicei dup nceputul nfloritului plantei-gazd. n cazul unui atac puternic, o singur plant de floarea-soarelui poate fi parazitat n acelai timp de 40-60 plante de lupoaie sau mai multe (Vrnceanu 1974, Peresipkin 1986).

nflorirea lupoaiei (anteza) are loc n lunile iunie-august (Pujadas-Silva A.J. 2000). n dependen de condiiile climaterice, ciclului de via subteran a Orobanche cumana este de la 30 pn la 100 de zile. Ciclul total de via de la germinarea seminelor pn la producerea de semine este de 3-7 luni (Pujadas-Silva A.J. 2000).

1.2.4. Efectul parazitismului Orobanche asupra plantei-gazd

Planta parazit acioneaz asupra plantei-gazd din momentul stabilirii unui contact cu aceasta. Efectele parazitismului Orobanche asupra gazdei pot fi foarte diferite, variind de la cauzarea rnilor nesemnificative a esuturilor vegetale pn la moartea plantei. ns, n general, efectele vizibile ale parazitului asupra gazdei sunt urmtoarele: ofilirea plantei, reducerea dimensiunii plantelor, micorarea recoltei i reducerea calitii produsului(Hurtado, 2004).

De regul, trei factori principali determin impactul parazitismului Orobanche asupra plantei-gazd: 1) dimensiunea parazitului; 2) viteza de cretere i activitatea metabolic a parazitului; 3) stadiul de dezvoltare a plantei n momentul atacului (Hurtado, 2004).

Observaiile fiziologice asupra specificului relaiei dintre parazit-gazd demonstreaz c parazitismul Orobanche produce diferite efecte asupra statutului de nutriie al plantei-gazd. Astfel, n relaia O. ramosa tutun, epuizarea rezervelor de potasiu n planta-gazd este considerat un factor responsabil pentru leziunea plantei (Ernst, 1986). Alte studii au demonstrat o reducere considerabil a coninutului de potasiu i fosfor i o cretere a coninutului de calciu n plantele atacate de Orobanche (Abou-Raya et al., 1973). n plantele de morcov (Daucus carota) atacate de O. crenata, se atest o reducere de cca. 1/3 a coninutului total de zaharoz (Schaffer et al., 1991). Stewart i Press (1990) au presupus c parazitismul Orobanche are un impact negativ asupra capacitii plantei de a absorbi apa din sol, fapt care duce la nchiderea stomatelor, respectiv, parazitismul Orobanche are un impact indirect i asupra capacitii plantelor-gazd pentru a fotosinteza (Stewart i Press; 1990). ns, n condiii de secet, plantele parazitate se ofilesc, deoarece lupoaia determin o intensificare a transpiraiei i o diminuare a reaciilor de oxido-reducere (Iliescu, 1974). Astfel, schimbrile din statutul de nutriie cauzate de plantele parazite sunt considerate a fi responsabile de o reducere, n mediu, cu 30 % a ratei de cretere a plantelor (Iliescu, 1974). Concluzionnd, plantele de floarea-soarelui parazitate de lupoaie, stagneaz n dezvoltare, rmn pipernicite, cu tulpini subiri i formeaz capitule mici, cu majoritatea seminelor seci. Dac atacul se manifest timpuriu, plantele nu formeaz calatidii sau, dac i formeaz, acesta sunt mici, degenerate. Cnd atacul se produce n stadiul de dezvoltare mai avansat, simptomele sunt slab vizibile, gravitatea simptomelor este dependent de intensitatea atacului (Vranceanu, 1974). 1.2.5. Metode de control a lupoaieiFloarea-soarelui reprezint una din principalele plante oleaginoase cultivate n Republica Moldova, care este atacat de lupoaie, considerat unul dintre cei mai principali duntori ai produciei de floarea-soarelui n regiunea Mediteranean i Europa de Est (Parker C.1994). Un spectru larg de metode au fost testate pentru controlul plantelor din genul Orobanche. ns, controlul acestui parazit este destul de dificil, deoarece cteva mii semine produse de o singur plant de lupoaie, pot fi uor dispersate de vnt, ap, sol, animale, oameni sau utilaje (Skoric D. 1988, Parker C. 1994). O alternativ este utilizarea culturilor rezistente la lupoaie, astfel nct i n zilele noastre continu cercetrile n vederea depistrii i introducerii genelor rezistente la acest patogen n materialul de ameliorare (Parker C.1994)Astfel, n dependen de ciclul de dezvoltare a parazitului se folosesc anumite metode de combatere (tabelul 1).

Tabelul 1.

Metodele de control pe parcursul ciclului de viata a lupoaiei (Kebread, Murdoch, 2001)

Etapele ciclului de dezvoltare a lupoaieiMetodele corespunztoare de control

Dispersarea seminelorCarantin

Supravieuirea seminelor n solAfumarea (Fumizarea)

Solarizare

Germinarea seminelorRotaia recoltei (gazda fals)

Stimulatori ai germinrii

Inhibitori ai germinrii

Creterea radicelelor spre rdcina gazdeiFertilizarea cu azot

Penetrarea gazdeiRezistena recoltei

Ataarea funcionala la gazdRezistena recoltei

Creterea subteran a tuberculilorErbicide: - glifost

- sulfoniluraza

Culturi capcane

Producerea seminelorPulverizarea cu pictura

Plivire manual

Ardere

Control biologic

Carantina reprezint o msur de evitare a ptrunderii animalelor pe cmpurile infectate, unde erbivorele domestice reprezentnd un agent de dispersare a seminelor de lupoaie. Timpul de reinere a seminelor n tractul digestiv poate s varieze de la 15 ore pn la 120 ore, n dependen de specia mamiferului (Jacobson i al., 1987). Utilizarea n cmp a ngrmintelor proaspete, care conin semine viabile reprezint un alt mijloc de rspndire a Orobanche. De regul, ngrmintele sunt transformate n granule sau pastile, prelucrarea termic a crora determin degradarea unui procent mare de semine (Joel., 1988), dei unele semine ar putea supravieui, fiind mai rezistente la ocul termic (zer, 1979).

Afumarea (fumizarea) const n eliminarea depozitelor de semine prin arderea resturilor de plante i distrugerea seminelor de la suprafaa solului folosind substane chimice (metil bromid, sodium metham, diazomet etc.). Preventiv, solul trebuie sa fie umectat timp de 10-14 zile pentru a asigura imbibiia seminelor. Solul se acoper cu plastic fotodegradabil timp de 48 ore dup rspndirea produsului chimic. Acest tip de aplicare distruge de la 50-100% de semine depozitate (Parker & Riches, 1993; Goldwasser., 1994). ns, aceast metod este foarte costisitoare, iar substanele chimice pot prezenta un pericol potenial pentru mediul nconjurtor (Goldwasser., 1994).Solarizarea este o metod care se bazeaz pe acoperirea solului umed cu o pelicul de polietilen n timpul sezonului cald al anului. Datorita acestei pelicule, are loc captarea razelor solare i nclzirea solului pn la nivelul care este letal pentru buruienele i seminele acestora (Stapleton J.J., Devay J.E., 1986). Temperatura de 48-57C (Jacobson., 1980) distruge seminele de Orobanche aflate n stare de imbibiie n partea superioara a solului pn la 5 cm (Sprich., 1990). Solarizarea este o tehnic de control, dar nu una de eradicare. Costul filmului este mare i aceast tehnic poate fi utilizat n lunile calde ale anului (Foy et al., 1989; Jacobsohn et al., 1980). Solarizarea ar putea fi mai efectiv dac se va combina cu adugarea compuilor de azot. S-a observat c plantele ce paraziteaz pe rdcini se dezvolt mai abundent n soluri srace, nefertile. Ataarea parazitului se petrece pe un fon sczut de substane nutritive, iar adugarea nitrailor sau a altor compui azotai pentru fertilizarea solului inhib dezvoltarea parazitului (Jain & Foy, 1992). Acelai efect a fost observat n cmp, dup aplicarea compuilor amoniacali (Van Hezewilik i colab., 1991). ns, principalul mijloc de lupt mpotriva buruienilor din cultura florii-soarelui l constituie metodele agrotehnice. Una din aceste metode este rotaia culturilor agricole. n cazul florii-soarelui, datorit sensibilitii sale pronunate la boli, monocultura este practic exclus (Sin i colab., 1986). Crearea hibrizilor de floarea-soarelui rezisteni la complexul de rase de lupoaie i la principalii patogeni, Plasmopora halstedii, Diaporthe helianthi, i Phomopsis precum i tehnica modern de care dispune astzi agricultura privind combaterea chimic a buruienilor, bolilor i duntorilor i folosirea ngrmintelor i a irigaiei, au permis s se renune la rotaia de 8-10 ani (Vrnceanu 2000), considerat obligatorie n trecut (Semihnenko i cb., 1960). Vrnceanu (1974) i Sin i colab., (1976) au artat c introducerea n producie a hibrizilor rezisteni la man i la lupoaie nu va justifica renunarea la rotaia florii-soarelui de cel puin 4 ani, avnd n vederea posibilitatea apariiei unei rase noi de man sau lupoaie, sau ali parazii (Vrnceanu, 1974 i Sin i colab., 1976).

Stimularea germinaiei seminelor de Orobanche poate fi realizat i de alte culturi culturi capcane. O astfel de cultur a servit Brassica campestis care a redus rezervele de semine de O. aegyptica aproximativ cu 30% (Acharya i cb. 2002). Folosirea Trifolium alexandrium ca o cultur capcan a redus apariia O. crenata n cultura de fasole cu 92% peste 3 ani i cu 98% peste 4 ani respectiv (Al-Menoufi, 1991).

Aplicarea erbicidelor (glifosat, imazetapir, acetoclor) reprezint o metod chimic de combatere a Orobanche (Foy et al., 1989). Controlul chimic selectiv al lupoaiei prin aplicarea erbicidelor este efectiv doar n cazuri limitate, atunci cnd semnturile sunt suficient de tolerante la aciunea compuii chimici ai erbicidelor (Garcia-Torres et al., 1988; Foy et al., 1989). Majoritatea erbicidelor, folosite pentru combaterea lupoaiei, nu posed o selectivitate i exercit o aciune negativ asupra plantelor de cultur (Foy et al., 1989). n unele situaii, erbicidele n proporii mici ar permite controlul de lupoaie, dar ar exista un risc al dezvoltrii rezistenei la unele erbicide care au fost aplicate anterior. Crearea unor soiuri i hibrizi de plante de cultur rezistente la erbicide din clasa glifosate, clorsurfuron i imidazoline, ar crea oportuniti excelente pentru controlul speciilor de Orobanche (Joel et al., 1995; Gressel et al., 1996).

Utilizarea erbicidelor se efectueaz nainte de semnat, preemergent (Garcia-Torres 1988, 1992, 1995a), sau la diferite etape de dezvoltare a plantei gazde postemergent (Lolas 1986, Americanos, 1991, Tingrui 1996), iar n unele cazuri pentru combaterea lupoaie se trateaz i seminele de floarea-soarelui (Garcia-Torres 1995 b, 1996).Dar pn n prezent, nici unul din aceste procedee agrotehnice nu sunt justificate economic i sunt foarte laborioase. Combaterea biologic reprezint o metoda mult mai efectiva de control a Orobanche cu utilizarea micoerbicidelor sau insectelor care n acelai timp este i o metod ecologic (Sauerborn, 1998).

Un exemplu de micoerbicid este ciuperca Ulocladium atrum care a fost folosit experimental pentru controlul O. crenata la fasole n Siria (Linke i colab., 1992). Un interes prezint genul Fuzarium (F. lateritum, F. arthrosporiodes i F. oxysporum), care tot mai larg se ntrebuineaz n combaterea lupoaiei (Bozukov & Kouzmanova, 1994, Bedi, 1994; Thomas, 1998Cohen., 2002, Jupp, 2001, D. Muller-Stover, 2004).

Phytomyza orobanchia este o insect, ale crei larve paraziteaz pe tulpini i pe capsule de O. ramosa i alte specii din genul Orobanche, reducnd astfel producia de semine, mai ales ca ciclul de dezvoltare a acestei diptere este foarte scut i pe parcursul dezvoltrii lupoaiei se dezvolt trei generaii. (Norambuena i cb., 2001).n Siria, tratarea semnturilor cu Phytomyza orobanchia a redus producerea seminelor de lupoaie cu 30%. ns, eficiena aplicrii Phytomyza orobanchia depinde de factorii climaterici i de absena n mediu a rpitorilor naturali ai insectei (Sauerborn, 1998).Pentru un control i mai efectiv, unii cercettori propun aplicarea mijloacelor biologice n combinaie cu mijloacele chimice. Un astfel de studiu a fost efectuat de D. Muller-Stover i colab. (2005), care au aplicat Fusarium oxysporum n combinaie cu esterul S-metilic al acidului benzol (1,2,3) tiadiazol-7-carbotionic (BTH). Dat fiind faptul c O. cumana paraziteaz pe un spectru larg de plante de cultur i produce un numr mare de semine mici cu o facultate germinativ foarte bun i care se rspndesc n spaiu foarte uor, combaterea parazitului prin folosirea asolamentelor sau msurilor de carantin este foarte dificil (Ish-Shalom-Gordon et al., 1993; Parker and Riches, 1993; Ruso et al., 1996; Sukno et al., 1999; Roman et al., 2001).

Metodele de combatere a lupoaiei utilizate la momentul actual nu permit eradicarea totala a parazitului, plus la aceasta unele dintre ele sunt duntoare mediului nconjurtor. O alternativ este utilizarea culturilor rezistente la lupoaie, reprezentnd o metod efectiv, economic i o soluie ecologic (Sackston, 1992; Ruso et al., Parker C. 19941996; Sukno et al., 1999; Lu et al., 2000; Echevarra-Zomeno et.al., 2006). 1.3. Tipurile de rezisten i mecanismele reaciei de rspuns

a plantelor fa de agentul patogen

Dei plantele nu posed beneficiile unui sistem de anticorpi circulator, caracteristic regnul animal, acestea n cursul evoluiei i-au creat un sistem de aprare de o eficacitate nalt, capabil s reziste la atacul potenialilor invadatori (Mysore and Ryu 2004; Chisholm et al. 2006; Jones and Dangl 2006). Aceast rezistena reprezint un proces complex multifactorial, ce depinde de o serie de factori, precum:

a) specia, varietatea i populaia din care face parteplanta-gazd;

b) specia i rasa sau populaia parazitului;

c) factorii de mediu abiotici sau biotici (Cubero et al., 1994).

Strategia potenial de aprare a plantei-gazd contra plantelor parazite include mecanisme care blocheaz stadiile de dezvoltate ale parazitului precum: germinarea, formarea apresoriumuluii ataamentul; inducia haustorului, penetrarea esuturilor vegetale de ctre parazit i conectarea acestuia la sistemul vascular, dezvoltarea, rsrirea, creterea i nflorirea (Jorrin, 1999; Serghini, 2001). La plantele rezistente aceste mecanisme funcioneaz la stadiile timpurii de dezvoltare ale antofitelor (Lane, 1997; Goldwasser, 1999). Dei bazele moleculare ale rezistenei plantelor la antofite nc rmn a fi elucidate, totui n literatura de specialitate au fost descrise cteva mecanisme, grupate n dou categorii mari pre-haustoriale i post-haustoriale (Lozano-Baena, 2007).

n ultimul timp, se acord o atenie mare studierii aspectelor citologice ale rezistenei plantelor la antofite (Dorr 1994; Antonova and Ter Borg, 1996; Gowda., 1999; Goldwasser., 2000; Labrousse., 2001; Zehhar., 2003; Perez-de-Luque., 2005b, 2006a, 2006b). Au fost studiate barierele fizice (lignificarea esuturilor) care mpiedic penetrarea rdcinilor de nut, bob, mazre, mzriche, rapia, morcov, floarea-soarelui de ctre speciile Orobanche O. crenata, O. aegyptiaca, O. cumana, O.ramosa. Mecanismele defensive pre-haustoriale depistate n cortex (Echevarra-Zomeno., 2006; Perez-de-Luque., 2006a, 2007b) sau n endodermis (Perez-de-Luque, 2005b, 2005c, 2006a, 2007b) previn ptrunderea haustorului n cilindrul central. Dac totui haustorul ptrunde n cilindrul central, se declaneaz un mecanism defensiv post-haustorial cum ar fi acumularea unui strat de clei vegetal (mucilage) (Perez-de-Luque et al., 2005a, 2006b).

Un mecanism defensiv post-haustorial al plantelor la atacul plantelor-parazite este producerea i acumularea de fitoalexine (Goldwasser , 1999;Serghini, 2001; Perez-de-Luque., 2005a; Echevarra-Zomeno., 2006; Lozano-Baena., 2007). Secretarea de fitoalexine la floarea-soarelui precede inducia haustorului, are loc n perioada de formare a apresoriumului pe rdcini i se ncheie dup distrugerea acestuia.

S-a stabilit c att la atacul de microorganisme patogene, ct i la cel al Orobanche, la plante se declaneaz n mare parte mecanisme similare de aprare (Joel and Portnoy, 1998; Westwood et al., 1998; Goldwasser et al., 1999) aa ca: sinteza i secretarea de ctre planta-gazd a inhibitorilor de germinare i dezvoltare a antofitelor(Serghini., 2001); creterea coninutului de fitoalexine (compui fenolici) n rdcinile plantelor-gazd (Wegmann, 1991; Lane , 1997; Westwood, 1998; Serghinit, 2001; Eizenberg., 2001; Lozano-Baena, 2007); necotizarea celulelor n jurul locului de ptrundere a haustorului, fapt care previne dezvoltarea ulterioar a acestuia (Dorr., 1994; Lane,1997; Goldwasser, 1997; Goldwasser., 1999); depozitarea carbohidrailor i fenolilor pe peretele celular, lignificarea vaselor xilemei sau a endodermisului, formarea unui strat ncapsulat pe parenchima cortical (Drr, 1994; Antonova, 1994; Ish-Shalom Gordon, 1994; Goldwasser, 1999; Labrousse., 2001; Perez-de-Luque, 2005c, 2006b); inducia de proteine PR- (Hammond-Kosack and Jones, 1996; Joel and Portnoy, 1998; Castillejo, 2004); creterea activitii unor enzime specifice, ca de exemplu a peroxidazei (Goldwasser, 1999; Prez-de-Luque., 2005a); depozitarea calusului i producerea de forme active de oxigen (Perez-de-Luque et al.,

HYPERLINK "http://jxb.oxfordjournals.org/cgi/content/full/57/15/4189" \l "BIB32#BIB32" 2006a).

Reacia plantei-gazd la atacul agenilor patogeni se clasific dup cteva criterii. Unul din aceste criterii, frecvent menionat n literatura de specialitate este criteriul funcional, conform cruia rezistena poate fi nespecific i specific (Day, 1974).

1.3.1. Rezistena nespecific i indus

Rezistena nespecific (nonhost resistance) mai este numit general sau constitutiv i se manifest n mod egal fa de toate rasele sau biotipurile agentului patogen. Acest tip de rezisten este cea mai comun, general, durabil i stabil form de rezisten (Heath 2000; Thordal-Christensen 2003; Jones and Takemoto 2004) i se clasific n dou tipuri:

tipul I, fr simptome vizibile i

tipul II, asociat cu reacia hipersensibil, ca rezultat a aciunii moleculelor asociate cu patogenul PAMP (pathogen-associated molecular pattern) (Mysore and Ryu 2004).

Rezistena nespecific cuprinde o varietate de mecanisme, unele dintre care sunt preformate, iar altele sunt induse (Dangl and Jones 2001; Thordal-Christensen 2003; Jones and Takemoto 2004; Mysore and Ryu 2004; Chisholm et al. 2006).

Mecanismele de aprare preformate sunt determinate att de barierele mecanice asigurate de epiderm, cuticul, deschiderile naturale, peretele celular i citoscheletul, ct i de compui antimicrobieni existeni deja n plant (Heath 2000; Dixon 2001; Agrios 2005; Nrnberger and Lipka 2005; Halkier and Gershenzon 2006). n calitate de compui antifungici/antimicrobieni servesc o varietate mare de metabolii secundari cu masa molecular mica aa ca: saponinele, fenolii, acizi ciclici hidroxaminici, glicozidele, izoflavonoidele (Dixon 2001; Mysore and Ryu 2004; Nrnberger 2004). Metaboliii respectivi sunt prezeni n plantele sntoase n form activ (Papadopoulou et al. 1999) sau sub form de derivaii inactivi, care sufer transformri ca rspuns imediat la atacul patogenului (Halkier and Gershenson 2006). Odat ce agentul patogen sau elicitorii acestuia au ptruns n apoplastul celulelor, planta-gazd iniiaz un rspuns imediat de aprare mediat de PAMP ca mecanism de baza a rezistenii (Mysore and Ryu 2004; Nrnberger et al. 2004;Nrnberger and Lipka 2005; Zipfel and Felix 2005; Melotto et al. 2006).

Mecanismele de aprare indus (rezistena indus) se manifest att la nivel structural, prin formarea unor structuri histologice ca: suberul, tilozele, ligninele i gomele, ct i la nivelul biochimic prin: schimbarea pH-ului sucului celular (n mediu acid), modificarea presiunii osmotice, chimiotropismului, sinteza alcaloizilor, heteroauxinelor, fitoncidelor, fenolilor etc. Mecanismele rezistenei induse a plantelor au rol de a recunoate, neutraliza, imobiliza sau degrada agentul fitopatogen (Prvu 1988)

1.3.2. Rezistena specific gazdei.Rezistena specific a gazdei este rezistena genotipurilor, limitat la o specie particular de patogeni, strns asociat cu recunoaterea dup mecanismul gen pentru gen i nsoit de reacia de hipersensibilitate (Dangl and Jones 2001; Martin et al. 2003; Nimchuk et al. 2003; Alfano and Collmer 2004;Mysore and Ryu 2004). Rezistena specific la rndul su poate fi de tip local i rezistena sistemic dobndit (Ryals et al. 1996).

Rezistena local

Rezistena local se asociaz cu un ir de procedee fiziologice i biochimice aa ca: stresul oxidativ, inducerea fluxului de ioni de H+, K+, Ca2+, Cl- prin membrana plasmatic, fosforilarea i defosforilarea proteinelor, biosinteza proteinelor implicate n producerea moleculelor de semnalizare aa ca acidul salicilic, acidul jasmonic, etilena, la fel i acumularea de proteine PR- i a unor metabolii secundari de aprare (Dixon. 1994;Glazebrook and Ausubel 1994; Dangl, 1996; Hammond-Kosack and Jones 1997; Jab. 1997; Ligterinkl. 1997; Heo. 1999; Asai. 2002; Cheng. 2002).

Stresul oxidativ i rspunsul imun hipersensibil

Stabilirea unui echilibru de via dintre patogen i planta-gazd nu este chiar att de simpl, ntruct planta n procesul de evoluie i-a format capacitatea de a recunoate patogenul i de a rspunde la prezena acestuia prin stres oxidativ (Levine et al., 1994; , , 2001; Duca et al., 2007) sau prin iniierea unui rspuns imun hipersensibil (HR, hypersensitive response).

Stresul oxidativ este rezultatul formrii n esuturile atacate de ctre patogen a formelor active de oxigen (FAO) sau specii reactive ale oxigenului (SRO) aa ca: H2O2, radicali OH- i O2-. n condiii normale, SRO sunt rapid eliminate de sistemul enzimatic a celulelor ce permite astfel meninerea unei homeostaziei-redox normale (Apel and Hirt 2004). ns, la dereglarea acestei homeostazii, producerea de SRO se accelereaz (Lamb and Dixon 1997; Apel and Hirt 2004). n celulele vegetale, FAO se formeaz i pe ci metabolice alternative, astfel producerea H2O2 n apoplast poate fi mediat de peroxidazele peretelui celular, oxalat oxidazele sau aminooxidazele (Apel and Hirt 2004; Mittler et al. 2004).

Formele active ale oxigenului sunt att nite compui toxici capabili s localizeze infecia prin moartea celulelor infectate, ct i nite transductori de semnale. Astfel, superoxid-anionul (O2-) i H2O2 activeaz transcripia i respectiv expresia genelor de rezisten (Levine et al., 1994; Tenhaken et al., 1995). SRO stimuleaz producerea acidului ascorbic, -tocoferolului i a carotenoizilor (Gille and Siegler, 1995), activeaz genele care codific enzime antioxidante protectoare glutation-S-transferaza i glutation peroxidaza (Levine et al., 1994; Tenhaken et al., 1995), superoxiddismutaza i catalaza (Larson, 1995), particip la ntrirea peretelui celular prin inducerea sintezei de glicoproteine bogate n hidroxiprolin, de celuloz i de lignin; n sinteza de proteine implicate n patogenez, difuzia H2O2 n celulele vecine focarului de infecie activeaz producia de acid salicilic i declaneaz rspunsul de aprare sistemic (Sharma 1996).O alt reacie de rspuns la creterea concentraiei de SRO n esuturile plantei este sinteza proteinelor de oc, care protejeaz sistemul enzimatic celular mpotriva proceselor oxidative (Burdon, 1993; Orozco and Glijin, 2006).

Deci, rspunsul hipersensibil este o form de moarte celular programat, o consecin a reprogramrii metabolismului n celulele nconjurate de infecie pentru a stopa rspndirea patogenului (Lamb et al., 1989). Planta reacioneaz la anumii markeri organici ai celulei microorganismului (acizi grai, fragmente de membrane celulare) sau la peptide specifice caracteristice pentru anumite rase de patogeni. n ultimul, caz inducia reaciei HR este controlat de gene specifice de avirulen i rezisten. Hipersensibilitatea nu este un mecanism izolat, el fiind nsoit de o cascad de evenimente ca: variaia potenialului membranar; acidificarea mediului intracelular, influx de Ca2+ i H+ (activate de ATP-aze) corelat cu un eflux de Na+ i o deschidere a canalelor pentru Cl- ; eliberarea de specii active de oxigen (anionii O2- ,OH- i H2O2) i activarea secvenelor implicate n producerea lor (activare de kinaze, fosfataze, fosfolipaze) (Dangl J., 1994); se induce activarea proteinelor G (Low P. 1995) i a peroxidazelor (Nrnberger T., 1994).Rezistena sistemic dobndit

Rezistena sistemic dobndit (SAR - systemic acquired resistance) sau imunitatea dobndit reprezint o reacie de aprare a plantelor, care determin o rezisten la infeciile repetate ale unui spectru larg de patogeni (Uknes et a., 1992; ., 2000). Ptrunderea patogenului n esutul plantei reprezint un semnal pentru apariia unei reacii de tip SAR. Condiia esenial a apariiei reaciei - SAR este formarea necrozelor n rezultatul atacului patogenului. Reacia SAR este asemntoare cu rspunsul hipersensibil, ns viteza desfurrii reaciei - SAR i spectrul patogenilor la care planta devine rezistent este mai mare (Uknes et a., 1992).

Acest tip de rezisten se manifest prin sporirea rezistenei plantei la infectarea repetat cu patogeni micotici, bacterieni, virali i insecte-fitofage. Durata SAR dup infectarea primar constituie de la cteva sptmni pn la cteva luni ( ., 2000).

Imunitatea sistemic dobndit a plantelor este determinat de expresia unui ir de gene specifice, denumite SAR- gene. Expresia genelor specifice SAR ca rspuns la infecia cu ciuperci, bacterii i virusuri a fost identificat la diferite specii dicotiledonate, ns gradul de expresie, ct i homologia dintre genele corespunztoare la diferite specii de plante este diferit. De exemplu, la castravete, gena care codific PR-1 se expreseaz slab, n timp ce la tutun i arabidopsis aceast protein SAR- specific este principal. Acest lucru i-a i permis cercettorilor s delimiteze reacia-SAR din ntregul arsenal al reaciilor chimice de aprare a plantelor (Ryals et al., 1996).

Cercetrile reaciei -SAR se realizeaz pe dou modele vegetale tutun (Nicotiana tabacum) i arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Analiza proteinelor implicate n reacia - SAR arat c multe dintre ele fac parte din grupul de proteine PR- (Ryals et al., 1996), caracteristice pentru rspunsul hipersensibil. La tutun, de exemplu, n grupul proteinelor SAR intr urmtoarele proteine PR-: PR-1, (PR-1a, PR-1b, PR-1c), -1,3-glucanaze, (PR-2a, PR-2b, PR-2c, PR-Q), chitinazele din clasa II i III (PR-3a i PR-3b), tevein-proteinele (PR-4a i PR-4b), tomatin-proteinele (PR-5a, PR-5b) (Hammond-Kosack KE, Jones J.,1996). La Arabidopsis, proteinele SAR- sunt: PR-1, PR-2 i PR-5 (Ryals et al., 1996). Inductorii reaciei - SAR

n prezent, reaciei SAR i se atribuie un set de cai de transducere a semnalelor, care se declaneaz la aciunea patogenului i sunt realizate de molecule de semnalizare (inductori) aa ca acidul salicilic (AS), acidul jasmonic (AJ), etilena (ET), H2O2, NO i acid adscizic (Apel and Hirt 2004; Gfeller and Farmer 2004; Durrant and Dong 2004; Mittleret al. 2004; Dolledonne 2005; Lorenzo and Solano 2005; Torres and Dangl 2005; van Loon et al. 2006).

Acidul salicilic (AS) joac un rol principal n inducia imunitii sistemice (Durner et al., 1997). AS reprezint un inductor chimic al rezistenei plantelor la bolile provocate de ctre ciuperci, bacterii, virusuri i al sintezei proteinelor PR- la multe specii de plante (Reymond and Farmer, 1998; Sudha and Ravishankar, 2002; Kusumoto, 2007). Tratarea exogen a plantelor cu AS sau cu analogii acestuia activeaz genele HR i SAR. Astfel, plantele transgenice de tutun cu gena nahG, al crei produs este responsabil pentru transformarea AS n catehol inactiv sunt lipsite de capacitatea de imunizare (Ryals, 1996; , 2000; Hurtado, 2004). n contrast, plantele de tutun transgenic cu genele bacteriene ICS (isochorismate synthase) i PIL (piruvat-liazele) la care se sintetizeaz n cantiti mari AS manifest o rezisten nalt la diferii patogeni (Verberne et al., 2000). Aplicarea exogen a analogilor sintetici AS ca BTH (S-metil benzo[1,2,3] tiadiazol-7 - carbothioic) de asemenea induc reacia-SAR (Friedrich, 1996).

Infectarea plantei de ctre un patogen incompatibil induce acumularea de AS att n esuturile infectate, ct i n cele neinfectate. AS provoac sinteza local a diferitelor substane antimicrobiene (fitoalexine, fenoli, proteine PR-) i stimuleaz ntrirea pereilor celulari. Surplusul de AS este transformat ntr-un conjugat neactiv al AS cu glucoz, care la infectarea repetat a plantei se hidrolizeaz pn la AS liber. Creterea coninutului de AS activeaz genele specifice SAR i determin dezvoltarea imunitii sistemice ( ., 2000)Acidul jasmonic (AJ) reprezint un inductor suplimentar al reaciei -SAR, induce rezistena mpotriva insectelor (McCorn., 1997) i patogenilor (Thomma., 1998; Wang., 2002; Lorenzo, 2003; Dong, 1998). AJ i derivaii acestuia induc sinteza sisteminei i a inhibitorilor proteazelor serinice. Controlul nemijlocit al expresiei genelor inhibitoare de proteaze este realizat de ctre peptidul sistemina, iar expresia genei sisteminei se afl sub controlul acidului jasmonic (Farmer and Ryan, 1990).

Jasmonaii sunt compui volatili, capabili s declaneze reacii de aprare att n esuturile vecine ale plantei infectate, ct i n plantele vecine intacte. Astfel, acidul jasmonic este capabil s asigure un contact dintre indivizii din cadrul unei populaii. Jasmonaii fiind responsabili pentru gradul de rezisten a plantelor la fitofagi nu reprezint unicele molecule semnal al reaciei -SAR ntruct nu exercit o influen asupra expresiei unui ir de HR i SAR gene. Ambii inductori AS i jasmonaii regleaz procese metabolice distincte i funcioneaz n plante paralel (Reymond and Farmer, 1998; Thomma et al., 1998).

Etilena (ET) de asemenea este implicat n rspunsul imun, dei rolul acesteia variaz n funcie de tipul patogenului i specia de plant (Wang., 2002). n general, ET se consider a fi implicat n perceperea atacului unui patogen i inducerea expresiei genelor asociate cu aprarea (Dong 1998; Wang. 2002) i fiind caracteristic doar pentru anumite interaciuni gazd-parazit (van Loon, 2006). n plus, unii patogeni sunt capabili sa produc ET ca un factor virulent, ce sporete capacitatea parazitului de a coloniza esuturile gazdei (Chagu, 2006). Interaciunea dintre AJ i ET a fost demonstrat n cursul mecanismelor de aprare a plantei la atacul patogenilor (Penninckx., 1998). Unul din produsele finale ale cii de transducere AJ/ET n cursul atacului de patogeni este un polipeptid cu mas molecular mic, cu proprieti antifungice i un coninut nalt de cistein (Penninckx et al., 1996).1.3.3. Mecanisme fiziologo-biochimice de rezisten a florii-soarelui la lupoaie

La floarea-soarelui de asemenea au fost identificate unele din mecanismele de aprare care blocheaz dezvoltarea lupoaiei la diferite stadii (Dorr , 1994; Jorrin., 1999; Serghini, 2001; Eizenberg, 2001; Labrousse, 2001; Echevarra-Zomeno, 2006). Sinteza, acumularea i secreia compuilor chimici este un mecanism important de protecie a plantelor mpotriva microorganismelor, insectelor, buruienilor i plantelor parazite (Rice, 1974; Murray, 1982; Wilson and Rice, 1968; Wegmann., 1991; Urdangarin., 1999). Astfel, s-a stabilit c 7-hidroxil cumarinele (scopoletina i ayapina) florii-soarelui au un rol defensiv mpotriva O. cumana prevenind germinarea i inducia haustorului. Cumarinele sunt metabolii secundari polifuncionali (Jorrin and Prats, 1999), din grupul fitoalexinelor (Tal and Robeson, 1986), ele pot aciona ca compui alelochimici atunci cnd mpiedic germinarea seminelor de lupoaie sau ca fitoalexine atunci cnd stopeaz ptrunderea haustorului i conectarea acestuia de sistemul vascular al plantei (Khadija Serghini i al., 2001).

Un rol important n procesul de consolidare a peretelui celular la atacul plantelor parazite l au peroxidazele i proteinele PR- (Hammond-Kosack and Jones, 1996). Cercetrile efectuate de Antonova i Ter Borg (1995) au demonstrat c la rasele mai virulente de O. cumana se atest un nivel sczut de peroxidaz n celulele rdcinii parazitului (Antonova i Ter Borg (1995). Acesta posibil se explic prin faptul c peroxidaza secretat de ctre planta-parazit poate fi folosit de floarea-soarelui pentru polimerizarea compuilor fenolici n lignin i respectiv la lignificarea peretelui celular (Mayer et al., 1997). Aadar, coninutul sczut de peroxidaza la rasele mai agresive de lupoaie reprezint un factor care faciliteaz ptrunderea haustorului n esutul vegetal al plantei-gazd (Goldwasser et al., 1999).

Alt mecanism de protecie care mpiedic ptrunderea haustorului n cortex i dezvoltarea ulterioar a plantei parazite este rspunsul hipersensibil asociat de moartea programat a celulelor infectate (Lamb et al., 1989). Acesta a fost studiat, la floarea-soarelui atacat de Orobanche cumana (Drr et al., 1994), precum i la mzrichea (Vicia athropurpurea) atacat de O. aegyptiaca (Goldwasser et al., 1997)

Aadar, au fost studiate i analizate trei mecanisme principale de rezisten a florii-soarelui la lupoaie (Fernandez-Martinez., 2008):

1) producerea deficient de ctre rdcinile plantei-gazd a stimulatorilor de germinare a seminelor de Orobanche;

2) existena barierelor mecanice sau chimice care stopeaz ptrunderea haustorului n rdcina plantei-gazd (lignificarea sau rspunsul imun hipersensibil);

3) acumularea de compui toxici (fenoli) care opresc creterea i dezvoltarea haustorului i conectarea acestuia cu sistemul vascular al plantei-gazd.

1.4. Aspecte genetice ale rezistenei plantelor fa de agentul patogen

Unul din factorii primordiali care condiioneaz rezistena plantelor fa de agenii patogeni este cel genetic. Plantele definite ca rezistente sunt cele a cror expresie genetic reduce sau previne dezvoltarea agenilor patogeni. Din punct de vedere genetic, rezistena poate fi: oligogenic, poligenic i citoplasmatic (Prvu 1988 ).

Rezistena oligogenic (vertical) este determinat de o singur gen sau de cteva gene majore. Acest tip de rezisten asigur o protecie total i complet a plantelor mpotriva atacului unei rase a agentului patogen (Van der Plank, 1963).

Rezistena poligenic (orizontal, nespecific) este general i se manifest n mod egal fa de toate rasele agentului patogen. Aceast rezisten este determinat de un numr mare de gene minore, care sunt nespecializate, au efect individual slab i acioneaz aditiv. Rezistena orizontal nu asigur o protecie complet a plantelor fa de atacul agenilor patogeni, n schimb este durabil i stabil. Acest tip de rezisten nu dispare ca urmare a schimbrilor ce apar n populaia agentului patogen (Van der Plank, 1975).

Rezistena citoplasmatic este determinat de materialul genetic (citoplasmogene) care se conine n citoplasma celulei (Pirvu 1988).

Echilibrul gazd-parazit se menine indiferent de schimbarea factorilor de mediu, deoarece ambele organisme se adapteaz concomitent la noile condiii ecologice. De altfel, genele pentru rezisten ale plantei gazd i cele pentru virulen ale patogenului evolueaz mpreun i formeaz constelaii de gene bine conturate (Dangl and Jones, 2001).

Conceptul de rezisten mediat de genele de rezisten R- (de la R-resistance) a fost introdus de ctre Flor n 1956 (Hurtado, 2004), n rezultatul studierii aspectelor genetice a interaciunii dintre planta de in i ciuperca Uredinales. Conform ipotezei gen pentru gen plantele au capacitatea de a produce proteine R-, care recunosc factori specifici ai patogenului (efectori) codificai de ctre genele avr- patogenului (Lamb, 1989; Dangl and Jones, 2001), deci fiecrei gene pentru susceptibilitate sau rezisten din planta gazd i corespunde o gen pentru virulen sau avirulen din parazit. n mod obinuit, genele pentru rezisten ale plantei gazd sunt dominante (R) i acelea pentru susceptibilitate sunt recesive (r). Genele responsabile de avirulena patogenului sunt dominante (A) i cele care determin virulena (a) sunt recesive (Flor, 1956).Conform ipotezei gen pentru gen, sunt posibile patru combinaii de gene n interaciunea gazd-parazit. Combinaiile de gene R-a, r-A i r-a determin reacii compatibile, ntr-o singur combinaie de gene R-A, rezult o reacie incompatibil n sistemul gazd-parazit i nu se produce infecia (Prvu 1988 ).

1.4.1. Rezistena plantelor mediat de genele R- i reacia de hipersensibilitaten interaciune gazd-parazit, rezistena plantelor cultivate se refer la modelul gen pentru gen (Flor 1971; Staskawicz, 1995), rezistena fiind determinat de o singur gen R-, produsul creia direct sau indirect interacioneaz cu elicitori specifici sintetizai de genele de avirulen a patogenului (Flor 1971; Hammond-Kosack and Jones 1997; Nimchuk 2003). Rezistena condiionat de genele R- este specific, unde majoritatea acestora recunosc una, mai rar dou, molecule specifice codificate de genele avr- ale patogenului (Nimchuk et al., 2003). Funciile tuturor genelor R- i aspectele genetice ale interaciunii R-avr nc nu sunt pe deplin elucidate, ns se presupune c proteinele R- nu recunosc moleculele de virulen ale patogenului direct, ci schimbrile care au loc n celulele plantei-gazd cauzate de patogen (produsele activitii enzimatice ale avr-proteinelor). Aceast presupunere guard hypothesis dei nu are suficiente probe, reprezint un gid n interpretarea rezultatelor experimentelor (Dangl and Jones, 2001).Genele de rezisten prezint o structur foarte bine conservat n cadrul diverselor specii de plante i sunt clasificate n trei clase, n funcie de structura domeniilor pe care le codeaz. Majoritatea genelor de rezisten codific domenii bogate n leucin (Gebhardt 1997, Hammond-Kosack and Jones 1997).Cercetrile genetice au demonstrat c familiile de gene R- reprezint o parte considerabil din genomul plantelor (Nimchuk et al., 2003). Se estimeaz c genomul de Arabidopsis are cca. 125 de gene de tip R-, iar la plantele de orez, cca. 600 de gene R-(Dangl and Jones, 2001).Cea mai numeroas clas de gene R- codific proteinele NBS-LRR (nucleotide-binding site plus a leucinerich repeat sequence), care sunt proteine de tipul receptorilor, caracterizate prin prezena unui situs N-terminal de legare a nucleotidelor (NBS), secven care are rol de a lega ATP i/sau GTP n diverse protein-kinaze i captul C-terminal, care este o secven structural specific alctuit din 20-30 aminoacizi de leucin (LRR). Structurile de tipul LRR particip la interaciuni de tip protein-protein (Kobe, Deisenhofer 1995, Jones 1996). Un grup aparte a acestei clase sunt proteinele NBS-LRR- cu un domen distinct N-terminal omolog cu domeniile Toll la drozofil i cu gena receptorului la mamifere interleucin (IL) -1 (TIR) (Nimchuk et al. 2003). Genele NBS-LRR sunt capabile s produc mai muli transcripi n cadrul fenomenului de splicing alternativ i respectiv, s codifice diferite tipuri de proteine-NBS-LRR. Varietatea de transcripi sintetizai de ctre genele TIR-NBS-LRR tipul N a fost identificat la tutun n cadrul infectrii cu virusul mozaicului de tutun TMV (- tobacco mosaic virus) (Dinesh-Kumar, Baker, 2000).

O alt clas de gene R- codific proteine extracitoplasmatice bogate n leucin LRR (a leucinerich repeat sequence), structur ce are un rol important n interaciunile de tip enzim-inhibitor (Dixon 1994, Jones 1994). Ca exemplu pot servi gena Cf2 ce confer rezistena toatelor fa de Cladosporium fulvum (Dixon 1994) i gena Xa21, de la orez, ce confer toleran la Xanthomonas oryzae (Song 1995). Un alt grup, sunt genele RPS2 i RPM1 de la Arabidopsis, ce conin domenii de tip leucin-zipper (Alber T., 1992).

Un rol n transmiterea informaiilor primite de plante are loc prin cascade de transducie (fosforilare i desfosforilare), n care sunt implicate genele pto i fen. Familia de gene pto i fen joac au Gena Pto confer rezisten tomatelor fa de Pseudomonas syringae (Martin 1993), iar gena Fen confer sensibilitate la insecticidul Fentihon ( Hammond-Kosack and Jones 1997).

Genele R- nu sunt localizate pe cromozomi la ntmplare (, , 2001). Sunt cunoscute trei tipuri de amplasare: singular dialel - ocup un singur locus, cu dou alele, unde genele R- controleaz susceptibilitatea i rezistena plantelor. Rezistena, de regul, se transmite prin ereditate ca un caracter dominant

singular polialel posed un locus cu mai multe alele codominante, alelele multiple determinnd rezistena la diferite specii i rase de patogeni; nlnuit - un numr mare de locusuri di- i polialelice nlnuite, aceste locusuri alctuiesc clustere de gene similare fenotipic care determin rezistena la una sau cteva boli (, , 2001).

Clusterii de gene nlnuite se formeaz n urma crossing-overului intragenic i intergenic la moleculele de ADN care au secvene repetitive drepte (bd - bd) sau invertate (bd - dba). n urma crossing-overului inegal, la un genitor are loc deleia unui sector cromozomal, iar la al doilea genitor are loc duplicarea sectorului cromozomal i prin urmare din o gen se formeaz dou gene nlnuite. Cel mai mare interes l prezint sectorul LRR al proteinelor R- cu secvene nalt repetitive. Datorit mutaiilor genice, mutaiilor structural cromozomale (deleii i inversii), sectorul -LRR se caracterizeaz printr-o mare variabilitate genetic (Ellis and Dodds, 2000). S-a demonstrat experimental c mutaiile care modific reacia la infectarea cu rase avirulente de patogeni sunt cartate n sectorul -LRR (Dangl and Jones, 2001).

O caracteristic vizibil a interaciunii de tip R-Avr este reacia hipersensibil (HR) care este nsoit de un stress oxidativ i intensificarea expresiei genelor implicate n aprare sau genele asociate cu patogenii PR- (de la pathogene related genes) care blocheaz rspndirea patogenului n plante (Goodman and Novacky 1994; Staskawicz, 1995; Dangl, 1996; Hammond-Kosack and Jones 1997; Lamb and Dixon 1997; Rubiales et al., 2003b; Prez-de-Luque et al., 2005c). Proteinele codificate de genele PR- posed un grad nalt de similaritate structural, pe cnd majoritatea proteinelor de tip Avr- arat o omologie redus sau lipsa acesteia (Schornack, 2006). Aplicarea metodelor proteomicii a relevat faptul c n urma atacului plantelor cu Orobanche, n afar de expresia genelor PR- (Joel and Portnoy, 1998), n urma atacului sunt expresate o serie de gene i accelerate mecanisme fizioloice ca reacie de rspuns, precum este gena ce codific enzima chitinaza (Castillejo et al., 2004; Vieira Dos Santos et al., 2003.), majorarea activitii peroxidazei i coninutului de compui fenolici (Serghini et al., 2001; Echevarra-Zomeo et al., 2006; Goldwasser et al., 1999; Prez-de-Luque et al., 2005a), inducerea sintezei fitoalexinelor (Serghini et al., 2001PRIVATE "TYPE=PICT;ALT=Go"INCLUDEPICTURE \d "/icons/fig-down.gif"

), liagnificarea (Goldwasser et al., 1999; Majorarea activitii unor enzime specifice a fost relatat i la utilizarea plantei-model Medicago truncatula infectat cu Orobanche i analiza proteinelor n gel 2D i MALDI-TOF mass spectrometrie a atestat sinteza n planta gazd a enzimelor metabolismului carbohidrailor, proteinkinazelor, chitinazei, ascorbatperoxidazei etc. (M.A. Castillejo, E. Dumas-Gaudot.....). Mecanismele de aprare ale plantei n faa potenialelor patogeni sunt de o mare complexitate. Pentru amorsarea unui singur mecanism este necesar activitatea sau biosinteza de novo a mai multor enzime, care la rndul lor genereaz producerea sau unei multitudini de metabolii. n plus un singur metabolit poate fi utilizat de mai multe ci metabolice, a cror int final nu induce acelai tip de rspuns de aprare. Planta are capacitatea de a activa mecanismul de aprare optim. Rspunsul de aprare este influenat de stadiul fiziologic al plantei, de tipul agresorului, de intensitatea i durata atacului i nu n ultimul rnd de condiiile din mediul nconjurtor (Ni-Lazr M., 1998). 1.4.2. Genetica rezistenei florii-soarelui fa de lupoaie

n procesul evoluiei apar rase virulente noi de lupoaie, care infecteaz soiurile i hibrizii de floarea-soarelui. Selecia formelor de floarea-soarelui rezistente la lupoaie a constituit o preocupare de baz nc de la nceputul secolului XX, cnd n 1928, formele cultivate de floarea-soarelui rezistente la rasa de lupoaie A (Kruglik A-41 i Saratovsky 169) au fost atacate de ctre o ras nou de lupoaie, foarte virulent de tip B (Pustovoit, 1976; Parker and Riches, 1993). ns, elucidarea existenei factorilor genetici de rezisten la lupoaie n cadrul genomului florii-soarelui cultivate a uurat munca amelioratorilor n obinerea formelor mai rezistente de floarea-soarelui. Identificarea determinismului genetic al mecanismelor de rezisten la factorii biotici i abiotici, precum i elaborarea markerilor moleculari utili n selectarea formelor rezistente la plante de cultur constituie o problem actual. Primele surse bibliografice privind existena unui substrat genetic al rezistenei genetice a soiurilor locale de florea-soarelui fa de Orobanche au fost identificate n Rusia, n anul 1916 (Pustovoit, 1966; Parker and Riches, 1993), iar primul studiu genetic al rezistenei la lupoaie i stabilirea dominanei imunitii n F1 i segregarea mendelian n F2 a fost efectuat n 1921, de ctre Placek, care a concluzionat asupra tipului monogenic de rezisten la rasa A de lupoaie (Placek, 1921). Deja ctre anul 1935, au fost create soiurile Jdanov 8281 i Jdanov 8885 rezistente la rasa B, pentru ca apoi, gena de rezisten la rasa B s fie transferat la formele de floarea-soarelui cu coninut ridicat de ulei Peredovik i VNIIMK 1646 (Melero-Vara et al., 1989; Fernandez-Martinez et al., 2000).

ns, la nceputul anilor 60 ai sec. XX, plantele ce posed genele de rezisten la rasele A i B au fost atacate de ctre o ras nou a lupoaiei, rasa E, care reprezint un complex de la 17 pn la 22 de subrase foarte virulente (Petrov, 1968; Melero-Vara et al., 1989). Problema s-a complicat, cnd n anul 1995, n Spania a fost identificat o ras nou de lupoaie virulent, rasa F (Alonso et al., 1996; Dominguez, 1999), rezistena fa de care a fost depistat att la formele cultivate, ct i la cele slbatice de floarea-soarelui (Sukno et al., 1999; Fernandez-Martinez et al., 2000; Rodriguez-Ojeda et al., 2001). De asemenea, recent a fost descoperit o ras i mai virulent (G), care atac formele de floarea-soarelui rezistente la rasa F (Molinero-Ruiz and Melero-Vara, 2005).

Motenirea monogenetic i dominant a rezistenei fa de rasele de lupoaie a fost atestat n majoritatea studiilor genetice (Pogorletsky i Geshele 1976; Vrnceanu i al. 1980; Sukno i al. 1999). Pacureanu (2004), de asemenea, susine c rezistena la rasa F n Romnia este determinat de aciunea unei singure gene dominante (Pacureanu 2004).

Dup Vrnceanu (1980; 1986), se disting 5 rase fiziologice ale lupoaiei (notate de A la E) i respectiv 5 gene dominante de rezisten fa de acestea (Or1, Or2, Or3, Or4, i Or5). Analiza populaiilor segregante de floarea-soarelui a demonstrat faptul c genele (Or1 - Or5) sunt sau alelice sau strns nlnuite (Vranceanu et al., 1980, Ish-Shalom-Gordon et al., 1993; Sukno et al., 1998, 1999; Fernandez-Martinez , 2000). Rase virulente noi de lupoaie care atac plantele de floarea-soarelui ce posed genele Or1-Or5, n afar de Romnia (Pacureanu et al., 2004), au fost identificate n Bulgaria (Shindrova, 2006) i n Turcia (Kaya et al., 2004). n contrast cu rezistena derivat din sursele cultivate, rezistena la rasa F a populaiei BR-4, derivat din speciile slbatice este controlat de gena dominant Or6 (Perez-Vich et al., 2002). ns, cercetrile ulterioare au indicat o dominan incomplet a genei Or6 i prezen a altei gene Or7, a crei expresie depinde de mediu (Perez-Vich et al. 2002, 2004a; Velasco et al., 2006). Unele cercetri explic o motenire mai complex a caracterului, incluznd dou gene dominante (Dominguez, 1996b), una sau dou gene recesive (Ramaiah, 1987, Rodriguez-Ojeda et al., 2001; Akhtouch et al., 2002), epistazie recesiv dubl (Kirichenco i al. 1987), interaciune aditiv a genelor minore (Pogorlekii i Gheele, 1975), gene cu interaciune complimentar (Krohin, 1980), dou gene Or necumulative (Ciriaev, 1987), citoplasmogene (Paleev, 1983) sau chiar motenirea cantitativ (Pustovoit, 1966) sau de natur poligenic, cu o heritabilitate foarte redus (Cubero, 1994; Rubiales, 2003).

Folosind metode moleculare au fost cartate genele rezistenei florii-soarelui la rasele E i F de lupoaie. Gena Or5 care determin rezistena la rasa E a fost cartat n regiunea telomeric a grupului de linkaj (LG-3) a hrii genetice de floarea-soarelui (Lu et al., 2000; Tang et al., 2003; Perez-Vich et al., 2004b). Analiza locilor de tip QTL (de la quantitative trait loci) a artat c variabilitatea fenotipic a rezistenei la rasa E este determinat de un locus major QTL (ce corespunde cu gena Or5) asociat sau cu rezistena sau cu susceptibilitatea plantei, n timp ce rezistena la rasa F este controlat de cteva locusuri QTL cu efecte moderate, asociate cu numrul de tulpini de lupoaie pe planta-gazd (Perez-Vich et al., 2004b). La plantele leguminoase, mazre i bob, de asemenea, au fost detectate genele QTL de rezistena la Orobanche (Roman et al., 2002; Valderrama et al., 2004). Aceste rezultate sugereaz faptul c rezistena florii-soarelui la lupoaie are o component calitativ (responsabil sau de prezena sau de absena lupoaiei) i cantitativ (controleaz severitatea atacului de lupoaie numrul de tulpini pe planta-gazd). Doar cartarea genelor QTL pe hrile genetice, este insuficient pentru o selecie molecular rapid i eficient (Rispail et al., 2006).Identificarea markerlor SCAR (sequenced characterized amplified region) i SSR (simple sequence repeat) linkai cu gena Or5 care determin rezistena florii-soarelui la rasa E de O. cumana reprezint o direcie nou de perspectiv (Lu et al., 2000).

n afar de identificarea genelor care confer rezistena fa de lupoaie, un alt obiectiv const n identificarea procedeelor de transmitere a acestor caractere de la un genotip la altul. O surs important de obinere a noilor forme de floarea-soarelui ce posed rezisten la lupoaie reprezint formele slbatice, n special Helianthus tuberosus L. (Pustovoit, 1966; Vranceanu et al., 1980). Astfel, au fost create forme rezistente la Orobanche n rezultatul introgresiei genelor de rezisten de la Helianthus tuberosus L. la floarea-soarelui de cultur n fosta URSS i Romnia (Pustovoit, 1966; Vranceanu et al., 1980). n Spania, Ruso et al. (1996) i Fernandez-Martinez et al. (2000) au identificat la 29 de specii perene slbatice de floarea-soarelui forme cu un grad nalt de rezisten la rasele de lupoaie E i F (Ruso et al. (1996) i Fernandez-Martinez et al. (2000). Rezistena la lupoaie a fost depistat la speciile slbatice de floarea-soarelui i n alte ri (Pogorletsky and Geshele, 1976; Christov., 1996; kori, 1988). Aceste evaluri demonstreaz c speciile slbatice de Helianthus reprezint o surs bogat de gene de rezistena la noi rase virulente de lupoaie. Transferul de gene ale rezistenei la lupoaie de la speciile slbatice anuale de floarea-soarelui la formele cultivate se realizeaz prin ncruciri i back-crossuri, ct i cu utilizarea culturii in vitro, dublarea numrului de cromozomi n F1 i crearea de amfidiploizi (Jan and Fernandez-Martinez, 2002). ******Aadar, n rezultatul infectrii plantei de ctre un patogen biotrof se induce un ir de reacii de aprare, de diferit natur. Acestea la rndul su sunt implicate n mrirea rezistenei plantelor la infectarea curent sau ulterioar. Un rol important n imunizarea plantelor i revin unor semnale specifice, care se formeaz la infectarea primar a plantei i care sunt capabile s imunizeze esuturile care nu contacteaz cu patogenul, precum i factorul genetic, determinat de genele de rezisten i reacia de hipersensibilitate.CAPITOLUL II. OBIECTUL I METODELE DE CERCETARE

Investigaiile efectuate n scopul elucidrii particularitilor morfo-fiziologice, biochimice i genetice care caracterizeaz interaciunea dintre planta-gazd i parazit au fost realizate pe parcursul anilor 2006-2009 n cadrul laboratorului Securitate Biologic din Centrul de Cercetare tiine ale vieii, catedra Biologie Vegetal, Universitatea de Stat din Moldova i Centrul de Biologie Molecular a Universitii Academiei de tiine a Moldovei.

2.1. Obiectul de studiu i condiiile de cultivaren calitate de obiecte de cercetare au servit doi hibrizi de floarea-soarelui (Valentino i Xenia) i formele parentale ale acestora. Materialul semincer a fost oferit de Centrul de Cercetri tiinifice AMG-MAGROSELECT SRL, or. Soroca, n persoana D-lui Rotaru T., dr. hab. n biologie.

Analizei au fost supui un ir de caractere morfologice i fiziologice pentru determinarea formelor rezistente la lupoaie (Orobanche cumana Wallr.).

Studiile anterioare a acestor hibrizi i formelor parentale lor (A. Cpn, 2006), au relevat c indicii morfofiziologici cercetai (tabelul 2.1.) s-au caracterizat prin specificitate genotipic ce variau pe parcursul ontogenezei. Analiza comparativ a indicilor morfologici studiai la hibrizii de prima generaie (Xenia F1, Valentino F1) au demonstrat ca n majoritatea cazurilor genotipurile hibride se caracterizau prin valori superioare fa de formele parentale.

Tabelul 2.1.

Indici morfologici ai familiilor Xenia i Valentino n faza de nflorire

Nr. ordIndici morfologiciFamilia XeniaFamilia Valentino

F1F1

1.nlimea tulpinii n faza de nflorire i maturitate (cm)136/

14087/

88169/

175152/

153120/

121180/

183

2.Diametrul tulpinii n faza de nflorire (cm)2,21,631,91,82,2

3.Numrul de frunze28,327,529,529,839,932,3

4.Lungimea frunzei (cm)20192013,215,316,7

5.Limea frunzei (cm)18,916,519,112,814,115,9

6.Suprafaa foliar (cm2)498141685655221642234089

7.Durata ciclului de dezvoltare (zile)117107126119105127

Un alt indice important care a fost cercetat anterior la aceste genotipuri a fost indicele productivitii, producia de semine fiind determinat de urmtoarele componente: diametrul calatidiului, numrul de semine, masa a 1000 semine, coninutul procentual de miez n smn.

Din cercetrile recente (A. Cpn, 2006) s-a constatat ca hibrizii de prima generaie se caracterizeaz prin valori superioare ale diametrului inflorescenei, iar masa a 1000 semine i coninutul procentual de miez la aceti hibrizi au luat valori intermediare n comparaie cu formele parentale (tabelul 2.2.).

Tabelul 2.2.

Indicii productivitii familiei Xenia i Valentino

Nr. ordIndicii productivitiiFamilia XeniaFamilia Valentino

F1F1

1.Diametrul inflorescenei (cm)17,5215,2519,6415,4414,2018,15

2.Masa a 1000 semine (g)54,6379,2551,3367,5344,2656,2

3.Coninutul de miez (%)77,0262,6878,2282,4676,4879,89

Pentru evidenierea genei de rezisten Or5 au fost testate 54 de genotipuri: 27 linii necunoscute, 11 linii ASC, 10 hibrizi (Alcazar, Drofa, Favorit, Olea, Oxana, Performer, Turbo, Valentino, Vitalia, Xenia) i formele parentale a hibrizilor Drofa,Valentino i Xenia.

Cultivarea i infectarea florii-soarelui in vivo.Hibrizii Valentino i Xenia i formele parentale lor n primul an de studiu au fost infectate cu trei populaii de lupoaie din diferite regiuni geografice: Moldova, Rostov i Volgograd. Agentul patogen a fost oferit cu amabilitate de D-lui Rotaru T., dr. hab. n biologie - CC MAGROSELECT, or. Soroca.

Inocularea artificial a plantelor a fost efectuat n vase de vegetaie, n care s-a introdus mixtura de sol (nisip : turb, 1:1, v/v) uniform infectat cu semine de lupoaie (la 200 g amestec s-a adugat 30-40 mg semine) [Pancenko 1975]. Amestecul de sol a fost udat cu 100 ml ap i vasele au fost lsate 7 zile pentru precondiionarea seminelor de lupoaiei, dup care au fost plantate seminele de floarea-soarelui germinate timp de 2 zile. Dup 14-15 zile de cultivare plantulele au fost transferate n vase mai mari (cu volum de ). Vasele au fost expuse n camera de cultivare, la temperatura de 23-25C, fotoperiodicitatea de 14-16 ore, umiditatea de 60%.

n anul doi de cercetare, s-a studiat interrelaiile gazd - parazit - temperatur la aceeai genotipuri de floarea-soarelui. Genotipurile respective/date au fost infectate cu lupoaiei autohton, colectat de la plantele infectate de floarea-soarelui n vara anului 2006 din centrul Republicii Moldova. Seminele de lupoaie au fost separate de inflorescenele uscate i pstrate la ntuneric la temperatura camerei. Infectarea s-a efectuat conform recomandrilor [Pancenko 1975]. Vasele au fost expuse n camera de cultivare. Plantele au fost crescute la dou regimuri diferite de temperaturi: la temperatura medie de 15/14 C (aer/sol) cu fotoperioada de 12-14 i 28/25 C (aer/sol) cu fotoperioada de 14-16 ore i umiditatea de 60%. Temperatura aerului i a solului a fost msurat zilnic. Materialul a fost analizat dup o sptmn din momentul apariiei lupoaiei la suprafaa solului.

n anul trei de studiu au fost testate 27 de genotipuri fiind infectate dup metoda Pancenko, 1975. o parte din plantule la faza vegetativ de dou frunze adevrate s-a extras ADN pentru evidenierea genei Or5, iar celelalte au fost cultivate timp de 60 zile pentru a determina gradul de infecie/atac.

2.2. Metode de cercetare

2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici

Parametrii morfo-fiziologici: nlimea plantelor, volumul sistemului radicular, suprafaa foliar, coninutul pigmenilor asimilatori au fost analizate conform metodelor clasice [Boldor O. 1983, Duca M