Die indirekte Genotypanalyse als diagnostisches Verfahren beim Marfan-Syndrom

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    25-Aug-2016

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  • B.M. LaudahnP. GyurusU. OrthA. GalC.A. Nienaber

    Die indirekte Genotypanalyseals diagnostisches Verfahrenbeim Marfan-Syndrom

    Z Kardiol 89:939948 (2000) Steinkopff Verlag 2000 AORTA- UND SYSTEMERKRANKUNGEN

    ZFK610

    Eingegangen: 8. Mai 2000Akzeptiert: 3. Juli 2000

    Prof. Dr. C.A. Nienaber ())B. M. LaudahnUniversitatskrankenhaus EppendorfInnere Medizin IIAbteilung fur KardiologieMartinistrae 5220246 Hamburge-mail: nienaber@UKE.uni-hamburg.de

    P. Gyurus U. Orth A. GalInstitut fur HumangenetikUniversitatskrankenhaus EppendorfHamburg

    Indirect genotype analysis as a toolfor diagnosis of Marfan syndrome

    Summary Marfan syndrome(MFS) is an autosomal dominantdisorder of connective tissue charac-terized by skeletal, ocular andcardiovascular manifestations. Thedisease is caused by mutations inthe FBN1 gene, encoding fibrillin,an important component of elastic

    fibers. Diagnosis of Marfan syn-drome is currently based on detailedclinical examination and/or mutationanalysis in the fibrillin gene. Clini-cal expression varies widely bothamong and within families, render-ing clinical diagnosis extremely dif-ficult. In this study, we performedsegregation analysis of allelic DNApolymorphisms to support diagnosisof Marfan syndrome. This type ofgenotype analysis is a useful, addi-tional diagnostic tool for familieswith Marfan syndrome and providesincremental information of diagnosisor exclusion of Marfan syndromebased on clinical findings.

    Key words Marfan syndrome fibrillin-1 gene clinical variability haplotype segregation analysis

    Zusammenfassung Das Marfan-Syndrom ist eine autosomal-domi-nant vererbte Bindegewebserkran-kung mit Beteiligung des skeletta-len, okularen und kardiovaskularenSystems. Die Erkrankung wirddurch Mutationen im FBN1-Gen

    verursacht, das fur das GlykoproteinFibrillin, eine elementare Struktur-komponente der elastischen Fasernkodiert. Die Diagnose des Marfan-Syndroms basiert auf zwei Saulen,erstens der klinischen Evaluierungder Patienten, zweitens dem direktenMutationsnachweis im FBN1-Gen.Inter- und intrafamiliare Unterschie-de im klinischen Erscheinungsbilderschweren die phanotypische Dia-gnostik. In dieser Arbeit wird die in-direkte Genotypanalyse, in welcherdie Segregation von allelischenDNA-Polymorphismen verfolgtwird, als ein zusatzliches Verfahrenfur die Diagnose vorgestellt. Mittelsindirekter Genotypdiagnostik und inKombination mit den klinischen Un-tersuchungsbefunden kann die Dia-gnose oder der Ausschluss des Mar-fan-Syndroms noch sicherer gestelltwerden, insbesondere bei klinischenGrenzfallen.

    SchlusselworterMarfan-Syndrom Fibrillin 1-Gen klinische Variabilitat indirekte Genotypdiagnostik

    Einleitung

    Das Marfan-Syndrom (MFS) ist eine autosomal-domi-nant vererbte Erkrankung der mikrofibrillaren Bestand-teile des Bindegewebes. Ursache fur den genetischenDefekt sind Mutationen im Fibrillin 1-Gen (FBN1),welches auf Chromosom 15q21.1 lokalisiert ist (1). Das

    Gen enthalt ca. 200000 Basenpaare mit 65 Exons undkodiert fur das cysteinreiche Glykoprotein Fibrillin (2).Das Fibrillinprotein stellt durch Zusammenlagerung zusogenannten 1012 nm groen Mikrofibrillen eine ele-mentare Strukturkomponente der elastischen Fasern dar,die in vielen unterschiedlichen Geweben der Extrazellu-larmatrix (ECM) vorkommen (3).

  • Die Angaben uber die Pravalenz des MFS variierenzwischen 1 :20000 (4) und 1 :10000 (5) bis hin zu1 :5000 (6). Die Rate der Neumutationen wird mit 15(7) bis 25% (8) angegeben.

    Beim Marfan-Syndrom handelt es sich um ein gene-tisch und klinisch heterogenes Krankheitsbild mit star-ker phanotypischer Variabilitat. Durch das ubiquitareVorkommen des Fibrillins kann sich der genetische De-fekt in unterschiedlichen Organsystemen manifestieren.So sind neben dem okularen und muskulo-skelettalenSystem vor allem die kardiovaskularen Manifestationenhervorzuheben, da letztere fur uber 90% der Todesfallevon Patienten mit MFS verantwortlich sind (9). Hier istinsbesondere die Aortendilatation mit ihren Folgen zunennen, sie allein macht 80% der kardiovaskularen To-desursachen bei Patienten mit Marfan-Syndrom aus. ZurZeit sind ca. 180 verschiedene FBN1-Mutationen mitunterschiedlichen Phanotypen beschrieben worden. Mis-sense-Mutationen stellen die haufigste Mutationsart dar,

    gefolgt von Veranderungen in Splei-Sequenzen, sowiekleinen Insertionen und Deletionen (33). Das phanotypi-sche Spektrum reicht von der sehr schweren Verlaufs-form des neonatalen Marfan-Syndroms (nMFS) (10,11), uber das klassische Marfan-Syndrom (1, 7) undden MASS-Phanotyp (Mitral-Aortic-Skin-Skeletal) (12),bis hin zu Patienten mit isolierten Manifestationen, wiez.B. isolierte skelettale Auffalligkeiten (13), isoliertesAortenaneurysma (14) oder pradominante Ektopia lentis(10, 15, 16). Sowohl die Involvierung als auch dieSchwere der Organbeteiligungen unterliegen inter- undsogar intrafamiliaren Schwankungen. Die durchschnitt-liche Lebenserwartung von unbehandelten Patienten lagbisher bei 32 Jahren (9). Tabelle 1 zeigt eine bersichtder moglichen Manifestationen in den verschiedenenOrgansystemen.

    Zur Zeit beruht die Diagnostik des Marfan-Syndromsvor allem auf zwei Verfahren. Der klinischen Diagnos-tik mit der nosologischen und interdisziplinaren Evalua-tion der Patienten (18), sowie dem direkten Mutations-nachweis im FBN1-Gen. Die klinische Evaluation bzw.die direkte Mutationsdiagnostik gestalten sich aufgrunddes variablen Erscheinungsbildes bzw. der Groe desFBN 1-Gens als schwierig und arbeitsaufwendig. Mit-tels Segregationsanalyse haben wir die Weitervererbungvon allelischen DNA-Polymorphismen aus demFBN1-Gen, sowie an Loci, die mit dem FBN1-Locusgekoppelt sind, verfolgt und stellen die Vorteile diesesdiagnostischen Verfahrens fur Familien mit Marfan-Syn-drom dar.

    Material und Methoden

    Patienten

    Bei den untersuchten Familien handelt es sich um funfdeutsche Familien mit Marfan-Syndrom und insgesamt38 Mitgliedern. Die klinischen Untersuchungsbefundeder Patienten stammen aus der interdisziplinarenSprechstunde der Kardiologischen Ambulanz des Uni-versitats-Krankenhauses Eppendorf (UKE), die nachden Kriterien der Genter Nosologie erhoben wordensind (18, 19, 20). In jeder Familie erfullen mindestenszwei Patienten diese Kriterien. Insgesamt sind 19 Pa-tienten (9 weibliche, 10 mannliche, mit einem mittlerenAlter von 35 Jahren (967 Jahre)) von der Erkrankungbetroffen. Allerdings erfullen nur 16 dieser 19 Patientendie Kriterien der Genter Nosologie, zwei erfullen siewegen fehlender Untersuchungsbefunde nur teilweise.Aber aufgrund der vorhandenen, meist kardiovaskularenBefunde und der positiven Familienanamnese ist dieDiagnose Marfan-Syndrom bei diesen zwei Patientenwahrscheinlich. Bei einer Patientin wurde das Marfan-Syndrom nach der Genter Nosologie zunachst formal

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    Tab. 1 Mogliche Manifestationen des Marfan-Syndroms (17)

    SkelettsystemThoraxdeformitaten (Pectus excavatum/carinatum)ArachnodaktylieKnick-PlattfueWirbelsaulendeformitatenSkolioseThorakale LordoseThorakale oder thorakolumbale Lordose

    HochwuchsHoher (Gotischer) GaumenHypermobile Gelenke mit Neigung zu Luxationen

    AugenLinsenektopieVerlangerung des AugapfelsNetzhautablosungMyopie

    Kardiovaskulares SystemDilatation der ascendierenden Aorta mit und ohne AorteninsuffizienzDilatation der thorakalen/abdominellen AortaAortendissektionMitralklappenprolapsMitralklappeninsuffizienzTrikuspidalinsuffizienzDilatation der Pulmonalarterien

    PulmonalsystemSpontanpneumothoraxRestriktive Lungenerkrankung infolge der ThoraxdeformitatenEmphysem

    IntegumentStriae distensae (ohne erkennbare Ursache)Hernien

    ZentralnervensystemDuraektasieLumbosakrale MeningozeleErweiterung des LumbosakralkanalsHyperaktivitat

  • ausgeschlossen. Von keinem der Patienten liegt bisherein direkter Mutationsnachweis im FBN1-Gen vor. Beikeiner der funf Familien wurde bisher eine indirekteGenotypdiagnostik durchgefuhrt.

    Polymerase-Kettenreaktion (PCR)Die DNA-Extraktion aus EDTA-Blut erfolgte durchdie Aussalzmethode nach Miller et al. (21). Danachwurde eine DNA-Amplifizierung durch PCR durch-gefuhrt. Fur alle verwendeten Primer wurden folgendePCR-Konditionen gewahlt: Denaturierung: 3 Minutenbei 94 8C, Annealing bei 55 8C fur 1 Minute, Extensionfur 1 Minute bei 72 8C, Final-Extension: 10 Minutenbei 72 8C; Zyklen: 3540; Magnesiumchloridkonzentra-tion: 1,5 mM.

    Mikrosatellitenmarker

    Insgesamt wurden Markerallele an sechs polymorphenLoci untersucht. Vier der Loci liegen extragenisch, incentromerer (D15S1012, D15S994 und D15S659) odertelomerer (D15S978) Ausrichtung, jedoch in unmittel-barer Nahe zum FBN1-Gen. Die PolymorphismenMTS-2 und MTS-4 liegen im FBN1-Gen selbst(Abb. 1). Tabelle 2 zeigt Eigenschaften der untersuchtenPolymorphismen. Durch die unterschiedliche Anzahl anrepetitiven Sequenzen (z.B. CA-Repeats an LocusD15S994, siehe Tabelle 2) an den beiden Allelen einesLocus entstehen durch PCR-Ampflikation zwei ver-schieden groe Produkte, d. h. der Patient ist heterozy-got an diesem Locus. Dieser Groenunterschied istdurch unterschiedliche Wanderungseigenschaften derAllele im elektrischen Feld mittels Gelelektrophoresenachweisbar. In Abb. 2 ist zu erkennen, dass der PatientI2 homozygot ist, wahrend I1 zwei unterschiedlichgroe Allele an diesem Locus aufweist, also heterozy-got ist. Die Separation der PCR-Produkte erfolgte bei

    den extragenischen Polymorphismen mit Hilfe einesABI PRISM Genetic Analyzer 310, da die hierfur ver-wendeten Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekop-pelt und dadurch fur dieses Gerat detektierbar sind(Abb. 2). Die PCR-Produkte der intragenischen Poly-morphismen wurden mittels Gelelektrophorese durchein 8%iges Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch an-schlieende Silbernitratfarbung dargestellt (Abb. 3). DieMarkerallele wurden der Groe nach separiert unddurchnummeriert. Die Haplotypen fur die einzelnenProbanden wurden so ermittelt, dass die geringst mog-liche Anzahl an Rekombinationen auftrat.

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    Abb. 1 Lage der untersuchten Markerloci und intragenischen DNA-Polymorphismen im FBN1-Gen. Die Angaben fur die MarkerlociD15S1012, D15S994, D15S659 und D15S978 stammen aus den In-ternetdatenbanken Soton (34) und Genethon (35). Die Lokalisationder intragenischen Polymorphismen (MTS-2 und MTS-4) entsprichtden Angaben aus (22), sowie den YAC-Contigs aus (23) und derDatenbank vom Whitehead Institute (36)* Rekombinationshaufigkeit in centiMorgan (cM) zwischen den ein-zelnen Loci (bei weiblichen Individuen). Angaben aus der Internet-datenbank Soton (34).

    Tab. 2 Eigenschaften der unter-suchten DNA-Polymorphismen Locus PhysikalischeLokalisation

    Hetero-zygotie

    Fragmentgroe Repeat

    D15S1012 15q21.1 0,72 104118 bp Di (CA)D15S994 15q21.1 0,73 306318 bp Di (CA)D15S659 15q21.1 0,84 174206 bp Tetra (GATA)D15S978 15q21.1 0,83 187215 bp Di (CA)FBN1/MTS-2 Intron 5 0,58 137165 bp Di (CA)FBN1/MTS-4 Intron 43 0,70 112128 bp Di (CA)

    bp: base pairsDi (CA): Dinukleotidrepeat, d.h. repetitive Sequenzen der Basen Cytosin und AdeninTetra (GATA): Tetranukleotidrepeat, d.h. repetitive Sequenzen der Basen Guanin, Adenin, Thymin undAdeninFBN1: Fibrillin 1-Gen

  • Ergebnisse

    Im Folgenden sind die Ergebnisse der indirekten Geno-typdiagnostik fur die funf Familien dargestellt. In denStammbaumen sind nur die informativen Loci angege-ben. Die Abb. 2 und 3 zeigen beispielhaft die Separati-on der Markerallele am Locus D15S659 (Abb. 2) bzw.FBN1/MTS-2 (Abb. 3).

    Segregationsdaten

    Familie 1

    Die Abb. 4 zeigt die Segregationsdaten der Familie 1. Diebetroffenen Familienmitglieder I-1, I-3 und II-1 erfullenalle die diagnostischen Kriterien der Genter Nosologie.Alle Patienten weisen eine Beteiligung des kardiovasku-laren und skelettalen Systems auf, jedoch keine okularenManifestationen. Kernspintomographisch ist der Bulbusaorticus der Patientin I-1 auf eine ovalare Lumenweitevon 4,74 cm dilatiert. Nebst skelettaler Beteiligung ist

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    Abb. 2 Darstellung der Separation der Allele am Locus D15S659mit Hilfe der Kapillargelelektrophorese des ABI PRISM Genetic Ana-lyzer 310. Zeichenerklarung fur den Stammbaum: Quadrate: mann-liche Individuen; Kreise: weibliche Individuen; schwarze Symbole: er-krankte Personen; weie Symbole: phanotypisch unauffallige Per-sonen; graue Symbole: Individuen ohne eindeutigen Phanotyp. DerPatient II-3 ist bereits verstorben. Die separierten Allele werden derGroe nach durchnummeriert. Der genetische Defekt kosegregiert indieser Familie mit dem Markerallel 4 (mit Pfeil gekennzeichnet). Diebeiden phanotypisch auffalligen Geschwister II-2 und II-4 tragen dasvaterliche Allel 4. Bei der Patientin II-5 wurde das Marfan-Syndromrein formal aufgrund grenzwertiger Befunde ausgeschlossen. Aller-dings ist zu erkennen, dass auch sie das Markerallel 4 von ihrem Va-ter geerbt hat, ebenso wie ihre betroffenen Geschwister II-2 und II-4.Dem phanotypisch auffalligen Enkelsohn III-2 wurde vom Vater II-2das grovaterliche Allel 4 weitervererbt, wahrend seine klinisch un-auffallige Schwester III-1 das gromutterliche Allel 2 an diesem Lo-cus von ihrem Vater II-2 geerbt hat

    Abb. 3 Darstellung der Segregation von Markerallelen am FBN1-Locus MTS-2. Die Auftrennung der PCR-Fragmente erfolgte durchPolyacrylamidgelelektrophorese. Der genetische Defekt zeigt eine Ko-segregation mit dem Allel 1

    3

  • auch eine lumbosakrale Duraektasie vorhanden. Der Pa-tient I-3 wurde mit einem bioprothetischen Mitralklap-penersatz aufgrund einer schweren Mitralinsuffizienzauf dem Boden eines Mitralklappenprolapses versorgt.Ferner lag bei dem Patienten ein disseziierendes Aortena-neurysma vom Typ De Bakey III vor, welches operativdurch einen prothetischen Ersatz der descendierendenthorakalen Aorta behandelt wurde. Echokardiographischist der Aortenbulbus mit 44 mm ektatisch. Zusatzlich istein typischer marfanoider Habitus vorhanden. Der dritteBetroffene innerhalb der Familie ist der Patient II-1. AlsZeichen einer kardiovaskularen Beteiligung ist eine Dis-sektion der Aorta ascendens (operativ mit einem Compo-site-Graft und Aortenklappenersatz versorgt), sowie eineDissektion der Aorta abdominalis, und ein Mitralklappen-prolaps vorhanden. Bei Person II-2 wurde das Marfan-Syndrom nach der Genter Nosologie ausgeschlossen. Inkeinem Organsystem der Probandin fanden sich Anhalts-punkte fur das Vorliegen eines Marfan-Syndroms. Die Er-gebnisse der indirekten Genotypdiagnostik bestatigen denAusschluss der Diagnose. Die Person II-2 hat von ihrerMutter I-1 die Markerallele 4 (D15S1012), 3 (D15S659)und 2 (D15S978) vererbt bekommen, die wahrscheinlichmit der Wildtypkopie des FBN1-Gens kosegregieren,wahrend der betroffene Sohn II-1 die Markerallele 3(D15S1012), 1 (D15S659) und 3 (D15S978) aufweist,die in der Familie wahrscheinlich mit dem genetischenDefekt kosegregieren. Die Loci D15S994, MTS-2 undMTS-4 sind nicht informativ, da die Mutter I-1 homozy-got fur diese Allele ist.

    Familie 2

    Beim Patient I-2 liegt ein klassisches Marfan-Syndrommit skelettaler, okularer und kardiovaskularer Betei-

    ligung vor (Abb. 5). Eine Aortendilatation mit gleichzei-tig bestehender Aortenklappeninsuffizienz wurde durcheine Conduit- und Aortenklappenersatzoperation ver-sorgt. Ferner konnte eine aneurysmatische Erweiterungder Aorta descendens mit zusatzlicher Dissektion diag-nostiziert werden. Kernspintomographisch zeigt sich beider Tochter II-2 mit 42 mm ein grenzwertiger Durch-messer im Bereich des Sinus valsalvae. Zusatzlich weistdie Patientin noch skelettale und okulare Manifestatio-nen auf, sowie eine lumbosakrale Duraektasie, sodasshier die diagnostischen Kriterien auch ohne eindeutigenkardiovaskularen Befund erfullt werden. Aufgrund vonskelettalen und kardiovaskularen Befunden wurde beidem Patienten II-3 das Marfan-Syndrom diagnostiziert.Echokardiographisch ist eine hochgradige Aorteninsuffi-zienz bei normalen Aortendiametern, sowie ein Mitral-klappenprolaps mit deutlicher Mitralinsuffizienz erkenn-bar. Bei der Patientin II-4 sind keine kardiovaskularenund okularen Manifestationen vorhanden, jedoch wer-den die Kriterien der Genter Nosologie, unter der Be-rucksichtigung der positiven Familienanamnese, durchdas Vorliegen von marfantypischen skelettalen Befun-den und Beteiligung der Dura erfullt. Der Patient III-1zeigt angesichts seines Alters (12 Jahre) eine maiggra-dige Erweiterung der Aortenwurzel (31 mm). Sie wirktechokardiographisch in Relation zu den ubrigen Herz-hohlen leicht dilatiert. Durch zusatzliche skelettale, oku-lare und durale Manifestationen kann das Marfan-Syn-drom nach den gultigen diagnostischen Kriterien diag-

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    Abb. 4 Segregationsdaten der Familie 1. Der grau unterlegte Haplo-typ kosegregiert mit dem genetischen Defekt

    Abb. 5 Segregationsdaten der Familie 2

  • nostiziert werden. Die ubrigen Familienmitglieder sindklinisch unauffallig. Die Betroffenen II-2, II-3 und II-4haben von ihrem ebenfalls betroffenen Vater die Allele2 bzw. 1 an den Loci D15S994 bzw. D15S978 vererbtbekommen. Alle ubrigen Loci sind nicht informativ.

    Familie 3

    Die beiden Patienten (II-3 und III-3 in Abb. 6) dieserFamilie weisen keine kardiovaskularen Befunde auf.Der Vater II-3 zeigt skelettale, pulmonale und duraleManifestationen. Bei III-3 wurden marfantypische ske-lettale und durale Veranderungen diagnostiziert. Als An-gehorige eines Indexpatienten erfullt sie damit die Kri-terien der Genter Nosologie. Die ubrigen Familienmit-glieder sind klinisch unauffallig. Interessant ist, dassden Geschwistern II-2 und II-3 dieselben Markerallelean D15S659, D15S978, MTS-2 und MTS-4 von ihremVater I-1 vererbt wurden. Zwei dieser Markerallele(Allel 2 am Locus D15S659 und Allel 1 am LocusD15S978) sind auch den Enkelkindern III-1 und III-3vererbt worden. Da I-1, II-2 und III-1 klinisch volligunauffallig sind, lassen die Genotypen und die kli-nischen Daten in dieser Familie den Verdacht zu, dasses bei II-3 zu einer Neumutation im FBN1-Gen gekom-men ist. Dadurch ist erklarbar, warum III-1 klinisch un-auffallig ist, obwohl sie an den Loci D15S659 undD15S978 dieselben grovaterlichen Markerallele tragt,

    wie ihre phanotypisch auffallige Cousine III-3. Der Pa-tient II-3 hat dann wiederum den genetischen Defekt anseine alteste Tochter III-3 vererbt. Eine weitere Erkla-rung ware das Vorliegen einer extrem milden Verlaufs-form des Marfan-Syndroms bei I-1, II-2 und III-1, so-dass die Manifestationen der Diagnostik entgehen wur-den.

    Familie 4

    Retrospektiv kann bei der bereits verstorbenen PatientinI-2 (Abb. 7) das Marfan-Syndrom diagnostiziert werden.Anamnestisch besa die Patientin marfantypische ske-lettale und okulare Manifestationen, zusatzlich erlitt sieeine Typ A-Dissektion. Bei allen anderen betroffenenPatienten kann die Diagnose Marfan-Syndrom eindeutignach den gultigen Kriterien gestellt werden. Bei der Pa-tientin II-2 liegt ein klassisches Marfan-Syndrom mitskelettaler, okularer und kardiovaskularer Beteiligungvor. Echokardiographisch wurde eine anuloaortale Ekta-sie mit einem maximalen Diameter von 40 mm und einMitralklappenprolaps diagnostiziert. Kernspintomogra-phisch konnte eine Dilatation der Pulmonalarterien gesi-chert werden. Auch bei dem Sohn (III-1) der Patientinkann ein klassisches Marfan-Syndrom mit kardiovasku-larer, skelettaler und ophthalmologischer Beteiligungfestgestellt werden. Echokardiographisch zeigt sich an-

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    Abb. 6 Segregationsdaten der Familie 3Abb. 7 Segregationsdaten der Familie 4

  • gesichts des Alters des Patienten (12 Jahre) ein mit 19mm erweiterter Aortenklappenring und ein mit 25 mmdilatierter Bulbus aortae. Bei der Patientin II-3 wurdeaufgrund einer akuten Typ A-Dissektion eine Composi-te-Graft-Implantation vorgenommen. Weiterhin sind alsZeichen einer kardiovaskularen Beteiligung eine aneu-rysmatische Erweiterung im bergangsbereich des Ar-cus aortae zur Aorta descendens, sowie ein Mitralklap-penprolaps mit Mitralinsuffizienz und eine deutliche Di-latation des Pulmonalarterienstammes (Abb. 8) zu nen-nen. Zusatzlich sind marfantypische skelettale Manifes-tationen vorhanden. Auch bei ihrer Tochter III-2 ist einekardiovaskulare Beteiligung ersichtlich. Kardiologischist angesichts des Alters von 9 Jahren bereits ein deut-lich aufgeweiteter Bulbus aortae, eine Aortenklappen-dilatation mit mittelschwerer Aortenklappeninsuffizienzund ein Mitralklappenprolaps erkennbar; mit den skelet-talen Befunden werden die Kriterien der Genter Noso-logie erfullt. Die ubrigen Familienmitglieder I-1 undII-1 sind phanotypisch unauffallig. Der genetische De-fekt kosegregiert in dieser Familie mit Markerallelen 2(D15S994), 4 (D15S659) und 1 (MTS-2). Diese Mar-kerallele stammen offensichtlich von der erkranktenMutter I-2. Dies ist trotz fehlender genetischer Datennachvollziehbar, da I-1 jeweils homozygot fur andereAllele an den entsprechenden Loci ist. Beide Betroffe-nen in Generation II haben wiederum diese Markerallelean ihre ebenfalls betroffenen Kinder III-1 bzw. III-2weitervererbt. Allerdings kann man aufgrund der fehlen-den Genotypdaten von II-4 nur vermuten, welches Alleldes intragenischen Polymorphismus MTS-2 bei III-2

    von der Mutter II-3 und welches vom Vater II-4 erhal-ten wurde.

    Familie 5

    Die Person I-1 war bisher einer interdisziplinaren Eva-luierung nicht zuganglich (Abb. 9). Anamnestisch ergibtsich aber auch hier der hochgradige Verdacht auf dasVorliegen eines Marfan-Syndroms (positive Familien-anamnese, 6 mal Leistenhernien operativ versorgt).Beim altesten Sohn II-2 wurde aufgrund von kardiovas-kularen und skelettalen Befunden, sowie einer zusatz-lichen Beteiligung des Integumentes durch rezidivieren-de Leistenhernien die Diagnose Marfan-Syndrom ge-stellt. Echokardiographisch liegen sowohl ein Mitral-klappenprolaps, als auch eine Dilatation Bereich des Si-nus valsalvae vor. Bei seinem Sohn (III-2) ist bereitseine deutliche Dilatation der Aortenwurzel in Kombina-tion mit einem Mitralklappenprolaps erkennbar. Ange-sichts seines Alters von 11 Jahren ist die Interpretationder orthopadischen Befunde schwierig. Ein marfantypi-scher Habitus ist vorhanden, aber formal werden dieKriterien der Genter Nosologie derzeit nicht erfullt. DerPatient II-3 verstarb im Alter von 41 Jahren im Rahmeneiner Mitralklappenoperation. Bei ihm bestand eine Mit-ralklappeninsuffizienz auf dem Boden eines Mitralklap-

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    Abb. 8 MRT-Transversalschnitt in Hohe der Pulmonalarterie. DiePulmonalarterie ist deutlich dilatiert (bis ektatisch) bei normalenDruckverhaltnissen; diese Pulmonalarteriendilatation stellt ein seltenesKriterium nach der Genter Nosologie dar. Deutlich erkennbar liegtauch eine Dissektion der Aorta descendens vor. Die Aorta ascendensist bereits durch eine Dacron-Prothese ersetzt

    Abb. 9 Segregationsdaten der Familie 5

  • penprolapses. Die Autopsie hat das Marfan-Syndromhistologisch gesichert. Aufgrund von skelettalen, oku-laren und kardiovaskularen Befunden wurde bei der Pa-tientin II-4 das Marfan-Syndrom nach der Genter Noso-logie diagnostiziert. Von kardiologischer Seite bestehtsowohl ein Mitralklappenprolaps, als auch ein Trikuspi-dalklappenprolaps. Die Person II-5 zeigt echokardiogra-phisch lediglich einen grenzwertigen Mitralklappenpro-laps mit einer ebenfalls grenzwertigen Mitralinsuffi-zienz. Die Kriterien fur das Vorliegen von skelettalenund okularen Manifestationen werden nicht eindeutigerfullt. Hier wurde das Marfan-Syndrom zunachst for-mal nach der Genter Nosologie ausgeschlossen. Sie hatallerdings dieselben vaterlichen Markerallele an den Lo-ci D15S1012, D15S994, D15S659, D15S978 undMTS-2 erhalten wie ihre erkrankten Geschwister II-2und II-4. Daher muss bei der Patientin II-5 aufgrundder indirekten Genotypdiagnostik und unter Berucksich-tigung der vorliegenden klinischen Befunde der hoch-gradige Verdacht auf ein Marfan-Syndrom geauertwerden. Interessant sind die Segregationsdaten von III-1und III-2. An den Loci D15S1012, D15S994 undD15S659 hat der betroffene Sohn III-2 die grovaterli-chen Markerallele vererbt bekommen, die auch bei denanderen betroffenen Familienmitgliedern zu finden sind.Seine phanotypisch unauffallige Schwester III-1 tragt andiesen Loci die gromutterlichen Markerallele, die indieser Familie nicht mit dem genetischen Defekt koseg-regieren. An den intragenischen PolymorphismenMTS-2 und MTS-4, sowie dem extragenischen LocusD15S978, der nach Angaben der Internetdatenbank So-ton (34) distal vom FBN1-Gen liegt, haben die beidenGeschwister die gleichen gromutterlichen Allele vomVater geerbt, die in der Familie nicht mit dem Defektkosegregieren. Es ist also bei III-2 zu einer Rekombina-tion zwischen dem extragenischen Locus D15S659 unddem FBN1-Locus, typisiert durch den intragenischenPolymorphismus MTS-4, gekommen. Diese Rekom-bination konnte sowohl extra-, als auch intragenischaufgetreten sein. Gegen eine extragenische Rekombina-tion spricht, dass bei dem Patienten III-2 marfantypi-sche Organveranderungen vorhanden sind.

    Diskussion

    Beim Marfan-Syndrom handelt es sich um eine auto-somal-dominant vererbte Erkrankung der elastischen Fa-sern des Bindegewebes. Unterschiedliche Angaben uberdie Haufigkeit des MFS infolge der starken phanotypi-schen Heterogenitat deuten bereits die Problematik derDiagnostik im Einzelfall an. Das Spektrum reicht vonden schweren Verlaufsformen des neonatalen Marfan-Syndroms (nMFS) (10) und Shprintzen-Goldberg-Syn-droms (24), bei dem in einem Fall eine FBN1-Mutation

    nachgewiesen werden konnte (25), uber den klassischenPhanotyp mit kardiovaskularer, skelettaler und okularerBeteiligung und dem MASS-Phanotyp (Mitral-aortic-skin-skeletal) (12) bis hin zu Patienten mit isoliertenManifestationen, wie z.B. isolierte skelettale Befunde.Klare Geno/-Phanotypen-Korrelationen konnten sichbisher nicht herauskristallisieren. Eine Ausnahme bildetdas neonatale Marfan-Syndrom (nMFS); alle bisher be-schriebenen Mutationen dieses sehr schweren Phanotypsliegen in den Exons 2427 bzw. 3132 (11). NeuereEvaluationen der bestehenden Mutationsdaten deutenan, dass die 3-Region des FBN1-Gens im Bereich derExons 5965 eine Pradilektionsstelle fur milde Verlaufs-formen darstellt (26). Sowohl die Involvierung als auchdie Schwere einzelner Manifestationen unterliegen zumTeil starken inter- und auch intrafamiliaren Schwankun-gen (12). Klinisch ist es daher schwierig, bestimmtePhanotypen des Marfan-Syndroms von gesonderten En-titaten, wie z.B. Mitralklappenprolaps, familiares Aor-tenaneurysma oder habitueller Hochwuchs, die nichtzwangslaufig mit FBN1-Mutationen einhergehen mus-sen, abzugrenzen, was die Diagnose des Marfan-Syn-droms erschwert. Eine fruhzeitige und vor allem pra-symptomatische Diagnostik und damit auch ein fruhzei-tiger Beginn einer adaquaten Therapie ware aber vongroem Nutzen. Murdoch et al. (9) zeigten 1972 ineiner Studie, dass das Durchschnittsalter von verstorbe-nen, unbehandelten Patienten mit Marfan-Syndrom beinur 32 Jahren lag. Mit den Moglichkeiten der modernenverbesserten Diagnostik und Therapie liegt die mittlereberlebenszeit heute schon deutlich hoher. ChirurgischeElektiveingriffe an der Aorta gehen mit einer Fruhletali-tat (bis 30 Tage postoperativ) von 1% einher, im Ge-gensatz dazu steht eine Sterblichkeit von 7 bis 27% beinotfallmaig durchgefuhrten Eingriffen aufgrund einerakuten Typ A-Dissektion (27). Shores et al. (28) zeigteneinen Benefit fur Patienten mit Marfan-Syndrom bezug-lich der Dilatationsrate der Aorta, des Auftretens vonKomplikationen wie Aortenklappeninsuffizienz undAortendissektion, sowie der Sterblichkeit durch die pro-phylaktische Gabe von Betarezeptorenblockern. Mehre-re Studien konnten zeigen, dass der positive Effekt derBetarezeptorenblocker vor allem bei Kindern in einemAlter von 10 bis 15 Jahren bei Behandlungsbeginn auf-trat (27).

    Zur Zeit beruht die Diagnose des Marfan-Syndromsvor allem auf zwei Verfahren, namlich der klinischenDiagnostik mit der nosologischen und interdisziplinarenEvaluation der Patienten nach den revidierten Kriterienvon Gent (18), und andererseits auf dem direkten Muta-tionsnachweis im FBN1-Gen. Bei phanotypischer Diag-nostik besteht das Problem, dass im Falle des Marfan-Syndroms eine vereinfachte und kategorisierende Noso-logie einer sehr variablen Krankheit mit einem sehrbreiten klinischen Erscheinungsbild gegenubersteht.Manche Manifestationen pragen sich erst in der fruhen

    946 Zeitschrift fur Kardiologie, Band 89, Heft 10 (2000) Steinkopff Verlag 2000

  • Adoleszenz aus. Im Kindesalter ist eine Interpretationder Untersuchungsbefunde unter Berucksichtigung desAlters vielfach schwierig. Die Diagnostik nach der Gen-ter Nosologie stutzt sich auf das Vorhandensein be-stimmter Manifestationen, wobei eine Abstufung der In-tensitat einer jeweiligen Manifestation meist unberuck-sichtigt bleibt. Bei klinischen Grenzfallen und isoliertenVerlaufsformen gestaltet sich die Diagnostik problema-tisch. Montgomery et al. (29) entdeckten in einer Fami-lie Patienten mit einer FBN1-Mutation, die lediglichmilde skelettale und kardiovaskulare Veranderungenaufwiesen und daher nicht die strengen diagnostischenKriterien der Genter Nosologie erfullten. Zusatzlichemolekulargenetische Befunde wurden in diesen Fallenwertvolle Informationen liefern.

    Die zweite Saule der Diagnostik des Marfan-Syn-droms liegt in der direkten Mutationsdiagnostik imFBN1-Gen. Angesichts der Groe des Gens mit 65 ko-dierenden Exons und den Tatsachen, dass erstens nochkein Hot spot im FBN1-Gen bekannt ist und zweitensdie meisten FBN1-Mutationen familienspezifisch sind,ist die direkte Mutationsdiagnostik sehr zeit- und ar-beitsintensiv. Hayward et al. (30) untersuchten 50 Fami-lien mit Marfan-Syndrom mittels SSCA (Single strandconformation analysis) und Heteroduplexanalyse aufMutationen im FBN1-Gen. Die Detektionsrate der Mu-tationen lag bei maximal 78%. Negative Ergebnisse beider FBN1-Mutationsdiagnostik mit den oben genanntenMethoden schlieen demnach die Existenz einerFBN1-Mutation nicht eindeutig aus.

    Die indirekte Genotypdiagnostik kann als zusatz-liches diagnostisches Kriterium die klinische Diagnosedes Marfan-Syndroms unterstutzen. Gerade bei kli-nischen Grenzfallen und bei Kindern kann sie als alters-unabhangiger Befund weitere wertvolle Informationenliefern, welche die Diagnose oder den Ausschluss derDiagnose Marfan-Syndrom sichern. Zu beachten ist al-lerdings, dass die indirekte Genotypdiagnostik auf Fa-milienuntersuchung basiert. Je groer die Anzahl derverfugbaren Familienmitglieder ist, desto sicherer kannim Einzelfall eine diagnostische Aussage unter Beruck-sichtigung der Segregationsdaten getroffen werden. Umeine Bestimmung der Markerallele vorzunehmen, diemit dem genetischen Defekt kosegregieren, sollten min-destens zwei Familienmitglieder die klinischen Kriterienzweifelsfrei erfullen. Die genaue Anzahl der benotigtenFamilienmitglieder ist abhangig von der Struktur derFamilie, sowie dem Informationsgehalt der einzelnengenetischen Marker. Eine weitere Limitation dieser Me-thode stellt die Moglichkeit einer Locus-Heterogenitatdar. Zwar weisen die uberwiegende Mehrheit aller Fa-milien mit Marfan-Syndrom eine Kopplung zu demFBN1-Locus in 15q21.1 auf, allerdings existieren auchStudien, die bei Familien mit einem marfanahnlichenErscheinungsbild eine Kopplung mit der Region15q21.1 ausschliessen. Stattdessen konnte hier eine

    Kopplung mit der Region 5q23-q31 (FBN2-Gen) (31),beziehungsweise mit der Region 3p24.2-p25 (32) nach-gewiesen werden. Insbesondere in solchen Familien, inwelchen eine Segregationsanalyse, z.B. aufgrund derStammbaumgroe nur eingeschrankt durchfuhrbar ist,muss dieser Faktor berucksichtigt werden.

    Die Vorteile der indirekten Genotypdiagnostik liegenin der schnellen Durchfuhrbarkeit und der Unabhangig-keit der untersuchten Markerallele vom Alter des Pa-tienten, dem klinischen Schweregrad der Erkrankungund dem Zeitpunkt des Auftretens verschiedener Mani-festationen. Diese Unabhangigkeit ist besonders beiKindern und klinischen Grenzfallen von groem Nut-zen.

    Die interdisziplinare Evaluation der Patienten zurklinischen Bestandsaufnahme und Verlaufskontrolle istdennoch unverzichtbar. Nur durch sie ist eine klinischeProgression der Erkrankung erkennbar, die moglicher-weise ein interventionelles Handeln erforderlich macht.Desweiteren kann nur durch eine direkte DNA-Sequen-zierung eine Mutation im FBN1-Gen dargestellt und de-ren biologische Signifikanz ermittelt werden. Die indi-rekte Genotypdiagnostik erweist sich jedoch als wert-volles Instrument in der Evaluierung des Marfan-Syn-droms. Als zusatzlicher Parameter zum klinischen Un-tersuchungsbefund erlaubt sie es, die Diagnose oder denAusschluss des Marfan-Syndroms abzusichern. Durchdie indirekte Genotypdiagnostik kann ein Elternteil alsmoglicher Trager des mutanten Allels identifiziert undbei bestehenden Kinderwunsch auf die Risiken einerWeitervererbung hingewiesen werden. Durch die Ver-wendung von mehreren polymorphen Markern erhohtsich die Wahrscheinlichkeit, dass eine diagnostischeAussage gemacht werden kann. Der diagnostische Wertvon informativen intragenischen Markern ist, sofern kei-ne intragenische Rekombination vorliegt, praktisch mitder Aussagekraft der direkten Mutationsanalyse ver-gleichbar. Ebenso kann durch den Einsatz von sowohlcentromer, als auch telomer FBN1-flankierenden Mar-kern, die eine geringe genetische Distanz zumFBN1-Gen besitzen, eine hohe diagnostische Aus-sagekraft der Methode erzielt werden. Rekombinationenkonnen so detektiert und in die Interpretation der Be-funde miteinbezogen werden. Lediglich das Auftretenvon Doppelrekombinationen, die allerdings aufgrundder geringen genetischen Entfernung der Markerloci(Abb. 1) sehr selten vorkommen, bleiben unentdeckt.Die Segregationsanalyse fungiert als Schnittstelle zwi-schen klinischer Evaluation und direkter Mutationsdiag-nostik.

    947B. M. Laudahn et al.Die indirekte Genotypanalyse beim Marfan-Syndrom

  • 948 Zeitschrift fur Kardiologie, Band 89, Heft 10 (2000) Steinkopff Verlag 2000

    Literatur

    1. Dietz HC, Cutting GR, Pyeritz RE, Ma-slen CL, Sakai LY, Corson GM, Puffen-berger EG, Hamosh A, NanthakumarEJ, Curristin SM, Stetten G, MeyersDA, Francomano CA (1991) Marfansyndrome is caused by a recurrent denovo missense mutation in the fibrillingene. Nature 352:337339

    2. Magenis ER, Maslen CL, Smith L, Al-len L, Sakai LY (1991) Localization ofthe Fibrillin (FBN) gene to chromosome15, Band q21.1. Genomics 11:346351

    3. Sakai LY, Keene DR, Engvall E (1986)Fibrillin, a new 350-kD glycoprotein, isa component of extracellular micro-fibrils. J Cell Biol 103:24992509

    4. Lee B, Godfrey M, Vitale E, Hori H,Mattei M-G, Sarfarazi M, Tsipouras P,Ramirez F, Hollister D (1991) Linkageof Marfan syndrome and a phenotypi-cally related disorder to two differentfibrillin genes. Nature 352:330334

    5. McKusick VA (1991) The defect inMarfan syndrome. Nature 352:279281

    6. Dietz HC, Pyeritz RE (1995) Mutationsin the human gene for fibrillin-1 (FBN1)in the Marfan syndrome and related dis-orders. Hum Mol Genet 4:17991809

    7. Pyeritz RE, McKusick VA (1979) TheMarfan syndrome: diagnosis and man-agement. N Engl J Med 300:772777

    8. Maslen CL, Glanville RW (1993) Re-view: The molecular basis of Marfansyndrome. DNA Cell Biol 12:561572

    9. Murdoch JL, Walker BA, Halpern BL,Kuzma JW, McKusick VA (1972) Lifeexpectancy and causes of death in theMarfan syndrome. N Engl J Med 286:804808

    10. Kainulainen K, Karttunen L, Puhakka L,Sakai L, Peltonen L (1994) Mutations inthe fibrillin gene responsible for domi-nant ectopia lentis and neonatal Marfansyndrome. Nat Genet 6:6469

    11. Booms P, Cisler J, Mathews KR, God-frey M, Tiecke F, Kaufmann UC, VetterU, Hagemeier C, Robinson PN (1999)Novel exon skipping mutation in the fi-brillin-1 gene: two hot spots for neonatalMarfan syndrone. Clin Genet 55:110117

    12. Dietz HC, Ramirez F, Sakai LY (1994)Marfans Syndrome and other micro-fibrillar diseases. Adv Hum Genet 22:153186

    13. Milewicz DM, Grossfield J, Cao S-N,Kielty C, Covitz W, Jewett T (1995) AMutation in FBN1 disrupts profibrillinprocessing and results in isolated skele-tal features of the marfan syndrome. JClin Invest 95:23732378

    14. Francke U, Berg MA, Tynan K, BrennT, Liu W, Aoyama T, Gasner C, MillerDC, Furthmayr H (1995) A Gly1127Sermutation in an EGF-like domain of thefibrillin-1 gene is a risk factor for as-cending aortic aneurysm and dissection.Am J Hum Genet 56:12871296

    15. Lonnqvist L, Child A, Kainulainen K,Davidson R, Puhakka L, Peltonen L(1994) A novel mutation of the fibrillingene causing ectopia lentis. Genomics19:573576

    16. Kielty CM, Davies SJ, Phillips JE, JonesCJ, Shuttleworth CA, Charles SJ (1995)Marfan syndrome: fibrillin expressionand microfibrillar abnormalities in afamily with predominant ocular defects.J Med Genet 32:16

    17. Nienaber CA, v. Kodolitsch Y, KaufmannU, Laudahn B, Raghunath M, Meinertz T(1999) Klinik und Genetik des Marfan-Syndroms. Medgen 11:275279

    18. De Paepe A, Devereux RB, Dietz HC,Hennekam RCM, Pyeritz RE (1996) Re-vised diagnostic criteria for the Marfansyndrome. Am J Med Genet 62:417426

    19. Nienaber CA, v. Kodolitsch Y (1999)Therapeutic management of patientswith Marfan syndrome focus oncardiovascular involvement. Cardiologyin review 7:332341

    20. v. Kodolitsch Y, Raghunath M, NienaberCA (1998) Das Marfan-Syndrom: Prava-lenz und naturlicher Verlauf der kardio-vaskularen Manifestationen. Z Kardiol87:150160

    21. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF(1988) A simple salting out procedurefor extracting DNA from human nu-cleated cells. Nucleic Acids Res 16(3):1215

    22. Pereira L, Levran O, Ramirez F, LynchJR, Sykes B, Pyeritz RE, Dietz HC(1994) A molecular approach to the stra-tification of cardiovascular risk in fa-milies with Marfans syndrome. N EnglJ Med Jul 21;331(3):148153

    23. Biery NJ, Eldadah ZA, Moore CS, Stet-ten G, Spencer F, Dietz HC (1999) Re-vised genomic organization of FBN1and significance for regulated gene ex-pression. Genomics 56:7077

    24. Shprintzen RJ, Goldberg RB (1982) Arecurrent pattern syndrome of craniosyn-ostosis associated with arachnodactylyand abdominal hernias. J CraniofacGenet Dev Biol 2:6574

    25. Sood S, Eldadah ZA, Krause WL,McIntosh I, Dietz HC (1996) Mutationin fibrillin-1 and the Marfanoid-cranio-synostosis (Shprintzen-Goldberg) syn-drome. Nat Genet 12:209211

    26. Palz M, Tiecke F, Booms P, Goldner B,Rosenberg T, Fuchs J, Skovby F, Schu-macher H, Kaufmann UC, v KodolitschY, Nienaber CA, Leitner C, Katzke S,Vetter B, Hagemeier C, Robinson PN(2000) Clustering of mutations asso-ciated with mild marfan-like phenotypesin the 3 region of FBN1 suggests a po-tential genotype-phenotype correlation.Am J Med Genet 91:212221

    27. Von Kodolitsch Y, Raghunath M, KarckM, Haverich A, Nienaber CA (1998)Das Marfan Syndrom: Therapie bei kar-diovaskularen Manifestationen. Z Kar-diol 87:173184

    28. Shores J, Berger KR, Murphy EA, Pyer-itz RE (1994) Progression of aortic dila-tation and the benefit of long-term b-adrenergic blockade in Marfans syn-drome. N Engl J Med 330:13351341

    29. Montgomery RA, Geraghty MT, Bull E,Gelb BD, Johnson M, McIntosh I, Fran-comano CA, Dietz HC (1998) Multiplemolecular mechanisms underlying sub-diagnostic variants of Marfan-syndrome.Am J Hum Genet 63:17031711

    30. Hayward C, Porteous ME, Brock DJ(1997) Mutation screening of all 65exons of the fibrillin-1 gene in 60patients with Marfan syndrome: reportof 12 novel mutations. Hum Mutat;10(4):280289

    31. Lee B, Godfrey M, Vitale E, Hori H,Mattei M-G, Sarfarazi M, Tsipouras P,Ramirez F, Hollister D (1991) Linkageof Marfan syndrome and a phenotypi-cally related disorder to two differentfibrillin genes. Nature 352:330334

    32. Collod G, Babron M-C, Jondeau G,Coulon M, Weissenbach J, Dubourg O,Bourdarias JP, Bonaiti-Pellie C, JunienC, Boileau C (1994) A second locus forMarfan syndrome maps to chromosome3p24.2-p25. Nat Genet 8:264268

    Internetdatenbanken

    33. The Human Gene MutationDatabase Cardiff (HGMD)http://www.uwcm.ac.uk

    34. Sotonhttp://cedar.genetics.soton.ac.uk

    35. Genethonhttp://www.genethon.fr

    36. Whitehead Institute for BiomedicalResearchhttp://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/lookup-contig

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