Diagnóstico molecular en infecciones oculares

Dr. Carlos Álvarez-Guzmán. Dr. Alejandro Rodríguez-García. Dr. Jaime Torres-Gómez. Instituto de Oftalmología y Ciencias Visuales, Tec Salud.

Cátedra de Investigación en Oftalmología y Ciencias Visuales

Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del Tecnológico de Monterrey

Introducción

Van Gelder, R. Applications of the polymerase chain reaction to diagnosis of ophthalmic disease. Surv Ophthalmol 46:248-258, 2001.

PCR‣ Reacción en Cadena: productos de reacciones son sustratos de la segunda y sucesivamente

‣ de la Polimerasa: única enzima usada en la reacción

Principios de PCR

PCR eficienciaEl grado de amplificación logrado y la sensibilidad son altas

35 ciclosPCR diagnóstico >1010 amplificación

34 billones de copiasen pocas horas

una sola molécula de DNA

✓ fragmento de 500 pares de bases correspondería a 20 ng de DNA✓suficiente para observar en gel de agarosa de electroforesis teñido con bromuro de etidio

PCR proceso

Fuente de DNAacuoso

vítreo

sangre

Secuencia a amplificar

gen (mDNA) neuropatía óptica de Leber

gen UL97 citomegalovirus (CMV)

Muestra de DNA

primers

DNA polimerasa termoestable

bases nucleotídicas

buffers

gel electroforesis :acrilamida o agarosa

papel de nitrocelulosaMg++

Obtención de muestrasCualquier especimen ocular o biopsia

Raspado conjuntival Paracentesis CA Punción vítrea

colocarlo en solución salina balanceada

50 microlitros 100-150 microlitros

algunas veces de cassette de infusión

✓congelarlos en hielo seco o nitrógeno líquido (-80°C)✓evitar congelar y descongelar: degradación DNA✓En ausencia de condiciones: sólo colocar la muestra en tubo de microfuga

ESTERILIDAD

Eficacia del PCR✓Capacidad de realizar la prueba en cantidades pequeñas de tejido.✓Sensibilidad alta 10-100 genomas (copias DNA) que corresponde a menos de una UFC

Puntos a considerar

CONTAMINACIÓN✴pequeñas cantidades de microorganismos✴pipetas, personal de laboratorio✴falsos positivos✴DNA latente en huésped

✴herpes: EBV, CMV✴Mantener el contexto clínico

Sensibilidad Especificidad

✴El DNA del huésped y el primer deben empatar perfectamente para obtener un producto.✴POLIMORFISMOS entre cepas del mismo organismo

✴Falsos negativos✴AD19 CMV

PCR en uveítis posteriorKnox et al. Uveítis virales

-PCR en acuoso o vítreo-37 ojos de dilemas en uveítis-opacidad de medios o historia natural inconsistente con curso clínico-diagnóstico de uveítis viral en 25 pacientes.-casos negativos: toxoplasmosis

Knox CM, Chandler D, Short GA, Margolis TP: Polymerase chain reaction-based assays of vitreous samples for the diagnosis of viral retinitis. Use in diagnostic dilemmas. Ophthalmology 105:37–44,

Indicaciones-opacidad de medios: catarata o vitritis.-Mitchell et al-primers VVZ, CMV-9 pacientes: 4 positivos CMV y 3 VVZ. -el resto toxoplasmosis

Toxoplasmosis✓Utilidad de PCR:

✓casos atípicos ✓Primoinfección: parecida a oros tipos de retinitis

✓estudios iniciales poca sensibilidad <50%, la cual aumentó con el uso de secuencias altamente

repetidas✓ Montoya el al.

✓DNA en 80% de casos de toxoplasmosis ocular con IgG positivas✓ Bou et al DNA Toxoplasma gondii en

✓ sangre periférica en pacientes con toxoplasmosis ocular activa, reactivaciones

diagnosticadas por este método

Harper T, Miller D, Schiffman J, Davis J. Polymerase chain reaction analysis of aqueous and vitreous specimens in the diagnosis of posterior segment infectious uveitis. Am J Ophthalmol 2009;147:140-147.

PCR + en uveítis posterior infecciosa

133 px corioretinitis infecciosa

433 PCR105 acuoso y 38 vítreas

HSV, VVZ, CMValteración en tratamientoresolución en 25 pacientes

¿Acuoso o vítreo?

Harper T, Miller D, Schiffman J, Davis J. Polymerase chain reaction analysis of aqueous and vitreous specimens in the diagnosis of posterior segment infectious uveitis. Am J Ophthalmol 2009;147:140-147.

PCR en edoftalmitis

El EVS reportó eficiencias del 70% en el cultivo. 1

1. Microbiologic factors and visual outcome in the en- dophthalmitis vitrectomy study. Am J Ophthalmol 122:830– 46, 1996

Cultivo✴resultados lentos✴inicio de tratamiento empírico

PCR✴secuencias DNA ribosomal: diseño primers (difícil).✴fluidos o biopsias de ojos con endofltalmitis✴utilidad para cultivos negativos 2.✴bacterias en:

✴100% cultivo positivo✴44% cultivo negativo✴1/3 de la negativas: hongos✴primers para hongos 3.

2. Therese KL, Anand AR, Madhavan HN: Polymerase chain reaction in the diagnosis of bacterial endophthalmitis. Br J Ophthalmol 82:1078–82, 1998

3. Hidalgo JA, Alangaden GJ, Eliott D: Fungal endophthalmitis diagnosis by detection of Candida albicans DNA in intraocu- lar fluid by use of a species-specific polymerase chain reac- tion assay. J Infect Dis 181:1198–201, 2000

90% de las endoftalmitis pueden ser detectadas por PCR

PCR en edoftalmitis temprana

‣Estudio prospectivo de 64 ojos‣Signos de endoftalmitis hasta 1 año después de catarata‣Muestras de vítreo por punción o vitrectomía‣cultivo y PCR (resultado principal)‣Controles de vitrectomías de casos no inflamatorios

Resultados‣DNA bacteriano en 37 pacientes (66%) comparado con 19 (34%) cultivo‣Sólo un paciente cultivo + (Nocardia) PCR -‣18 muestras + para cultivo y PCR 100% de concordancia en patógeno.

Cornelia RJ, et al. Anm J Ophthalmol 2012;153: 1031-1037

PCR en edoftalmitis tardía

‣Complicación tardía, amenaza visión y representa retos diagnósticos.

‣P acnes, S. epidermidis, Actinomyces israelli‣Hongos

‣Microorganismos difíciles de cultivar‣detección por cultivo solo en 50%

‣Diagnosticados por clínica‣Tratamiento: vitrectomía, capsulectomía y reemplazo de lente

‣Terapia médica puede ser efectiva. S. epidermidis

Lohmann et al.1

-primers de DNA 16 S ribosomal-25 ojos con endoftalmitis tardías-cultivo acuoso y microscopía 0% detección-cultivo vítreo 24% detección

-PCR acuoso 84% detección-PCR y punción vítrea diagnóstico en 92% de los casos

Lohmann CP, Linde HJ, Reischl U: Improved detection of microorganisms by polymerase chain reaction in delayed en- dophthalmitis after cataract surgery. Ophthalmology 107: 1047–51; discussion 1051–2, 2000

PCR en enfermedades externas‣Casos de conjuntivitis y queratitis: cultivo y tinción de Gram ‣Adenovirales el ELISA no permite identificar serotipos‣Takeuchi et al. nuevo serotipo asociado a una epidemia en Japón 1.

‣Herpes y conjuntivitis de inclusión Chlamydia‣Jackson et al. PCR multiplex 2

‣adenovirus y HSV: frotis conjuntival‣una sola reacción se detectan múltiples patógenos

1. Takeuchi S, Itoh N, Uchio E: Adenovirus strains of subgenusD associated with nosocomial infection as new etiological agents of epidemic keratoconjunctivitis in Japan. J Clin Mi- crobiol 37:3392–4, 1999

2. Jackson R, Morris DJ, Cooper RJ: Multiplex polymerase chain reaction for adenovirus and herpes simplex virus in eye swabs. J Virol Methods 56:41–8, 1996

‣Acanthamoeba‣retraso en el diagnóstico consecuencias devastadoras‣difícil cultivo y tinción con blanco de calcofluor baja sensibilidad‣Lehman PCR de raspado epitelial

‣84% de sensibilidad comparada con 53% de cultivo‣lágrima tiene 66% sensibilidad

‣Marthers et al ‣DNA en 24 de 33 raspados epiteliales‣distintas a A. castellanii

3. Mathers WD, Nelson SE, Lane JL: Confirmation of confocal mi- croscopy diagnosis of Acanthamoeba keratitis using polymerase chain reaction analysis. Arch Ophthalmol 118:178–83, 2000

Uso exclusivo de PCR en oftalmologíaMicroorganismos de difícil cultivo

Serologías de difícil accesoResistencia a antimicrobianos

Toxoplasma gondii ‣tradicionalmente tratado como única cepa‣ Boothroyd 1

‣ 3 cepas molecularmente identificables‣ sensibilidades a sulfas: heterogenicidad en respuesta a tratamiento

Citomegalovirus‣identificar cepas resistentes es crucial‣evitar implante de ganciclovir ‣mutaciones en gel UL97‣Liu et al.2 mutaciones puntuales que confieren resistencia en 11 muestras de vítreo

Síndromes mascarada‣ linfoma de células B‣ imitar un proceso uveítico‣ oncogenes en control de inmunoglobulinas

2. Liu W, Kuppermann BD, Martin DF: Mutations in the cy- tomegalovirus UL97 gene associated with ganciclovir-resis- tant retinitis. J Infect Dis 177:1176–81, 1998

1. Sibley LD, Boothroyd JC: Construction of a molecular karyo-type for Toxoplasma gondii. Mol Biochem Parasitol 51:291–300, 1992

• El PCR es una técnica de biología molecular disponible en nuestro medio.

• El conocimiento de las bases moleculares y el procesamiento de la

muestra es indispensable para una alta sensibilidad de la prueba.

• Diseñar estrategias diagnósticas: uso de cultivos, tinciones y pruebas de

DNA es más útil que la sensibilidad de pruebas separadas.

• Tomar en cuenta el contexto clínico para la interpretación de los resultados

Conclusiones

carlos.alvarez.g@gmail.com