dezvoltarea şi validarea metodei de determinare a etanolului prin gc

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE ,,GR. T. POPA” IAŞI

FACULTATEA DE FARMACIE

DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE A ETANOLULUI PRIN GC-HS

ŞI STUDII PRIVIND DOZAREA ETANOLULUI DIN DIFERITE FLUIDE BIOLOGICE PRIN GC-HS

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conducători ştiinţifici PROF. DR. ELENA BUTNARU PROF. DR.VASILE ASTĂRĂSTOAE

Doctorand DIANA FILARET DORUBEŢ

IAŞI 2011

2

Decizia de numire a comisiei nr. 22083 din 13.10.2011

Data susţinerii publice 09.12.2011

3

Cuprinsul tezei de doctorat

I. Introducere. Obiectivele propuse

1

STADIUL CUNOAŞTERII

II. Consideraţii generale privind alcoolul etilic 4 II.1. Alcoolul etilic şi clasificarea băuturilor alcoolice II.2. Proprietăţi fizico-chimice. Prepararea alcoolului etilic. Etanolul-carburant

4 6

II.3. Evaluarea toxicologică a etanolului 7 II.3.1. Particularităţi toxicocinetice 7 II.3.2. Particularităţi toxicodinamice 11 II.3.3. Simptomatologia 20

II.3.3.1. Intoxicaţia acută II.3.3.2. Intoxicaţia cronică (alcoolismul)

20 22

II.4. Situaţia consumului de alcool în lume II.5. Situaţia consumului de alcool în Uniunea Europeană

25 27

II.5.1. Impactul alcoolului asupra Europei II.5.2. Patologia generată de consumul de alcool în Uniunea Europeană II.5.3. Alcoolul şi economia Europei II.5.4. Folosirea alcoolului în Europa

29 31

31 32

II.6. Situaţia consumului de alcool în România 34 II.6.1. Morbiditatea generată de consumul de alcool în România II.6.2. Interacţiunea alcoolului cu medicamentele

36

37 III. Metode chimico-toxicologice de investigare a alcoolului etilic 38

III.1. Analiza etanolului – metode clasice III.2. Metode gaz cromatografice

38 39

III.2.1. Noţiuni generale de gaz cromatografie III.2.2. Mărimi ce definesc repartiţia cromatografică III.2.3. Procesul cromatografic de separare III.2.4. Cromatograma III.2.5. Mărimi ce caracterizează separarea cromatografică III.2.6. Structura sistemului cromatografic III.2.7. Limitările tehnicilor gaz-cromatografice pe Coloană III.2.8. Informaţia cantitativă în analiza cromatografică III.2.9. Informaţia calitativă în analiza cromatografică III.2.10. Istoricul analizelor headspace III.2.11. Principiile de baza în analiza headspace

39 40 40 41 43 44 46

47 48 49 51

4

CONTRIBUŢII PERSONALE

IV. Consideraţii generale asupra consumului de alcool în Judeţul Vaslui

55

IV.1. Motivarea studiului IV.2. Metoda şi probele biologice IV.3. Rezultate şi discuţii

55 56 56

IV.3.1. Rezultate obţinute la determinarea cantitativă a alcoolului etilic în probele de sânge provenite de la conducătorii auto IV.3.2. Rezultate obţinute la determinarea cantitativă a alcoolului etilic în probele de sânge provenite de la peroane decedate

56

61

IV.4. Concluzii 66 V. Stabilirea unor corelaţii între valoarea alcoolemiei şi cauzele de deces

68

V.1 Motivarea studiului V.2. Materiale şi metodă V.3. Rezultate şi discuţii V.4. Concluzii

68 69 70

108 VI. Studii chimico-toxicologice de determinare a alcoolului etilic prin GC-HS

110

VI.1. Validarea metodei de dozare a etanolului din sânge prin GC-HS folosind izopropanolul ca standard intern

110

VI.1.1. Motivarea studiului VI.1.2. Principiul metodei VI.1.3. Materiale şi aparatură VI.1.4. Validarea metodei

110 110 111 112

VI.1.4.1. Specificitatea metodei VI.1.4.2. Liniaritatea VI.1.4.3. Exactitatea şi precizia metodei VI.1.4.4. Reproductibilitatea şi precizia intermediară VI.1.4.5. Limita de detecţie şi limita de cuantificare

112 114 117 118

122

VI.1.5. Concluzii 122 VI.2. Dezvoltarea şi validarea metodei de determinare a etanolului din diverse fluide biologice folosind terţ-butanolul, drept standard intern

124 VI.2.1. Motivarea studiului VI.2.2. Principiul metodei VI.2.3. Materiale şi aparatură VI.2.4. Validarea metodei

124 124 124 126

VI.2.4.1. Specificitatea metodei VI.2.4.2. Liniaritatea metodei VI.2.4.3. Precizia VI.2.4.4. Repetabilitatea

126 128 130 133

5

VI.2.4.5. Acurateţea VI.2.4.6. Limita de detecţie şi limita de cuantificare

134 141

VI.2.5. Concluzii 145 VI.3. Prezentarea comparativă a concentraţiei alcoolului etilic determinat din fluide biologice prin metoda GC-HS şi metoda Cordebard

147

VI.3.1. Motivarea studiului VI.3.2. Principiul metodelor utilizate VI.3.3. Materiale şi aparatură VI.3.4. Rezultate şi discuţii VI.3.5. Concluzii

147 147 147 150 157

VI.4. Aplicarea metodei de dozare a etanolului prin GC-HS din fluide biologice recoltate post-mortem folosind terţ- butanolul, drept standard intern

158 VI.4.1. Motivarea studiului VI.4.2. Prezenţa post mortem a alcoolului VI.4.3. Materiale şi aparatură VI.4.4. Consideraţii asupra recoltării fluidelor biologice post mortem VI.4.5. Rezultate şi discuţii

158 159 163 164

168

VI.4.5.1. Determinarea concentraţiei alcoolului din sânge VI.4.5.2. Determinarea concentraţiei alcoolului din urină VI.4.5.3. Determinarea concentraţiei alcoolului în umoarea vitroasă VI.4.5.4. Determinarea concentraţiei alcoolului în lichidul cefalorahidian

169

179

182

188

VI.4.6. Concluzii 192 VII. Concluzii generale. Contribuţii originale. Perspective de cercetare

194

VIII. Bibliografie 201 ANEXA 1

6

CAPITOLUL IV CONSIDERAŢII GENERALE ASUPRA CONSUMULUI DE

ALCOOL ÎN JUDEŢUL VASLUI Scopul studiului a fost de a evidenţia situaţia consumului de

alcool la conducătorii auto şi nivelul alcoolemiei la persoanele decedate din diferite cauze.

IV.2. Metodă şi probe biologice Probele biologice au fost analizate prin metoda Cordebard,

modificată după Banciu şi Droc. Probe biologice

- sânge venos de la conducători auto; - sânge din vena femurală recoltat de la persoane decedate.

IV.3. Rezultate şi discuţii IV.3.1. Rezultate obţinute la determinarea cantitativă a alcoolului

etilic în probele de sânge provenite de la conducătorii auto În perioada 2005-2010 în Laboratorul de Toxicologie din

cadrul Serviciului Judeţean de Medicină Legală Vaslui, au fost analizate în medie 1076 probe pe an.

Numărul determinărilor efectuate la conducătorii auto şi valorile alcoolemiei sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1. Repartiţia numerică a valorilor alcoolemiei determinate la

conducătorii auto din judeţul Vaslui, în perioada 2005-2010

Anul Nr. deter.

Valoarea alcoolemiei (g‰) 0 0-0,8 0,8-2 2-3 > 3

2005 1092 490 216 367 19 0 2006 957 382 123 422 30 0 2007 1024 345 77 520 82 0 2008 1260 375 91 671 114 9 2009 1063 244 86 601 129 3 2010 1064 212 47 643 155 7 Total 6460 2048 640 3224 529 19

Repartiţia procentuală a cazurilor analizate în perioada

2005-2010, în funcţie de valoarea alcoolemiei, este prezentată în figura 1.

7

44,87 19,78 33,61 1,740

39,92 12,85 44,1 3,130

33,69 7,52 50,78 8,010

29,76 7,22 53,25 9,050,72

22,95 8,09 56,54 12,140,28

19,924,42

60,43 14,570,66

0% 20% 40% 60% 80% 100%

2005

2006

2007

2008

2009

2010

0 0-0,8 g‰ 0,8-2 g‰ 2-3 g‰ > 3 g‰

Fig. 1. Repartizarea procentuală a alcoolemiilor efectuate la conducătorii auto, în perioada 2005-2010, în Judeţul Vaslui

Din cele 6460 determinări efectuate în perioada 2005-2010,

3772 (58,39%) au prezentat alcoolemie peste 0,8 g‰, limită considerată penală în cazul conducătorilor auto, conform legislaţiei în vigoare în România. Acest procent foarte mare impune un control mai riguros al conducătorilor auto şi în acelaşi timp o îmbunătăţire a metodelor de determinare deoarece o mare parte din conducătorii auto ajung să conteste aceste rezultate şi pot eluda prevederile legale.

Dacă avem în vedere că aceste persoane sunt conducători auto, este predictibil riscul pe care îl prezintă atunci când sunt în trafic. Nu sunt de neglijat nici cazurile cu alcoolemie sub limita penală deoarece în funcţie de reactivitatea individuală o alcoolemie sub 0,8 g‰ poate afecta reflexele persoanei respective cu consecinţe sociale grave.

Numărul cazurilor cu alcoolemie peste valoarea de 0,8 g‰ a crescut de la an la an, de la 386 (35,35%) cazuri în anul 2005 la 805 cazuri (75,66%) în anul 2010.

Comparativ cu media determinărilor naţionale, pentru judeţul Vaslui se observă o creştere a consumului de alcool la conducătorii auto, creştere care este mai importantă pentru intervalul de concentraţie 0,8-2 g‰ (creştere cu aproape 20%), mai ales în anii 2007-2010.

Măsurile impuse de autorităţi pentru a reduce consumul de

8

alcool în rândurile conducătorilor auto, cum sunt creşterea frecvenţei controalelor în trafic, creşterea nivelului amenzilor, nu au determinat o reducere reală a consumului de alcool. IV.3.2. Rezultate obţinute la determinarea cantitativă a alcoolulul

etilic în probele de sânge provenite de la persoane decedate În perioada 2005-2010 în Laboratorul de Toxicologie din

cadrul Serviciului Judeţean de Medicină Legală Vaslui, au fost efectuate în medie 743 de determinări pe an (tabelul 2). Tabelul 2. Repartiţia numerică a alcoolemiilor determinate la cadavru,

în perioada 2005-2010, în judeţul Vaslui

Anul Nr. deter.

Valoarea alcoolemiei (g‰) 0 0-0,8 0,8-2 2-3 > 3

2005 707 359 62 118 114 54 2006 629 344 65 102 92 26 2007 674 348 72 105 99 50 2008 904 471 90 168 129 46 2009 661 283 99 127 101 51 2010 884 390 132 158 120 84 Total 4459 2195 520 778 655 311

În cazul alcoolemiei determinate la cadavru, putem considera

cel puţin teoretic că valori de peste 2 g‰ pot constitui o cauză de deces mai ales dacă individul în cauză prezintă fenomene patologice cardiace, renale sau hepatice.

Din cele 4459 de determinări efectuate în perioada 2005-2010, 14,69% (655 cazuri) au prezentat valori ale alcoolemiei între 2 şi 3 g‰, iar 6,97% (311 cazuri) au prezentat valori ale alcoolemiei peste 3 g‰ (figura 2).

9

50,78 8,77 16,69 16,12 7,64

54,69 10,33 16,22 14,63 4,13

51,63 10,68 15,58 14,69 7,42

52,1 9,96 18,58 14,27 5,09

42,81 14,98 19,21 15,28 7,72

44,12 14,93 17,87 13,58 9,5

0% 20% 40% 60% 80% 100%

2005

2006

2007

2008

2009

2010

0 g‰ < 0,8 g‰ 0,8-2 g‰ 2-3 g‰ > 3 g‰

Fig. 2. Repartizarea procentuală a alcoolemiilor efectuate

la persoane decedate, în perioada 2005-2010, în Judeţul Vaslui

IV.4. Concluzii Privind toate aceste date prezentate putem clar să afirmăm că

de la an la an în perioada analizată, observăm o creştere continuă a cazurilor cu alcoolemie de peste 0,8 g‰. Comparând mediile cu media naţională, observăm diferenţe importante pentru valorile zero şi cele cuprinse între 0,8 şi 2. Numărul cazurilor cu alcoolemie între 0,8 şi 2 g ‰ fiind cu 13 unităţi procentuale, mai multe în judeţul Vaslui decât la nivel naţional.

La persoanele decedate se observă o creştere de la an la an a alcoolemiei cu valori mai mari de 3 g‰, ceea ce presupune de multe ori că alcoolul reprezintă o cauză directă de deces.

10

CAPITOLUL V

STABILIREA UNOR CORELAŢII ÎNTRE VALOAREA CONCENTRAŢIEI ALCOOLULUI

ŞI CAUZELE DE DECES Alcoolul este un determinant al stării de sănătate, responsabil

pentru 7,4% din totalitatea invalidităţilor şi deceselor premature în UE. Aproape 1 din 3 bărbaţi şi 1 din 5 femei consumă alcool peste limitele de siguranţa acceptate în prezent.

Studiul a urmărit stabilirea unei corelaţii între concentraţia alcoolului în diferite fluide biologice şi cauza de deces stabilită de medicul legist şi evidenţierea influenţei nefaste a consumului de alcool asupra vieţii oamenilor.

Probe biologice luate în lucru: sânge venă femurală, umoare vitroasă, urină, sânge cord, sânge hematom subdural. Concentraţia alcoolului a fost determinată prin metoda Cordebard, modificată după Banciu şi Droc.

Au fost analizate 356 de cazuri în care valoarea alcoolului a fost mai mare de 0,40 g‰. Cazurile au fost analizate în perioada 2008-2010, în judeţul Vaslui (fără oraşul Bârlad).

V.3. Rezultate şi discuţii

În colaborare cu medicul legist, care a stabilit diagnosticul de deces, luând în consideraţie rezultatele macroscopice ale autopsiei, raportul toxicologic, raportul histopatologic, rezultatele tanatochimice şi datele anchetei, cazurile au fost clasificate în funcţie de diagnosticul de deces (figura 3).

21,91%

12,92%

8,15%

6,46%

6,46%

8,15%

14,04%

6,46%

8,15%

7,30%

afecţiuni cardiacespânzurarecomă etilicăhipotermieaccidenteomucidereintoxicaţiiînectraumatismealte cauze

Fig. 3. Repartiţia procentuală a cazurilor luate în studiu,

în funcţie de cauza decesului

11

Decese care au survenit în urma unor afecţiuni cardiace

asociate cu consumul de etanol Dintre afecţiunile cardiace cel mai frecvent identificate au

fost arteroscleroza coronariană, cardiomiopatia dilatativă şi hipertrofică, valvulopatiile, miocardiofibroza şi pericardita.

Au fost analizate 78 de cazuri în perioada 2008-2010 cu vârsta cuprinsă între 23-81 de ani, cu o medie de 58,38 ani în anul 2008; 55,50 ani în anul 2009 şi 55,81 ani în anul 2010.

Datele obţinute la analiza toxicologică a probelor provenite de la persoanele care au decedat din cauza unor afecţiuni cardiace asociate cu consumul de alcool (cu alcoolemie peste 1,5 g‰ - vena femurală) sunt prezentate în tabelele 3-5.

Tabelul 3. Cazurile analizate în anul 2008 cu alcoolemie

peste valoarea de 1,5 g‰ (vena femurală) şi cu afecţiuni cardiace Nr. caz

Concentraţie alcool (g‰) Vârsta (ani) Mediul Sexul femurală urină

4 1,65 2,35 42 R M 23 1,65 0,55 78 U M

121 2,15 2,05 72 R F 144 1,55 1,35 35 R M 172 2,20 2,95 64 R M 221 2,45 2,35 66 R M 222 2,40 2,75 68 R M 244 2,30 - 68 R M 235 2,15 2,60 42 R M 271 1,90 2,15 59 R M 273 1,65 - 72 R M 280 2,40 2,20 69 R F 317 2,05 2,55 81 R M 338 2,35 2,95 63 R M 342 1,80 2,90 72 R F

12

Tabelul 4. Cazurile analizate în anul 2009 cu alcoolemie peste valoarea de 1,5 g‰ (vena femurală) şi cu afecţiuni cardiace

Nr. caz


20 1,50 1,95 78 R M 36 1,80 2,35 44 R M 54 1,95 - 52 R M 79 2,10 2,30 53 U M 83 1,65 2,25 53 R M 187 2,65 2,95 36 R M 193 1,95 2,50 50 U M 211 1,90 2,25 52 R M 214 2,15 2,25 59 R M 222 2,30 2,60 70 R M 260 2,40 59 R F 304 2,75 3,05 63 R M 310 2,40 2,95 58 R M 306 1,65 - 32 R F

Tabelul 5. Cazurile analizate în anul 2010 cu alcoolemie

peste valoarea de 1,5 g‰ (vena femurală) şi cu afecţiuni cardiace Nr. caz


72 3,30 3,50 69 R F 97 2,25 - 57 R F

100 1,90 - 74 U M 129 2,95 3,15 39 R M 143 1,60 2,10 44 R M 168 2,50 3,10 34 R M 178 1,70 2,80 55 U M 218 2,25 2,50 51 R M 226 1,60 - 59 R M 228 1,65 - 62 U M 240 3,25 3,20 53 R M 248 2,00 2,10 66 U M 261 2,40 2,80 23 U M 297 2,45 3,00 64 R M 330 1,90 2,20 81 R M 340 1,90 2,20 33 R M 364 2,45 2,60 59 U M 398 2,65 2,90 69 R F

13

Consumul de alcool este specific bărbaţilor, dar am identificat şi cazuri în care femei cu afecţiuni cardiace au fost depistate la analiza post-mortem cu alcoolemie peste valoarea zero. În lotul total, 13 au fost femei (16,67%) şi 65 (83,33%) au fost bărbaţi (figura 4).

16,13% 83,87%

10,00% 90,00%

22,23% 77,77%

0% 20% 40% 60% 80% 100%

2008

2009

2010

femeibărbaţi

Fig. 4. Repartiţia procentuală a cazurilor cu afecţiuni cardiace

şi alcoolemie peste valoarea 0,40 g‰, în funcţie de sex 17 cazuri (21,79%) din lotul total, provin din mediul urban şi

61 (78,21%) din mediul rural. Calculând pentru lotul total valoarea medie a alcoolemiei în

funcţie de mediul de provenienţă, se observă că pentru mediul urban valoarea este de 1,35 g‰, iar pentru mediul urban 1,71 g‰.

Se observă din figura 5, că în toţi aceşti trei ani luaţi în studiu, cele mai mari valori ale alcoolemiei au fost situate între 1-2 g‰ şi mai mari de 2 g‰, ceea ce explică şi numărul mare de decese de diferite cauze în care este implicat şi consumul de alcool.

29,0

3%

45,1

7%

25,8

0% 35,0

0%45,0

0%

20,0

0%

37,0

3%

33,3

4%

29,6

3%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

< 1 g‰ 1-2 g‰ > 2 g‰

2008 2009 2010

Fig. 5. Repartiţia procentuală a cazurilor

în funcţie de valoarea alcoolemiei

14

În acest studiu, din 78 de cazuri diagnosticate cu boli cardiace

asociate consumului de alcool doar 16 cazuri au avut valori ale alcoolemiei mai mici de 1 g‰, respectiv 6 cazuri în 2008, 6 cazuri, în 2009, 4 cazuri în 2010.

Cardiomiopatia alcoolică este o afecţiune în care consumul excesiv de alcool pe o perioada îndelungată slăbeşte muşchiul cardiac şi determină insuficienţă cardiacă. Consumul de alcool este asociat cu o varietate de afecţiuni cardiovasculare: fibrilaţia atrială, flutterul atrial, alte aritmii supraventriculare, extrasistole ventriculare, moarte subită, hipertensiune şi atac cerebral.

Cardiomiopatia alcoolică reprezintă 4% dintre toate cauzele cardiomiopatiilor. Consumul de alcool pe termen lung reprezintă a doua cauză principală a cardiomiopatiei dilatative.

Decese care au survenit în urma

intoxicaţiilor etilice acute - comele alcoolice Alcoolul este un drog, o substanţă psihoactivă şi un toxic

celular cu efect deprimant asupra sistemului nervos central. Rezultatele obţinute, la analiza celor 46 de cazuri de persoane

care au decedat în perioada 2008-2010 prin intoxicaţie etanolică acută şi care au prezentat alcoolemie peste 1,5 g‰ au fost sintetizate în tabelele 6-8.

Tabelul 6. Concentraţia alcoolică la persoanele decedate prin intoxicaţie etilică acută-comă etilică în anul 2008

Nr. caz


8 2,30 2,85 50 U M 36 3,30 3,55 55 R M 51 2,65 3,75 32 R M 52 3,15 3,30 49 U M

113 3,65 - 41 R M 115 1,80 1,95 53 R M 240 3,15 3,35 76 U M 241 3,05 3,80 68 R M 269 3,85 3,90 47 R F 288 3,65 3,45 42 U M 327 3,30 - 55 U M 326 2,95 3,45 64 R M

http://www.romedic.ro/aritmia

15

Tabelul 7. Concentraţia alcoolică la persoanele decedate

prin intoxicaţie etilică acută-comă etilică în anul 2009 Nr. caz


31 3,65 3,70 44 U M 155 2,55 2,80 50 U M 167 3,95 2,25 26 U M 191 2,50 3,00 41 R M 229 4,60 3,70 53 U M 271 3,30 - 78 R F 273 3,00 - 53 U M 285 3,55 3,95 58 R M 297 3,85 - 72 R F 323 3,80 3,85 38 R M

Tabelul 8. Concentraţia alcoolică la persoanele decedate

prin intoxicaţie etilică acută-comă etilică în anul 2010 Nr. caz


7 2,00 1,85 56 U M 19 3,20 3,90 42 U M 89 4,10 4,70 41 R M 86 2,40 - 45 R M

107 3,55 3,70 54 R M 110 3,85 4,35 41 R F 112 3,65 3,85 48 R M 116 3,55 3,85 38 U M 123 4,65 3,85 62 R M 155 3,40 3,90 63 R M 167 3,95 3,40 65 R F 169 3,50 4,00 55 R M 198 3,60 4,50 42 R F 181 2,25 - 4 R F 183 3,35 2,95 62 U F 265 4,15 3,85 47 R F 268 3,20 - 73 U F 277 3,30 3,85 18 R M 280 3,50 4,20 61 R M 303 2,90 3,15 54 R M 341 4,55 4,60 61 U M

16

343 4,50 3,90 38 R M 347 4,50 4,60 31 R F 391 3,50 3,95 73 R F

Vârsta medie a pacienţilor a fost de 52,66 ani (2008),

51,30 ani (2009) şi 48,91 ani (2010); cu o medie pentru lotul total de 50,41 ani, ceea ce înseamnă o populaţie relativ tânără, aptă de muncă.

Se constată că în general numărul de decese survenite prin comă etilică a fost mai mare în mediu rural.

Din datele prezentate, se observă că valorile medii ale alcoolemiilor în toţi anii la bărbaţi sunt de peste 3,50 g‰, iar la femei peste 2,99 g‰ (figura 6).

3,45

3,522,99

3,85

3,57

3,59

0

1

2

3

4

5

2008 2009 2010anul

alco

olem

ie m

edie

femininmasculin

Fig. 6. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie de sex

pentru cazurile cu deces prin comă etilică Acţiunea alcoolului asupra sistemului nervos central se

desfăşoară progresiv în strânsă legătură cu cantitatea de alcool din sânge. Mai întâi sunt afectate emisferele cerebrale care prin scoarţa cerebrală cenuşie constituie centrul conştiinţei, a raţiunii, precum şi locul central de recepţionare a diferitelor senzaţii.

Consumul cronic de alcool determină modificări morfopatologice cerebrale, astfel atrofia cerebrală şi degenerescenţa cerebeloasă alcoolică interesează în special vermisul cerebelos şi respectiv cortexul frontal, în stadiile avansate devine severă şi difuză cu marcantă lărgire a spaţiilor lichidiene externe şi interne.

17

Decese care au survenit în urma suicidului prin spânzurare asociate cu consumul de etanol

Interacţiunile dintre alcoolism, depresie şi anxietate sunt foarte complexe, iar persistenţa depresiei şi/sau a anxietăţii, netratate la timp şi integrat, înrăutăţeşte calitatea vieţii crescând şi riscul suicidar. Rezultatele obţinute la analiza probelor provenite de la persoane care s-au sinucis prin spânzurare şi la care alcoolemia a fost peste valoarea de 1,5 g‰ (vena femurală) sunt prezentate în tabelele 9-11.

Tabelul 9. Cazurile depistate cu alcoolemie peste 1,5 g‰ (vena femurală) şi care s-au sinucis prin spânzurare, în anul 2008 Nr. caz


5 2,00 2,70 30 R M 118 2,80 3,05 40 R F 131 2,60 - 72 R M 159 1,80 2,30 61 U M 266 2,40 3,15 39 R M 330 1,80 1,90 55 R M



27 2,70 3,25 44 R M 28 1,75 - 48 R M 43 2,60 2,95 24 R M 51 2,10 - 41 U M 64 1,90 2,35 34 R M 68 3,15 3,40 38 R F 95 1,55 1,65 44 R M

134 2,25 2,70 61 R M 189 2,55 3,00 38 R M 198 2,50 2,70 28 U M 220 1,60 2,10 46 R M 245 2,05 2,70 35 R M 266 1,60 - 41 R M 264 2,60 2,90 34 R F 275 2,35 2,90 49 R M 290 2,75 3,10 48 U M 294 1,50 1,85 66 U M

18



53 1,90 2,55 39 U M 65 2,30 2,80 40 U M

106 1,70 - 49 R M 118 2,15 - 32 R M 146 1,65 - 38 U M 153 2,75 3,15 47 R M 158 2,65 - 36 R M 197 2,40 - 51 R M 255 2,20 2,50 38 R M

258 2,35 2,95 55 R M 295 2,30 - 30 R M 328 3,20 - 39 R M 374 1,75 1,35 33 U F 386 1,75 2,10 36 U M

În perioada 2008-2010 au fost înregistrate 50 de cazuri de

suicid prin spânzurare, cu o vârstă medie a indivizilor de 44,63 ani, dar cu variaţii de: 53 ani (2008), 44,70 ani (2009) şi 40,80 ani în anul 2010. 76% din cazuri sunt persoane din mediul rural şi 24% din mediul urban.

Se poate observa că în perioada analizată ponderea sinuciderilor prin spânzurare a fost mai mare în mediul rural. Din lotul total analizat 92% sunt bărbaţi şi doar 8% sunt femei. Variaţia alcoolemiei medii funcţie de sex în cazurile de deces prin spânzurare este prezentată în figura 7.

1,86

2,8 2,88

1,861,751,83

00,5

11,5

22,5

33,5

2008 2009 2010 anul

alco

olem

ie m

edie

masculinfeminin

Fig. 7. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie de sex

pentru cazurile cu deces prin spânzurare

19

În anul 2000, s-au sinucis aproximativ 815.000 de persoane în

întreaga lume. Aceasta înseamnă o rată a mortalităţii de circa 14,5 la 100.000 de locuitori sau un deces la fiecare 40 de secunde. Sinuciderea reprezintă a 13-a cauză de deces în lume.

Alcoolodependenţa asociată cu o tulburare depresivă comportă un mare risc autolitic, ceea ce argumentează necesitatea depistării şi tratării active a alcoolicilor deprimaţi.

Datele prezentate, indică faptul că în marea majoritate a cazurilor, persoanele care au ales să facă acest gest, indiferent de motivaţiile fiecăruia sau de mediul din care a provenit, au consumat cantităţi impresionante de alcool (48,97% din indivizi cu alcoolemie peste 2 g‰), care indirect, putem sugera că a fost una din cauzele care au dus la gestul suicidal.

Decese care au survenit în urma hipotermiei

asociată cu consumul de etanol Alcoolicii beau mai mult pe vreme geroasă, pentru a se

încălzi, dar căldura astfel obţinută, prin vasodilataţie, este înşelătoare. Majoritatea cazurilor de hipotermie apar în lunile de iarnă.

Factorii de risc includ vârstele extreme (în special persoanele în vârstă), cei fără locuinţă, consumatorii de alcool, malnutriţia, sărăcia, bolile psihice, folosirea de neuroleptice şi hipotiroidismul.

Hipotermia este întâlnită la persoanele intoxicate cu alcool, intoxicaţia inhibând mecanismul de apărare împotriva frigului.

Valori mai mari ale concentraţiei alcoolului în urină, aşa cum se observă în numeroase cazuri de persoane decedate prin hipotermie, arată că alcoolul era în fază de eliminare şi că la aceste persoane decesul prin hipotermie s-a produs mai târziu decât consumul de alcool. Doar în patru cazuri concentraţia alcoolului în sânge a fost mai mare decât în urină, acesta fiind în faza de absorbţie ceea ce indică faptul că decesul a survenit rapid după consumul de alcool.

Vârsta medie pentru lotul total a fost de 59,26 ani, cu următoarele medii pe ani: 62 ani (2008), 51 ani (2009) şi 59,88 ani în 2010.

Din 26 de cazuri în care persoanele au decedat prin hipotermie asociată cu un consum mare de alcool, 11,54% au provenit din mediul urban şi 88,46% din mediul rural.

20

Din lotul total, 18 (69,23%) sunt bărbaţi şi 8 (30,77%) sunt femei. Valorile medii ale alcoolemiei funcţie de sex pentru cazurile de deces prin hipotermie, sunt aproape duble la bărbaţi comparativ cu femeile (figura 8).

0,65

2,33

1,13

1,58

2,25

0

0,5

1

1,5

2

2,5

2008 2009 2010 anul

alco

olem

ie m

edie

femininmasculin

Fig. 8. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie sex

pentru cazurile de deces prin hipotermie Conform rapoartelor poliţiei privind aceste cazuri o parte din

persoane erau oameni fără adăpost care consumau frecvent alcool şi cădeau pe străzi unde datorită gradului avansat de ebrietate, adormeau.

Valorile în umoarea vitroasă, la cadavrele unde s-a putut preleva, au fost mult mai mari decât în vena femurală, ceea ce ne arată ca după cădere ei au mai trăit, erau în faza de eliminare a alcoolului, de aceea valorile în vitros sunt mult mai mari decât în vena femurală.

Decese care au survenit în urma accidentelor rutiere/ feroviare

asociate cu consumul de etanol Intoxicaţia alcoolică diminuează (într-un raport direct

proporţional cu gradul intoxicaţiei) toate calităţile care se cer unui bun conducător autor: atenţia continuă, coordonarea mişcărilor, rapiditatea judecării unei situaţii, reflexele intacte pentru a putea interveni prompt în situaţii dramatice.

Rezultatele obţinute la analiza probelor provenite de la persoanele decedate în urma unor accidente rutiere sau feroviare sunt prezentate în tabelele 12-14.

21

Tabelul 12. Cazurile de deces prin accident rutier sau feroviar şi cu o concentraţie alcoolică peste 1,5 g‰ (2008)

Nr. caz


11* 1,65 2,35 50 R M 50 1,75 1,40 57 R F

191 2,35 2,70 21 R M 223 1,65 1,65 43 R M

248 2,70-craniu; 2,60-torace 3,20 36 R M

264 2,25 2,90 27 R M * accident feroviar Pentru cazul 248, datorită exanguinării cadavrului, nu s-a

putut preleva sânge din vena femurală, dar valoarea alcoolemiei din umoarea vitroasă corelată cu cea din urină au putut oferi informaţii preţioase medicului legist asupra concentraţiei etanolului.

Tabelul 13. Cazurile de deces prin accident rutier sau feroviar şi cu o

concentraţie alcoolică peste 1,5 g‰ (2009) Nr. caz


10 2,55 2,75 45 R M 59 3,10 2,25 20 R M

227 3,10 - 72 R M

Tabelul 14. Cazurile de deces prin accident rutier sau feroviar şi cu o concentraţie alcoolică peste 1,5 g‰ (2010)

Nr. caz


40 1,70 2,35 42 R M 207 1,95 2,75 30 R M 250 2,30 2,25 39 R M 260 2,40 2,05 60 U M 316 2,20 2,40 68 U M 324 1,55 1,60 33 R M 325 1,95 2,10 50 R M

* accident feroviar Lotul total a fost format din 23 de cazuri cu vârsta medie de

43 ani, cu următoarele valori medii pe an: 39,63 ani (2008), 46,20 ani

22

(2009) şi 46 ani în anul 2010. Din 23 de cazuri analizate, 26,08% dintre cazuri provin din

mediul urban şi 73,92% din mediul rural. Valorile medii ale alcoolemiei au oscilat între 0,65 g‰

(mediu urban) şi 2,91 g‰ (mediu rural) valoarea cea mai mare fiind înregistrată în anul 2009 (figura 9).

2,25

0,65

2,3

1,58

2,91

1,89

00,5

11,5

22,5

33,5

2008 2009 2010 anul

alco

olem

ie m

edie

urbanrural

Fig. 9. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie de mediul de provenienţă, pentru cazurile cu deces prin accidente rutiere sau

feroviare 95,65% sunt bărbaţi şi 4,35% femei, iar valoarea medie a

alcoolemie depăşeşte valoarea 1,67 g‰ (figura 10).

1,75 22,01

1,67

00,5

11,5

22,5

2008 2009 2010 anul

alco

olem

ie m

edie

femininmasculin

Fig. 10. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie de sex, pentru cazurile cu deces prin accidente rutiere sau feroviare

Conform Poliţiei Rutiere Române, una dintre principalele

cauze ale producerii accidentelor rutiere este conducerea autovehiculelor sub influenţa băuturilor alcoolice. În România, se înregistrează ,în medie, 2794 de decese cauzate de accidente rutiere,potrivit datelor adunate de Organizaţia Mondială a Sănătăţii,

23

Eurostat şi Banca Mondială şi 126 de decese la un milion de locuitori. Astfel,România se află pe locul cinci în Europa şi Asia Centrală,din punctul de vedere al costurilor provocate de accidentele rutiere,se arată întrun studiu publicat de Poliţia Rutieră Română.

În cazurile examinate în judeţul Vaslui care au decedat în urma acestor tipuri de accidente valoarea alcoolemiei a fost de cele mai multe ori extrem de mare. În cazul accidentelor rutiere, toate persoanele decedate au fost conducători auto.

Decese care au survenit în urma intoxicaţiilor cu diferite substanţe

asociate cu consumul de etanol Din 23 de cazuri luate în studiu, 16 cazuri au fost intoxicaţii

acute cu monoxid de carbon. Doar 3 persoane au avut o valoare a alcoolului mai mică de 1 g‰ (câte un caz pentru fiecare an). În 11 cazuri s-au înregistrat valori ale alcoolemiei de peste 1,5 g‰, ceea ce duce la incoordonare motorie, la afectarea memoriei şi a înţelegerii.

Vârsta medie pentru lotul analizat a fost de 57,86 ani, cu următoarele medii anuale: 50 ani în 2008, 58,66 ani în 2009 şi 62,90 ani în 2010.

Din cele 16 cazuri intoxicate cu monoxid de carbon, trei (18,75%) provin de mediul urban şi 13 din mediul rural (81,25%), marea problemă în mediul rural reprezentând-o sobele care nu sunt întreţinute corespunzător, provocând an de an tragedii în rândul populaţiei. În toţi anii luaţi în studiu, valorile medii ale alcoolemiei, la persoanele decedate prin intoxicaţii, sunt peste 1,50 g‰ (figura 11).

1,8 1,781,651,89 1,93

0

0,5

1

1,5

2

2,5

2008 2009 2010 anul

alco

olem

ie m

edie

urbanrural

Fig. 11. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie de mediul de

provenienţă, pentru cazurile cu deces prin intoxicaţie

24

Pentru lotul total, 13 sunt bărbaţi (56,52%) şi 10 femei (43,48%), ponderea fiind destul de echilibrată în privinţa acestui tip de decese. Alcoolemia medie la lotul studiat (2008-2010) a variat între 1,26 şi 2,3 g‰ la femei, iar la bărbaţi între 1,66 şi 2,15 g‰ (figura 12).

1,26

2,3

1,6

2,15

1,661,71

0

0,5

1

1,5

2

2,5

2008 2009 2010 anul

alco

olem

ie m

edie

femininmasculin

Fig. 12. Valorile medii ale alcoolemiei (g‰) în funcţie de sex,

pentru cazurile cu deces prin intoxicaţie Datele provenite de la cele 356 de cazuri analizate sunt

prezentate în tabelul 15. Tabelul 15. Tabel centralizator cu persoanele decedate

din anumite cauze şi consum de alcool

Cauza decesului

Nr. cazuri

Vârsta medie (ani)

Alcoolemie medie (g‰)

Mediu Sex

urban rural M F

Boli cardio-vasculare 78 56,75 1,62 17 61 65 13

Spânzurare 50 44,70 1,86 12 38 46 4 Comă etilică 46 50,41 3,40 16 30 34 12 Hipotermie 26 52,26 1,59 3 23 18 8 Accidente rutiere/ feroviare

23 43 1,78 6 17 22 1

Omucidere 29 48,48 2,20 3 26 22 7 Intoxicaţii 23 57,86 1,77 3 20 13 10 Înec 23 55,34 1,90 6 17 19 4 Traumatisme prin cădere 29 57,13 1,81 8 21 20 9

Alte cauze 29 52 1,45 9 20 26 3 Total/medii 356 52,48 1,98 83 273 285 71

25

Din datele centralizate în tabelul 15 se constată că indiferent

de cauza de deces media de vârstă este între 43 şi 58 de ani, ceea ce înseamnă o populaţie relativ tânără, activă în câmpul muncii. Se poate observa că media de vârstă cea mai mică este în cazul accidentelor rutiere (43 ani) şi în cazul sinuciderilor (44 ani). În marea majoritate a cazurilor valoarea medie a alcoolemiei a fost peste 1,5 g‰.

Din totalul de 356 de cazuri studiate cele mai multe decese (76,69%) au fost în mediul rural. La sexul masculin s-au înregistrat 80,05% decese în timp ce la femei 19,95%

Se observă că pe perioada celor trei ani luaţi în studiu, cele mai multe decese sunt produse prin moarte cardiacă asociată cu consum de etanol, valoarea medie a concentraţiei de alcool fiind de 1,62 g‰. Urmează sinuciderile prin spânzurare şi comele etanolice fiecare reprezentând mai mult de 10%, respectiv 14,04% şi 12,92%, restul cauzelor de deces fiind sub 10%. Atât în cazul sinuciderilor cât şi al comelor etanolice, valorile concentraţiilor etanolului sunt mari 2,2 g‰ respectiv 3,4 g‰ (figura 13).

00,5

11,5

22,5

33,5

4

afec

tare

card

iacă

spân

zura

re

com

ă et

ilică

hipo

term

ie

acci

dent

e

omuc

ider

e

into

xica

ţii

înec

trau

mat

ism

e

cauza decesului

alcoolemie 200820092010

Fig. 13. Repartiţia pe ani în funcţie de cauza de deces

şi valoarea medie a alcoolemiei (g‰) Indiferent de cauza decesului valorile medii ale alcoolemiilor

sunt foarte mari (peste 1,5 g‰), ceea ce înseamnă deja pierderea

26

coordonării musculare, tulburări de mers, confuzie mintală, exagerarea stărilor emoţionale, ameţeli, scăderea răspunsului la durere, dezorientare şi afectarea vorbirii.

V.4. Concluzii

Din analiza rezultatelor obţinute, pentru o perioadă de trei ani (2008-2010) se constată că:

• numărul de decese prin afectare cardiacă, asociată cu concentraţii mari al alcoolului a crescut de la an la an, valorile maxime alcoolemiei determinate fiind: 2,45 g‰ (2008); 2,75 g‰ (2009) şi 3,30 g‰ (2010);

• în cazul deceselor prin spânzurare datele obţinute ne indică valori ale alcoolemiei peste 1,80 g‰;

• pentru persoanele decedate prin comă etilică valorile medii ale concentraţiei alcoolice la bărbaţi sunt peste 3,50 g‰, iar la femei peste 2,99 g‰;

• au fost înregistrate la 50 de cazuri de siucid prin spânzurare; concentraţia alcoolică în vena femurală a variat între 1,40-2,60 g‰ (2008); 0,50-3,15 g‰ (2009) şi 0,40-3,20 g‰ (2010).

• în perioada 2008-2010 în judeţul Vaslui au decedat 23 de persoane din cauza intoxicaţiilor cu diferite substanţe şi consum de alcool; cele mai multe intoxicaţii au fost cu monoxid de carbon (16 cazuri).

27

CAPITOLUL VI

STUDII CHIMICO-TOXICOLOGICE DE DETERMINARE A ALCOOLULUI ETILIC PRIN GC-HS

VI.1. VALIDAREA METODEI DE DOZARE A ETANOLULUI

DIN SÂNGE PRIN GC-HS FOLOSIND IZOPROPANOLUL CA STANDARD INTERN

Limitările metodei Cordebard, omogenitatea variabilă a

probelor care induce erori la prelevarea eşantionului pentru analiză, necesitatea alinierii metodelor de dozare a alcoolului etilic din probele biologice la cerinţele analitice din ţările Uniunii Europene, au impus necesitatea elaborării unei noi metode analitice care să elimine pe cât posibil orice sursă de eroare şi să confere analistului siguranţa unui rezultat corect.

VI.1.2. Principiul metodei

Alcoolul etilic separat din proba biologică în dispozitivul head space, este introdus în coloana cromatografică în care migrează în funcţie de afinitatea faţă de faza staţionară a coloanei şi este vehiculat către detector. Semnalul generat în detector este vizualizat sub forma unui pic pe cromatogramă, iar în funcţie de curba de calibrare şi aria pic-ului obţinut la analiza probei se determină concentraţia alcoolului etilic în proba respectivă.

VI.1.3. Materiale şi aparatură

Reactivi şi probe biologice etaloane standardizate (Restek, USA) de alcool etilic de

concentraţii: 0,5 g‰; 0,8 g‰; 1,0 g‰; 1,5 g‰; 2,0 g‰; 3,0 g‰; 4,0 g‰ în apă bidistilată;

probe de sânge prelevate pe anticoagulant (NaF); izopropanol (standard intern) (Merck).

Prelucrarea probelor Probele au fost prelevate de la conducători auto, la solicitarea

poliţiei, utilizând truse speciale. În flaconul de headspace de 20 mL se introduc: 250 µL probă,

1750 µL soluţie isopropanol 0,4 g‰ în soluţie sulfat de amoniu 1M.

28

Aparatură Condiţiile pentru HS (G 1888): temperatura cuptorului 80°C;

temperatura buclei 90°C; temperatura buclei de transfer 110°C; timpul de echilibrare 15 minute; timpul unui ciclu GC 6 minute; timpul de injectare 0,5 minute.

Condiţiile pentru GC (Agilent, GC 6890 N): temperatură cuptor 60°C izoterm; rata de splitare 5:1, gaz purtător - He; detectori: FID-1 260oC; FID-2 260oC; coloane: DB-ALC1 (30m x 0,32µm x 1,8µm) şi DB-ALC2 (30m x 0,32µm x 1,2µm).

VI.1.4. Validarea metodei

VI.1.4.1. Specificitatea metodei În condiţiile menţionate metoda este specifică pentru etanol,

obţinându-se un timp de retenţie bine definit pentru etanol şi pentru izopropanol (figura 14).

Fig. 14. Cromatograma obţinută la analiza unei soluţii standard de

etanol de concentraţie 1 g‰ În funcţie de tipul coloanei utilizate atât pentru alcool etilic

cât şi pentru izopropanol au fost obţinuţi timpi de retenţie specifici: • alcool etilic - 1,361 min. (coloana DB-ALC1), 1,311 min.

(coloana DB-ALC2); • izopropanol - 1,550 min. (coloana DB-ALC1), 1,457 min.

(coloana DB-ALC2). Coloana DB-ALC1 are o grosime a fazei staţionare de 1,8 µm

(comparativ cu 1,2 µm pentru coloana DB-ALC2) şi va determina creşterea timpului de retenţie a analitului în coloană.

Rezoluţia obţinută a fost întotdeauna > 3,5 ceea ce indică o foarte bună separare a picurilor.

29

VI.1.4.2. Liniaritatea Pentru evaluarea liniarităţii s-a stabilit curba de etalonare

formată din 7 puncte. Pentru fiecare punct de pe curbă s-au pregătit trei soluţii, care au fost analizate în aceleaşi condiţii şi s-a calculat media determinărilor.

Parametrii caracteristici curbelor realizate în cazul utilizării coloanei DB-ALC1 şi a detectorului FID-1A sunt prezentaţi în tabelul 16, iar curba de calibrare în figura 15.

Tabelul 16. Parametrii caracteristici curbei de etalonare

tR (min) Semnalul Concentraţia soluţiei de alcool etilic (g‰)

Media ariei picurilor

1,362 coloana DB-ALC1 detector FID-1A

0,5 71,95158 0,8 121,20863 1,0 154,96611 1,5 224,55360 2,0 301,76907 3,0 453,08987 4,0 608,08527

Amount Ratio0 5

Area Ratio

0

0.2

0.4

0.6

0.8

12

3

4

5

6

7

etanol, FID1 A

Correlation: 0.99958

Rel. Res%(3): 1.618

Area Ratio = 0.09142198*AmtRatio -0.0058

Fig. 15. Curba de calibrare pentru coloana DB-ALC1, detector FID-1A Ecuaţiile dreptelor caracteristice celor două curbe de calibrare

sunt: • pentru curba realizată pe coloana DB-ALC1, detector FID-1A

y = 152,09 · conc – 1,5847 R2 = 0,99958 • pentru curba realizată pe coloana DB-ALC2, detector FID-2B

y = 158,84 · conc – 2,3269 R2 = 0,99953 VI.1.4.3. Exactitatea şi precizia metodei

30

Pentru determinarea exactităţii şi preciziei metodei s-au rulat etaloanele drept probe, obţinându-se concentraţii apropiate de cele teoretice, procentul de regăsire (acurateţea) încadrându-se între 99,37% şi 107,7%. Aceste valori ale procentelor de regăsire subliniază precizia şi exactitatea metodei elaborate.

Datele obţinute sunt prezentate în tabelul 17 (coloană DB-ALC1; detector FID-1A).

Tabelul 17. Rezultatele obţinute la evaluarea exactităţii şi preciziei

metodei, utilizînd soluţii de etanol în apă

tR (min)

Media ariei picurilor

Concentraţia teoretică

(g‰)

Concentraţia determinată

(g‰)

Regăsirea (%)

1,362 76,73072 0,5 0,53854 107,70% 1,361 153,04187 1,0 1,02518 102,51% 1,361 227,03665 1,5 1,53140 102,09% 1,360 457,00775 3,0 2,96672 98,89% 1,361 618,54785 4,0 3,97495 99,37%

Valorile pentru deviaţia standard relativă corespunzătoare

concentraţiei (RDS), calculată pe baza programului Chem Station au fost între 0,5 şi 3,5%.

VI.1.4.4. Reproductibilitatea şi precizia intermediară Pentru a evidenţia repetabilitatea metodei s-au rulat mai

multe zile la rând eşantioane pregătite din acelaşi probe de sânge care au fost realizate zilnic în aceleaşi condiţii ca şi curba de etalonare. Rezultatele inter-day au fost foarte bune, obţinându-se de la o zi la alta diferenţe de concentraţii între 0,01 şi 0,05 g‰.

Valoarea RSD (corespunzătoare concentraţiei) pentru prima zi a fost de 3,412 şi 2,484 pentru a doua zi.

Pentru matricile omogene valorile RSD au fost cuprinse între 0,5 şi 3,5%. Obţinerea unor valori ale RSD sub 3,5% subliniază încă odată superioritatea metodei de analiză prin gaz cromatografie cuplată cu head space comparativ cu metoda Cordebard unde pentru aceste probe neomogene apar erori la separarea alcoolului etilic din proba biologică.

Datorită individualităţii probelor de sânge (matrice complexă şi unică fiecărui pacient) s-a verificat şi precizia per probe reale. Astfel prin rularea unor probe de sânge de la 3 pacienţi diferiţi, câte

31

6 determinări pentru 2 pacienţi, respectiv 5 determinări la ultimul pacient.

Valorile RSD obţinute pentru cele trei probe au fost de: 1,72 (pacientul 1), 2,60 (pacientul 2) şi 1,61 (pacientul 3), valori care demonstrează repetabilitatea metodei.

VI.1.4.5. Limita de detecţie şi limita de cuantificare Rezultatele sunt prezentate în tabelul 18. Tabelul 18. Limitele de detecţie şi limitele de cuantificare Semnalul ES a LD (g‰) LC (g‰)

2 2,96415 158,84 0,055 0,186 1 2,69742 152,09 0,053 0,177

VI.1.5. Concluzii

Rezultatele obţinute arată că pe domeniul de concentraţie studiat (0,5-4,0 g‰) metoda este liniară, exactă şi precisă (RDS ≤3,5%). Această metodă este rapidă (6 minute), sângele nu necesită prelucrări suplimentare, doar o diluţie cu standard intern.

Omogenitatea matricei este direct proporţională cu exactitatea rezultatelor, obţinându-se pentru aceste probe valori ale RDS ≤ 1,5%.

32

VI.2. DEZVOLTAREA ŞI VALIDAREA METODEI DE

DETERMINARE A ETANOLULUI DIN DIVERSE FLUIDE BIOLOGICE FOLOSIND TERŢ-BUTANOLUL, DREPT

STANDARD INTERN Pentru a elimina interferenţa isopropanolului, care este un

produs de descompunere a probelor biologice, am înlocuit standardul intern cu terţ-butanolul care nu apare în procesele de descompunere a fluidelor biologice sau a ţesuturilor.


Reactivi şi probe biologice soluţii etalon standardizate (Restek, USA) de alcool etilic de

concentraţii: 0,5 g‰; 0,8 g‰; 1,0 g‰; 1,5 g‰; 2,0 g‰; 3,0 g‰; 4,0 g‰, în apă bidistilată;

probe de sânge de control (probe standardizate) (Medichem) care conţin alcool etilic, de concentraţii: 0,5 g‰; 0,8 ‰; 1,1 ‰;

probe de sânge prelevate pe anticoagulant (NaF) de la conducători auto şi probe de sânge prelevate de la cadavre (din vena femurală)

terţ-butanol (standard intern) (Merck); soluţie sulfat de amoniu 1M în apă bidistilată.

Prelucrarea probelor În flaconul de headspace de 20 mL se introduc: 250 µL probă,

1750 µL soluţie terţ-butanol 0,4 g‰ în soluţie sulfat de amoniu 1M. Aparatură Condiţiile pentru HS (G 1888): temperatura cuptorului 80°C;

temperatura buclei 90°C; temperatura buclei de transfer 110°C; timpul de echilibrare 15 minute; timpul unui ciclu GC 6 minute; timpul de injectare 1,0 min.

Condiţiile pentru GC (GC 6890 N): temperatura cuptorului 40°C (izoterm); rata de splitare 5:1; presiunea 18,8 psi (constantă); gaz purtător - He; make-up - He- pentru detector, hidrogen şi aer sintetic; detectori: FID-1A 260oC şi FID-2B 260oC; coloane DB-ALC1 (30m x 0,32µm x 1,8µm) şi DB-ALC2 (30m x 0,32µm x 1,2µm).

33

VI.2.4. Validarea metodei VI.2.4.1. Specificitatea metodei Specificitatea metodei este demonstrată de timpii de retenţie

diferiţi pentru alcoolul etilic şi standardul intern (figura 16).

Fig. 16. Cromatograma obţinută la analiza soluţiei etalon

de alcool etilic 0,5 g‰ pe cele două coloane specifice analizei alcoolului În funcţie de tipul coloanei s-au obţinut următorii timpi de

retenţie: - alcool etilic - 1,593 min. (coloana DB-ALC1); 1,544 min.

(coloana DB-ALC2); - terţ-butanol - 2,252 min. (coloana DB-ALC1); 2,155 min.

(coloana DB-ALC2). Rezoluţia obţinută a fost întotdeauna > 3,5 ceea ce indică o

foarte bună separare a picurilor aşa cum se poate şi observa din cromatogramă.

VI.2.4.2. Liniaritatea metodei Pentru evaluarea liniarităţii s-a stabilit curba de etalonare

formată din 7 puncte. Din fiecare concentraţie s-au rulat câte 3 flacoane, iar în tabelul 19 este trecuta media ariilor picurilor obţinute pentru coloana DB-ALC1 şi detectorul FID-1A. Curba de calibrare este prezentată în figura 17.

34

Tabelul 19. Parametrii caracteristici curbei de etalonare realizată pe coloana DB-ALC1 pentru analiza etanolului

tR (min) Semnalul Concentraţia soluţiei

de alcool etilic (g‰) Media ariilor

picurilor


0,5 94,48441 0,8 143,54817 1,0 179,07971 1,5 263,82382 2,0 355,03076 3,0 574,42194 4,0 728,93152

Amount Ratio 0 5

Area Ratio

0 0.05

0.1 0.15

0.2 0.25

0.3 0.35

1 2 3

4 5

6

7

etanol, FID1 A

Correlation: 0.99994

Rel. Res%(1): -1.522 Area Ratio = 0.03674466*AmtRatio -0.0007516

Fig. 17. Curba de calibrare obţinută la analiza alcoolului etilic pe coloana DB-ALC1 şi detectorul FID-1A

Ecuaţiile dreptelor caracteristice celor două curbe de calibrare

sunt: • pentru curba realizată pe coloana DB-ALC1, detector FID-1A

y = 178,55 · x – 3,774 R2 = 0,99994 • pentru curba realizată pe coloana DB-ALC2, detector FID-2B

y = 185,77 · x – 5,512 R2 = 0,99993

VI.2.4.3. Precizia Precizia sistemului a fost stabilită prin rularea unor probe de

sânge de la pacienţi diferiţi, câte 5 determinări pentru fiecare pacient. În cazul analizei probelor de la primii doi pacienţi (probele au

fost perfect omogene) valorile RSD au fost sub 1%: 0,905325 (pacientul 1) şi 0,961965 (pacientul 2).

Analizând proba provenită de la al treilea pacient s-a obţinut un RSD de 2,518, ceea ce dovedeşte că atunci când sângele nu este perfect omogen valoarea RSD creşte, dar creşterea este în limita

35

acceptată de specificaţiile tehnice ale aparatului (maxim 5%). Precizia intermediară şi reproductibilitatea, urmează a fi

demonstrate în colaborare cu colegii din celelalte laboratoare. VI.2.4.4. Repetabilitatea Repetabilitatea analizei (precizia intra-proba) s-a stabilit prin

efectuarea a câte 9 determinări pentru fiecare nivel de concentraţie cunoscut, în cadrul aceleaşi zile. Datele obţinute la analiza soluţiilor de concentraţie de 1,5 g‰; 2,5 g‰ şi 3 g‰, cu media, deviaţiile standard (SD) şi valorile RSD sunt prezentate în tabelul 20.

Tabelul 20. Rezultatele obţinute la evaluarea repetabilităţii analizei

(precizia intra-probă)

Nr. determinării

Date practice obţinute la analiza soluţiei etalon de concentraţie

1,5 g‰ 2,5 g‰ 3 g‰ 1 1,53333 2,51206 3,00373 2 1,53338 2,45475 3,00767 3 1,54975 2,46245 3,01235 4 1,52861 2,50904 3,02735 5 1,52984 2,50282 3,01935 6 1,54295 2,51022 3,07797 7 1,53315 2,51201 3,00975 8 1,53320 2,45571 3,03135 9 1,54379 2,46131 3,02147

Media 1,536444 2,486708 3,023443 SD 0,007235 0,026948 0,022415 RSD (CV) 0,470905 1,083699 0,741383

VI.2.4.5. Acurateţea Pentru determinarea acurateţei (exactitatea) metodei s-au

rulat: etaloanele cu alcool în apă drept probe, obţinându-se

concentraţii apropiate de cele teoretice, procentul de regăsire încadrându-se între 100,39% şi 102,2% (în funcţie de coloană şi detector),

etaloane de sânge de control care conţin etanol cu următoarele concentraţii: 0,25 g‰; 0,5 g‰; 0,8 g‰; 1,1 g‰, procentele de regăsire fiind intre 99,61% şi 103,12%. Pentru fiecare concentraţie s-au rulat câte 3 flacoane, în tabel fiind trecută media.

36

Datele obţinute pentru toate cele 7 puncte din curba de etalonare şi regăsirea pentru soluţiile etalon de etanol în apă sunt prezentate în tabelul 21.

Tabelul 21. Rezultatele obţinute la evaluarea acurateţei metodei,

utilizând soluţii de etanol în apă tR

(min) Media ariilor

picurilor Concentraţia

teoretică (g‰) Concentraţia

determinată (g‰) Regăsirea

(%) 1,589 94,48441 0,5 0,50194 100,39% 1,591 143,54817 0,8 0,80912 101,14% 1,591 179,07971 1,0 1,01051 101,05% 1,592 263,82382 1,5 1,53338 102,22% 1,591 355,03076 2,0 2,03223 101,61% 1,590 574,42194 3,0 3,00767 100,25% 1,593 728,93152 4,0 4,07141 101,78%

Pentru siguranţa rezultatelor zilnice, în fiecare zi trebuie

verificată curba de etalonare din ziua precedentă, evaluându-se cel puţin 2, 3 puncte de pe curbă, de concentraţii cunoscute. Dacă, în urma verificărilor curba corespunde, se introduc probele de sânge de control, corespunzătoare la minim 2 puncte din curba de etalonare şi abia apoi se introduc probele de la pacienţi.

După ce a fost verificată curba de etalonare utilizând soluţii de etalon în apă corespunzătoare la trei puncte din curbă, s-a trecut la verificarea concentraţiilor unor probe standardizate de etanol în sânge, rezultatele fiind prezentate în tabelul 22.

Tabelul 22. Datele obţinute la analiza probei standardizate de etanol în

sânge (coloana DB-ALC1, detector FID-1A) tR

(min) Media ariilor

picuril Concentraţia teoretică (g‰)

Concentraţia determinată (g‰)

Regăsirea (%)

1,594 98,41310 0,5 0,53014 106,03 1,594 138,54683 0,8 0,82873 103,59 1,593 191,59000 1,1 1,14448 104,04

Se observă că procentele de regăsire, la analiza probelor

standardizate de etanol în sânge, sunt mai mari comparativ cu cele determinate la analiza soluţiilor de etanol în apă, ele încadrându-se în limitele cerute pentru validarea metodelor pe produse biologice (±20%) şi în limitele intervalului de încredere recomandat de

37

producători. Cu toate acestea, utilizarea sângelui de control, care este un

sistem foarte stabil, permite utilizarea zilnică a acestor probe pentru o perioadă mai lungă de timp, astfel se pot utiliza probe zilnice pentru o perioadă de cel puţin o lună fără să prezinte modificări semnificative ale concentraţiilor de etanol.

Rezultatele obţinute la realizarea curbelor de calibrare şi la analiza probelor de sânge standardizate în etanol au fost aplicate la analiza probelor de sânge. Din fiecare probă s-au rulat câte 5-8 flacoane. Valorile pentru deviaţia standard relativă (RSD), calculată pe baza programului ChemStation au fost între 0,5-3,5%.

S-a stabilit acurateţea metodei şi pe sânge, realizând o curbă de calibrare cu etanol în sânge standardizat (Medichem), în 5 puncte de concentraţii (tabelul 23). Pentru curba de calibrare respectivă coeficientul de corelaţie a fost 0,99921, ceea ce indică o foarte bună liniaritate a metodei şi pe standarde de sânge. După stabilirea liniarităţii s-au rulat probe cu sânge de control standardizate de aceleaşi concentraţii ca şi cele din curbă.

Tabelul 23. Caracteristicile curbei de calibrare

cu etanol în sânge standardizat

tR (min) Semnalul

Concentraţia soluţiei de

alcool (g‰)

Media ariilor

picurilor


0,25 48,45324 0,40 74,32893 0,50 90,43574 0,80 150,34129 1,10 213,73936

După realizarea curbei de etalonare cu probe de sânge

standardizate în etanol, exactitatea şi precizia metodei au fost stabilite prin verificarea punctelor de pe curbă, rezultatele sunt prezentate în tabelul 24 (coloana DB-ALC1, detector FID-1A).

38

Tabelul 24. Datele obţinute la evaluarea exactităţii şi preciziei metodei în cazul utilizării unor probe de sânge standardizate în etanol

tR (min)

Media ariilor picurilor

Concentraţia teoretică (g‰)

Concentraţia determinată (g‰)

Regăsirea (%)

1,593 75,12577 0,25 0,24702 98,80% 1,593 75,12577 0,40 0,39488 98,72% 1,592 97,59976 0,50 0,50845 101,69% 1,597 145,86461 0,80 0,81571 101,96% 1,593 223,48657 1,10 1,13307 103,00%

Procentele de regăsire calculate la verificarea punctelor din

curba de calibrare, cuprinse între 98,72 şi 103%, ne indică faptul că, în condiţiile utilizate, metoda de separare a etanolului din proba biologică cu o compoziţie complexă (sânge), prin utilizarea metodei GC-HS asigură obţinerea unor rezultate foarte exacte, cu posibilitatea verificării zilnice a curbei de calibrare şi implicit a echipamentului.

VI.2.4.6. Limita de detecţie şi limita de cuantificare Rezultatele sunt prezentate în tabelul 25.

Tabelul 25. Limitele de detecţie şi de cuantificare calculate la analiza alcoolului etilic prin GC-HS

Semnal ES a LD (g‰) LC (g‰) 1 4,470 187,055 0,071 0,238 2 4,708 194,137 0,072 0,242

VI.2.5. Concluzii Rezultatele obţinute arată că pe domeniul de concentraţie

studiat (0,062-4,0 g‰) metoda este liniară, exactă şi precisă (RDS ≤ 3,5%), rapidă, iar sângele nu necesită prelucrări suplimentare, doar o diluţie cu standard intern.

Omogenitatea matricei este direct proporţională cu exactitatea rezultatelor, obţinându-se pentru probele omogene valori ale RDS ≤ 1,5%.

Metoda va putea fi aplicată în laboratoarele institutelor şi serviciilor de medicină legală care astfel se vor alinia prevederilor normelor internaţionale.

Sugerăm să se lucreze probele în duplicat, să se facă media lor şi să se calculeze zilnic biasul (deplasarea faţă de ţintă) sau incertitudinea de măsurare.

39

VI.3. PREZENTAREA COMPARATIVĂ A CONCENTRAŢIEI

ALCOOLULUI ETILIC DETERMINAT ÎN FLUIDE BIOLOGICE PRIN METODA GAZ-CROMATOGRAFICĂ ŞI METODA

CORDEBARD Pentru a substitui în cadrul laboratoarelor de toxicologie

medico-legală metoda utilizată în prezent şi anume metoda Cordebard, este necesar să fie evidenţiate avantajele noii metode elaborate. Pentru a arăta acest lucru s-a efectuat un studiu comparativ al celor două metode.

VI.3.3. Materiale şi aparatură Probe biologice • probe biologice provenite de la persoane decedate - 22 de

probe de sânge recoltat din vena femurală şi 9 probe de urină; • probe biologice provenite de la 50 de conducători auto.

VI.3.4. Rezultate şi discuţii Rezultatele obţinute la analiza prin cele două metode, a

probelor recoltate de la persoane decedate, sunt prezentate comparativ în figurile 18 şi 19.

0

1

2

3

4

5

303

295

108

107

112

117

118 98 106

116 89 87 79 63 65 171

170

167

155

159

153

158

Metoda Cordebard Metoda GC-HS

Fig. 18. Prezentarea grafică comparativă a rezultatelor obţinute la

determinarea concentraţiei alcoolului în probele de sânge, provenite de la cadavre, prin metoda Cordebard şi metoda GC-HS

40

0

1

2

3

4

5

295 108 107 112 116 89 159 153 158

Metoda CordebardMetoda GC-HS


determinarea concentraţiei alcoolului în probele urină, provenite de la cadavre, prin metoda Cordebard şi metoda GC-HS

Analiza datelor indică faptul că la valori mari ale alcoolemiei,

există diferenţe mari între cele două metode, probabil datorită în principal faptului că metoda Cordebard este liniară doar până la valori în jur de 2,5-2,8 g‰ în timp ce metoda GC-HS este liniară pe un interval mai mare de valori. Probele care depăşesc aceste valori ar trebui diluate şi reanalizate prin medota Cordebrad.

În cazurile în care prin metoda Cordebard avem valori mult mai mari comparativ cu gaz cromatografia explicaţia ar putea fi că metoda Cordebard nefiind specifică etanolului, în cazul în care în matricea de interes sunt şi alte substanţe volatile acestea interferă cu etanolul, ceea ce duce la valori fals crescute pentru etanol.

Pentru 13 din cele 22 de probe de sânge analizate, concentraţia etanolului în vena femurală, determinată prin metoda GC-HS este mai mare decât cea determinată prin metoda Cordebard, în timp ce la analiza probelor de urină pentru toate cazurile analizate concentraţia alcoolului determinat prin GC-HS este mai mare decât pentru metoda Cordebard.

Pentru probele de sânge concentraţia mai mare obţinută prin metoda GC-HS a fost observată în cazul în care concentraţia alcoolului a depăşit valoarea de 2 g‰.

Fenomenul a fost observat şi la analiza probelor de urină (figura 19) unde în toate cazurile concentraţia alcoolului a depăşit valoarea de 2 g‰ prin metoda Cordebard, respectiv 2,5 g‰ prin metoda GC-HS. Diferenţele înregistrate au fost cuprinse între 0,25 şi 1,19 g‰.

41

Diferenţele sunt foarte importante pentru medicina legală, având în vedere că analiza datelor statistice indică faptul că la valori ale alcoolemiei de peste 2 g‰ sunt înregistrate cele mai multe decese sau fapte antisociale.

Au fost realizate şi determinări comparative, prin cele două metode, pe 50 de probe provenite de la conducători auto. Au fost analizate probe în duplicat, iar în lucrare este prezentată media celor două determinări.

Rezultatele obţinute au fost grupate în funcţie de valoarea alcoolemiei determinată prin metoda Cordebard, astfel: alcoolemie 0-0,5 g‰; alcoolemie 0,5-1 g‰, alcoolemie 1-1,5 g‰, alcoolemie 1,5-2 g‰ şi alcoolemie peste 2 g‰ (figurile 20-24).

00,10,20,30,40,50,60,7

2 37 46 proba

alco

olem

ie

Metoda CordebardMetoda GC-HS


determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 0-0,5 g‰) şi metoda GC-HS

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

5 6 11 19 20 22 10 31 38 39 47 48proba

alco

olem

ie Metoda Cordebard Metoda GC-HS

Fig. 21. Prezentarea grafică comparativă a rezultatelor

obţinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 0,5-1 g‰) şi metoda GC-HS

42

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

7 8 14 16 17 18 21 23 25 28 32 33 40 42 43 45 49proba

alco

olem

ie



determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 1-1,5 g‰) şi metoda GC-HS

0

0,5

1

1,5

2

2,5

1 12 13 15 24 27 29 30 34 35 36 41 44 50proba

alco

olem

ie



obţinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie 1,5-2 g‰) şi metoda GC-HS

43

00,5

11,5

22,5

3

3 4 9 26 proba

alco

olem

ie



obţinute la determinarea alcoolemiei, prin metoda Cordebard (alcoolemie peste 2 g‰) şi metoda GC-HS

Din cele 50 de probe analizate, în 424 de cazuri concentraţia

alcoolului determinată prin metoda GC-HS a fost mai mare decât cea determinată prin metoda Cordebard.

Diferenţele au fost observate mai ales în cazul probelor cu alcoolemie peste 1,5 g‰. Aceste diferenţe înregistrate au fost între 0,01 şi 0,32 g‰. Au fost înregistrate şi cazuri în care alcoolemia determinată prin metoda Cordebard a prezentat valori mai mici decât cea determinată prin metoda GC-HS, dar de această dată diferenţa dintre valorile înregistrate a fost mai mică, cuprinsă între 0,02 şi 0,13 g‰.

Diferenţele, mai mari între rezultatele determinărilor efectuate la cadavre decât cele efectuate la persoanele vii, sunt determinate de caracteristicile probelor de sânge recoltate de la aceşti indivizi şi subliniază încă odată faptul că post-mortem au loc transformări în organism şi care se reflectă în concentraţia alcoolului determinat.

VI.3.5. Concluzii

Prin metoda GC-HS probele se prelucrează extrem de simplu şi de rapid (6 minute). Probele trebuie să fie cât mai omogene, deoarece neomogenitatea lor determină creşterea valorii RSD.

Prin faptul că zilnic putem controla curba de calibrare, folosind atât etaloane în sânge cât şi în apă, putem să calculăm regăsirea, deci implicit avem informaţii asupra rezultatelor probelor de control, putem avea şi certitudinea corectitudinii rezultatelor finale ale pacienţilor.

44

Utilizarea sistemului HS(headspace) care foloseşte în analiză vaporii rezultaţi în urma volatilizării alcoolului din probă, exclude riscul de contaminare a detectorului, de deteriorare sau contaminare a fazei staţionare(coloanelor).

Metoda Cordebard fiind manuală, face ca erorile care apar zilnic să nu poată fi controlate. Faptul că metoda foloseşte cantităţi mari de probă şi probele nu pot fi lucrate în duplicat constituie alt dezavantaj.

Deoarece post mortem pot apare în procesul de putrefacţie şi alte substanţe volatile cu molecule mici, care în metoda Cordebard interferau cu etanolul, folosind tehnica GC-HS aceste erori dispar cu desăvârşire.

VI.4. APLICAREA METODEI DE DOZARE A ETANOLULUI PRIN GC-HC DIN FLUIDE BIOLOGICE RECOLTATE POST-MORTEM

Eşantionul ideal pentru determinarea alcoolului post mortem este sângele şi anume sângele recoltat din venele periferice (femurală, subclaviculară), deoarece este cel mai puţin expus modificărilor post mortem. Când nu se poate preleva o cantitate suficientă din sângele periferic se recoltează sânge din diverse alte locuri din organism, dar în final rezultatele obţinute trebuie corelate, deoarece concentraţia alcoolului depinde de zona de unde a fost recoltată proba.

Posibilele surse de etanol post mortem, pot fi, din ingestia antemortem, producţia endogenă antemortem şi neoformarea microbiană postmortem.

Pentru a putea avea un tablou cît mai complet privind concentraţia alcoolului la momentul morţii s-au analizat probe biologice recoltate din diferite zone ale organismului.


Probele au fost analizate prin GC-HS, utilizând terţ-butanolul ca standard intern. Toate probele au fost analizate în duplicat şi s-a înregistrat media valorilor obţinute.

Probe biologice • probe de sânge prelevate din vena femurală, artera aortă

(inima stângă); artera pulmonară (inima dreapta); • lichid pericardic (LP), lichid cefalorahidian (LCR), umoarea

45

vitroasă (UV), urină. Au fost analizate probe biologice provenite de la 33 de

cadavre în cadrul Serviciului Judeţean de Medicina Legală Vaslui. Numărul cazurilor luate în lucru a fost de 150 de cadavre, din care au fost selectate cele care nu au fost putrefiate, care nu au suferit traumatisme severe şi care au avut valori relativ mari ale alcoolemiei.

VI.4.4. Rezultate şi discuţii

Rezultatele obţinute la analiza probelor biologice provenite de la cele 33 de cadavre, sunt prezentate în tabelul 26.

Tabelul 26. Concentraţia alcoolului în fluidele biologice

recoltate de la cadavre

Nr. crt

Nr. caz

Sânge artera

pulmonară

Sânge aortă

Sânge vena

femurală UV LCR LP urină

1 286 1,52 1,93 1,65 1,53 1,84 3,05 1,20 2 303 1,65 1,80 1,82 - 1,50 - 2,26 3 108 2,28 2,34 2,57 3,25 3,20 2,90 4 117 0,78 0,97 1,07 0,67 - - 1,30 5 87 0,40 0,47 0,48 0,45 - 0,75 0,30 6 79 5,66 6,00 4,63 4,66 4,93 - - 7 103 2,33 2,45 2,50 2,83 2,92 - - 8 167 3,09 3,80 3,45 3,87 4,08 4,10 3,40 9 163 0,55 0,57 0,69 0,96 - 0,67 1,80

10 277 3,15 3,40 3,32 4,54 - 4,55 3,84 11 89 4,38 4,67 4,52 5,10 5,52 6,54 4,73 12 159 2,18 2,77 2,43 3,20 - 3,01 3,68 13 146 1,59 1,61 1,67 2,53 - 2,45 2,47 14 280 3,51 3,74 3,50 4,70 - 4,70 4,18 15 198 3,53 4,08 3,63 4,80 4,14 5,80 4,52 16 98 1,63 1,54 1,60 1,62 1,68 1,66 - 17 63 2,51 2,25 2,34 2,82 - 3,40 - 18 65 2,58 2,54 2,57 3,42 3,32 3,11 2,80 19 116 3,47 3,22 3,14 4,87 - 4,55 3,85 20 106 1,75 1,53 1,58 2,08 2,25 2,18 - 21 118 1,44 1,28 1,54 1,96 1,98 - - 22 112 3,78 3,23 4,00 - 5,13 - 3,85 23 107 4,96 4,64 3,94 5,00 5,28 - 3,70 24 295 2,50 2,32 2,60 3,48 - 3,32 3,85

46

25 215 1,36 1,05 1,33 1,63 - 1,53 1,65 26 202 1,20 1,15 1,43 1,95 1,80 1,72 2,00 27 100 0,81 0,80 0,66 0,83 0,96 0,97 - 28 171 2,76 2,45 3,20 3,53 3,21 3,72 3,67 29 170 0,68 0,68 0,73 0,94 - 1,24 0,95 30 168 2,43 2,32 2,50 3,20 3,26 - 3,25 31 155 3,33 3,21 3,44 3,92 4,00 4,18 - 32 153 2,88 2,82 3,03 3,71 - 3,64 4,34 33 158 2,51 2,33 2,73 3,15 - 3,33 4,07

VI.4.5.1. Determinarea concentraţiei alcoolului din sânge Aşa cum se poate observa din datele prezentate, în cazurile

1-15, valorile etanolului din sângele provenind din aortă, sunt uşor mai mari decât cele provenite din artera pulmonară. Aceste diferenţe ar putea fi explicate prin redistribuţia postmortem a alcolului, astfel imediat după deces acesta poate difuza datorită gradientului de concentraţie din stomac către pericard şi camerele cardiace. Fenomenul este uşor de înţeles datorită poziţiei anatomice a stomacului care se află în apropiere de camera stângă a inimii. Diferenţele dintre cordul drept şi respectiv cel stâng depind în cea mai mare parte de concentraţia etanolului în stomac la momentul decesului.

Comparativ rezultatele obţinute pentru cele două părţi ale inimii cu corespondent în artera aortă şi arterele pulmonare sunt prezentate în figura 25.

0

1

2

3

4

5

6

7

286

303

295

108

107

112

117

100

118 98 103

106

116 89 87 79 63 65 277

280

215

202

198

171

170

168

167

155

163

159

153

158

146

pulmonara

aorta


determinarea concentraţiei alcoolului în artera aortă şi artera pulmonară

47

Un alt fenomen descris frecvent, şi care a fost observat şi în

cazurile noastre a fost cel de redistribuţie prin căile pulmonare, dacă conţinutul gastric este aspirat în aceste căi, ceea ce sugerează că redistribuţia are loc prin venele pulmonare către camera stângă a inimii. Aspirarea poate să apară în timpul proceselor de agonie sau după moarte în timpul relaxării sfincterului gastro-esofagian.

Este recomandată recoltarea sângelui din cordul drept (artere pulmonare) deoarece este mai puţin influenţat de redistribuţie decât cel din cordul stâng. Când concentraţia este mai mare în inima dreapta decât în partea stângă a inimii, cauza ar putea fi glicogenoliza hepatică post mortem: în urma acestui proces se eliberează glucoză în inima dreaptă prin venele hepatice şi vena cavă inferioară, ceea ce poate determina producţia endogenă de alcool post mortem.

În studiul nostru au fost 7 cazuri cu regurgitare (1, 3, 8, 10, 11, 14, 15) în care valoarea etanolului a fost mai mare în sângele provenind din aortă (inima stângă) decât din artera pulmonară (dreapta).

Media raportului dintre sânge aortă/sânge femural (fig. 26) a fost de 0,97 şi cel dintre artera pulmonară/sânge femural este tot de 0,97. Se observă ca nu există diferenţe mari de concentraţii ale etanolului între camerele cardiace şi sângele femural, probabil datorită faptului că în cadavrele studiate nu s-au observat semne de putrefacţie şi cadavrele nu au prezentat traumatisme severe care ar fi putut să influenţeze aceste valori.

În studiul nostru în cazurile 16, 18, 21, 26, 27, 30, 31, 32, 33, diferenţele dintre cele două camere ale inimii fiind foarte mici putem sugera că diferenţa se poate datora formării de etanol post mortem în camera dreaptă.

48

0

1

2

3

4

5

6

7

286

303

108

117 87 79 103

167

163

277 89 159

146

280

198 98 63 65 116

106

118

112

107

295

215

202

100

171

170

168

155

153

158

Vena femuralăAortă

Fig. 26. Prezentarea grafică comparativă a rezultatelor obţinute la determinarea concentraţiei alcoolului (g‰) în vena femurală şi artera

aortă VI.4.5.2. Determinarea concentraţiei alcoolului din urină Avantajul major al folosirii urinei comparativ cu sângele este

acela că invazia bacteriilor şi fungilor asupra vezicii urinare este extrem de mică, exceptând cazurile de diabet.

Rezultatele obţinute la dozarea alcoolului din vena femurală şi urină sunt prezentate comparativ în figura 27.

0

1

2

3

4

5

286

303

108

117 87 167

163

277 89 159

146

280

198 65 116

112

107

295

215

202

171

170

168

153

158

Vena femuralăUrină

Fig. 27. Prezentarea grafică comparativă a rezultatelor obţinute la determinarea concentraţiei alcoolului din vena femurală şi urină

Raportul urină/sânge, ne poate da informaţii despre cinetica

etanolului, dacă a fost atins echilibrul în organism şi dacă alcoolul este în fază de eliminare sau de absorbţie.

49

Conform datelor din literatura de specialitate între momentul realizării concentraţiei maxime a alcoolului în sânge şi al realizării concentraţiei maxime a alcoolului în urină există o perioadă de întârziere şi în funcţie de aceasta se poate stabili dacă individul a consumat recent sau nu, alcoolul care a fost determinat în fluidele biologice.

În studiul nostru pe 33 de autopsii s-a găsit o medie a raportului urină/sânge de 1,27, ceea ce sugerează că marea majoritate a cazurilor luate în studiu au fost în faza de eliminare.

VI.4.5.3. Determinarea concentraţiei alcoolului în umoarea

vitroasă Datorită izolării sale de restul corpului riscul de contaminare

sau de difuzie a microorganismelor din stomac este mult redus sau chiar inexistent. Umoarea vitroasă este într-un compartiment periferic al corpului şi există o întârziere în absorbţia şi eliminarea alcoolului, comparativ cu sângele.

O concentraţie negativă a etanolului în vitros, şi un rezultat pozitiv în sânge, sugestionează că alcoolul din sânge a fost produs post mortem şi nu provine din ingestie.

Datele din literatura de specialitate indică o medie a raportului vitros/sânge cuprinsă între 0,91 şi 1,34. În studiul nostru am obţinut o medie a acestui raport de 1,22.

În cazurile în care valoarea în vitros este mai mare decât în vena femurală, se poate concluziona că alcoolul este în faza de eliminare.

Comparativ rezultatele obţinute la determinarea concentraţiei alcoolului din vena femurală şi umoarea vitroasă sunt prezentate în figura 28.

50

0

1

2

3

4

5

6

286

108

117 87 79 103

167

163

277 89 159

146

280

198 98 63 65 116

106

118

107

295

215

202

100

171

170

168

155

153

158

Vena femuralăUV

Fig. 28. Prezentarea grafică comparativă a rezultatelor obţinute la determinarea concentraţiei alcoolului (g‰) din vena femurală şi

umoarea vitroasă Pentru cele trei lichide cu conţinut apos ridicat, cum sunt

urina, lichidul pericardic (LP) şi umoarea vitroasă, au fost analizate doar 21 de probe deoarece pentru celelalte cazuri nu a fost posibilă recoltarea fluidului biologic. Se observă diferenţe relativ mici între cele trei fluide biologice care au un conţinut mare de apă în compoziţie, în 9 cazuri diferenţele fiind aproape nesemnificative, ceea ce poate sugera că în cazurile când nu avem la dispoziţie sânge, oricare din aceste fluide ne poate ajuta să avem o orientare privind concentraţia etanolului.

VI.4.5.4. Determinarea concentraţiei alcoolului în lichidul

cefalorahidian Un alt fluid biologic luat în studiu a fost lichidul

cefalorahidian (LCR), care poate să indice concentraţia etanolului în sistemul nervos central.

Pentru cazurile analizate (18 din 33 de probe) în cadrul studiului nostru, concentraţia alcoolului în sânge este în general mai mică decât cea determinată în LCR. Comparativ rezultatele obţinute la analiza sângelui din vena femurală şi lichidul cefalorahidian sunt prezentate în figura 29.

În cadrul studiului nostru raportul LCR/sânge femural a fost de 1,19, raport ce este susţinut şi de datele din literatură, conform cărora, acest raport ar trebui să fie de 1,2.

51

0

1

2

3

4

5

6

286

303 79 103

167 89 198 98 65 106

118

112

107

202

100

171

168

155

Vena femuralăLCR

Fig. 29. Prezentarea comparativă a rezultatelor obţinute la

determinarea concentraţiei alcoolului (g‰) din vena femurală şi lichidul cefalorahidian

Aşa cum se poate observa din datele prezentate, concentraţiile etanolului în LCR sunt apropiate de cele din vitros, ceea ce ar putea sugera că în lipsa vitrosului, poate fi utilizat LCR-ul alături de sânge pentru evaluarea cineticii etanolului.

VI.4.6. Concluzii

Datorită unei variabilităţi extrem de mari a condiţiilor şi factorilor de mediu, de prelevare a probelor, de natura probelor, de starea cadavrului este extrem de dificil să exprimăm cu certitudine valoarea concentraţiei etanolului la momentul decesului.

Luând în studiu probe de sânge şi patru tipuri de fluide biologice care nu conţin hematii, făcând corelaţii între ele şi raportând rezultatele pentru fiecare caz la sângele din vena femurală, se poate sugera că oricare din aceste fluide este extrem de folositor pentru a putea vedea cinetica alcoolului post mortem.

Aşa cum se poate observa din graficele prezentate, în funcţie de starea cadavrului, se poate încerca să se preleveze oricare fluid din cele prezentate, care este considerat a fi cel mai puţin expus modificărilor post mortem specifice fiecărui decedat.

Rezultate cât mai precise în interpretarea post mortem, putem avea încercând să reducem sursele de erori din faza preanalitică, astfel colectarea, pregătirea, stocarea probelor, să fie cât mai corect efectuate, să prelevăm probe multiple din cât mai multe locuri din organism încercând să avem cât mai corect un indiciu despre cinetica etanolului la momentul morţii, şi încercând să determinăm dacă proba de interes conţine şi alte substanţe volatile în afară de etanol.

52

VII. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUŢII ORIGINALE.

PERSPECTIVE DE CERCETARE Lucrarea este structurată în două părţi: • Stadiul cunoaşterii - capitolele II şi III. • Contribuţiile personale- capitolele IV, V şi VI. Capitolul II conţine date din literatura de specialitate

referitoare la: sinteza şi proprietăţile fizico-chimice ale alcoolul etilic; proprietăţile toxicologice şi date privind situaţia consumului de alcool în lume, Uniunea Europeană şi în România.

Capitolul III cuprinde date privind metodele chimico-

toxicologice de investigare a alcoolului etilic. În capitolul IV sunt prezentate date asupra consumului de

alcool în Judeţul Vaslui. Pentru evaluarea consumului de alcool în judeţul Vaslui, în

perioada 2005-2010, au fost analizate 6460 de probe de sânge provenite de la conducătorii auto şi 4459 de probe provenite de la cadavru. Probele au fost analizate prin metoda Cordebard (metoda oficială).

Din cele 6460 probe provenite de la conducătorii auto, în perioada 2005-2010, 3772 (58,39%) au prezentat alcoolemie peste 0,8 g‰, limită considerată penală, conform legislaţiei în vigoare în România.

Numărul cazurilor cu alcoolemie peste valoarea de 0,8 g‰ a crescut de la an la an, de la 386 (35,35%) cazuri în anul 2005, la 452 (47,23%) în 2006, 602 (58,79%) în 2007, 794 (63,02%) în 2008, 733 (68,96%) în anul 2009 şi 805 (75,66%) în anul 2010.

Datele ne arată că se impune un control mai riguros al conducătorilor auto şi în acelaşi timp o îmbunătăţire a metodelor de determinare deoarece o mare parte din conducătorii auto ajung să conteste aceste rezultate şi pot eluda prevederile legale.

Probele prelevate de la cadavru au fost repartizate astfel în funcţie de valoarea alcoolemiei: 2195 cu alcoolemie 0 g‰; 520 cu alcoolemie între 0 şi 0,8 g‰; 778 cu alcoolemie între 0,8 şi 2 g‰; 655 cu alcoolemie între 2 şi 3 g‰; 311 cu alcoolemie peste 3 g‰.

53

14,69% probe au prezentat valori ale alcoolemiei între 2 şi 3 g‰, iar 6,97% au prezentat valori ale alcoolemiei de peste 3 g‰.

În capitolul V sunt prezentate rezultatele studiului privind

stabilirea unor corelaţii între valoarea alcoolemiei şi cauzele de deces.

• Au fost analizate probe prelevate de la 1300 de cadavre pe o perioadă de 3 ani şi au fost luate în studiu 356 de cazuri în care valoarea alcoolemiei a fost mai mare de 0,40 g‰. În aproape toate cazurile au fost analizate probe de sânge din vena femurală, şi în mod variabil probe de urină şi/sau umoare vitroasă. Determinarea concentraţiei alcoolului din fluide biologice recoltate s-a efectuat prin metoda Cordebard.

• Din rezultatele obţinute, pentru o perioadă de trei ani (2008-2010) se constată că:

- la 78 persoane (21,91%) decesul s-a produs prin afectare cardiacă, iar concentraţiile maxime de alcool determinate au crescut de la an la an: 2,45 g‰ (2008); 2,75 g‰ (2009) şi 3,25 g‰ (2010);

- în cazul persoanelor decedate prin comă etilică (46 cazuri, 12,92%) valorile medii ale concentraţiei alcoolice în toţi anii la bărbaţi sunt peste 3,50 g‰, iar la femei peste 2,99 g‰;

- în perioada 2008-2010 s-a determinat concentraţia alcoolului în 50 (14,04%) de cazuri de sinucidere prin spânzurare. Concentraţia alcoolică medie în vena femurală a variat între 1,40-2,60 g‰ (2008); 0,50-3,15 g‰ (2009) şi 0,40-3,20 g‰ (2010);

- 26 (7,30%) de decese au fost determinate de hipotermia asociată cu consumul de alcool. Valoarea maximă a alcoolului din vena femurală s-a înregistrat în anul 2009 (2,60 g‰);

- s-au analizat 23 (6,46%) cazuri de deces prin accidente rutiere şi feroviare; valorile medii ale alcoolemiei au oscilat între 0,65 g‰ (mediu urban) şi 2,91 g‰ (mediu rural);

- în perioada 2008-2010 în judeţul Vaslui au decedat 23 (6,46%) de persoane din cauza intoxicaţiilor cu diferite substanţe şi consum de alcool; cele mai multe intoxicaţii au fost cu monoxid de carbon (16 cazuri);

- din rezultatele obţinute pe perioada luată în studiu se constată că cel mai mare procentaj de decese sunt din cauză cardiacă (21,91%) asociată cu consumul de alcool, urmează sinuciderile prin

54

spânzurare (14,04%) şi comele etilice (12,92%). Capitolul VI cuprinde rezultatele studiilor chimico-

toxicologice de determinare a alcoolului etilic prin GC-HS. În subcapitolul VI.1. sunt prezentate rezultatele privind

elaborarea şi validarea metodei de dozare a etanolului din sânge prin GC-HS folosind izopropanolul ca standard intern.

Pentru analiză s-a folosit un echipament Agilent, GC 6890 N, cu headspace G 1888 (HS).

Parametrii obţinuţi în urma validării sunt: - specificitatea metodei - evidenţiată prin determinarea unor timpi

de retenţie diferiţi pentru analit (alcool etilic - 1,361 min. - coloana DB-ALC1) şi standardul intern (izopropanol - 1,550 min. - coloana DB-ALC1);

- domeniul de liniaritate: 0,5-4,0 g‰; - limita de detecţie: 0,053 g‰ (coloana DB-ALC1), 0,055 g‰

(coloana DB-ALC2); - limita de cuantificare: 0,177 g‰ (DB-ALC1); 0,186 g‰

(DB-ALC2); - precizia sistemului - RDS ≤ 3,5%; - exactitatea şi precizia metodei: s-au determinat procentele de

regăsire între 99,37% şi 107,7%. Metoda validată elimină orice sursă de eroare şi conferă

analistului siguranţa unui rezultat corect. În subcapitolul VI.2. sunt prezentate rezultatele obţinute la

dezvoltarea şi validarea metodei de determinare a etanolului din diverse fluide biologice folosind terţ-butanolul drept standard intern.

A fost necesară schimbarea standardului intern pentru a aplica metoda la analiza probelor biologice provenite de la cadavre unde au loc şi procese de putrefacţie, când se sintetizează izopropanol.

Rezultatele obţinute au demonstrat că metoda este: • specifică - pentru cei doi alcooli s-au obţinut timpi de

retenţie diferiţi: alcool etilic - 1,593 min. (coloana DB-ALC1); 1,544 min. (coloana DB-ALC2); terţ-butanol - 2,252 min. (coloana DB-ALC1); 2,155 min. (coloana DB-ALC2);

• liniară în intervalul de concentraţie 0,5-4,0 g‰, curbele de calibrare fiind caracterizate prin coeficienţi de corelaţie de 0,99994 (coloana DB-ALC1) şi 0,99993 (DB-ALC2);

55

• precisă şi exactă: precizia sistemului a fost stabilită prin rularea unor probe de sânge de la pacienţi diferiţi, când s-au obţinut valori ale RSD sub 1% pentru probele omogene şi în jur de 2,5% pentru probe neomogene.

Repetabilitatea analizei (precizia intra-probă) s-a analizat efectuându-se câte 9 determinări pe fiecare nivel de concentraţie cunoscut, în cadrul aceleaşi zile. Rezultatele obţinute încadrându-se în marja de eroare admisibilă pentru acest tip de aparat (RSD < 5%) şi pentru probele biologice (±20).

Pentru determinarea acurateţei (exactitatea) s-au determinat valori ale procentul de regăsire între 100,39% şi 102,2% pentru soluţiile de etanol în apă, respectiv între 99,61% şi 103,12% pentru etaloane de sânge de control care conţin etanol.

Determinările efectuate pe probe cu omogenitate diferită au demonstrat că lipsa omogenităţii matricei determină în mod proporţional creşterea valorii RSD ceea ce va induce erori de interpretare a rezultatelor.

Limitele de detecţie stabilite pentru această metodă au fost: 0,071 g‰ (coloana DB-ALC1) şi 0,072 g‰ (coloana DB-ALC2).

Limitele de cuantificare: 0,238 g‰ (coloana DB-ALC1) şi 0,242 g‰ (coloana DB-ALC2).

Subcapitolul VI.3. cuprinde rezultatele obţinute la analiza concentraţiei alcoolului etilic din fluide biologice prin metoda GC-HS şi metoda Cordebard. Au fost analizate 22 de probe de sânge recoltate din vena femurală de la cadavre, 9 probe de urină de la cadavre şi 50 de probe de sânge de la conducătorii auto.

Date obţinute ne arată că, atât la probele de sânge cât şi de urină există diferenţe ale concentraţiei alcoolului între cele două metode şi anume prin metoda GC-HS s-au obţinut valori mai mari faţă de metoda Cordebard mai ales pentru valori ale alcoolului mai mari de 2 g‰.

Pentru probele provenite de la conducătorii auto, în majoritatea cazurilor s-au găsit alcoolemii mai mari prin metoda GC-HS faţă de metoda Cordebard.

Rezultatele obţinute la aplicarea metodei de dozare a etanolului prin GC-HS din fluide biologice recoltate post-mortem folosind terţ-butanolul drept standard intern sunt prezentate în subcapitolul VI.4.

56

În funcţie de starea cadavrului au fost recoltate probe de sânge (vena femurală, artera aortă, artera pulmonară), umoare vitroasă, lichid cefalorahidian, urină, lichid pericardic. Probele au provenit de la 33 de cadavre şi au fost analizate în cadrul Serviciului Judeţean de Medicină Legală Vaslui.

Rezultatele obţinute demonstrează că: • raportul concentraţiilor medii ale alcoolului din sânge

aortă/sânge femural şi artera pulmonară/sânge femural a fost de 0,97. Valorile identice ale rapoartelor ar putea fi explicate prin faptul că aceste cadavre nu au prezentat semne de puterfacţie sau de traumatisme;

• concentraţia alcoolului în lichidul pericardic este semnificativ mai mare, ceea ce se poate datora cantităţii mai mari de apă în acest fluid biologic;

• raportul concentraţiilor alcoolului din urină/sânge femural a fost de 1,27, ceea ce sugerează ca marea majoritate a cazurilor luate în studiu au fost în faza de eliminare a alcoolului;

• raportul concentraţiilor alcoolului umoare vitroasă/sânge femural a fost de 1,22.

Analizând concentraţia alcoolului în trei tipuri de probe de sânge şi patru probe biologice cu conţinut crescut în apă, corelând datele şi raportându-le între ele, putem sugera că oricare din aceste fluide este extrem de folositor pentru a putea aprecia cinetica alcoolului post-mortem.

Rezultatele obţinute în urma studiilor efectuate subliniază că problema analizei alcoolului din probele biologice nu este complet rezolvată şi că în orice moment apar noi surse de variaţii, iar analiştii toxicologi trebuie să încerce eliminarea acestora.

57

CONTRIBUŢII ORIGINALE • S-a realizat un studiu statistic privind consumul de alcool în

judeţul Vaslui. • S-au stabilit corelaţii între valoarea alcoolemiei şi cauzele

de deces. • S-a validat metoda de dozare a etanolului din sânge prin

GC-HS folosind izopropanolul ca standard intern. • S-a dezvoltat şi validat metoda de determinare a etanolului

din diverse fluide biologice folosind terţ-butanolul drept standard intern, metodă aplicată la dozarea alcoolului din probe biologice recoltate de la cadavre.

• S-a efectuat un studiu comparativ al concentraţiei alcoolului etilic din fluide biologice prin GC-HS şi metoda Cordebard (oficială).

PERSPECTIVE DE CERCETARE

Tema tezei de doctorat oferă posibilitatea orientării către noi direcţii de cercetare:

• aplicarea metodelor GC-HS validate la cercetarea principalilor metaboliţi ai etanolului: acetaldehida, acid acetic;

• dezvoltarea şi validarea unei metode GC-HS pentru dozarea compuşilor volatili care apar în timpul proceselor de descompunere şi putrefacţie a cadavrelor;

• validarea şi dezvoltarea unei metode GC-MS pentru determinarea 5-hidroxitriptofolului (5HTOL) şi a acidului 5-hidroxiindol acetic (5HIAA). Aceştia sunt metaboliţi ai serotoninei şi pot fi utilizaţi ca markeri biotoxicologici pentru a evidenţia dacă alcoolul provine din ingestia antemortem sau post-mortem.

58

VII. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Agarwall D.P., Seitz H.K. Alcohol in Health and Disease. Ed. Marcel

Dekker, Inc., 2001. 2. Agoroaei L., Butnaru E. Toxici gazoşi şi volatili. Editura „Gr. T. Popa”,

U.M.F. Iaşi, 2005. 3. Allen N.E., Beral V., Casabonne D. et al. Moderate alcohol intake and

cancer incidence in women. Journal of the National Cancer Institute 2009; 101 (5): 296-305.

4. Aradottir S., Seidl S., Wurst F.M., Jonsson B.A., Alling C., Phosphatyidylethanol in humans organs and blood: a study on autopsy material and influences by storage conditions. Alcohol Clin. Exp. Res. 2004; 28: 1718-1723.

5. Athanaselis S., Stefanidou M., Koutselinis A. Interpretation of postmortem alcohol concentration. Forensic Sci. Int. 2005; 149: 289-291.

6. Bau P.F.D., Bau H.D.C., Rosito G.A., Manfroi W.C., Fuchs F.D. Alcohol consumption, cardiovascular health, and endothelial function markers. Alcohol 2007; 41 (7): 479-488.

7. Briglia E.J., Bidanset J.H., Dal Cortivo L.A. The distrbution of ethanol in post mortem blood specimens. J. Forensic Sci. 1992; 37: 991-998.

8. Brinkmann B., Fechner G., Karger B., DuChesne A. Ketoacidosis and lactic acidosis – frequent causes of death in chronic alcoholics? Int. J. Legal Med. 1998; 111: 115-119.

9. Caballeria J. Current concepts in alcohol metabolism. Ann. Hepatolog. 2003; 2: 60-68.

10. Crabb D.W., Matsumoto M., Chang D., You M. Overview of the role of alcohol dehydrogenase and aldehid dehydrogenase and their variants in the genesis of alcohol related pathology. Proc. Nutr. Soc. 2004; 63: 49-63.

11. Cullen S.A., Mayers R.W. Alcohol discovered in the urine after death: ante-mortem ingestion or post-mortem artefact? Med. Sci. Law 2005; 45: 196-200.

12. De Lima I.V., Midio A.F. Origin of blood ethanol in decomposed bodies. Forensic Sci. Int. 1999; 106: 157-162.

13. De Zeeuw R.A. Laboratory guidelines in analytical toxicology-how to approach qualitative analysis. J. Forensic Sci. 1992; 37: 1437-1442.

14. Denmark L.N. The investigation of beta-hydroxybutyrate as a marker for sudden death due to hypoglycemia in alcoholics. Forensic Sci. Int. 1993; 62: 225-232.

59

15. Dermengiu D. Patologie medico-legală. Editura Viaţa Medicală Românească, Bucureşti, 2002.

16. Dermengiu D. Tanatochimie medico-legală. Editura Bucura Mond, Bucureşti, 1998.

17. Flanagan R.J., Connally C. Interpretation of analitycal toxicology results in life and at postmortem. Toxicol. Rev. 2005; 24: 51-62.

18. Flanagan R.J., Connally G., Evans J.M. Analytical toxicology: guideliness for sample collection postmortem. Toxicol. Rev. 2005; 24: 63-71.

19. Gagajewski A., Murakami M.M. et al. Measurement of chemical analytes in vitreous humour: stability and precision studies. J. Forensic Sci. 2004; 49: 371-374.

20. Gallardo E. Şi Queiroz J.A. The role of alternative specimens in toxicological analysis. Biomed. Chromatogr. 2008; 22: 795-821.

21. Garriot J.C. Analysis for alcohol in postmortem specimens. in: J.C. Garriot (Ed.), Medical and Legal Aspects of Alcohol, Lawyers & Judges Publishing Company, Tuscon, 2003, 163-176.

22. Grellner W., Iffland R. Assesment of postmortem blood alcohol by ethanol levels measured in fluids from putrefactive blisters. Forensic Sci. Int. 1997; 90: 57-63.

23. How C., Howton K. et al. Psychiatric and personality disorders in deliberate self-harm patients. British Journal of Psychiatry 2001; 178: 48-54.

24. Helander A., Dahl H. Urinary tract infection: a risk factor for false negative urinary ethyl glucuronide but not ethyl sulfate in the detection of recent alcohol consumption. Clin. Chem. 2005; 51: 1728-1730.

25. Helander A., Beck O., Jones A.W. Distinguishing ingested ethanol from microbial formation by analysis of urinary 5HTOL and 5HIAA. J. Forensic Sci. 1990; 40:95-98.

26. Helander A., Beck O., Jones A.W. Urinary 5HTOL/5HIAA as biochemical marker of postmortem ethanol synthesis. Lancet 1992; 340:1159.

27. Hilberg T., Rogden S., Morland J. Postmortem drug redistribution-human cases related to results in experimental animals. J. Forensic Sci. 1999; 44: 3-9.

28. Honey D., Caylor C., Luthi R., Kerrigan S. Comparative alcohol concentrations in blood and vitreous fluid with illustrative case studies. J. Anal. Toxicol. 2005; 29: 365-369.

29. Johnson R.D., Lewis R.J., Angier M.K., Vu N.T. The formation of ethanol in postmortem tissue. Office of Aerospace Medicine 2004; 4: 1-10.

60

30. Johnson R.D., Lewis R.J., Canfield D.V., Dubowski K.M., Blank C.L. Utilizing the urinary 5-HTOL/5HIAA ratio to determine ethanol origin in civil aviation accident victims. J. Forensic Sci. 2005; 50: 670-675.

31. Jones A.W. Reference limits for urine/blood ratios of ethanol in two successive voids from drinking drivers. J. Anal. Toxicol. 2002; 26: 333-339.

32. Jones A.W. Are changes in blood-ethanol concentration during storage analytically significant? Importance of method imprecision. Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45: 1299-1304.

33. Jones A.W. Measuring alcohol in blood and breath for forensic purposes; A historical review. Forensic Sci. Rev. 1996; 8: 13-44.

34. Jones A.W., Fransson M. Blood analysis by headspace gas chromatography; Does a deficient sample volume distort ethanol concentration? Med. Sci. Law 2003; 43: 241-247.

35. Jones A.W., Holmgren H. Comparasion of blood-ethanol concentration in deaths attributed to acute alcohol poisoning and chronic alcoholism. J. Forensic Sci. 2003; 48: 874-879.

36. Jones A.W., Holmgren P. Uncertainty in estimating blood ethanol concentrations by analysis of vitreous humor. J. Clin. Pathol. 2001; 54: 699-70.

37. Jones A.W., Holmgren P. Urine/blood ratios of ethanol in deaths attributed to acute alcohol poisoning and chronic alcoholism. Forensic Sci. Int. 2003; 135: 206-212.

38. Kugelberg F.C., Jones A.W. Interpreting results of ethanol analysis in postmortem specimens: a review of the literature. Forensic Sci. Int. 2007; 165: 10-29.

39. Leikin J.B., Watson W.A. Post-mortem toxicology: what the dead can and cannot tell us. J. Toxicol. 2003; 41: 47-56.

40. Pelissier-Alicot A.L., Gaulier J.M., Champsaur P., Marquet P. Mechanism underlying postmortem redistribution of drugs: a review. J. Anal. Toxicol. 2003; 27: 533-544.

41. Ziavrou K., Boumba V.A.,Vougiouklakis Th.G. Insights into the origin of postmortem ethanol. Int. J. Toxicol. 2005; 24: 69-77.

42. * * * European Status Report on Alcohol and Health 2010, pg.285-286 http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0004/128065/e94533.pdf.

43. * * * Restek. A technical guide for static Headspace analysis using GC. 44. * * * SOFT/AAFS Forensic Laboratory Guidelines, 2002.

LISTA CU LUCRĂRI PUBLICATE

1. Dorubeţ D.,Moldoveanu S.,Mircea C.,Butnaru E.,Astărăstoae V. Development and validation of a quantitative determination method of blood ethanol bz gas chromatography with headspace(GC-HS), Rom.J.Leg.Med(4) 303-308(2009)

2. Dorubeţ D.,Mircea C.,Astărăstoae V.,

Butnaru E. Validation of a GC-HS method for ethanol quantitative analysis using as internak standard tert-butanol, Farmacia,(59) 5 ,2011

1

CURRICULUM VITAE Chimist principal DORUBEŢ (FILARET) DIANA MĂDĂLINA e-mail: madfilaret@ yahoo.com STUDII 2007-prezent

Doctorat fără frecvenţă în specialitatea toxicologie: Dezvoltarea şi validarea metodei de determinare a etanolului prin GC-HS şi studii privind dozarea etanolului din diferite fluide biologice prin GC-HS

2006-2007 Masterat în Toxicologie Clinică- Universitatea de Medicină si Farmacie „GR.T.Popa” Iaşi

1980-1984 Facultatea de Chimie Iaşi-specializarea chimie-fizică 1976-1980 Liceul de chimie Vaslui-profilul chimie SPECIALIZĂRI PROFESIONALE 1998 Chimist principal specialitatea „Biochimie medicală şi

enzimologie clinică” 1993 Chimist specialist specialitatea„Biochimie medicală şi

enzimologie clinică” PREGĂTIRE POSTUNIVERSITARĂ 2010 Curs postuniversitar” Metabolismul mineral “,Disciplina de

biochimie, Universitatea de Medicină si Farmacie „GR.T.Popa” Iaşi

2005 Curs postuniversitar”Biochimia şi explorarea funcţiilor ficatului “,Disciplina de biochimie, Universitatea de Medicină si Farmacie „GR.T.Popa” Iaşi

EXPERIENŢĂ PROFESIONALĂ

Perioada Funcţia Locul de muncă

Sarcini şi responsabilităţi

2005-prezent

Chimist principal-manager tehnic

Serviciul Judeţean de Medicină-Legală Vaslui-lab.de toxicologie

Efectuarea analizelor toxicologice şi serologice destinate acestui tip de laborator

2

2007-prezent

Chimist principal- manager tehnic

Clinica privată S.C.Teoclinik Vaslui

Efectuarea analizelor biochimice, de coagulare, imunologie, validarea rezultatelor finale, supervizarea bilunară a controlului extern de calitate pe toate sectoarele laboratorului,pregătirea personalului mediu şi superior din subordine

2005-2007


Laborator privat S.C. Eurotest Vaslui

Efectuarea analizelor biochimice, de coagulare, imunologie, validarea rezultatelor finale, supervizarea bilunară a controlului extern de calitate pe toate sectoarele laboratorului

1988-2005


Spitalul Judeţean de Urgenţă Vaslui-laboratorul clinic

Efectuarea analizelor biochimice, de coagulare, imunologie, validarea rezultatelor finale, supervizarea bilunară a controlului extern de calitate pe toate sectoarele laboratorului

APARTENENŢA LA SOCIETĂŢI PROFESIONALE profesionale ORDINUL BIOCHIMISTILOR, BIOLOGILOR SI

CHIMISTILOR IN SISTEMUL SANITAR DIN ROMANIA(OBBCSSR)

3

PARTICIPAREA LA MANIFESTĂRI ŞTIINŢIFICE 2011 Congresul Naţional de Medicină Legală, Poiana Braşov 2010 Congresul Naţional de Farmacie, Tg.Mureş 2009 Congresul Naţional de Medicină Legală, Bran 2008 Curs de management şi asigurarea calităţii în laboratoarele

medicale-Spitalul Clinic Colţea Bucureşti 2007 Curs de gaz cromatografie cu headspace, Agilrom Scientific

Bucureşti A-III-a conferinţă a OBBCSSR cu participare internaţională Bucureşti

2006 Curs de gaz cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă,Agilrom Scientific Bucureşti Curs de specializare cu tema: determinarea alcoolemiei la persoanele implicate în traficul rutier şi în cazuri medico-legale-Institutul deMedicină Legală Mina Minovici-Bucureşti A-II-a conferinţă a OBBCSSR cu participare internaţională Bucureşti

2005 Congresul Naţional de Medicină Legală, Sibiu 2004 Congresul Balcanic de Medicină Legală,Macedonia 1997 Curs de imunologie clinică- Spitalul Clinic Fundeni-

Bucureşti 1992 Curs de biochimie medicală- Spitalul Clinic Fundeni-

Bucureşti 1989 Curs de enzimologie clinică -Spitalul Clinic Fundeni-

Bucureşti LUCRĂRI PUBLICATE -Development and validation of a quantitative determination method of blood ethanol by gas chromatography with headspace (GC-HS), Rom J Leg Med (4) 303 - 308 (2009) - Validation of a GC/HS method for ethanol quantitative analysis using as internal standard tert-butanol , Farmacia, 2011, Vol. 59, 5 Limbi străine cunoscute: engleza avansat

Documents

dezvoltarea şi validarea metodei de determinare a etanolului prin gc