Determinazione della faseDeterminazione della faseCristallografia delle piccole molecoleCristallografia delle piccole molecole Metodi Metodi direttidiretti

Metodo della Sostituzione IsomorfaMetodo della Sostituzione Isomorfa

Molecole Grandi (Proteine)Molecole Grandi (Proteine) (Sostituzione Isomorfa Multipla – MIR, (Sostituzione Isomorfa Multipla – MIR, multiple isomorphous multiple isomorphous

replacement).replacement).

MIR – Introduzione di nuovi centri di scattering nella cella elementare:MIR – Introduzione di nuovi centri di scattering nella cella elementare: costituiti da atomi pesanti (in modo che essi contribuiscano significativamente costituiti da atomi pesanti (in modo che essi contribuiscano significativamente

alla diffrazione) alla diffrazione) in numero limitato (per localizzarne la posizione)in numero limitato (per localizzarne la posizione) non dovrebbero cambiare le caratteristiche strutturali della molecola e della non dovrebbero cambiare le caratteristiche strutturali della molecola e della

cella (cristalli isomorfi).cella (cristalli isomorfi).

In pratica la MIR si ottiene facendo diffondere diversi complessi di metalli In pratica la MIR si ottiene facendo diffondere diversi complessi di metalli pesanti nei canali dei cristalli preformati. Se le catene espongono gruppi –pesanti nei canali dei cristalli preformati. Se le catene espongono gruppi –SH, essi legheranno i metalli. Nelle metallo-proteine i metalli leggeri SH, essi legheranno i metalli. Nelle metallo-proteine i metalli leggeri possono essere sostituiti con metalli più pesanti (es. Zn-Hg, Ca-Sm).possono essere sostituiti con metalli più pesanti (es. Zn-Hg, Ca-Sm).

Determinazione della faseDeterminazione della faseI metalli pesanti contengono molti più elettroni degli atomi leggeri I metalli pesanti contengono molti più elettroni degli atomi leggeri (H,N,O,C,S) della proteina, diffondono i RX più intensamente. Dopo (H,N,O,C,S) della proteina, diffondono i RX più intensamente. Dopo una MIR se tutte le interferenze fossero positive tutti i raggi diffratti una MIR se tutte le interferenze fossero positive tutti i raggi diffratti aumenterebbero di intensità. Ma alcune interferenze sono negative, aumenterebbero di intensità. Ma alcune interferenze sono negative, per cui dopo la MIR, alcuni spot aumentano di intensità, altri per cui dopo la MIR, alcuni spot aumentano di intensità, altri diminuiscono ed altri non variano. diminuiscono ed altri non variano. Dalle differenze di intensità prima e Dalle differenze di intensità prima e dopo la MIR, si possono dedurre le posizioni degli atomi pesanti nel dopo la MIR, si possono dedurre le posizioni degli atomi pesanti nel cristallo. Le trasformate di Fourier di queste diff. di intensità cristallo. Le trasformate di Fourier di queste diff. di intensità forniscono le mappe dei vettori tra gli atomi pesanti (mappe di forniscono le mappe dei vettori tra gli atomi pesanti (mappe di Patterson).Patterson). Dalle mappe di Patterson si possono dedurre le posizioni Dalle mappe di Patterson si possono dedurre le posizioni degli atomi pesanti nella cella elementare, per cui da queste degli atomi pesanti nella cella elementare, per cui da queste lele ampiezze e le fasiampiezze e le fasi e dal loro contributo ai raggi diffratti dal cristallo. e dal loro contributo ai raggi diffratti dal cristallo.

Determinazione della faseDeterminazione della faseConoscendo:Conoscendo: Ampiezza e fase atomi pesantiAmpiezza e fase atomi pesanti Ampiezza proteina Ampiezza proteina Ampiezza proteina-metalli pesantiAmpiezza proteina-metalli pesanti

si può calcolare se l’interferenza dei RX diffusi dai metalli pesanti e si può calcolare se l’interferenza dei RX diffusi dai metalli pesanti e dalla proteina è costruttiva o distruttiva. Una dalla proteina è costruttiva o distruttiva. Una stima della fase della stima della fase della proteinaproteina si può ottenere dall’entità dell’interferenza con le informazioni si può ottenere dall’entità dell’interferenza con le informazioni sulla fase del metallo.sulla fase del metallo.

Sono però possibili due differenti angoli di fase, per distinguere tra le Sono però possibili due differenti angoli di fase, per distinguere tra le soluzioni possibili è necessario avere un complesso con un secondo soluzioni possibili è necessario avere un complesso con un secondo atomo pesante che darà altri due angoli di fase possibili per la proteina. atomo pesante che darà altri due angoli di fase possibili per la proteina. Quello che avrà lo stesso valore di uno degli angoli di fase determinati Quello che avrà lo stesso valore di uno degli angoli di fase determinati nel caso precedente sarà l’angolo di fase corretto.nel caso precedente sarà l’angolo di fase corretto.

In pratica si devono preparare più di due complessi proteina-metallo In pratica si devono preparare più di due complessi proteina-metallo pesante per ottenere una fase buona per tutte le riflessioni.pesante per ottenere una fase buona per tutte le riflessioni.

Le ampiezze e le fasi dei dati ottenuti vengono impiegati per calcolare Le ampiezze e le fasi dei dati ottenuti vengono impiegati per calcolare le le mappe di densità elettronica mappe di densità elettronica dell’unità ripetitiva del cristallo.dell’unità ripetitiva del cristallo.

Costruzione del modelloCostruzione del modelloLa mappa di densità elettronica va interpretata in termini di catena La mappa di densità elettronica va interpretata in termini di catena peptidica (sequenza aa). Vi sono però limiti dei dati:peptidica (sequenza aa). Vi sono però limiti dei dati:– imprecisioni da errori negli angoli di faseimprecisioni da errori negli angoli di fase– risoluzione dei dati che dipende dall’ordine nei cristalli (misurata in A, minore risoluzione dei dati che dipende dall’ordine nei cristalli (misurata in A, minore

è il suo valore più elevata è la risoluzione e quindi la quantità di dettagli che si è il suo valore più elevata è la risoluzione e quindi la quantità di dettagli che si possono osservare).possono osservare).

Bassa risoluzioneBassa risoluzione (>5) (>5) forma della molecola, regioni aforma della molecola, regioni aelica come cilindrielica come cilindri

Media risoluzioneMedia risoluzione (ca.3) (ca.3) percorso della catena e fittingpercorso della catena e fittingsequenza aasequenza aa

Alta risoluzioneAlta risoluzione ca.2 – si discrimina tra catene laterali molto ca.2 – si discrimina tra catene laterali molto similisimili ca.1 – atomi come sfere di densità ca.1 – atomi come sfere di densità elettronicaelettronica

La costruzione del modello iniziale è un processo di prova/errore. La costruzione del modello iniziale è un processo di prova/errore. Occorre:Occorre: decidere in che modo la catena polipetidica traccia il suo percorso nella decidere in che modo la catena polipetidica traccia il suo percorso nella

densità elettronicadensità elettronica si tenta di adattare in base all’ipotesi la densità delle catene laterali della si tenta di adattare in base all’ipotesi la densità delle catene laterali della

sequenza nota del polipetidesequenza nota del polipetide

Utilizzo computer graficaUtilizzo computer grafica

Costruzione del modelloCostruzione del modelloLa mappa di densità La mappa di densità elettronica viene elettronica viene rappresentata sullo schermo rappresentata sullo schermo del computer (computer del computer (computer grafica) in combinazione con grafica) in combinazione con una parte della catena una parte della catena polipeptidica.polipeptidica.

La mappa di densità La mappa di densità elettronica ottenuta viene elettronica ottenuta viene interpretata adattandovi parti interpretata adattandovi parti della catena polipeptidica della catena polipeptidica con stechiometria nota con stechiometria nota (backbone e catene laterali).(backbone e catene laterali).

Le unità della catena Le unità della catena polipeptidica vengono polipeptidica vengono ruotate e traslate rispetto ruotate e traslate rispetto alla densità elettronica fino a alla densità elettronica fino a che si ottiene una buona che si ottiene una buona corrispondenza tra le due.corrispondenza tra le due.Utilizzo mappa Fourier Utilizzo mappa Fourier differenza (sia per ‘aggiustare’ differenza (sia per ‘aggiustare’ modello che per risolvere nuove modello che per risolvere nuove strutture).strutture).

Il modello viene via via corretto mediante Il modello viene via via corretto mediante affinamentoaffinamento, per cui esso viene , per cui esso viene modificato minimizzando la differenza tra ampiezze osservate modificato minimizzando la differenza tra ampiezze osservate sperimentalmente e quelle calcolate per un ipotetico cristallo contenente il sperimentalmente e quelle calcolate per un ipotetico cristallo contenente il modello invece della molecola reale (minimi quadrati).modello invece della molecola reale (minimi quadrati).

Questa differenza viene espressa come Questa differenza viene espressa come R-factorR-factor che rappresenta la che rappresenta la discordanza residua (R=0 per un accordo esatto, 0.59 per disaccordo totale).discordanza residua (R=0 per un accordo esatto, 0.59 per disaccordo totale).

Per una struttura proteica ben determinata Per una struttura proteica ben determinata R è compreso tra 0.15 e 0.20R è compreso tra 0.15 e 0.20..

La diff. residua (ad alta risoluzione) non è dovuta a grossi errori nel modello, La diff. residua (ad alta risoluzione) non è dovuta a grossi errori nel modello, ma a errori e inesattezze nei dati che derivano principalmente da:ma a errori e inesattezze nei dati che derivano principalmente da:Piccole variazioni nelle conformazione delle molecole proteichePiccole variazioni nelle conformazione delle molecole proteicheCorrezioni inadeguate presenza solventeCorrezioni inadeguate presenza solventeDifferenze orientamento microcristalli che formano il cristallo.Differenze orientamento microcristalli che formano il cristallo.

Il Il modello finalemodello finale è mediaè media delle molecole (leggermente diverse in delle molecole (leggermente diverse in conformazione e orientamento) presenti nel cristallo, per cui il modello non conformazione e orientamento) presenti nel cristallo, per cui il modello non corrisponde mai in modo esatto al cristallo reale.corrisponde mai in modo esatto al cristallo reale.

La conoscenza della sequenza aaLa conoscenza della sequenza aa (da sequenza nucleotica nelle tecniche DNA (da sequenza nucleotica nelle tecniche DNA ricmbinante per la produzione della proteina stessa) ricmbinante per la produzione della proteina stessa) è indispensabile per la è indispensabile per la determinazione della struttura a RXdeterminazione della struttura a RX. Le strutture determinate possono . Le strutture determinate possono identificare errori nella determinazione della sequenza.identificare errori nella determinazione della sequenza.

Costruzione del modello – R-Costruzione del modello – R-factorfactor

CristalloCristallo

Data CollectionData Collection|F|, (hkl)|F|, (hkl)

Fasi Fasi (hkl)(hkl)

Densità Densità elettronicaelettronica(x,y,z)(x,y,z)

StrutturaStruttura

Determinazione struttura proteineDeterminazione struttura proteine

GMER

Actina