7
Detection of Porcine Circovirus Type 2, Porcine Parvovirus and Porcine Pseudorabies Virus from Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome by Multiplex PCR S. Cao, H. Chen*, J. Zhao, J. Lu« , S. Xiao, M. Jin, A. Guo, B.Wu and Q. He Laboratory of Animal Virology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University,Wuhan, Hubei, 430070, P.R. China *Correspondence: E-mail: [email protected] Cao, S., Chen, H., Zhao, J., Lu«, J., Xiao, S., Jin, M., Guo, A.,Wu, B. and He, Q., 2005. Detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus and porcine pseudorabies virus from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome by multiplex PCR. Veterinary Research Communications, 29(3), 263^269 ABSTRACT Multiplex PCR was established to detect porcine circovirus type 2 (PCV-2), porcine parvovirus (PPV) and porcine pseudorabies virus (PRV) and applied to samples from 137 piglets exhibiting clinical signs of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). PCV-2 DNA was detected from all samples. Moreover, 43 samples were positive for PPV but negative for PRV; 11 samples were positive for PRV but negative for PPV; and 35 samples were positive both for PPV and PRV. These results suggests that PCV-2 co-infection with PRV and PPV may play an important role in PMWS. Also, multiplex PCR is an appropriate candidate method for diagnosis of PCV-2, PRV and PPV simultaneously in ¢eld cases. Keywords: multiplex PCR, porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, porcine pseudorabies virus, postweaning multisystemic wasting syndrome Abbreviations: PK, pig kidney cell line; PCV-2, porcine circovirus type 2; PCV-1, porcine circovirus type 1; PPV, porcine parvovirus; PRV, porcine pseudorabies virus; PMWS, postweaning multisystemic wasting syndrome; PRRSV, porcine reproductive and respiratory syndrome virus; PCIA, phenol- chloroform^isoamyl alcohol INTRODUCTION Porcine circovirus type 1 (PCV-1) was originally identi¢ed and described as a contaminant of a porcine kidney cell line (Tischer et al., 1982). So far, there is little evidence linking PCV-1 infection to clinical disease in swine. Recently a new disease called postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) of pigs was reported in Canada (Clark, 1997), the United States (Allan et al ., 1998), many European countries (Segale's et al ., 1997; Allan et al ., 1998; Ellis et al ., 1998) and some countries in Asia (Onuki et al., 1999; Shengbo et al., 2001; Kim et al., 2002; Kiatipattanasakul- Banlunara et al., 2002). It has had potentially serious economic impact on the swine industry. PMWS is characterized by wasting or unthriftiness, dyspnoea and jaundice. Experiments showed that dual infection of pigs with porcine circovirus type 2 (PCV-2) and porcine parvovirus (PPV) caused severe clinical signs and lesions of PMWS (Ellis Veterinary Research Communications, 29 (2005) 263^269 # 2005 Springer. Printed in the Netherlands 263

Detection of Porcine Circovirus Type 2, Porcine Parvovirus and Porcine Pseudorabies Virus from Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome by Multiplex PCR

  • Upload
    s-cao

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

��������� �� ����� ������ � ���� �� ����� ����� ���� ����� �� ������� �� � ��� ��� ���� ����������� ����������� ������� ������� �� � ������ �!

�� ���� �� ���� �� ���� �� ��� � �� ����� �� ��� �� ���� �� �� �� �� ����������� �� ��� ���� ���� �� ��� �� ��������� �������� ������� ����� ���� ��������������� ������ �� ! � "#$# ����%������&�����' ()��� ' �������*&�� ��#+�#��#�

���� ��� ��� ��� ���� ��� ��� � ��� ����� ��� ��� ��� ���� ��� ��� �� �� �� ��� ����� ������ � !�"�� ��"��#�"�$ �%! �� !�"�� !�"#�#�"�$ �� !�"�� !$���"�&�$ #�"�$ "�' !�($ )��� !�$�)��('�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' &% '�*��!*+ ,�-���������� $������� ������������� �"#$%� �./0�.1

���2-��2

��*��!*+ ,�- )�$ $��&*�$�� �� ���� !�"�� ��"��#�"�$ �%! � 3,�45�6� !�"�� !�"#�#�"�$ 3,,46�� !�"�� !$���"�&�$ #�"�$ 3,-46 �� �!!*�� �� $�'!*$ "�' 7/8 !�(*�$ +��&���( �*����* $�($� !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' 3,���6� ,�45� �9� )�$ ����� "�' �** $�'!*$���"�#"� :/ $�'!*$ )" !�$���# �" ,,4 &�� (���# �" ,-4; 77 $�'!*$ )" !�$���# �" ,-4&�� (���# �" ,,4; �� /� $�'!*$ )" !�$���# &��� �" ,,4 �� ,-4� 2�$ "$�*�$ $�(($�$ ����,�45� ��5� ���� )��� ,-4 �� ,,4 '�% !*�% � �'!�"��� "�* � ,���� �*$�� '�*��!*+ ,�- �$� �!!"�!"��� ������� '���� �" ���(�$�$ � ,�45�� ,-4 �� ,,4 $�'�*����$*% � <*� ��$$�

,��+����' '�*��!*+ ,�-� !�"�� ��"��#�"�$ �%! �� !�"�� !�"#�#�"�$� !�"�� !$���"�&�$ #�"�$�!�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�'

�����������' ,=� !�( >��% �** *�; ,�45�� !�"�� ��"��#�"�$ �%! �; ,�457� !�"�� ��"��#�"�$�%! 7; ,,4� !�"�� !�"#�#�"�$; ,-4� !�"�� !$���"�&�$ #�"�$; ,���� !�$�)��( '�*��$%$�'��)�$��( $%�"�'; ,--�4� !�"�� "!"������# �� "$!�"���"% $%�"�' #�"�$; ,�?�� !��*5��*�"� �"'0�$��'%* �*����*

?92-@�A�2?@9

,�"�� ��"��#�"�$ �%! 7 3,�4576 )�$ �"�(��**% ����<� �� �$�"�&� �$ �����'��� � � !�"�� >��% �** *� 32�$��" �� � �� 71B�6� �� �"� ��" �$ *���*#��� *�>�( ,�457 � ���� �� �*����* ��$�$ � $)�� -��*% � ) ��$�$��**� !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' 3,���6 � !�($ )�$ "!�"�� ������ 3�*�">� 71186� �� A��� ����$ 3�**� �� � �� 711B6� '�% C�"�!� ����"�$3�(�*D$ �� � �� 7118; �**� �� � �� 711B; C**�$ �� � �� 711B6 �� $�' ����"�$ � �$��3@�>� �� � �� 7111; ��(&� �� � �� ���7; =�' �� � �� ����; =����!�����$�>�*5��*��"� �� � �� ����6� ?� ��$ ��� !�����**% $"���$ ���'�� �'!��� � �� $)����$�"%� ,��� �$ ���"���"�E� &% )�$��( �" ���"� ��$$� �%$!�� �� F������C+!"�'�$ $��)� ���� ���* � ���� � !�($ )��� !�"�� ��"��#�"�$ �%! � 3,�45�6�� !�"�� !�"#�#�"�$ 3,,46 ���$� $#" �*����* $�($ �� *$��$ � ,��� 3C**�$

��������� $������� ������������� �1 3����6 �./0�.1� ���� �!"�("� ,"��� � �� 9��"*��$

�./

�� � �� 71116� )��* ����*���� )��� ,�45� �*� !"����� �*% '�*� �� '��"����$��*�(���* *$��$ 3�**� �� � �� 7111; =�% �� � �� ����; ="�>�)>� �� � �� ����6�@��" "!�"�$ ������� ���� !�"�� "!"������# �� "$!�"���"% $%�"�' #�"�$3,--�46 �� !�"�� !$���"�&�$ #�"�$ 3,-46 �*$� !*�%� � �'!�"��� "�* �"!"�����( $#" �*����* $�($ �� *$��$ � ,��� 3������ �� � �� ���7; -�#�"��� � �� ����6�

? ���$ $���%� ) �'�$�"�� �" �� <"$� ��' � '�*��!*+ ,�- �" �����( ,�45��,,4 �� ,-4 � !�(*�$ )��� �*����* $�($ � !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��($%�"�'� 2��$ )�** !"�#�� � ) '���� �" !����( �#$��(���� � ,����

��2C-?��� �9� �C2�@��

-��& � �� �����

� ����* 7/8 !�(*�$� �07� )>$ �*�� +��&���( �*����* $�($ � ,��� ��*���()�$��(� �%$!��� ���"� ��$$ �� *%'!� �� *�"('� )" �&���� "�' 77 �"'$ � $�+ !"�#��$ 3���(+�� ��� ��&�� ���(��(� ����(� ���(���6 � ����� 2�$ !�(*�$ )" $��"�<�� &% G���>*% &*��( �� �> �"�"% �� ���"*%'!� ��$ �� *�($ )" ��**��� �$ $�'!*$ �" �9� +�"������

-��& � ��������

�9� +�"����� )�$ !" �"'� ����"��( �� !"#���$ "!�"�$ 3=����!�����$�>�*5��*��"� �� � �� ����6� H�"$�� 7�� '( � �� "$!���# ��$$� 3*%'!� �� �� *�(6)�$ ��'�(�E� )��� � ��'�(�E"� 2� �� $�'!*$ )" ���)� �� "�E ��"��'$ �� 08��� 2� $�'!*$ )" �� $�$!�� � �9� +�"����� &�I" 3��: '(J'*!"����$ =� 7�� ''�*J� 9��*� 7� ''�*J� 2"�$5��* 3!� B��6� �� ''�*J� C�2�3!� B��6 �� ���K $����' ����%* $�*!���6 �� �� $�$!$�� )�$ ���&��� �� ���� �" �: �� ��"�( �� ���&����� !"����$ = 3��� '(6 )�$ ���� �(��� �9� )�$+�"���� )��� � !��*0��*�"� �"'0�$��'%* �*����* 3,�?�� ��L�:L76 '�+��" � 2C&�I" 37� ''�*J� 2"�$5��* 3!� B��6� 7 ''�*J� C�2� 3!� B��6� 2� $�*���� )�$'�+� )��� +�"����� &�I" �� )�$ ���&��� �� "��' �'!"���" �" 7� '�� ����"� �(� �� //��� �" : '�� �9� � �� ��! *�%" )�$ ��**��� �� !"��!����� �/ '�*J� $����' ����� 3!� ���6 �� ��5��*� 11��K �*����*� �9� )�$ !**�� &%��"� �(���� �� �� ���� �" �� '� �� ��$$�*#� � ��0/� �* � �*�"�!�"�<� )��"�H��**%� �&��� / �( � �9� $�'!* )�$ $�&F��� �� ,�- �'!*�<������

"����� ��.����

2�" $�$ � !"�'"$ )" �$�(� ����"��( �� !"#���$ !�&*������$ 3��(&� �� � �����7; ��*�( �� � �� ����6� 2� <"$� !"�'" $� !7 3��5������2�22�52��2��2��25/�6 �� !� 3��5������22����2�2��2 �2�5/�6 �$ $!��<� �"

�.:

,�45� �� �'!*�<$ � !"����� � :1: &! "�' @-H� � ,�45�� 2� $��� !"�'" $�!/ 3��5�����������2�����25/�6 �� !: 3��5�2����������22�����25/�6 �$ $!��<� �" ,-4 �� �'!*�<$ � !"����� � �78 &! "�' �� �/ (� ,-4� 2� ���"� !"�'" $� !� 3��5����2�����22��2�22�25/�6 �� !. 3��52��2�2��22�2�2��2���5/�6 �$ $!��<� �" ,,4 �� �'!*�<$ � !"����� � 77B &! "�' �� �"0 ( � ,,4�

�� ��& �1 "�$

2�" $�$ � !"�'"$ �$ �$�"�&� �&�# )" ��'&�� �" '�*��!*+ ,�-� ��*��!*+,�- )�$ !" �"'� )��� �&��� / �( $�'!* �9� � � �� �* #�*�' 3��� �'�*J� � ��� !"�'"� � ''�*J� �(�*�� ��� �'�*J� �92,$� *��&�I"� ��� A 2�. �9�!�*%'"�$6� �%�*�( !�"�'�"$ )" 1��� �" : '� 37 �%�*6; 1:�� �" 7 '�� �8�� �" 7 '�� �� 8��� �" 7�� '� 3/� �%�*$6; ��( )��� � <�* +�$�� $�! � 7� '��� 8���� 2� ,�- !"�����$ )" ��*%$� &% �K �(�" (* *��"�!��"$�$� 2� #"� % ��#"����% � '�*��!*+ ,�-� �� $����"� ,�-$ $!��<� �" ,�45�� ,-4 �� ,,4 )"�*$� �!!*�� $!�"��*% �" �� !�$���# �� (���# ���"�* $�'!*$ ����"��( ��!"#���$ "!�"�$ 3��(&� �� � �� ���7; ��*�( �� � �� ����6� 2� !*�$'�� !25,�4�������( �� ��'!*� (�' � ,�45� )�$ �$� �$ !�$���# ���"�* �" ,�45�� 2�!*�$'�� !25(� ������( �� �/ ( � ,-4 )�$ �$� �$ !�$���# ���"�* �" ,-4�2� !*�$'�� !254,� ������( �� �"0 ( � ,,4 )�$ �$� �$ !�$���# ���"�* �",,4� ,=57� �**$ " � ,�45�� ,-4 �� ,,4 )" �$� �$ (���# ���"�*�

-C�A�2�

�� ��& �1 "�$

2� '�*��!*+ ,�- �$$�% �$�( ��" !��"$ � !"�'"$ $���$$ �**% �'!*�<� ��"��$���� "�('�$ )��� ��I"� $�E$ �$ +!���� �� �$�� $!�"��*% &% ��$����"� ,�-� ��� !��" � !"�'"$ )�$ $!��<�� ,�45� $!��<� !"�'"$ �'!*�<� �!"����� � :1: &! "�' �� !25,�4� !*�$'��� &�� ��� �� �'!*� % �% !"����� "�'�� !25(� !*�$'�� �" �� !254,� !*�$'��� ,-4 $!��<� !"�'"$ �'!*�<� � !"����� � �78 &! "�' �� !25(� !*�$'��� &�� ��� �� �'!*� % �% !"����� "�' �� !25,�4�!*�$'�� �" �� !254,� !*�$'��� ,,4 $!��<� !"�'"$ �'!*�<� � !"����� � 77B &! "�' �� !254,� !*�$'��� &�� ��� �� �'!*� % �% !"����� "�' �� !25,�4� !*�$'���" �� !25(� !*�$'��� �� ��" !��"$ � !"�'"$ )" ��*��� � �� ,�- �$$�%���% �'!*�<� ���" "$!���# $�E5$!��<� !"�����$ �� �� &��$ � �� �(�" (**��"�!��"$�$ $!�"��� #"% �*�"*% 3H�(�" 76�

�.�

&& ������ �� �� ��& �1 "�$ � 3� � �����

2� '�*��!*+ ,�- )�$ �!!*�� �� ���� ,�45�� ,-4 �� ,,4 � �� $�'!*$ "�'7/8 !�(*�$ +��&���( �*����* $�($ � ,���� 2�"(� �9� "�('�$ 3��*���( :1:&! �" ,�45�� �78 &! �" ,-4� �� 77B &! �" ,,46 )" �'!*�<� 3H�(�" �6� �** � �� 7/8 $�'!*$ )" !�$���# �" ,�45�� �'�( ��'� :B $�'!*$ )" !�$���# �",�45� �*�� :/ $�'!*$ )" �*$� !�$���# �" ,,4 &�� (���# �" ,-4; 77 $�'!*$)" !�$���# �" ,-4 &�� (���# �" ,,4; �� /� $�'!*$ )" !�$���# &��� �" ,,4�� ,-4� 2�$ $�'!*$ )" �*$� �$�� $!�"��*% &% ,�-� 2� "$�*�$ )" �� $�'�$ � �� '�*��!*+ ,�-�

�?��A��?@9

,�- �$ � $$���# ���(�$��� '���� �� �$ )��*% �$� �" !����( ������� ? ��"*�&�"���"%� ) ��# $��&*�$�� ,�- �� ���" '����$ �" ������ � ,�45�� ,,4�� ,-4� "$!���#*%� � <*� ���(�$�$� ? ��" �#$��(����� ) ��� ���� ,,4 �",-4 �9� )�$ �*$� ����� "�' '�% ,�45�5!�$���# $�'!*$� @��" "$�"��"$��# "!�"�� ,�45�� ,,4 �� ,-4 � �$$������� )��� ,��� 3�**� �� � �� 7111;������ �� � �� ���7; -�#�"� �� � �� ����; =�' �� ���� ���/6� ?� �$ $�(($�� ����,�45� ��5� ���� )��� ,-4 �" ,,4 �$ ��''� � ,��� ��$$� 2�" �"� � $!��<��� ��#�� ���(�$��� '���� �" ,�45�� ,-4 �� ,,4 $�'�*����$*% �$ ��"(� � �" �*����* ���(�$�$� ? ���$ $���%� ��" $�$ � !"�'"$ $!��<� �" ,�45�� ,-4�� ,,4 )" ��'&�� �" '�*��!*+ ,�-� 2� '�*��!*+ ,�- )�$ �!!*�� ��$�'!*$ "�' 7/8 !�(*�$ +��&���( �*����* $�($ � ,���� �� �� $�' ��'� ��$

H�(�" 7� �!��<���% � �� '�*��!*+ ,�- �" �� ��I"������ � ,�45�� ,-4�� ,,4� ���� ������ �9� '�">"; *� 7� *%$�� � ,�45�5� ,-45 �� ,,45 " ,=57� �**$; *� �� ��!*�$'�� !254,� �����$ �� �"0 ( � ,,4 377B &! !"�����6; *� /� �� !*�$'�� !25(������$ �� �/ ( � ,-4 3�78 &! !"�����6; *� :� �� !*�$'�� !25,�4� �����$ ��'!*�(�' � ,�45� 3:1: &! !"�����6

�..

$�'!*$ )" �*$� �$�� $!�"��*% &% $����"� ,�- �$ ���"�*$� ,�"�*** "$�*�$ )"�&���� "�' &��� '�*��!*+ ,�- �� $����"� ,�-� ?� �$ $�(($�� ���� '�*��!*+,�- �$ � �!!"�!"��� ������� '���� �" ���(�$�$ � ,�45�� ,-4 �� ,,4 �<*� ��$$�

��� ,��� )�$ <"$� �$�"�&� � ����� 3�*�">� 71186� ,�45� ��$ & �$�*��� "�' �� ��$$�$ � !�($ )��� ,��� � �� A��� ����$� �"'�%� ������ H"����!��� =�"�� ��!� �� ���" ����"�$� ? "�� %�"$� ��" ��$ & ��"�$�(#��� ��<"'�( ���� ,�45� !*�%$ � �'!�"��� "�* � ,���� ,�45�� �*����(�$$���* �" �#*�!'� � ,���� '�% "G��" ���" ����"$ �" �(�$ $��� �$ ,,4�,--�4 �� ,-4 �� ���� �� �** $!��"�' � �*����* $�($ �� *$��$ �$$������)��� ��#��� ��$$ � ,���� @��" "$�"��"$ ��# �*$� "!�"�� ,�45� � ��5� ���� )��� ,,4� ,-4 �" ,--�4 "!"����$ �%!���* ,��� 3C**�$ �� � �� ����;-��"�(�E5�""��F� �� � �� 7111; ��"'$ �� � �� ���76� ��)#"� � ���� )��� ,�45� �",,4�*� ��*� �� "!"���� ,���� ? ���$ $���%� ,�45� �9� )�$ ����� "�' �**$�'!*$ &% '�*��!*+ ,�-� ��"�#"� :/ $�'!*$ )" !�$���# �" ,,4 &�� (���# �" ,-4; 77 $�'!*$ )" !�$���# �" ,-4 &�� (���# �" ,,4; �� /� $�'!*$ )"!�$���# &��� �" ,,4 �� ,-4� 2�$ <��($ $�!!�"� �� #�) ���� ,�45� �$ ��'!�"��� �(� � ,��� �� ���� ���" �(�$ $��� �$ ,-4 �� ,,4 �" �*$��$$������ )��� ,����

H�(�" �� �!!*������ � '�*��!*+ ,�- �" ������ � ,�45�� ,-4 �� ,,4 � <*� ��$$��� �� ������ �9� '�">"; *� 7� !�$���# �" ,�45�� ,-4 �� ,,4; *� �� !�$���# �",�45� �� ,-4; *� /� !�$���# �" ,�45� �� ,,4; *� :� !�$���# �" ,�45�; *� �� *%$��� ,�45�5� ,-45 �� ,,45 " ,=57� �**$ �$ (���# ���"�*; *� .� '�+��" � !*�$'��$ !25,�4�� !25(� �� !254,� �$ !�$���# ���"�* � ��5� ���� )��� ,�45�� ,-4 �� ,,4 3:1:&!� �78 &! �� 77B &! !"�����$6

�.8

��=9@��C��C�C92�

2��$ !"�F�� )�$ $�!!�"�� &% 9�����* 9���"�* ���� H������� � ����3/.78�8�76� 2� �����"$ �" ("�� �* �� �" ��� ��>"�E� H���� ���� �( ����� ���"�( H�(� ���'� �� �� �$�� ��� �" ���" ������* �$$�$��� ��'���<����� � �� '��$�"�!�� 2��>$ �" �� �� �" ��&� H�( �" $�'!*��**�����

-CHC-C9�C�

�**�� ����� ��9�**%� H�� =�%� ��� �� �� ��� �*�">� C���� C**�$� ����� ���$� ����� ���� ���� ������"� ����� 711B� ?$�*���� � !�"�� ��"��#�"�$5*�> #�"�$$ "�' !�($ )��� � )�$��( ��$�$ � ��A�� �� C�"�!� 4���� �� ��������� /�������� 5����������� &'� /07�

�**�� ����� =�%� ��� ��9�**% H�� H�$�"� ����� C**�$� ����� ="�>�)>�� ����� ���� ���� �� ����"������ 7111� C+!"�'��* "!"������� � )�$��( ��$�$ �� ���� &% ��5� ��� � !�($ )���!�"�� ��"��#�"�$ �� !�"�� !�"#�#�"�$� 4���� �� ���&������� "���� ���� &�&� 7077

�*�">� C���� 7118� ,�$�5)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�'� "��������� �� ��� ������ ����������� -+�� "������������ �(� :110��7

C**�$� ��� ��$$�"�� ��� �*�">� C���� ��"��(� ��� �**�� ��� ��**$�� ,�� ��"�>�!!� ��� ��"��� =�� ��9�**%�H�� ���� H�� 2���� �� �� ���$� ��� 711B� ?$�*���� � ��"��#�"�$ "�' *$��$ � !�($ )���!�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�'� ������ ��������� 4���� 6 $���� ��7 ��7 �������������� $"� ::0�7

C**�$� ��� ="�>�)>�� ��� ���"'�"� ��� ���$� ��� �"������� ��� �*�">� C���� �**�� ��� =��&%� �����$$�"�� ��� ���� ��� ��"��� =�� ��"��(� ��� =�%� �� �� ��9�**%� H�� 7111� -!"������� � *$��$ � !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' � (���&����� !�(*�$� 4���� �� ���������/�������� 5����������� &&� /07:

C**�$� ����� �"������� ��� �*�">� C���� �**�� ��� ���� ��� ���$� ����� ��"��(� ��� �$�� =����="�>�)>�� ��� =��&%� ��� ��$$�"�� ��� ��"��� =� �� ��9�**%� H�� ����� ��5� ���� &% !�"����"��#�"�$$ �� !�"�� !�"#�#�"�$ � !�( )��� ���"�**% ��G��"� !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��($%�"�'� 4���� �� ��������� /�������� 5����������� &�� �70�8

��"'$� ,���� ��"�� ����� ��*&�"� ,���� ��*�� ��-�� ��("� =���� ��"�E�#� ?� �� ,��*� ,���� ���7�C+!"�'��* "!"������� � $#" ��$�$ � ��J�� !�($ ����""�*% � ��� )��� �%! � !�"����"��#�"�$ �� !�"�� "!"������# �� "$!�"���"% $%�"�' #�"�$���������� "���� ���� $(� ��B0/1

��*�(� �� ������� �� �� ���G��(� ��� ����� C$��&*�$�'� � '�*��!* ,�-5&�$� ���(�$$ � !�"�� !�"#�#�"�$ �� !�"�� !$���"�&�$ #�"�$� 4���� �� ������� ����� ���� ���������� �&�7�/07��

=�%� ��� ��I��� ��� ��9�**%� H�� ���� ��� C**�$� ��� ="�>�)>�� �� �� �**�� ����� �����-!"������� � *$��$ � !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' &% � ���� � ��#����*!�($ )��� !�"�� ��"��#�"�$ �%! � �*� �" � ��'&����� )��� !�"�� !�"#�#�"�$� 4���� �����&������� "���� ���� &��� 10�:

=����!�����$�>�*5��*��"����� 2���*"����"�� -�� ��E�>�� =�� �*&�"G�� ����� 2���)�(�)���-�� 9�>�%�'�� �� �� ���� =�� ����� ������ � !�"�� ��"��#�"�$ � 3,�45�6 �9� &% $�� ,�- "�' �"'�*�5<+� ��$$�$ � !�$�5)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' 3,���6 !�($ � 2���*���4���� �� ��������� ������ -������ )*� ::10��

=�'� �� �� ���� ��� ���/� ��*��!*+ $�� ,�- ��'!�"� )��� � ���� �%&"���E���� �" ����I"������ � !�"�� ��"��#�"�$$ �� !�"�� !�"#�#�"�$ "�' !�($ )��� !�$�)��( '�*��5$%$�'�� )�$��( $%�"�'� ������ 4���� �� ��������� $������� 6 $���� ������� �� $����������7 ��7 ������� )+� 7//08

=�'� ��� ���(� ��=�� ��(� 2�� ���� ����� ����� �� �� ���� ��� ����� ,�$�)��( '�*��$%$�'��)�$��( $%�"�' � !�($ � =�"�L !"#�*�� '��"�$��!�� *$��$ �� ��+�$��( '��"��"(��$'$�4���� �� ��������� ������ -������ )*� �80.�

="�>�)>�� ��� C**�$� ����� ���� ��� =�%� ��� ��9�**%� H� �� �**�� ����� ����� 4�"�* )�$��($%�"�' � $)�L +!"�'��* "!"������� � !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' �(���&����� $)� &% ��� ���� )��� !�"�� ��"��#�"�$ � �� !�"�� !�"#�#�"�$� ���������"���� ���� $+� ��:0�./

�.B

@�>�� ��� �&� =�� 2�(�$��� =�� =�)�$��'�� =�� 2������ �� �� 2$�'��$�� ��� 7111� ������ � !�"�� ��"��#�"�$ "�' *$��$ � � !�( )��� )�$��( ��$�$ � ��!�� 4���� �� ��������� ������ -������ )&� 7771077�/

������� ��� �(�*$� ��� -�$**� ��� ��*$�'�(*��� ��� -��"�(�E5�""��F�� ����� ������� H�� H�*��� �������*������ ��� ���*� ��� ,*��5��"�� �� �� ��'�(�� ��� ���7� �*����* �� !����*�(���*�&$"#����$ � !�($ )��� !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�'� ��������� $������ ��� /�80/.7

-��"�(�E5�""��F�� ����� �(�*$� ��� -�$**� ��� ������� ��� �%**�� ��� ��'!"���� �� �� ��'�(����� 7111� ��F$E>%D$ ��$�$ #�"�$ � ���� ����""� )��� !�$�)��( '�*��$%$�'�� )�$��($%�"�' � !�($���������� $������ &**� 7��07�/

-�#�"�� ��� ��*�$��� ��� �(�*$� ��� ��"���� ��� ,*��5��"�� ��� -�$**� ��� C**"&"�>� ��� ��>"�E� ���� ��'�(�� ��� ����� C+!"�'��* ����*���� � ��#����* !�($ )��� !�"�� "!"������# ��"$!�"���"% $%�"�' #�"�$ �� !�"�� ��"��#�"�$ �� 4���� �� ���� ���� +)� /�/�0/�/1

�(�*D$� ��� ���F�"� ��� ��'�(�� ��� �� ��� �* ,�E�� ��� 9�#�*� -�� ���"�$��� ��� � *�$ �"�$� ���H""�� �� �� ����'"� =���� 7118� H�"$� "!�"� � !�$�5)��( '�*��$%$�'�� )�$��( $%�"�' � !�($� �!������������ $������ &*&� .��0.�7

��(&�� ��� ������� ��� ����&�� ��� ��(��� ��� M���� �� �� �� �� ��� ���7� 2� $��&*�$�'� ���!!*������ � ,�- �� ���(�$�$ !�"�� ��"��#�"�$ �%! �� 4���� �� ������� ����� ���� �����������'� �/0�.

2�$��"� ?�� �*�"&*�' ��� 4��"'� �� �� =��� ����� 71B�� � #"% $'�** !�"�� #�"�$ )��� ��"��*�"$�(*5$�"��� �9�� 8������ �",� .:0..

3���!��L : ��"�� ���:6

�.1