Deregulation von microRNA und Mutationen des ... · Deregulation von microRNA und Mutationen des Tumorsuppressorgens CYLD im Hodgkin Lymphom Inaugural-Dissertation zur Erlangung des

Deregulation von microRNA und

Mutationen des Tumorsuppressorgens CYLD

im Hodgkin Lymphom

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades

Dr. rer. nat.

der Fakultät für

Biologie

an der

Universität Duisburg-Essen

vorgelegt von

Annette Schmidt

aus Essen

April 2011

II

Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden am Institut für

Zellbiologie (Tumorforschung) des Universitätsklinikums Essen durchgeführt.

1. Gutachter: Prof. Dr. Ralf Küppers

2. Gutachter: Prof. Dr. Bernhard Horsthemke

Vorsitzende des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. Shirley Knauer

Tag der mündlichen Prüfung: 28.06.2011

III

Inhaltsverzeichnis: III

Abkürzungsverzeichnis VIII

Abbildungsverzeichnis X

Tabellenverzeichnis XII

1. Einleitung 1

1.1 B-Zell Entwicklung 2

1.1.1 Die frühe B-Zell Entwicklung 2

1.1.2 Die Keimzentrumsreaktion 3

1.2 Pathogenese maligner Lymphome 4

1.3 B-Zell non-Hodgkin Lymphome (B-NHL) 5

1.3.1 Das diffus großzellige B-Zell Lymphom (DLBCL) 6

1.3.2 Das Burkitt-Lymphom (BL) 6

1.3.3 Die B-Zell chronisch lymphatische Leukämie (B-CLL) 7

1.4 Das Hodgkin-Lymphom (HL) 7

1.4.1 Immunohistochemische Analyse von HRS-Zellen 8

1.4.2 Abstammung und Klonalität von HRS-Zellen 9

1.4.3 Verlust der B-Zell-Identität von HRS-Zellen 10

1.4.4 Pathogenese des HL 11

1.4.4.1 Chromosomale Instabilität und genetische Aberrationen 11

1.4.4.2 Assoziation mit EBV 12

1.4.4.3 Zelluläre Interaktion von HRS-Zellen mit dem Mikromilieu 13

1.4.4.4 Konstitutiv aktive Signalwege 14

IV

1.5 MicroRNA (miRNA) 16

1.5.1 Biogenese 17

1.5.2 Interaktion von miRNA und Zielgen-mRNA 18

1.5.3 Mechanismen der Inhibierung der mRNA-Translation

durch miRNA 19

1.5.4 MiRNAs im Hodgkin Lymphom 20

1.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 22

2. Material und Methoden 23

2.1 DNA-Arbeitstechniken 23

2.1.1 DNA-Präparation 23

2.1.2 Bestimmung der DNA-Konzentration 23

2.1.3 Semi-verschachtelte 2-Runden PCR für die Mutationsanalyse

von CYLD 23

2.1.4. PCR-Bedingungen und verwendete Oligonukleotide 24

2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA 26

2.1.6 Elution von DNA aus Agarosegelen 27

2.1.7 Aufreinigung von PCR-Produkten 27

2.1.8 Ligation von DNA zur Klonierung 27

2.1.9 DNA-Transformation 28

2.1.10 Plasmidisolierung aus E.coli-Bakterien (Mini-Präparation) 28

2.1.11 Sequenzreaktion und Auswertung 29

2.2 RNA-Arbeitstechniken 30

2.2.1 RNA-Extraktion 30

2.2.2 Hitzschockbehandlung von HRS-Zellen 30

2.2.3 Reverse Transkription (RT) von mRNA 30

2.2.4 RT-PCR für CYLD in HL-Zelllinien 31

2.2.5 RT von miRNA 31

V

2.2.6 Multiplex-Präamplifikation von miRNA-cDNA 32

2.2.7 Quantitative Echtzeit-PCR 32

2.2.7.1 miRNA-qPCR mit Einzelassays 33

2.2.7.2 miRNA-qPCR mit TaqMan Low Density Arrays (TLDA) 34

2.2.7.3 mRNA-qPCR mit Einzelassays 34

2.3 Arbeiten mit Primärgewebe 34

2.3.1 Herstellung von Gewebeschnitten 34

2.3.2 Immunfärbung von Gefriergewebsschnitten 34

2.3.3 Färbung von Paraffingewebeschnitten 35

2.3.4 Mikrodissektion von HRS-Zellen aus Paraffingewebeschnitten

mittels Laser-Microbeam Mikrodissektion (LMM) und Laser

Pressure Catapulting (LPC) 35

2.3.5 Isolierung von Keimzentrums-B-Zellen 36

2.4 Arbeiten mit Zellen 37

2.4.1 Zellkultur 37

2.4.2 Kultivierung von Zellen 37

2.4.3 Zellzahlbestimmung 38

2.4.4 Durchflusszytometrische Analyse und Zellsortierung (FACS) 38

2.5 Statistik 38

2.5.1 Statistische Auswertung der miRNA-TLDA 38

2.5.1.1 Auswertungen mit Genespring GX 38

2.5.1.1.1 Normalisierung der Datensätze 38

2.5.1.1.2 Hierarchische Gliederung 39

2.5.1.1.3 Paarweise Vergleiche 39

2.5.1.1.4 Prinzipielle Komponenten Analyse (PCA) 40

2.5.1.2 Auswertungen mit R 40

VI

3. Ergebnisse 41

3.1 Etablierung eines RT-qPCR-Protokolls für microRNA aus

geringen Zellmengen 41

3.1.1 Etablierungsexperimente mit Zelllinien 42

3.1.2 Etablierungsexperimente mit mikrodissektierten Zellen

aus HL-Fällen 44

3.1.3 Etablierung des Multiplex-RT und Präamplifikationsprotokolls 46

3.1.4 Reproduzierbarkeit der TLDA-Analysen 48

3.2 MicroRNA-Expressionsanalysen in HL-Tumorzellen, GC-B-Zellen

und CD30+ GC-B-Zellen 49

3.2.1 MiRnome-weite Analyse der miRNA-Expression in HL-

Tumorzellen und GCB-Zellen 49

3.2.2 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen

und HRS-, bzw. LP-Zellen 53

3.2.3 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen und

HL-Zelllinien 58

3.2.4 Differentielle miRNA-Ausprägung in HL-Subtypen 59

3.2.4.1 Differentielle miRNA-Expression im cHL und NLPHL 59

3.2.4.2 Differentielle miRNA-Expression im NS-, NS CD20+-

und MC-cHL 62

3.2.5 Verwandtschaft von GC-B-Zellen, CD30+ GC-B-Zellen

und HL-Tumorzellen 65

3.4 Mutationsanalyse des Tumorsuppressorgens CYLD im cHL 70

3.4.1 Hinweise auf eine Tumorsuppressorgen-Funktion von

CYLD im cHL 70

3.4.2 Mutationsanalysen von CYLD in cHL-Zelllinien 70

3.4.3 Mutationsanalyse von CYLD in HRS-Zellen 73

VII

4. Diskussion 75

4.1 Etablierung einer Methode zur miRNom-Analyse in

mikrodissektierten HRS- Zellen 75

4.2 MicroRNA-Expressionsanalysen in HL-Tumorzellen, GC-B-Zellen

und CD30+ GC-B-Zellen 75

4.2.1 MiRnome-weite Analyse der miRNA-Expression in

HL-Tumorzellen und GCB-Zellen 75

4.2.2 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen und

HRS-, bzw. LP-Zellen 76

4.2.3 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen

und HL-Zelllinien 83

4.2.4 Differentielle miRNA-Ausprägung in HL-Subtypen 84

4.2.4.1 Differentielle miRNA-Expression im cHL und NLPHL 85

4.2.4.2 Differentielle miRNA-Expression im NS-, NS CD20+-

und MC-cHL 86

4.2.5 Verwandtschaft von GC-B-Zellen, CD30+ GC-B-Zellen

und HL-Tumorzellen 90

4.3 Mutationsanalyse des Tumorsuppressorgens CYLD im cHL 91

4.3.1 Mutationsanalysen von CYLD in cHL-Zelllinien 91

4.3.2 Mutationsanalyse von CYLD in HRS-Zellen 92

5. Ausblick 94

6. Zusammenfassung 96

Literatur 98

Teilpublikationen 116

Anhang

Danksagung

Lebenslauf

Erklärungen

VIII

Abkürzungsverzeichnis:

ABC-DLBCL in vitro-aktiviertes B-Zell-ähnliches DLBCL

AGO Argonautprotein

AID Aktivierungs-induzierte Cytidin-Deaminase

AIDS aquired immune deficiency syndrome

APC Antigen-präsentierende Zellen

BCR B-Zell Rezeptor (engl. B cell receptor)

BL Burkitt-Lymphom

B-NHL B-Zell Non-Hodgkin-Lymphom

bp Basenpaare

BSA Rinderserum-Albumin

cDNA komplementäre oder Kopie-DNA

cHL klassisches Hodgkin-Lymphom

CLL chronische lymphozytische Leukämie CSR Klassenwechselrekombination

(engl. class switch recombination)

D Diversitäts-Genelement des Ig-Locus (engl. diversity region) DLBCL diffus-großzelliges-B-Zell-Lymphom

(engl. diffuse large B cell lymphoma)

DNA Desoxyribonukleinsäure

EBV Epstein-Barr-Virus

EtOH Ethanol

FC Fold Change

FCS fötales Kälberserum

FDC follikulär-dendritische Zelle (engl. follicular dendritic cell)

FFPE Formalinfixiert, Paraffineingebettet

GC Keimzentrum (engl. germinal center)

GCB-DLBCL Keimzentrums-ähnliches DLBCL

HL Hodgkin-Lymphom

HRS Hodgkin/Reed-Sternberg

Ig Immunoglobulin

IgH Ig schwere Kette (engl. heavy chain) J Verbindendungs-Genelement des Ig-Locus

(engl. joining region)

kb Kilo Basenpaare

LCL Lymphoblastoide Zelllinien

LMPC Laser Microdissection and Pressure Catapulting MACS magnetische Zellseparation

(engl. magnetic activated cell sorting)

MC-HL gemischtzelliges HL (engl. mixed cellularity)

MCL Mantelzelllymphom (engl. mantle cell lymphoma) MHC Haupthistokompatibilitätskomplex

(engl. major histocompatibility complex)

miRNA, miR microRNA

IX

miRNA-ISH miRNA in situ-Hybridisierung

mRNA Boten-RNA (engl. messanger RNA)

NHL Non-Hodgkin-Lymphom

NK natural killer cell

NLPHL noduläres lymphozyten-prädominantes Hodgkin-Lymphom

NS-HL nodulär sklerosierendes HL

PA Präamplifikation

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion

(engl. Polymerase-Chain-Reaction)

Pol II DNA-abhängigen RNA-Polymerase II

PTLD Posttransplantations-lymphoproliferative Erkrankung

qPCR quantitative Real Time-PCR

RISC RNA induced silencing complex

RNA Ribonukleinsäure

rpm rounds per minute

RT reverse Transkription

SHM somatische Hypermutation

snoRNA kleine nukleoläre RNA (engl. small nucleolar RNA)

TAE

Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TCR T-Zell Rezeptor (engl. T cell receptor)

TLDA TaqMan low density array

TMC tonsilläre mononukleäre Zellen

TNF Tumornekrosefaktor

V variables-Genelement des Ig-Locus (engl. variable region)

WHO World Health Organisation

Mittelwert

X

Abbildungsverzeichnis:

Abbildung 1: Schematische Darstellung der NF-κB-Aktivierung in HRS-

Zellen. 15

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Biogenese und Funktionsweise

von miRNAs. 17

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Bindung einer miRNA an ihre

Ziel-mRNA. 18

Abbildung 4: Schematische Darstellung der reversen Transkription von

miRNA mit Stem-Loop-Primern. 32

Abbildung 5: Schematische Übersicht der Arbeitsschritte der miRNA-

Expressionsanalyse aus wenigen Zellen. 41

Abbildung 6: Auftragung der durch RT-qPCR ermittelten Ct-Werte für

RNU48. 42

Abbildung 7: Auftragung der durch RT-qPCR ermittelten ΔCt-Werte für

miR-15a, miR-16, miR-146a und miR-155 in L-1236. 43

Abbildung 8: MiR-155-Expression in Proben aus Gefrier- und FFPE-

Material eines HL-Falles. 45

Abbildung 9: Vergleich der ΔCt-Werte für die miRNAs 15a, 146a und 155

aus prä-amplifizierter und nicht präamplifizierter miR-cDNA

der HL-Zelllinie U-HO1. 46

Abbildung 10: Vergleich der ΔCt-Werte für die miRNAs 15a, 146a und 155

aus präamplifizierter und nicht präamplifizierter miR-cDNA

der HL-Zelllinie L-1236 und dem primären HL-Fall K836-07. 47

Abbildung 11: Streudiagramm der TLDA-Analysen Multiplex-RT-PA-

prozessierter 400-Zell-Aliquots der HL-Zellline U-HO1. 48

Abbildung 12: Unsupervised hirarchical clustering aller GC-B-Zell und HL-

Proben. 51

Abbildung 13: Unsupervised hirarchical clustering aller HL-Proben. 52

Abbildung 14: Heatmap der differentiell ausgeprägten miRNAs in GC-B-

Zellen und HL-Primärfällen.

54

XI

Abbildung 15: Inkonsistente miRNA-Ausprägung innerhalb der cHL-Fälle im

Vergleich zum NLPHL. 60

Abbildung 16: PCA aller untersuchten Zelltypen über die 200 am

variabelsten ausgeprägten miRNAs. 65

Abbildung 17: Heatmap der differentiellen miRNA-Expression in CD30+ GC-

B-Zellen und GC-B-Zellen. 66

Abbildung 18: Supervised PCA aller untersuchten Zelltypen anhand der

zwischen GC-B- und CD30+ GC-B-Zellen differentiell

ausgeprägten miRNAs. 68

Abbildung 19: Supervised PCA von HL-Zelllinien, GC-B- und CD30+

GC-B-Zellen. 69

Abbildung 20: CYLD-Mutationen in KM-H2. 71

Abbildung 21: Schematische Darstellung der Konsequenz der CYLD-

Mutation auf die Translation des Cyld-Proteins in der HL-

Zelllinie KM-H2. 72

Abbildung 22: Agarosegel der RT-PCR der HL-Zelllinien KM-H2, L-1236,

SUP-HD1 und U-HO1. 72

Abbildung 23: MiR-181b-Expression in HL-Primärfällen und GC-B-Zellen. 93

XII

Tabellenverzeichnis:

Tabelle 1: Differentielle miRNA-Expression im HL. 55

Tabelle 2: Differentielle miRNA-Expression im HL. 55

Tabelle 3: HL-Subtyp-spezifische miRNA-Regulation. 57

Tabelle 4: Vergleich der differentiellen miRNA-Expression in HL-Zelllinien

und Primärfällen. 58

Tabelle 5: Spezifische miRNA-Regulation in HL-Zelllinien. 59

Tabelle 6: Differentielle miRNA-Expression im NLPHL im Vergleich zu

den cHL-Sbtypen NS und MC. 61

Tabelle 7: Differentielle miRNA-Expression in NS- und MC-cHL-Fällen. 62

Tabelle 8: Differentielle miRNA-Expression in NS- und CD20+ NS-cHL-

Fällen. 63

Tabelle 9: Differentielle miRNA-Expression in CD20+ NS- und MC-cHL-

Fällen. 64

Tabelle 10: Übereinstimmende differentielle miRNA-Expression von

CD30+ GCB-Zellen und HL-Tumorzellen. 67

Tabelle 11: CYLD-Mutationen in HL-Zelllinien. 73

Tabelle 12: CYLD-Mutationen in cHL-Fällen. 74

Tabelle 13: Vergleich der in der vorliegenden Arbeit definierten HL-

spezifischen miRNA-Signatur mit korrespondierenden

Ergebnissen anderer Studien. 78

EINLEITUNG

1

1. Einleitung

Der Mensch ist innerhalb seiner Umwelt kontinuierlich einer Vielzahl von

Krankheitserregern, z.B. Pilzen, Parasiten, Viren und Bakterien, ausgesetzt. Die

Epithelien bilden zwar eine wirksame mechanische Barriere gegen diese Pathogene,

können jedoch keinen vollständigen Schutz gegen ihr Eindringen und die

anschließende Ausbreitung im Organismus gewährleisten. Im Falle einer Infektion

wird eine sogenannte Immunantwort initiiert, innerhalb derer die Pathogene durch

Zellen des Immunsystems inaktiviert und eliminiert werden.

Das Immunsystem gliedert sich in zwei Komponenten. Die angeborene Immunität

beruht auf unspezifischen Abwehrmechanismen und reagiert innerhalb kurzer Zeit

auf das Eindringen eines Erregers in den Organismus. Hierzu zählen beispielsweise

das Komplementsystem und phagozytierende Zellen. Das Hauptmerkmal der

spezifischen oder adaptiven Immunabwehr ist ihre Anpassungsfähigkeit gegenüber

unbekannten oder veränderten Krankheitserregern. Zellen der adaptiven

Immunabwehr sind in der Lage, Antigen-Strukturen sowohl bekannter als auch

unbekannter eindringender Pathogene zu erkennen und gezielt zelluläre

Abwehrmechanismen und die Bildung von Antikörpern einzuleiten. Neben Antigen-

präsentierenden Zellen (engl. antigen presenting cells, APC), wie z.B. dendritischen

Zellen, spielen hierbei die T- und B-Lymphozyten, kurz T- und B-Zellen genannt, eine

maßgebliche Rolle.

Lymphoide T-Vorläuferzellen werden im Knochenmark gebildet und wandern von

dort aus zur Reifung in den Thymus. Durch den an ihrer Oberfläche ausgeprägten T-

Zell-Rezeptor (engl. T cell receptor, TCR) können sie die von APC mittels des

Haupthistokompatibilitätskomplex (engl. major histocompatibility complex, MHC)

präsentierten Antigene zu erkennen. Es gibt drei Haupttypen von T-Zellen: T-

Helferzellen sind durch Sezernierung von Zytokinen und Zell-Zell-Stimulation an der

Aktivierung anderer Immunzellen beteiligt, zytotoxische T-Zellen erkennen und

eliminieren Erreger-befallene Zellen durch Induktion von Apoptose und

regulatorische T-Zellen vermitteln unter anderem die Toleranz gegenüber Auto-

Antigenen.

B-Zellen entwickeln sich im Knochenmark und der fötalen Leber aus

hämatopoetischen Stammzellen. Sie erkennen freie oder zellgebundene Antigene

über Immunglobuline (Ig), die entweder als membranständiger B-Zell-Rezeptor (engl.

B cell receptor, BCR) ausgeprägt oder als lösliche Antikörper sezerniert werden

EINLEITUNG

2

können. B-Zellen können sowohl T-Zell-abhängig als auch unabhängig aktiviert

werden, wobei beide Prozesse zur Produktion von Antikörpern durch die B-Zelle

führen. T-Zell abhängige Immunreaktionen beinhalten die Interaktion von B- und T-

Zellen sowie APC und führen zur Differenzierung von B-Zellen in Plasmazellen, die

hochaffine Antikörper sezernieren, und zur Entwicklung langlebiger Gedächtnis-B-

Zellen.

1.2 B-Zell Entwicklung

1.1.1 Die frühe B-Zell Entwicklung

Während der frühen Entwicklung im Knochenmark durchlaufen B-Zellen

verschiedene Prozesse, die zur Ausbildung der Antikörperspezifität führen.

Antikörper werden durch die Ig-Gene kodiert und gehören zur Familie der

Glykoproteine. Sie bestehen aus jeweils zwei identischen schweren bzw. leichten

Ketten (engl. heavy / light chains), die durch kovalente Disulfidbrücken zu einer

Ypsilon-förmigen Struktur miteinander verknüpft sind. Sowohl schwere als auch

leichte Ketten weisen einen konstanten Carboxyterminus auf (C-Region, engl.

constant region), wohingegen ihr Aminoterminus (V-Region, engl. variable region)

durch die zufällige Umlagerung von Ig-Gensegmenten variiert. Diese schrittweise

erfolgende Umlagerung der Ig-Gene, die V(D)J-Rekombination genannt wird, ist

kennzeichnend für die frühe B-Zell-Entwicklung und dient der Erweiterung der

Antikörperrepertoires; es können ca. 1014 verschiedene BCR gebildet werden, so

dass jede B-Zelle einen einzigartigen Antikörper ausprägt, der als klonaler Marker

dienen kann (Janeway und Travers, 1997). Entsteht ein funktionales, nicht-

autoreaktives Ig aus der V(D)J-Rekombination, so wird dieses auf der Zelloberfläche

ausgeprägt (Gellert, 2002). Anschließend verlassen die B-Zellen das Knochenmark

und wandern in die Peripherie (Rajewsky, 1996). Trifft die B-Zelle in der T-Zell-Zone

eines lymphatischen Organs auf ein zu ihrem BCR passendes Antigen, wird sie

durch T-Helferzellen vermittelte Co-Stimulation aktiviert und differenziert entweder in

eine kurzlebige, niedrig-affine Antikörper-sezernierende Plasmazelle (Liu et al., 1991)

oder wandert in primäre Follikel und initiiert dort eine sogenannte

Keimzentrumsreaktion (Jacob und Kelsoe, 1992).

EINLEITUNG

3

1.1.2 Die Keimzentrumsreaktion

Keimzentren (engl. germinal center, GC) bestehen aus proliferierenden B-Zellen

sowie einwandernden anderen Zelltypen in Follikel peripherer lymphatischer Gewebe

wie z.B. Milz, Lymphknoten, Tonsillen und die Peyer’schen Plaques. Naïve B-Zellen

wandern in die T-Zell-reichen Zonen und werden dort durch CD4-positive (CD4+) T-

Zellen und APC aktiviert. Das etablierte GC ist unterteilt in eine dunkle Zone, die

vornehmlich aus proliferierenden, CD77 ausprägenden Zentroblasten besteht, und

eine helle Zone, in der sich neben nicht-proliferierenden Zentrozyten auch

Makrophagen, T-Zellen und follikulär dendritische Zellen (engl. follicular dendritic

cells, FDC) befinden (Kroese et al., 1990). Neben CD77 prägen GC-B-Zellen noch

weitere Marker aus wie z.B. CD10 und CD38 (Klein et al., 2003). Ein kleiner Teil der

Population exprimiert außerdem den CD30-Rezeptor, der normalerweise auf

aktivierten B- und T-Zellen zu finden ist (Alzona et al., 1994). Die genaue Funktion

dieser Subpopulation konnte bisher nicht geklärt werden.

Während der GC-Reaktion wird die Antigen-Affinität des BCR optimiert. Hierbei spielt

die somatische Hypermutation (SHM), bei der die variablen Regionen der Ig-Gene

modifiziert werden, eine maßgebliche Rolle (Berek et al., 1991; Küppers et al., 1993).

Durch SMH, die vermutlich vorwiegend in den Zentroblasten der dunklen GC-Zone

stattfindet (Liu et al., 1992), werden hauptsächlich Punktmutationen, jedoch auch

kleinere Deletionen oder Duplikationen in die IgV-Gene eingefügt (Goossens et al.,

1998). Essentiell für die SHM ist das Enzym activation induced cytidine deaminase

(AID) (Muramatsu et al., 2000; Revy et al., 2000), welches Strangbrüche in die DNA

einfügt, die anschließend unter Einbringung von Mutationen durch die DNA-

Reparatur-Maschinerie ersetzt werden (Bransteitter et al., 2003; Di Noia und

Neuberger, 2007). Somatisch mutierte Zentroblasten differenzieren in Zentrozyten

und wandern in die helle GC-Zone, wo sie um die Bindung des von FDC

präsentierten Antigens konkurrieren. Wurde durch die SHM eine Verbesserung der

Antigen-Affinität des BCR erzielt werden die Zellen unter anderem durch T-Zell-

vermittelte CD40-Co-Stimulation positiv selektioniert und differenzieren in

Plasmazellen oder langlebigen Gedächtnis-B-Zellen (Klein und Dalla-Favera, 2008).

Im Falle einer niedrigeren oder nicht vorhandenen Antigen-Affinität des BCR erhält

die B-Zelle kein solches Überlebenssignal und stirbt durch Apoptose (Rajewsky,

1996). Der so ausgeübte Selektionsdruck im GC führt zur Expansion von B-Zell

Klonen mit hoch-affinen BCR, die schließlich zu Plasma- und Gedächtnis-B-Zellen

EINLEITUNG

4

differenzieren und das GC verlassen (Kroese et al., 1990; Küppers et al., 1993;

MacLennan et al., 1992).

Ein Teil der Zentrozyten im GC vollzieht die sogenannte

Klassenwechselrekombination (engl. Class switch Recombination, CSR). Dies

bedeutet, dass der Isotyp des exprimierten BCR gewechselt wird, was zu einer

veränderten Effektorfunktion des Antikörpers führt. Dessen Spezifität, die durch die

umgelagerten IgV-Gene gegeben ist, bleibt dabei erhalten (Manis et al., 2002). Naïve

B-Zellen exprimieren die Immunglobuline IgM und IgD, kodiert von den konstanten

IgM- und IgD-Genregionen. Während des Klassenwechsels werden AID-induzierte

Doppelstrangbrüche in die DNA eingebracht (Muramatsu et al., 2000; Revy et al.,

2000), die ursprüngliche konstante Region intrachromosomal deletiert und durch eine

stromabwärts befindliche konstante IgG, IgA oder IgE-Region ersetzt (Schrader et

al., 2005; Wuerffel et al., 1997), woraus schließlich die Änderung des BCR-Isotyps

resultiert.

1.2 Pathogenese maligner Lymphome

Als maligne Lymphome bezeichnet man monoklonale Neoplasien lymphoider Zellen.

Diese betreffen vornehmlich das lymphatische System, z.B. Lymphknoten, Milz oder

Knochenmark, können jedoch auch in anderen Organen auftreten. Nach der World

Health Organisation- (WHO) Klassifizierung werden sie in Hodgkin-Lymphome (HL)

und Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) unterteilt. Innerhalb der NHL wird zwischen B-

Zell-, T-Zell- und Natural Killer Cell- (NK) Lymphomen unterschieden. Zahlreiche

weitere Subtypen werde anhand ihrer histologischen, genetischen und

immunologischen Eigenschaften klassifiziert (Jaffe, 2001). Ein Großteil der NHL (ca.

90%) weist einen B-Zell-Ursprung auf (Fisher, 2003). Durch den Nachweis somatisch

mutierter IgV-Gene in den Tumorzellen wurde gezeigt, dass die meisten B-Zell-NHL

(B-NHL) aus GC- oder Post-GC-B-Zellen hervorgehen (Klein und Dalla-Favera,

2008; Kuppers, 1999). In einigen Lymphomen ist der SHM-Prozess noch aktiv, so

dass hier von einer direkten Abstammung von GC-B-Zellen ausgegangen werden

kann.

Die GC-Passage birgt somit besondere Risiken bezüglich der malignen

Transformation von B-Zellen. Dies hat mehrere Gründe. Zum einen ist es die hohe

Proliferationsrate von Zentroblasten; ihr Zellzyklus ist mit 6-12 h im Vergleich zu

anderen Zelltypen dramatisch beschleunigt (Allen et al., 2007). Die intensive

EINLEITUNG

5

Proliferation geht einher mit der zuvor beschriebenen SHM, was die Zellen einem

massiven genotoxischen Stress aussetzt. In anderen Zelltypen würden die durch

hohe Proliferationsraten und SHM verursachten DNA-Schädigungen zum Arrest des

Zellzyklus und Zelltod durch Apoptose führen. In den Zentroblasten wird dieser

Mechanismus jedoch kurzzeitig unterdrückt, unter anderem durch die Ausprägung

des transkriptionellen Repressors Bcl-6. Auf diese Weise wird temporäre Toleranz

gegenüber DNA-Schädigungen vermittelt und so die extreme Proliferationsrate der

GC-Zellen ermöglicht (Cattoretti et al., 1995; Phan und Dalla-Favera, 2004; Phan et

al., 2007). Des Weiteren kommt es während der SHM im GC zu AID-induzierten

Doppelstrangbrüchen im IgV-Locus (siehe 1.1.2), die, sofern zum selben Zeitpunkt

ein weiteres Chromosom mit Doppelstrangbruch benachbart ist, zu chromosomalen

Translokationen führen können (Küppers und Dalla-Favera, 2001). Außerdem wurde

gezeigt, das SHM auch Punktmutationen in Nicht-Ig-Genen, wie z.B. CD95,

verursachen kann; dieser Vorgang wird als aberrante SHM (ASHM) bezeichnet

(Müschen et al., 2000b).

Ein weiterer Risikofaktor für maligne Transformationen von B-Zellen im GC ist die

Klassenwechselrekombination (siehe 1.1.2). Durch die AID-induzierten DNA-

Strangbrüche können ebenfalls Translokationen im Ig-Locus entstehen, die in B-NHL

typischerweise zur Deregulation von Proto-Onkogenen führen. Dabei wird häufig ein

regulatorisches Element des Ig-Locus mit der intakten kodierenden Region des

Zielgens verknüpft (Fenton et al., 2004; Shiramizu und Magrath, 1990).

1.3 B-Zell non-Hodgkin Lymphome (B-NHL)

Die B-NHL werden gruppiert in indolente, d.h. langsam verlaufende Erkrankungen

wie z.B. die B-Zell chronisch lymphatische Leukämie (CLL) und aggressivere Typen

wie das diffus-großzellige B-Zell Lymphom (engl. diffuse large B cell lymphoma,

DLBCL) oder das Burkitt Lymphom (BL). Das DLBCL ist mit 30% aller auftretenden

Lymphome die am häufigsten vorkommende lymphoide Neoplasie. Das BL tritt fast

ausschließlich bei Kindern und jungen Erwachsenen auf und macht in dieser

Altersgruppe 35% aller Lymphomerkrankungen aus (Fisher, 2003). Im Folgenden

werden einige der wichtigsten B-NHL-Subgruppen beschrieben.

EINLEITUNG

6

1.3.1 Das diffus großzellige B-Zell Lymphom (DLBCL)

Das DLBCL umfasst eine heterogene Gruppe von Lymphomen, die sich histologisch,

immunologisch und genetisch unterscheiden. Varianten sind u.a. das

immunoblastische, das zentroblastische, das anaplastische, das T-Zell-reiche und

das primär mediastinale B-Zell Lymphom (PMBL) (Gatter, 2001). Die Heterogenität

der DLBCL spiegelt sich auch im variablen Krankheitsverlauf wieder; so sprechen

zwar viele Patienten zunächst auf Chemotherapie an, letztlich verläuft die Krankheit

jedoch in ca. 60% der Fälle tödlich (Staudt, 2003). Durch Genexpressionsanalysen

konnten zwei Subgruppen identifiziert werden, die entweder Ähnlichkeit mit GC-B-

Zellen (GCB-DLBCL) oder mit in vitro-aktivierten B-Zellen (ABC-DLBCL) zeigen

(Alizadeh et al., 2000). In beiden Subgruppen wurden somatisch mutierte IgV-Gene

gefunden, was auf eine GC-Abstammung der Zellen hindeutet; aktive SHM konnte

jedoch nur im GC-DLBCL nachgewiesen werden (Lossos et al., 2000). Auch anhand

charakteristischer genetischer Läsionen lassen sich die beiden Subtypen

unterscheiden; so finden sich Ig/BCL-2 Translokationen und c-REL Amplifikationen

ausschließlich im GC-DLBCL, während BCL-6-Translokationen hauptsächlich im

ABC-Typ vorkommen (Iqbal et al., 2007). Ausgeprägt wird das Gen jedoch in beiden

Subtypen (Huang et al., 2002).

1.3.2 Das Burkitt-Lymphom (BL)

Das BL gehört zu den aggressiven Lymphomen und weist eine der höchsten

Teilungsraten unter den humanen Tumoren auf (Hecht und Aster, 2000). Es wird von

der WHO in drei verschiedene Formen gegliedert. Die endemische Form tritt

hauptsächlich bei Kindern und jungen Erwachsenen in Afrika auf und ist in 95% aller

Fälle mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) assoziiert (Lindstrom und Wiman, 2002). Die

sporadische Form kommt in Europa und Nordamerika vor und weist nur selten eine

EBV-Assoziation auf. Der dritte Typus betrifft immundefiziente Menschen, die z.B. mit

dem Aquired immune deficiency syndrome virus (AIDS-Virus) infiziert sind oder unter

einer Posttransplantations-lymphoproliferativen Erkrankung (engl. post transplant

proliferative disorder, PTLD) leiden. Durch den Nachweis somatisch mutierter Ig-

gene in BL-Tumorzellen und andauernder SHM im endemischen BL kann eine

Abstammung von GC-B-Zellen angenommen werden (Chapman et al., 1998). Das

molekulargenetische Hauptmerkmal des BL ist die Translokation des c-MYC-

EINLEITUNG

7

Onkogens in einen der Ig-Loci (Hummel et al., 2006; Lindstrom und Wiman, 2002).

Des Weiteren wurden genetische und epigenetische Transformation gefunden, die

den Signalweg des Tumorsupressorgens p53 betreffen (Lindstrom und Wiman,

2002).

1.3.3 Die B-Zell chronisch lymphatische Leukämie (CLL)

Die CLL ist die am häufigsten vorkommende Leukämie der westlichen Welt. Der

Krankheitsverlauf beginnt indolent, kann jedoch im weiteren Verlauf in eine

aggressive Form übergehen. Charakteristisch für die CLL ist die Akkumulation von

reifen CD5+ B-Zellen im Blut oder lymphatischen Organen (Zenz et al., 2010). In ca.

50% der CLL-Fälle wurden somatisch mutierte Ig-Gene gefunden, was auf eine GC-

Passage der Vorläuferzellen hindeutet. Die restlichen 50% weisen unmutierte Ig-

Gene auf (Klein und Dalla-Favera, 2005; Oscier et al., 1997). Der

Hypermutationsstatus korreliert mit dem Krankheitsverlauf, wobei Fälle mit

unmutierten Ig-Genen eine signifikant schlechtere Prognose haben (Damle et al.,

1999). In vielen CLL-Fällen findet sich eine Deletion der chromosomalen Region

13q14, die unter anderem den Locus der microRNAs (miRNAs) 15a und 16-1

beinhaltet. miR-15a und -16-1 regulieren das anti-apoptotische Onkogen BCL2 und

werden in der CLL zumeist nicht ausgeprägt (Calin et al., 2002; Cimmino et al.,

2005). Des Weiteren wurden Mutationen in den Genen TP53 und ATM gefunden,

deren Proteinprodukte eine Rolle in der Zellantwort auf DNA-Schädigungen spielen

(Gaidano et al., 1991; Gumy-Pause et al., 2004).

1.4 Das Hodgkin-Lymphom (HL)

Das HL wurde erstmalig im Jahr 1832 von Thomas Hodgkin beschrieben (Hodgkin,

1832). Ein charakteristisches Diagnosemerkmal dieser Erkrankung ist das Auftreten

einer geringen Anzahl von großen neoplastischen, ein- oder mehrkernigen Hodgkin-

/Reed-Sternberg- (HRS) Zellen innerhalb eines inflammatorischen Mikromilieus, das

sich aus T-Zellen, B-Zellen, Eosinophilen, Neutrophilen, Makrophagen und

Mastzellen zusammensetzt. In der Regel machen die HRS-Zellen weniger als 1% der

Tumormasse aus (Weiss, 2007), wobei ihre Zahl von Fall zu Fall stark variieren kann.

Mit einer Inzidenz von 2 bis 4 Fällen auf 100.000/Jahr ist das HL zwar eine seltene

Erkrankung, jedoch eines der häufigsten Lymphome der westlichen Welt (Landgren

EINLEITUNG

8

und Caporaso, 2007). Nach morphologischen und immunphänotypischen Kriterien

wird es unterteilt in das klassische HL (engl. classic HL, cHL, ca. 95% aller HL) und

das noduläre Lymphozyten-prädominante HL (NLPHL, ca. 5%), dessen maligne

Zellen als LP-Zellen (für engl. lymphocyte predominant) bezeichnet werden (Jaffe,

2001). Nach WHO-Klassifizierung werden im cHL anhand von Histologie und

Phänotyp der Zellen vier weitere Untergruppen unterschieden: das nodulär-

sklerotisierende HL (NS-HL, ca. 60-80% aller HL), das gemischtzellige HL (engl.

Mixed Cellularity HL, MC-HL, ca. 15-30%), das lymphozytenreiche HL (engl.

lymphocyte rich classical HL, LR-cHL, ca. 6%) und das lymphozytenarme HL (engl.

lymphocyte depleted HL, LD-HL, ca. 1%) (Harris, 1999).

Das HL zeigt in der westlichen Welt eine bimodale Häufigkeitsverteilung, mit

erhöhten Inzidenzraten besonders im jungen Erwachsenenalter (ca. 25 Jahre) und,

in etwas schwächerem Ausmaß, im späteren Erwachsenensalter (ca. 60 Jahre)

(Glaser und Jarrett, 1996). Die verschiedenen Subtypen des HL unterscheiden sich

auch in ihrem Vorkommen in verschiedenen Altersgruppen; so kommt das NS-HL

vermehrt bei Kindern bzw. jungen Erwachsenen vor, während das MC-HL gehäuft im

späten Erwachsenenalter auftritt (Mueller, 1999).

Die klinischen Symptome des HL sind vielfältig. Typisch ist eine ausgeprägte, jedoch

ansonsten asymptomatische Lymphadenopathie, die vornehmlich supraklavikulär,

axillär oder zervikal lokalisiert ist. Ein Viertel der Patienten leidet zusätzlich unter

systemischen Symptomen wie Gewichtsverlust, körperlicher Abgeschlagenheit,

Fieber und Nachtschweiß (Yung und Linch, 2003).

Das NLPHL wird üblicherweise durch chirurgische Entfernung des betroffenen

Lymphknotens und anschließende Bestrahlung therapiert, während das cHL durch

eine Kombination von Chemo- und Strahlentherapie behandelt wird. Das NLPHL

kann so in ca. 95% aller Fälle erfolgreich behandelt werden, während die 5-Jahres-

Überlebensrate für therapierte cHL-Patienten bei ca. 90% liegt (Yung und Linch,

2003).

1.4.1 Immunohistochemische Analyse von HRS-Zellen

Zur immunhistochemischen Diagnose von HL wird hauptsächlich der

Oberflächenmarker CD30 genutzt, der vom größten Teil der HRS-Zellen stark

exprimiert wird (Drexler, 1992). CD30 ist ein Mitglied der Tumornekrosefaktor- (TNF)

Rezeptor-Superfamilie und wird von aktivierten Lymphozyten ausgeprägt. Was die

EINLEITUNG

9

Ausprägung anderer Zellmarker betrifft, so lassen sich die HRS-Zellen keinem

hämatopoetischen Zelltyp eindeutig zuordnen, was die Klärung ihres zellulären

Ursprungs lange Zeit behinderte. Obwohl inzwischen bekannt ist, dass HRS-Zellen in

den meisten Fällen von B-Zellen abstammen (Küppers et al., 1998a; Küppers et al.,

1994), exprimieren HRS-Zellen, im Gegensatz zu den malignen Zellen des NLPHL

(LP-Zellen), nur in seltenen Fällen B-Zell-Marker (siehe Kapitel 1.4.3). Hingegen

werden verschiedene Marker anderer hämatopoetischer Zelllinien ausgeprägt, so

z.B. CD15, ein Granulozyten- und Monozytenmarker (Drexler, 1992), die

dendritischen Zellmarker Restin, TARC und Fascin (Delabie et al., 1992; Pinkus et

al., 1997; van den Berg et al., 1999) sowie in einigen Fällen die zytotoxischen T-Zell-

Marker TIA-1 und Granzym B (Kanavaros et al., 1999; Krenacs et al., 1997;

Oudejans et al., 1996).

1.4.2 Abstammung und Klonalität von HRS-Zellen

Die zelluläre Abstammung und die klonale Verwandschaft von HRS-Zellen wurden

über einen langen Zeitraum kontrovers diskutiert. Dies lag zum einen am nicht

bestimmbaren immunohistologischen Phänotyp der HRS-Zellen, zum anderen jedoch

auch an der Seltenheit der malignen Zellen im Tumorgewebe, die die Anwendung

von Standard-Methoden wie Southern-Blot oder PCR-Analysen von Ganzschnitt-

DNA unmöglich machte. Schließlich konnten durch Mikromanipulation und

Mikrodissektion einzelne HRS-Zellen aus dem Gewebe isoliert und mittels sensitiver

PCR-Analysen eine Umlagerung ihrer IgV-Gene gezeigt werden (Bräuninger et al.,

2006; Küppers et al., 1994). Auf diese Weise wurde der B-Zell Ursprung sowohl von

HRS-Zellen im cHL als auch der von LP-Zellen im NLPHL nachgewiesen. Des

Weiteren wurde gezeigt, dass HRS-, bzw. LP-Zellen innerhalb eines Falles eine

klonale Verwandtschaft in ihren V-Genen aufweisen (Braeuninger et al., 1997;

Bräuninger et al., 1999; Hummel et al., 1996; Irsch et al., 1998; Marafioti et al., 1997).

Sowohl im cHL als auch im NLPHL sind die IgV-Gene der Tumorzellen somatisch

mutiert, was eine GC-Passage der Ursprungszellen nahelegt. In LP-Zellen findet

sich, im Gegensatz zu HRS-Zellen, zusätzlich in einem Teil der Fälle eine

intraklonale IgV-Gen-Diversität (Braeuninger et al., 1997; Küppers et al., 1998b;

Marafioti et al., 1997), die auf eine andauernde Hypermutation der Zellen und somit

einen direkten Ursprung aus GC-B-Zellen hinweist. Das Muster der somatischen

Mutationen in LP-Zellen lässt außerdem auf einen Selektionsprozess für einen

EINLEITUNG

10

funktionalen BCR schließen (Küppers, 2002). In HRS-Zellen hingegen wurden in ca.

25% der Fälle inaktivierende Mutationen in den IgV-Genen gefunden, wie

Stoppkodons, Insertionen oder Deletionen, die zur Verschiebung des Leserasters

führen (Bräuninger et al., 2006; Küppers, 2002). Solche „verkrüppelnden“ Mutationen

verhindern die Ausprägung eines funktionellen BCR, was innerhalb der GC-Reaktion

eigentlich den Zelltod durch Apoptose einleiten sollte (Lam et al., 1997); bei HRS

Zellen ist dies jedoch nicht der Fall. Dieser Umstand führte zu der Annahme, dass

HRS-Zellen von präapoptotischen GC-B-Zellen abstammen, die durch

vorangegangene transformierende Ereignisse dem programmierten Zelltod

entkommen konnten (Kanzler et al., 1996; Küppers et al., 1998a). Inaktivierende

Mutationen der IgV-Gene finden sich auffälligerweise beinahe ausschließlich in EBV-

positiven HL-Fällen (Bräuninger et al., 2006). Das durch EBV kodierte Protein

LMP2a, das von beinahe allen EBV-positiven HRS-Zellen ausgeprägt wird, ist in der

Lage die Präsenz eines BCR zu imitieren, was das Überleben BCR-defizienter HRS-

Vorläuferzellen im GC erklären könnte (Bechtel et al., 2005; Mancao und

Hammerschmidt, 2007).

In seltenen Fällen prägen HRS-Zellen auch T-Zell-Marker aus (Küppers, 2002).

Studien ergaben jedoch, dass klonale T-Zell-Rezeptor-Umlagerungen bei

gleichzeitiger Abwesenheit von IgV-Umlagerungen, die einen T-Zell-Ursprung

nahelegen würden, äußerst selten sind; der Anteil der aus T-Zellen

hervorgegangenen Fälle wird auf ca. 5% geschätzt (Müschen et al., 2000a; Seitz et

al., 2000).

1.4.3 Verlust der B-Zell-Identität von HRS-Zellen

Obwohl HRS-Zellen von B-Lymphozyten abstammen, prägen sie kaum B-Zell-

spezifische Proteine aus (Schwering et al., 2003). In immunhistochemischen Studien

konnte gezeigt werden, das sowohl die Expression von B-Zell-Oberflächenmarkern

wie CD20 und CD79 als auch die Ausprägung spezifischer Transkriptionsfaktoren

wie PU.1, BOB1 und Oct-2 herabreguliert ist. Letzteres könnte die niedrige bzw.

fehlende Ig-Transkription in HRS-Zellen erklären. (Mathas et al., 2002; Re et al.,

2001; Stein et al., 2001; Torlakovic et al., 2001; Watanabe et al., 2000). Zudem

konnte gezeigt werden, dass auch epigenetische Inaktivierung von B-Zell-

spezifischen Genen durch Promotermethylierung zu deren Herabregulation beiträgt

(Ushmorov et al., 2006; Ushmorov et al., 2004). Neben dem Verlust B-Zell-

EINLEITUNG

11

spezifischer Proteine spielt auch die Ausprägung von Genen, die anderen Zelltypen

zugeordnet werden, eine entscheidende Rolle beim Verlust des B-Bell-Phänoptyps

von HRS-Zellen. So werden unter anderem T-Zell spezifische Transkriptionsfaktoren

wie Notch1, GATA3 und T-bet ausgeprägt (Atayar et al., 2005; Jundt et al., 2002). Es

konnte gezeigt werden, das Notch1, ein Hauptregulator der T-Zell-Differenzierung, in

der Lage ist, die Ausprägung B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und die

Expression von Genen, die für andere Zelltypen charakteristisch sind, zu induzieren

(Jundt et al., 2008). So aktiviert Notch1 unter anderem die Expression von GATA3 in

HRS-Zellen (Stanelle et al., 2010), wohingegen es die Ausprägung der B-Zell-

Transkriptionsfaktoren E2A und EBF unterdrückt (Jundt et al., 2008).

Welche Rolle der Verlust der B-Zell-Identität in der Pathogenese des HL spielt ist

bislang nicht geklärt. Vor dem Hintergrund, dass HRS-Zellen von GC-B-Zellen

abstammen, die aufgrund der Abwesenheit eines funktionellen BCRs Apoptose-

prädestiniert sind, scheint es denkbar, dass der Verlust ihres ursprünglichen

Phänotyps zu ihrer Rettung vor dem programmierten Zelltod beiträgt.

1.4.4 Pathogenese des HL

1.4.4.1 Chromosomale Instabilität und genetische Aberrationen

Das gehäufte Auftreten chromosomaler Aberrationen wird als chromosomale

Instabilität bezeichnet und ist vor allem kennzeichnend für solide Tumore

(Gisselsson, 2002), wohingegen es in Lymphomen eher selten auftritt. HRS-Zellen

jedoch zeigen typischerweise ebenfalls einen abnormen Karyotyp, wobei es zum

Verlust oder Zugewinn ganzer Chromosomen kommen kann (Weber-Matthiesen et

al., 1995). Neben klonalen Aberrationen, die in jeder HRS-Zelle eines Falles

beobachtet werden können, wurden auch subklonale Veränderungen nachgewiesen,

was auf eine generelle chromosomale Instabilität der Zellen hinweist. Nur selten

kommen chromosomale Aberrationen rekurrent als spezifisches Merkmal des HL vor.

Chromosomale Zugewinne wurden unter anderem für Regionen nachgewiesen, die

die Gene MDM2, c-Rel und JAK-2 umfassen (Joos et al., 2000; Joos et al., 2002;

Kupper et al., 2001). MDM2 ist ein Inhibitor des p53-Tumorsupressor-Proteins,

wohingegen c-REL für eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-κB kodiert. Die

genetische Amplifikation der c-REL-Region 2p16 korreliert mit der Aktivität des NF-

κB-Signalweges in HRS-Zellen (Barth et al., 2003). JAK2 ist an der Aktivierung des

EINLEITUNG

12

JAK/STAT-Signalwegs beteiligt, der im HL ebenfalls konstitutiv aktiv ist. Analysen

jüngeren Datums bestätigten außerdem chromosomale Zugewinne für Regionen, die

Gene wie z.B. STAT6 (12q13), NOTCH1 (9q34) und JUNB (19q13), die im HL

exprimiert werden, beinhalten (Hartmann et al., 2008).

Auch inaktivierende Mutationen spielen eine Rolle in der Pathogenese des HL. In 10-

20% der HL wurden genetische Läsionen der NF-κB-Inhibitoren IκBα und IκBε

gefunden (Cabannes et al., 1999; Emmerich et al., 2003; Jungnickel et al., 2000).

Des Weiteren konnten in ca. 50% der HL-Fälle inaktivierende Mutationen oder

chromosomale Deletion des TNFAIP3-Gens nachgewiesen werden, das für den NF-

κB-Inhibitor A20 kodiert (Kato et al., 2009; Schmitz et al., 2009). Sowohl im cHL als

auch im NLPHL wurden destruktive Mutationen von SOCS1, einem Inhibitor des im

HL konstitutiv aktiven JAK/STAT-Signalwegs, nachgewiesen (Mottok et al., 2009;

Mottok et al., 2007; Weniger et al., 2006).

1.4.4.2 Assoziation mit EBV

Weltweit sind mehr als 90% der Menschen mit dem γ-Herpesvirus EBV infiziert. Das

Virus befällt vornehmlich Gedächtnis-B-Zellen und entwickelt in diesen eine

lebenslange Persistenz (Kutok und Wang, 2006). Die Erstinfektion erfolgt meist im

frühen Kindesalter und verläuft im Allgemeinen asymptomatisch. Bei einer

verspäteten Infektion im frühen Erwachsenenalter kann es zur Ausbildung einer

infektiösen Mononukleose (IM, Pfeiffer‘sches Drüsenfieber) kommen (Henle et al.,

1968). Eine IM-Erkrankung bedingt ein 2 bis 4-fach erhöhtes Risiko, im späteren

Leben ein HL zu entwickeln (Munoz et al., 1978). In der westlichen Welt sind die

HRS-Zellen in 40% der Fälle mit dem EBV infiziert, wohingegen der Anteil EBV-

positiver cHL-Fälle in den Entwicklungsländern deutlich höher ist (Jarrett und

MacKenzie, 1999). Da das Virusgenom in klonaler Form in HRS-Zellen vorliegt wird

eine Abstammung der Tumorzellen von einer bereits infizierten Vorläuferzelle

angenommen, was den Verdacht auf eine pathogenetische Bedeutung des EBV in

der Entwicklung des HL erhärtet (Anagnostopoulos et al., 1989; Weiss et al., 1989).

Die Mehrheit der EBV-infizierten HRS-Zellen prägt die EBV-kodierten Proteine LMP1

und LMP2a (engl. latent membrane proteine 1 and 2a) aus. LMP1 imitiert einen

aktiven CD40-Rezeptor, der für das Überleben und die Differenzierung der B-Zellen

im GC notwendig ist, und trägt so vermutlich dazu bei, HRS-Vorläufer-Zellen ohne

funktionalen BCR vor der Apoptose zu bewahren (Kilger et al., 1998). Des Weiteren

EINLEITUNG

13

aktiviert LMP1 den NF-κB-, den JAK/STAT- und den AP-1-Signalweg (Gires et al.,

1999; Gires et al., 1997; Kieser et al., 1997). Alle drei Signalwege sind im HL

konstitutiv aktiv (s. auch 1.4.4.4). Über die LMP-1-vermittelte NF-κB-Aktivierung wird

außerdem die Expression der onkogenen miR-155 induziert, die B-Zell-spezifische

Gene wie z.B. den Transkriptionsfaktor PU.1 oder AID supprimiert (Baltimore et al.,

2008). Auf die Funktion des Proteins LMP2a in diesem Kontext wurde bereits

hingewiesen (s. 1.4.2). Neben LMP1 und -2a prägen EBV-positive HRS-Zellen die

Virus-kodierte RNA EBER1 aus, die offenbar an der negativen Regulation von

Tumorsuppressorgenen wie CDKN1A (engl. cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)

beteiligt ist; die genauen Mechanismen wurden jedoch bislang nicht geklärt (Lin et

al., 2010).

In vitro-Studien haben gezeigt, dass eine EBV-Infektion BCR-defiziente GC-B-Zellen

vor Apoptose bewahren kann. Zur Generierung lymphoblastoider Zelllinien (engl.

lymphoblastoid cell lines, LCL) wurden tonsilläre GC-B-Zellen mit EBV infiziert; viele

der so immortalisierten, monoklonalen Linien wiesen „verkrüppelte“ BCR auf (Bechtel

et al., 2005; Mancao et al., 2005). Zudem wurde eine Korrelation zwischen EBV-

Infektion und „verkrüppelnder“ V-Gen-Mutation in HRS-Zellen gefunden (Bräuninger

et al., 2006).

1.4.4.3 Zelluläre Interaktion von HRS-Zellen mit dem Mikromilieu

Wie bereits in Kapitel 1.4 beschrieben ist eine Besonderheit des HL, dass die

malignen Zellen meist nur ca. 1% der gesamten Tumormasse ausmachen. Es gibt

zahlreiche Hinweise, dass die Interaktion mit dem zellulären Mikromilieu von

zentraler Bedeutung für das Überleben der HRS-Zellen ist. So ist es bis heute nicht

gelungen, HRS-Zellen in immunodefizienten Mäusen wachsen zu lassen (Kapp et al.,

1993; Meggetto et al., 1996). Auch die Etablierung von Zelllinien war mühselig und

konnte nur mit wenigen fortgeschrittenen Fällen, in denen die HRS-Zellen bereits

außerhalb des primären Tumors, z.B. in Pleuraergüssen oder im peripheren Blut,

nachweisbar waren, erfolgreich durchgeführt werden ((Drexler, 1993; Wolf et al.,

1996) siehe auch 2.4.1). Im Folgenden sollen einige der wichtigsten zellulären

Interaktionen von HRS- und Infiltrats-Zellen beschrieben werden.

HRS-Zellen prägen verschiedene Mitglieder der TNF-Rezeptor-Superfamilie aus, wie

CD30 und CD40 und RANK (Fiumara et al., 2001; O'Grady et al., 1994; Schwab et

al., 1982), deren Stimulation zur Aktivierung des NF-κB-Signalwegs führt (Skinnider

EINLEITUNG

14

und Mak, 2002). Das Mikromilieu wiederum stellt die zugehörigen Liganden zur

Verfügung; so wird der CD40-Ligand von umliegenden T-Zellen exprimiert während

der CD30-Ligand von mehreren Zelltypen, wie z.B. Eosinophilen oder Mastzellen,

ausgeprägt wird. HRS-Zellen sind häufig von CD4+ T-Helferzellen umgeben.

Vermittelt wird der enge Kontakt der beiden Zelltypen unter anderem durch die

Ausprägung der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 (CD58) und LFA-3 (CD54) durch die

HRS-Zellen, deren zugehörige Liganden wiederum von den rosettierenden T-Zellen

exprimiert werden (Delabie et al., 1995; Ellis et al., 1992).

Auch die Sekretion von Zytokinen spielt eine Rolle in der Interaktion zwischen HRS-

Zellen und ihrem Mikromilieu. Das Zytokin IL-13, das die Proliferation und das

Überleben von B-Zellen beeinflusst, wird in vielen cHL-Fällen von den HRS-Zellen

ausgeprägt (Kapp et al., 1999). Der zugehörige IL-13-Rezeptor findet sich sowohl auf

den malignen Zellen selbst als auch auf den umliegenden Lymphozyten und

Histiozyten, die somit ebenfalls durch die IL-13-Sekretion der HRS-Zellen beeinflusst

werden können.

1.4.4.4 Konstitutiv aktive Signalwege

In nicht malignen Zellen unterliegt die Aktivierung von Signalwegen einer strengen

Regulation. In HRS-Zellen jedoch sind zahlreiche Signalwege konstitutiv aktiviert,

was darauf schließen lässt, das dies von essentieller Bedeutung für das Überleben

der Zellen ist. Im Folgenden werden zwei der für das HL relevanten Signalkaskaden

beschrieben.

Ein Hauptmerkmal des cHL ist die Deregulation des NF-κB- (engl. nuclear factor κB)

Signalwegs (Bargou et al., 1997). Der NF-κB-Transkriptionsfaktor-Komplex setzt sich

aus Homo- und Heterodimeren der Untereinheiten p50, p52 und p65 (RelA), RelB

und Rel zusammen (Hayden und Ghosh, 2008). In unstimulierten Zellen werden die

NF-κB-Dimere im Zytoplasma durch spezielle Inhibitoren, die IκBs, gebunden, so

dass ihre Translokation in den Nukleus und die anschließende Bindung an

Zielgenpromotoren verhindert werden (Bonizzi und Karin, 2004). Durch Stimulation

verschiedener Rezeptoren, u.a. CD40, CD30 und RANK wird der proteosomale

Abbau der IκBs initiiert, wodurch NF-κB feigesetzt wird und die Transkription seiner

Zielgene aktivieren kann. Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der NF-

κB-Aktivierung in HRS-Zellen. Da NF-κB auch die Expression seiner eigenen

Inhibitoren IκBα, A20 und p50 anregt, ist seine Aktivität im Normalfall zeitlich

EINLEITUNG

15

begrenzt (Sen, 2006; Sun et al., 1993). Durch NF-κB-induzierte Transkription werden

sowohl anti-apoptotische als auch proliferative Signale vermittelt, die offenbar

essentiell für das Überleben von HRS-Zellen sind. Die konstitutive Aktivierung des

Signalwegs im HL kommt unter anderem durch Interaktion der Tumorzellen mit dem

Mikromilieu zustande; HRS-Zellen prägen CD30, CD40 und RANK-Rezeptoren aus,

deren Liganden von benachbarten Zellen im Infiltrat exprimiert werden ((Bräuninger

et al., 2006) siehe auch 1.4.4.3). Vermutlich spielen aber auch inaktivierende

Mutationen von NF-κB-Inhibitoren wie IκBs und A20 eine Rolle (Cabannes et al.,

1999; Emmerich et al., 2003; Schmitz et al., 2009). Ob Mutationen in weiteren

negativen NF-κB-Regulatoren mitverantwortlich für die konstitutive Aktivierung des

Signalwegs im HL sind, wurde bislang nicht geklärt; ein in dieser Hinsicht

interessantes Gen ist der Tumorsupressor CYLD, dessen Inaktivierung im multiplen

Myelom mit einer konstitutiven NF-κB-Aktivierung korreliert (Annunziata et al., 2007;

Keats et al., 2007).

Abb.1: Schematische Darstellung der NF-κB-Aktivierung in HRS-Zellen. Durch Stimulation der Oberflächenrezeptoren CD30 und CD40 mit den zugehörigen Liganden, die innerhalb des Mikromilieus ausgeprägt werden, wird der IKK-Komplex aktiviert. Dies führt zur Phosphorylierung, Ubiquitinierung und schließlich proteosomalem Abbau des NF-κB-Inhibitors IκBα. Die freigesetzten NF-κB-Dimere wandern in den Zellkern und initiieren dort die Transkription der Zielgene. In EBV-positiven cHL-Fällen erfolgt die NF-κB-Aktivierung unter anderem über endogene, LMP1-vermittelte Signalgebung.

CD40-Ligand

CD30-Ligand

CD40

CD30

LMP1

NEMOIKKα IKKβ

IKK-Komplex

IκBαNF-κB

Proteosomaler Abbau

Transkription der Zielgene

EINLEITUNG

16

Einige NF-κB-Zielgene sind Faktoren, die zur Aktivierung weiterer Signalwege

beitragen. So wird z.B. die Expression des Transkriptionsfaktors STAT5, einem

Mitglied der STAT-Protein-Familie, durch NF-κB initiiert. Der JAK/STAT-Signalweg ist

ebenfalls konstitutiv aktiv im HL. STAT-Transkriptionsfaktoren liegen normalerweise

inaktiv im Zytoplasma vor. Durch Zytokin-vermittelte Signalgebung werden Janus-

Kinasen (JAK) aktiviert, die durch Phosphorylierung ihrerseits STAT-Moleküle

aktivieren. Diese dimerisieren und wandern in den Zellkern, wo sie die Transkription

ihrer Zielgene einleiten. Die aberrante Aktivierung von STAT-Proteinen,

insbesondere von STAT3 und STAT5, wird mit onkogener Transformation in

Verbindung gebracht (Bowman et al., 2000). In HRS-Zellen wurde die konstitutive

Aktivierung von STAT3, STAT5 und STAT6 nachgewiesen (Hinz et al., 2002; Kube et

al., 2001; Skinnider und Mak, 2002); im Falle von STAT3 und STAT5 wird diese

durch aberrante Co-Expression des TH2-Zytokins IL-21 sowie des zugehörigen IL-21

Rezeptors vermittelt (Lamprecht et al., 2008; Scheeren et al., 2008). STAT6 wird

vermutlich über eine autokrine Stimulation des IL-13-Signalwegs reguliert, da HRS-

Zellen sowohl den IL-13-Rezeptor als auch dessen Liganden exprimieren (Skinnider

et al., 2001; Skinnider und Mak, 2002). Studien haben gezeigt, dass die ektopische

Expression aktivierter STAT5-Proteine tonsilläre B-Zellen immortalisieren und einen

Phänotyp ähnlich dem von HRS-Zellen induzieren kann (Scheeren et al., 2008).

1.5 MicroRNA (miRNA)

MiRNAs sind endogene, kurze (ca. 18-25 Nukleotide) RNA-Einzelstrangmoleküle, die

als negative Regulatoren der Genexpression auf post-transkriptioneller Ebene

fungieren. Sie spielen eine bedeutende Rolle in der Regulation basaler zellulärer

Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Stressantwort und Apoptose. Ihre

Entdeckung in C. elegans im Jahr 1993 hat das Forschungsfeld der Genregulation

revolutioniert (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993); seither wurden durch

intensive Forschungsarbeit und die Entwicklung zahlreicher neuer Methoden

weitreichende Erkenntnise über Biogenese von miRNAs, ihre Interaktion mit

korrelierenden mRNAs sowie die Prozesse, die letztendlich zur Hemmung der

Proteinsynthese führen, gewonnen.

EINLEITUNG

17

1.5.1 Biogenese

Die für miRNA kodierenden Gene können entweder einzeln vorliegen

(monocystronisch) oder als sogenanntes Cluster mit anderen miRNAs

(polycystronisch) von einem gemeinsamen Promoter aus transkribiert werden

(Ambros, 2004; Filipowicz et al., 2005). Je nach Lokalisation der miRNA-Gene wird

außerdem unterschieden zwischen intergenen miRNAs, deren Gene unabhängige

transkriptorische Einheiten darstellen, und intronischen miRNAs, die entweder in

Introns Protein-kodierender Gene (miRtrons) oder in den Introns, bzw. Exons nicht-

kodierender RNA lokalisiert sind. Ungefähr die Hälfte aller bekannten miRNAs ist

intronischen Ursprungs (Griffiths-Jones, 2007; Saini et al., 2008). Abbildung 2 zeigt

eine schematische Darstellung der Biogenese von miRNA. Mono- und

polycystronische miRNA-Gene werden im Allgemeinen von der DNA-abhängigen

RNA-Polymerase II (Pol II) transkribiert (Lee et al., 2004), wodurch ein bis zu

mehrere Kilobasen langes pri-miRNA- (engl. primary) Transkript mit 5’-terminaler 7-

Methylguanosin Kappe (engl. m7G-Cap) und 3’-terminalem Poly-A Schwanz generiert

wird. Die pri-miRNA faltet sich in Haarnadelstrukturen und enthält die späteren

miRNAs in Form von Stamm-Schleife- (engl. Stem-Loop) Strukturen. Diese werden

im Nukleus durch den Mikroprozessorkomplex, bestehend aus der RNAse III Drosha

und dem Co-Faktor DGCR8, ausgeschnitten, wodurch ein ca. 60-80 bp langes pre-

miRNA- (engl. precursor) Molekül entsteht (Bushati und Cohen, 2007; Chen und

Meister, 2005; Denli et al., 2004; Du und Zamore, 2005).

Abb. 2: Schematische Darstellung der Biogenese und Funktionsweise von miRNAs (nach Liu et al. 2007, modifiziert)

miRNA Gen

Pol II

pri-miRNA

AAAA

DroshaDCGR8

RNA-GTP

Exportin 5

Dicer/TRBP HelicaseHelicase

*miRNA(passenger strand)

3'UTR

3'UTRORF

ORF ORF

Zytoplasma

Zellmembran

miRISC

miRISC

mature miRNA(guide strand)

pre-miRNA

pre-miRNA

Nukleus

miRNA:miRNA*duplex

EINLEITUNG

18

Die pre-miRNA wird anschließend durch den Ran-GTP (engl. Ran-Guanin

Triphosphatase) abhängigen Nuklear-Export-Faktors Exportin5 aus dem Zellkern ins

Zytoplasma exportiert (Bohnsack et al., 2004). Dort wird durch das RNAse III Enzym

Dicer die Schleife der Stem-Loop-Struktur abgespalten. Der RNA-Duplex wird

anschließend durch das Enzym Helikase aufgewunden; im Allgemeinen bleibt der

Strang, dessen 5‘-Terminus am thermodynamisch instabileren Ende des RNA-

Doppelstranges liegt, als reife miRNA erhalten (guide strand), während sein

Gegenstrang (passenger strand) degradiert wird. Die reife miRNA wird in einen als

RISC (RNA induced silencing complex) bezeichneten Enzymkomplex inkorporiert,

dessen Hauptkomponenten Proteine der Argonaut-(AGO) Familie sind. Diese sind in

der Lage, die endonukleolytische Spaltung oder die Hemmung der Translation der

mRNA zu vermitteln (Peters und Meister, 2007; Sontheimer und Carthew, 2005).

1.5.2 Interaktion von miRNA und Zielgen-mRNA

Die Interaktion der in den RISC inkorporierten miRNAs mit der Ziel-mRNA wird über

komplementäre Basenpaarung vermittelt. In Metazoen binden miRNAs meist mit

imperfekter Komplementariät an ihre Ziel-Sequenzen, die vornehmlich im 3‘-UTR der

jeweiligen Ziel-mRNAs lokalisiert sind (Grimson et al., 2007; Lewis et al., 2005). Es

konnten drei „Grundregeln“ für diese Interaktion definiert werden, wobei diese bisher

wahrscheinlich nur unvollständig durch bioinformatische und experimentelle Ansätze

charakterisiert werden konnten. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung der

Bindung einer miRNA an ihre Ziel-mRNA.

Abb. 3: Schematische Darstellung der Bindung einer miRNA an ihre Ziel-mRNA (nach Filipowicz et al. 2008, modifiziert)

EINLEITUNG

19

Von essentieller Bedeutung für die regulatorische Funktion von miRNAs ist die

Komplementarität beider RNA-Stränge innerhalb der sogenannten Seed-Region. Die

Seed-Region wird durch die Nukleotide 2 bis 8 am 5‘-Ende der miRNA repräsentiert.

Während Fehlpaarungen (engl. mismatches) und Guanin (G)-Uracil (U)-Paarungen

(engl. G-U wobbles) in der 3‘-Region der miRNA toleriert werden, können sie

innerhalb der Seed-Region einen stark störenden Einfluss auf die Interaktion

zwischen miRNA und mRNA ausüben. Die zweite Grundvoraussetzung ist die durch

mismatches verursachte Bulge-Bildung im Zentrum des miRNA-mRNA-Duplex, die

vermutlich die AGO-vermittelte Spaltung der Ziel-mRNA ermöglicht. Als dritte

Bedingung für die genregulatorische Aktivität ist schließlich ein ausreichendes Maß

an Basen-Komplementarität zwischen dem 3‘-Bereich der miRNA und der

korrespondierenden mRNA-Region vonnöten (Brennecke et al., 2005). Die enorme

Flexibilität der möglichen Basenpaarungen zwischen miRNA und mRNA bedingt

offenbar die Vielfältigkeit der Genexpressionsregulation durch miRNAs; ein einziges

dieser Moleküle ist in der Lage, die Ausprägung einer Vielzahl von Genen zu

regulieren (Hendrickson et al., 2009).

Obwohl bekannt ist, dass miRNAs auch eine Translations-Aktivierung induzieren

können (Henke et al., 2008; Vasudevan und Steitz, 2007; Vasudevan et al., 2007),

liegt der Schwerpunkt der Forschung weitestgehend auf ihrer Funktion als

Translations-Repressoren. Deshalb sollen im Folgenden die bisherigen Erkenntnisse

auf diesem Themengebiet zusammenfassend dargestellt werden.

1.5.3 Mechanismen der Inhibierung der mRNA-Translation durch miRNA

Nach erfolgreicher Bindung des miRNA-RISC-(miRISC) Komplexes an die Ziel-

mRNA kann deren Translation in ein funktionelles Protein durch verschiedene

Mechanismen inhibiert werden. Die Ziel-mRNA kann entweder endonykleolytisch

gespalten oder durch Deadenylierung des 3’-terminalen Poly-A-Schwanzes, bzw.

Entfernung der 5’-terminalen m7G-Cap destabilisiert werden; beide Prozesse führen

letztendlich zur Degradation des Moleküls (Newbury et al., 2006; Parker und Song,

2004). Eine weitere Alternative ist die Repression der Proteinsynthese auf Initiations-

oder Elongationsebene; hierbei wird die Translation von mRNA unterdrückt ohne

eine Degradation der betroffenen Moleküle zu verursachen. Aufgrund bisheriger

experimenteller Daten wird das Modell der miRNA-vermittelten Initiationsrepression

favorisiert (Filipowicz et al., 2008). Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die

EINLEITUNG

20

Repression der Initiation den einzigen Angriffspunkt für miRNA-vermittelte

Translationshemmung darstellt. Es wird vermutet, dass ein weiterer

Repressionsmechanismus die Enfernung der Ribosomen von der zu translatierenden

mRNA ist; Studien haben gezeigt, dass die Dissoziation von Ribosomen von siRNA-

reprimierten mRNAs gegenüber der von Kontroll-mRNAs deutlich akzeleriert ist

(Petersen et al., 2006), was einen ähnlichen Effekt durch miRNA-vermittelte mRNA-

Regulation nahelegt.

1.5.4 MiRNAs im Hodgkin Lymphom

Innerhalb der letzten Jahre sind zahlreiche Publikationen über deregulierte miRNA-

Expression in Lymphomen erschienen. Nur wenige dieser Studien befassten sich in

diesem Kontext mit dem HL, und die Ergebnisse sind größtenteils nicht konsistent.

Dies könnte vor allem an der Verwendung unterschiedlicher Zellmaterialien für die

Generierung von miRNA-Expressionsprofilen liegen; so wurden entweder HL-

Zelllinien (Gibcus et al., 2009), Ganzschnitte von HL-Lymphknotenbiopsaten

(Navarro et al., 2008) oder mikrodissektierte HRS-Zellen verwendet (van Vlierberghe

et al., 2009). Ob die genannten Studien als umfassend repräsentativ betrachtet

werden können, scheint aus mehreren Gründen fraglich.

Alle HL-Zelllinien wurden aus Patienten mit weit fortgeschrittenem Krankheitsverlauf

etabliert, die zum Teil bereits mehrere Chemotherapien erhalten hatten. Des

Weiteren wurden die Zelllinien nicht aus HL-befallenen Lymphknoten, sondern aus

Ausschwemmungen maligner HRS- oder LP-Zellen in die Blutbahn oder ins

Knochenmark generiert, was bedeutet, dass diese Zellen ein für sie spezifisches

Charakteristikum, nämlich die Abhängigkeit von ihrem zellulären Mikromilieu,

verloren hatten. Somit sind HL-Zelllinien und HRS-Zellen aus Primärfällen nur

begrenzt vergleichbar. In der Studie von Navarro et al. 2008 wurden Ganzschnitt-

Gewebeproben von HL-Lymphknotenbiopsaten mit Zellmaterial aus reaktiven, nicht-

malignen Lymphknoten verglichen. Obwohl diese Studie ausschließlich miRNAs in

die Analysen mit einbezog, die auch in HL-Zelllinien exprimiert wurden, scheint es

fraglich, ob angesichts des seltenen Vorkommens der HRS-Zellen im Tumorgewebe

ein solches Expressionsprofil repräsentativ für die miRNA-Expression in den HRS-

Zellen selbst ist. In einer weiteren Studie wurden zwar mikrodissektierte HRS-Zellen

für die Erstellung von miRNA-Expressionsprofilen verwendet, jedoch wurden hier nur

EINLEITUNG

21

9 cHL-Fälle aus 2 Subgruppen (NS und MC) untersucht (van Vlierberghe et al.,

2009).

In zwei der drei oben genannten Studien wurde eine Überexpression von miR-155

nachgewiesen. Das miR-155-Gen wird innerhalb des Proto-Onkogens BIC (engl. B

cell integration cluster) kodiert, welches als proviraler Integrations-Bereich in avian

leukosis virus- (ALV) induzierten Hühner-Lymphomen identifiziert wurde (Clurman

und Hayward, 1989). Sowohl das BIC-Transkript als auch miR-155 werden im HL

und in anderen B-Zell-Lymphomen überexprimiert, was auf ihre Involvierung in die

Pathogenese dieser malignen Neoplasien hindeutet (Eis et al., 2005; Kluiver et al.,

2005; van den Berg et al., 2003).

Die Expression der miRNAs let-7a und miR-9 korreliert sowohl in HL-Zelllinien als

auch in HRS-Zellen primärer Fälle reziprok mit der Ausprägung des

Tumorsuppressorgens BLIMP1. Die 3‘-UTR der BLIMP1-mRNA weist multiple

Bindungsstellen für beide miRNAs auf, was auf eine direkte Regulation von BLIMP1

durch miR-9 und let-7a schließen lässt (Nie et al., 2008).

Eine Rolle als Tumorsuppressorgen im HL wird miR-135a zugewiesen. Die niedrige

Ausprägung dieser miRNA korreliert signifikant mit einer schlechteren Prognose für

HL-Patienten. In vitro-Experimente haben außerdem gezeigt, dass die ektopische

Expression von miR-135a in HL-Zelllinien Apoptose induziert. (Navarro et al., 2009).

EINLEITUNG

22

1.6 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, durch die Analyse der miRNA-Expression im HL

zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, die dieser

Erkrankung zugrunde liegen, beizutragen.

Im Rahmen dieser Arbeit soll zunächst ein verlässliches Protokoll sowohl für die

Mikrodissektion von HRS- und LP-Zellen aus Paraffingewebe, als auch die

anschließende Gewinnung und Amplifizierung von miRNA aus einer sehr geringen

Anzahl von Zellen entwickelt werden. Im Anschluss sollen miRNA-Expressionsprofile

mikrodissektierter HRS-Zellen aus verschiedenen cHL-Subtypen erstellt und mit

denen sortierter GC-B-Zellen verglichen werden. Zudem soll eruiert werden,

inwiefern sich die miRNA-Expression der LP-Zellen des NLPHL von der in HRS-

Zellen unterscheidet; da die Entitäten sowohl in morphologischer als auch

genetischer Hinsicht voneinander abweichen, ist eine differentielle miRNA-

Ausprägung zwischen ihnen nicht unwahrscheinlich. Des Weiteren soll auf Basis der

erstellten miRNA-Expressionsprofile das Verwandschaftsverhältnis zwischen HRS-

Zellen, LP-Zellen, GC-B-Zellen und CD30+ GC-B-Zellen bestimmt werden um zu

prüfen, ob letztere eventuell als Vorläuferzellen der ebenfalls größtenteils CD30+

HRS-Zellen in Frage kommen.

Ein Teilaspekt der vorliegenden Arbeit ist außerdem die Mutationsanalyse des

Tumorsupressorgens CYLD, eines negativen Regulators des im HL konstitutiv

aktiven NF-κB-Signalwegs (siehe 1.4.4.4). Der Mutationsstatus von CYLD soll

sowohl in mikrodissektierten HRS-Zellen aus Gefriergewebe als auch in HL-Zelllinien

bestimmt werden. Hierzu soll ein Protokoll etabliert werden, mit dem es möglich ist,

DNA aus einer sehr geringen Anzahl mikrodissektierter HRS-Zellen zu gewinnen,

das CYLD-Gen zu amplifizieren und die Sequenzen auf Mutationen hin zu

analysieren.

MATERIAL UND METHODEN

23

2. Material und Methoden

2.1 DNA-Arbeitstechniken

2.1.1 DNA-Präparation

Die Gewinnung von DNA aus Geweben und Zellmengen zwischen 250 – 1x106

Zellen wurde nach dem Prinzip der Proteinaussalzung und Alkoholfällung mit dem

DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben durchgeführt.

2.1.2 Bestimmung der DNA-Konzentration

DNA-Konzentrationen wurden mit Hilfe eines Nanodrop ND-1000

Mikrovolumenspektrometers (Thermo Scientific, Wilmington, USA) bestimmt. Hierzu

wurden um den Faktor 1:100 verdünnte DNA-Lösungen hergestellt und gegen

bidestilliertes, Nuklease-freies H2O gemessen. Die DNA-Konzentration wird durch die

Absorption der Lösung bei 260 nm nach dem Lambert-Beerschen Gesetz bestimmt,

demzufolge eine Absorption von 1 eine DNA-Konzentration von 50 µg/ml entspricht.

A = c * d * ε

A: Absorption, c: DNA-Konzentration, d: Schichtdicke der Küvette,

ε: Extinktionskoeffizient doppelsträngiger DNA bei 260 nm.

Die Reinheit der extrahierten DNA wird durch die Bildung des Quotienten der

Extinktion bei 260 und 280 nm bestimmt, wobei ein Quotient zwischen 1,8 und 2

einer hohen Reinheit entspricht.

2.1.3 Semi-verschachtelte 2-Runden PCR für die Mutationsanalyse von CYLD

Die semi-verschachtelte 2-Runden PCR für die Mutationsanalyse des

Tumorsupressorgens CYLD wurde zunächst als 1-Runden Protokoll mit aus Raji-

Zellen gewonnener DNA in verschiedenen Verdünnungen (50 pg-100 ng/µl) etabliert.

Verschiedene Magnesium- und Oligonukleotidkonzentrationen sowie

Anlagerungstemperaturen wurden getestet. Anschließend wurde mittels weniger

sortierter Zellen (20, 10 und einzelne BL-2 Zellen (BL-Zelllinie)) eine Multiplex-

Erstrunden-PCR entwickelt, in der in 3 Ansätzen je 4 bis 6 Exons des CYLD Gens


24

gemeinsam in 35 Zyklen voramplifiziert werden. In der anschließenden Zweitrunden-

PCR wurden die Exons mit einem eingerückten Primer sowie einem der Erstrunden-

Oligonukleotide in 45 Zyklen separat amplifiziert. Dieses Protokoll wurde ebenfalls

auf mikrodissektierte HRS-Zellen aus HL-Primärfällen angewandt, die zuvor mit 0,5

µg/ml Proteinase K bei 50°C verdaut wurden.

2.1.4 PCR-Bedingungen und verwendete Oligonukleotide (engl. Primer)

PCR Runde Amplifizierte Exons Mg2+-Konzentration Polymerasesystem

1

1

1

2

2

3, 5, 6, 12, 17, 18

(Multiplex)

10, 11, 13, 14, 15, 16

(Multiplex)

4, 7, 8, 9

(Multiplex)

3, 5, 6, 10, 13, 14,

15, 16, 17, 18

(einzeln amplifiziert)

4, 7, 9, 11, 12

(einzeln amplifiziert)

4,5 mM

4,5 mM

6 mM

4,5 mM

6 mM

Expand High Fidelity Kit (Roche)



Standard DNA TaqPolymerase (Fermentas)

Standard DNA TaqPolymerase (Fermentas)

PCR-Programme:

Runde 1: 3 min 95°C, danach Enzymzugabe bei 80°C; 35 Zyklen (30 s 95°C, 30 s

59°C, 60 s 72°C)7; 10 min 72°C, Pause 15°C

Runde 2: 3 min 30 s 95°C; 35 Zyklen (30 s 95°C, 30 s 59°C, 60 s 72°C); 5 min 72°C,

Pause 15°C


25

PCR

Runde

Exon

Primersequenzen (5’ 3’)

1. 3

5

6

12

17

18

E3F: tgatttcctttctttttacagcatgg; E3exR: gaagactcttgggaaaatttatttcg

E5exF: ggcaactattcctaatgtattctttc; E5R: gaaagaacttatccatgtaaccaaac

E6F: gttactgtcattccttgtttctcttc; E6exR: ctacatacatgttcagaagtaatagc

E12F: actggagttgtataagaaatgtgttg; E12exR: aaaagaggagctaaccatatatcac

E17F: tatttttaacagagacagggtttcac; E17exR: atgcaatccaagatataagactgttg

E18exF: ggattataaaatcactggcaaaaggg; E18R: atactttctagagtgcaaaatgcttc

1. 10

11

13

14

15

16

E10exF: gacagatgctttttacacataatactc; E10R: tggcactatctatacctattgcattc

E11F: tccagactttacttattttcctcttc; E11exR: tcacccatctcttattacatgaagac

E13F: tttgtcaggaaaacttgaaaactgtg; E13exR: tgttgaataatggcagtagaaatgag

E14F: ccaaagctacaccatcaattttatgg; E14exR: tgaaactaccaatagtcttaagactc

E15exF: tgccatgattttatttgagactcaag; E15R: agatacacactcatttaaccattctc

E16F: acttttttgaagccatgaacattgtc; E16exR: catcccttatagcaatcaagtacttc

1. 4

7

8

9

E4exF: agaaattttccagagtgattttcctg; E4R: gtgttcaatttgcaagtaaattggtc

E7F: gcttttcttttaacttactcctgtttc; E7exR: ggtctacttattctgtttccaaaaac

E8F: agaaatgtaagacagagtcaatatcc; E8exR: attattctgcagtgatagcttttctg

E9exF: caggtcttagaaaccttagttctttg; E9R: tgagattagaattagagtcattccag

2. 3 E3F: tgatttcctttctttttacagcatgg; E3intR: cacaaacaaacacactactaaaatgg

2. 4 E4intF: ctatatctatttctttcccttctctc; ; E4R: gtgttcaatttgcaagtaaattggtc

2. 5 E5intF: gacttccacatttacatttcattgag; ; E5R: gaaagaacttatccatgtaaccaaac

2. 6 E6F: gttactgtcattccttgtttctcttc; E6intR: cttttttaatgctatggcaagttagg

2. 7 E7F: gcttttcttttaacttactcctgtttc; E7intR: tttctctgatgagttagaaagaaagg

2. 8 E8F: agaaatgtaagacagagtcaatatcc; E8intR: aaaagcatataatagggcgaaatctg

2. 9 E9intF: aaggcacggtataatgcatattgaag; E9R: tgagattagaattagagtcattccag


26

PCR

Runde

Exon

Primersequenzen (5’ 3’)

2. 11 E11F: tccagactttacttattttcctcttc; E11intR: cagaaaacagcaaatagaacaccatg

2. 12 E12F: actggagttgtataagaaatgtgttg; E12intR: gctaatactttgacatgtgaatatgc

2. 13 E13F: tttgtcaggaaaacttgaaaactgtg; E13intR: gtctatttttccaatgcttctagaac

2. 14 E14F: ccaaagctacaccatcaattttatgg; E14intR: gactttcacataaaataccacaggtg

2. 15 E15intF: tgtttcataggacaccaatattaagg; E15R: agatacacactcatttaaccattctc

2. 16 E16F: acttttttgaagccatgaacattgtc; E16intR: taaacagaaaaggcaaaagcaatacc

2. 17 E17F: tatttttaacagagacagggtttcac; E17intR: ggattttctcagaaaatatcactcag

2. 18 E18intF: ttagaacttgactgccctataaagag; E18R: atactttctagagtgcaaaatgcttc

2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA

Agarosegele werden zur analytischen und präparativen Auftrennung von DNA

genutzt. Je nach Größe der amplifizierten DNA-Fragmente werden

Agarosekonzentrationen von 0,8 bis 2% verwendet, die in unterschiedlicher

Porengröße der Gele resultieren. Die negativ geladenen Nukleinsäuren wandern

nach Anlegen einer Spannung im TAE-Laufpuffer durch diese Poren zum positiven

Pol, wobei kürzere Fragmente weiter wandern als längere. Die amplifizierte DNA

wurde mit 1x Gelladepuffer versetzt und in die Taschen von 2%igen 1x TAE-

Agarosegelen pipettiert. Die Gele wurden mit 0,2 µg/ml Ethidiumbromid bzw 0,1 µl/ml

GelRedTM versetzt. Beide Stoffe interkalieren zwischen den Basen der DNA und

fluoreszieren bei Anregung mit UV-Licht. Durch Vergleich mit einem gleichzeitig

aufgetragenen Mengen- bzw. Größenstandard (DNA-Leiter) können Größe und

Konzentration der amplifizierten DNA-Fragmente ermittelt werden.

50 x TAE Puffer: 2 M Tris-Acetat

50 mM EDTA, pH 8,0

ad 1 l ddH2O


27

10 x Gelladepuffer: 50% (v/v) Glycerin

0,25% (w/v) Bromphenolblau

0,25% (w/v) Xylencyanol FF

100-1000 bp DNA-Leiter (Fermentas, St. Leon Roth)

2.1.6 Elution von DNA aus Agarosegelen

Die DNA-Fragmente wurden mit dem QiaexII Gelelution Kit (Qiagen) oder mit dem

InnuPREP DoublePure Kit (Analytik Jena) nach Herstellerangaben aus

Agarosegelen eluiert.

2.1.7 Aufreinigung von PCR-Produkten

Zur Reinigung der PCR-Produkte von Oligonukeotiden, Nukleotiden und Puffer

wurde das QiaexII Purification Kit (Qiagen) verwendet. Der überwiegende Teil der

PCR-Produkte wurde anschließend direkt einer Sequenzanalyse unterzogen (siehe

2.2.11). Konnten in der direkten Analyse keine eindeutigen Sequenzen ermittelt

werden, so wurden die gereinigten PCR-Produkte einem Klonierungsprozess

unterzogen, der im Folgenden beschrieben wird (siehe 2.1.8 – 2.1.10).

2.1.8 Ligation von DNA zur Klonierung

Zur Ligation der DNA-Produkte wurde das pGEM®-TEasy Vector System (Promega,

Mannheim) verwendet. Dazu wurden 0,5 – 2,5 µl PCR-Produkt mit 1 µl pGEM-Teasy

Plasmidvektor, 1 µl T4 DNA-Ligase und 5 µl Rapid Ligation Buffer gemischt.

Anschließend wurde mit bidestilliertem H2O auf ein 10 µl Volumen aufgefüllt und die

Ansätze über Nacht bei 4°C inkubiert.

2.1.9 DNA-Transformation

Chemisch kompetente Bakterien (XL1 Blue® competent E. coli Cells, Agilent,

Wallbronn) wurden mit je 3 µl Ligationsansatz transformiert. Dazu wurden 50 µl

Bakterien mit der Vektor-ligierten DNA 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden

die Ansätze einem 40 bis 50-sekündigen Hitzeschock ausgesetzt, erneut 2 min auf

Eis inkubiert und dann mit 450 µl eiskaltem SOC-Medium versetzt.


28

SOC-Medium: 2% (w/v) Pepton

0,5% (w/v) Hefeextrakt

10 mM NaCl

2,5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM Glucose

Nach 50 min Inkubation im Schüttler (37°C, 225 rpm) wurden die Ansätze auf LB-

Agar-Selektionsplatten, die mit IPTG, Ampicillin und X-Gal angesetzt wurden,

ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.

2.1.10 Plasmidisolierung aus E.coli-Bakterien (Mini-Präparation)

Transformierte Klone wurden einzeln von den LB-Agar-Selektionsplatten gepickt und

in je 5 ml LB-Medium mit entsprechendem Selektionsantibiotikum über Nacht im

Schüttler inkubiert (37°C, 225 rpm). Je 2 ml der Bakterienkulturen wurden

abzentrifugiert (1 min, 12000 x g, 4°C), der Überstand abgenommen und die Zellen

in 300 µl S1-Lösung suspendiert. Durch Zugabe von 300 µl S2-Lösung und 5 min

Inkubation bei Raumtemperatur (RT) wurden die Zellen lysiert und anschließend die

zellulären Proteine durch Zugabe von 300 µl S3-Lösung und 10-minütiger Inkubation

auf Eis ausgefällt. Nach Zentrifugation (15 min, 12000 x g, 4°C) wurde der Überstand

mit 630 µl Isopropanol versetzt und weitere 30 min zentrifugiert (14000 x g, 4°C). Das

Pellet wurde mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen (10 min, 12000 x g, 4°C), bei 37°C

getrocknet und anschließend in 50 µl H2O aufgenommen. Die Überprüfung der

Plasmid-DNA erfolgte durch Restriktionsendonukleasen und Sequenzierung.

LB-Medium: 10 g Pepton

5 g Hefeextrakt

170 mM NaCl

Ad 1 l

pH 7,5 (autoklaviert)


29

S1-Lösung: 50 mM Tris-HCl

10 mM EDTA

100 µg/ml RNase A

S2-Lösung: 200 mM NaOH

1% (w/v) SDS

S3-Lösung: 2,8 M Kaliumacetat

pH 5,1

2.1.11 Sequenzreaktion und Auswertung

Zur Sequenzierung der PCR-Produkte wurden adäquate DNA-Mengen (nach

Empfehlung des Herstellers) mit 3 pm des entsprechenden Primers, 0,5 µl Big Dye-

Lösung (Applied Biosystems) und 3,5 – 3,75 µl 5x Sequenzierpuffer (Applied

Biosystems) gemischt und mit H2O auf 20 µl Volumen aufgefüllt. Die

Sequenzreaktion wurde nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Ethanol-Fällung

wurden die Sequenzierprodukte auf dem ABI-3130-Sequenzierautomaten (Applied

Biosystems) analysiert. Die Mutationsanalysen für CYLD wurden mit dem Programm

SeqScape (Applied Biosystems) durchgeführt. Diese Software ermöglicht den

direkten Vergleich der aus der Analyse erhaltenen Sequenzen mit einer zuvor

eingegeben Referenzsequenz und zeigt Varianzen zwischen diesen direkt auf der

vorgegebenen Referenzpolypeptidkette an. Auf diese Weise können eventuelle

Mutation optisch erkannt werden. Des Weiteren können durch den simultanen

komplementären Vergleich von Sequenzen beider Richtungen zufällige Sequenz-

Artefakte, die z.B. durch Hintergrundrauschen entstehen, evaluiert und

herausgefiltert werden.


30

2.2 RNA-Arbeitstechniken

2.2.1 RNA-Extraktion

Gesamt-RNA aus größeren Zellmengen wurde mit dem RNeasy Mini Kit aus

pelletierten Zellen isoliert. Kleinere Mengen gesamt-RNA aus durchflußzytometrisch

sortierten Zellen wurden mit dem RNeasy Micro Kit extrahiert. Konzentration und

Qualität der RNA wurden mikrovolumenspektrometrisch am Nanodrop-Gerät

bestimmt.

Zur Extraktion kleiner RNA aus Zellinien und Gefriergewebe wurde das miRNeasy

Mini Kit verwendet, für Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete Proben das

miRNeasy FFPE Kit. Alle verwendeten RNA-Extraktionssysteme werden von der

Firma Qiagen (Hilden) hergestellt und wurden nach Herstellerangaben verwendet.

2.2.2 Hitzschockbehandlung von HRS-Zellen

Um RNA-Verlust auf Extraktionssäulen zu vermeiden, wurde miRNA aus sehr

geringen Mengen an HRS-Zellen (50-400 Zellen) nicht mittels der oben

beschriebenen Kits isoliert, sondern die Zellen wurden durch Hitzeschock (5-7 min

bei 95°C) lysiert. Das Lysat wurde in nachfolgenden Experimenten entsprechend

extrahierter RNA eingesetzt.

2.2.3 Reverse Transkription (RT) von mRNA

Um komplementäre cDNA aus Gesamt-RNA herzustellen, wurden für Zellmengen

über 1x105 das Omniscript RT Kit oder, für Zellmengen unter 1x105, das Sensiscript

RT Kit (Qiagen) verwendet. 15 ng – 1 µg Gesamt-RNA wurde mit 1 µM Random

Hexamer Primern (Roche), bzw. 1 µM Oligo-dt Primern (Qiagen),1 mM dNTP, 40

Einheiten RNAse Inhibitor (Promega) und 4 Einheiten Reverser Transkiptase

(Qiagen) in entsprechendem Puffer in einem Gesamtvolumen von 20 µl eine Stunde

bei 37°C inkubiert.


31

2.2.4 RT-PCR für CYLD in HL-Zelllinien

Mittels Oligo-dt-Primern revers transkribierte mRNA (s. 2.2.3) der cHL-Zelllinien L-

428, L-591, L-1236, KM-H2, HDLM2 und L540 wurde in 5 überlappenden

Fragmenten amplifiziert (40 Zyklen), welche die kodierende Region von CYLD

umfassen. SUP-HD1 und U-HO1wurden größtenteils mittels eines DNA-basierten

PCR-Protokolls analysiert (siehe 2.1.3, Zweitrunden-Protokoll); für die Exons 5 und 9

beider Linien wurde jedoch das RT-PCR-Protokoll angewandt, da diese in der

direkten PCR nicht amplifiziert werden konnten.

Fragment Primersequenzen (5‘ 3‘)

1 CYLD1F: TGCTGAAAACATGCTTTGGGACTGC

CYLD1R: GACCTGCGTAATCACTTTCCAATGC

2 CYLD2F: TCAGTGTGATGAAGATTGTGGCGTG

CYLD2F: AAAGTGGACTGTGGCCAATACTTCC

3 CYLD3F: CTACAGACTTTGACCGTTCTTCACC

CYLD3R: TGGGTCTAAGTAACACAGTGTCCAG

4 CYLD4F: GATTGGGAAGAAGAAAGGCATCCAG

CYLD4R: GGTAAGTCTTTGGGAAGTGACACTG

5 CYLD5F: AGTGTAGAGAATGCTACGACGATCC

CYLD5R: CATCACCACAAAGACATCCATTGCC

2.2.5 RT von miRNA

Da Primer normaler Länge (ca. 21 Nukleotide) zu lang sind um mit ihrer Hilfe die

kurzen miRNA-Moleküle (18-25 bp) amplifizieren zu können, werden hierfür

sogenannte Stem-Loop-Primer verwendet. Diese Primer weisen eine Stamm-

Schleife-Struktur mit 3 – 4 überhängenden Basen am 5‘-Ende auf, die mit dem 3‘-

Ende der miRNA hybridisieren (s. Abbildung 4). Anschließend wird die miRNA revers

transkribiert.


32

Die reverse Transkription von miRNAs erfolgte entweder in Einzelansätzen mit

separaten Stem-Loop-Primern oder als Multiplex-Reaktion mit einem Stem-Loop-

Primer-Gemisch aus 480 verschiedenen Oligonukleotiden (early access, Applied

Biosystems). In beiden Fällen wurde das TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription

Kit verwendet. Reaktionen für Einzelansätze wurden mit ca. 20 ng Gesamt-RNA

nach Herstellerempfehlung pipettiert und inkubiert. Für die Multiplex-miR-RT wurden

1 – 4 µl RNA bzw. Hitzeschock-Zelllysat mit 1 mM RT-Primer, 2 mM dNTPs und

10,25 mM MgCl2 mit den entsprechenden Komponenten aus dem TaqMan®

MicroRNA Reverse Transcription Kit angesetzt und mit H2O auf 10 µl aufgefüllt. Die

reverse Transkription erfolgte im PCR-Cycler unter folgenden Bedingungen:

40 Zyklen (16°C/2 min, 42°C/1 min, 50°C/1 s), 85°C/5 min, 4°C halten.

Alle verwendeten Reagenzien/Kits werden von Applied Biosystems hergestellt.

2.2.6 Multiplex-Präamplifikation von miRNA-cDNA

Zur Präamplifikation von miR-cDNA wurden 3 µl RT-Produkt mit 7,5 µl TaqMan

Preamplification Mix (Applied Biosystems) und 1 mM eines Präamplifikationsprimer-

Gemisches (480 Primer, early access, Applied Biosystems) vermischt und mit H2O

auf 15 µl Volumen aufgefüllt. Anschließend wurden die Ansätze im Cycler inkubiert.

(95°C/10 min, 55°C/2min, 72°C/2min), danach 12 Zyklen (95°C/15 s, 60°C/4 min),

4°C halten.

2.2.7 Quantitative Echtzeit-PCR (quantitative Real Time-PCR, qPCR)

QPCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der

herkömmlichen PCR beruht, jedoch zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen

DNA ermöglicht. Bei der TaqMan qPCR lagern sich komplementäre Forward- und

3'

3'

3‘

3‘

Abb. 4: Schematische Darstellung der reversen Transkription von miRNA mit Stem-Loop-Primern. (Chen et al., 2005)

https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catProductDetail&productID=4366596&catID=602646&backButton=true




http://de.wikipedia.org/wiki/Nukleins%C3%A4ure

http://de.wikipedia.org/wiki/Quantitative_Analyse


33

Reverse-Primer an die zu amplifizierende DNA an und werden von der AmpliTaq

Gold DNA Polymerase verlängert. Zusätzlich hybridisiert eine genspezifische

TaqMan Sonde mit der Matrize, an deren 5’-Ende sich ein hochenergetischer

Fluoreszenzfarbstoff (Reporter) befindet. Dessen Fluoreszenz wird vom am 3‘-Ende

befindlichen sogenannten „Quencher“, einem niedrigenergetischen Molekül,

absorbiert. Verlängert nun die DNA-TaqPolymerase die Primer, wird die Sonde

gespalten, Reporter und Quencher entfernen sich voneinander und Fluoreszenz wird

emittiert, welche proportional zur Menge der amplifizierten PCR-Produkte ansteigt.

Die Quantifizierung wird über den sogenannten Ct-Wert (engl. Cycle treshhold,

Schwellwert-Zyklus) vorgenommen. Dieser Wert beschreibt den PCR-Zyklus in dem

die gemessene Fluoreszenz eindeutig den Fluoreszenz-Hintergrund übersteigt.

2.2.7.1 miRNA-qPCR mit Einzelassays

Nach reverser Transkription und anschließender Präamplifikation von miRNA wurde

eine semi-quantitative qPCR mit dem ABI Prism 7900HTSequence Detection System

(Applied Biosystems) durchgeführt. Hierzu wurde die präamplifizierte miR-cDNA 1:80

verdünnt und mit TaqMan Universial PCR MasterMix, No AmpErase UNG (Applied

Biosystems), genspezifischen Primern und TaqMan Sonden (Applied Biosystems) für

die miRNAs hsa-mir-155 und die small nucleolar RNA RNU48 nach

Herstellerangaben in 10 µl Volumen angesetzt. RNU48 wird als Referenzgen vom

Hersteller empfohlen. Die qPCR mit einzelnen Assays diente als Qualitätskontrolle;

bei einem Ct-Wert größer 24 wurde die Probe für die TLDA-Analyse verworfen, da

erfahrungsgemäß bei Referenzgen-Ct-Werten über 24 die Anzahl der mit dem TLDA

detektierbaren miRNAs stark abnimmt. Hsa-miR-155 wurde als Positiv-Kontrolle

verwendet, da die Überexpression dieser miRNA im HL bekannt ist (Gibcus et al.,

2009; Kluiver et al., 2005). Alle Ansätze wurden in 96-well-PCR- Platten im ABI Prism

7900HTSequence Detection System (Applied Biosystems) inkubiert (2 min 50°C, 10

min 95°C; (15 sek 95°C, 1 min 60°C) x 40 Zyklen) und mit der zugehörigen Software

SDS 2.1 (Applied Biosystems) analysiert.


34

2.2.7.2 miRNA-qPCR mit TaqMan Low Density Arrays (TLDA)

Für qPCR auf TLDA-Karten (Version 1.0, Applied Biosystems) wurde eine 1:4

Verdünnung der präamplifizierten miR-cDNAs hergestellt und mit TaqMan Universial

PCR MasterMix und H2O nach Herstellerangaben angesetzt. Die Mischung wurde in

8 an der Oberseite des TLDA befindliche Ports pipettiert und durch zweimaliges

Zentrifugieren (1 min, 1200 rpm) auf die 384 Wells der Karte verteilt. In jedem der

Wells befinden sich Primer und Sonden für jeweils eine miRNA, die in einem

Volumen von 1 µl amplifiziert wird. Nach Versiegelung des TLDA wurde die qPCR im

ABI Prism 7900HTSequence Detection System nach folgendem Programm

durchgeführt: 2 min 50°C, 10 min 94,5°C; (30 sek 97°C, 1 min 50°C) x 40 Zyklen.

2.2.7.3 mRNA-qPCR mit Einzelassays

Revers transkribierte mRNA wurde 1:4 verdünnt und nach Angaben des Herstellers

mit TaqMan Universial PCR MasterMix, TaqMan Primern und Sonden und H2O in

10 µl Volumen angesetzt. PCR-Programm und Analyse wurden analog zum miRNA-

qPCR-Protokoll durchgeführt.

2.3 Arbeiten mit Primärgewebe

2.3.1 Herstellung von Gewebeschnitten

Von ausgewählten Lymphknotenbiopsaten (Formalin-fixiert und in Paraffin

eingebettet oder Gefrierproben) wurden 3-7 µm dicke Schnitte angefertigt und auf

membranbeschichtete Objektträger (Zeiss, Jena) aufgezogen.

2.3.2 Immunfärbung von Gefriergewebsschnitten

2 Stunden bei 37°C getrocknete Gefriergewebsschnitte wurden 10 min in Aceton

fixiert und anschließend 30 min bei 37° C auf einer Heizplatte erneut getrocknet. Der

Primärantikörper wurde in 1x TBS-Puffer (1% BSA) verdünnt. Pro Schnitt wurden

100 µl Antikörperverdünnung aufgegeben. Danach wurden die Schnitte 45 min in der

feuchten Kammer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen in 1 x TBS (je 5 min)

wurden die Schnitte 30 min mit dem Sekundärantikörper inkubiert. Es folgten drei

weitere Waschschritte (je 5 min) und eine 30-minütige Inkubation mit Streptavidin-

gekoppelter alkalischer Phosphatase (SteptABComplex, DAKO). Nach erneutem,


35

dreimaligem Waschen (je 5 min) wurde das Fast Red-Substrat aufgegeben. Die

Reaktion wurde unter dem Mikroskop beobachtet und durch Waschen in Wasser

gestoppt. Die Zellkerne wurden mit Hämalaun nach Mayer (AppliChem, Darmstadt)

gegengefärbt, 5 min gebläut und 1-2 h bei 37° C getrocknet.

2.3.3 Färbung von Paraffingewebeschnitten

Paraffinschnitte wurden über Nacht bei 37°C getrocknet. Anschließend wurde das

Gewebe deparaffiniert (2x 10 min Xylol, 5 min EtOH 100%, 5 min EtOH 96%, 5 min

EtOH 70%) und die Zellkerne 1 min 30 s mit Hämalaun nach Mayer angefärbt. Nach

dreimaligem Waschen in RNAse-freiem H2O wurden die Schnitte 30 sek mit 2 %iger

Eosin-G-Lösung (Delta Select, Rimbach) gefärbt und erneut 3 mal gewaschen. Die

Färbelösungen wurden mit jeweils 20 Einheiten (engl. units, U) RNAse-Inhibitor

(Roche) versetzt, um RNA-Degradation zu vermeiden. Anschließend wurde der

Schnitt in 100% EtOH getaucht und 15 min bei Raumtemperatur getrocknet.

2.3.4 Mikrodissektion von HRS-Zellen aus Paraffingewebeschnitten mittels

Laser-Microbeam Mikrodissektion (LMM) und Laser Pressure Catapulting

(LPC)

Die Mikrodissektion von HRS-Zellen wurde am PALM ® Robot-MicroBeam (PALM,

Bernried) mit dazugehörigem Axiovert 200 Mikroskop (Zeiss, Jena) im Institut für

Pathologie der Johann-Wolfgang-Goethe-Universität in Frankfurt/Main durchgeführt.

Für Einzelzell-PCR-Untersuchungen wurden 0,5 ml Reaktionsgefäße mit steril

filtrierter 1%iger BSA-TBS-Lösung gefüllt und für 30 min inkubiert, um unspezifische

Bindungen am Plastik zu verhindern. In die Deckel der LPC-

Mikrozentrifugenröhrchen (PALM) wurden 20 μl 1 x High Fidelity Puffer (Roche) mit

Zusatz von 0,1% Triton-X-100 (Roche) vorgelegt. Die Deckel wurden in die

entsprechende Halterung am PALM ® Robot- MicroBeam eingesetzt und in die

korrekte Position gebracht. HRS-Zellen wurden bei 400facher Vergrößerung am

Bildschirm des Computers identifiziert und mit Hilfe der Computermaus markiert. Das

Ausschneiden und Katapultieren der Zellen in den Deckel erfolgte durch einen Laser

und wurde durch die Software selbsttätig ausgeführt. Nach erfolgter LPC wurde das

Reaktionsgefäß vorsichtig aus der Halterung entfernt, der Deckel geschlossen und

die dort befindlichen Zellen für 2 min bei 15000 x g in das Reaktionsgefäß


36

zentrifugiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Zellen bei -20°C gelagert.

Mikrodissezierte HRS-Zellen für miRNA-Analysen wurden in 200 µl

Mikrozentrifugenröhrchen mit adhäsiver Deckelbeschichtung (PALM) katapultiert.

Anschließend wurden 12 µl H2O mit Zusatz von 0,1% Triton-X-100 (Roche) auf die

adhäsive Fläche pipettiert und die Röhrchen auf dem Kopf stehend bei -80° C bis zur

weiteren Verwendung eingeforen.

2.3.5 Isolierung von Keimzentrums-B-Zellen

Die Isolierung humaner GC-B-Zellen erfolgte aus Biopsaten von Routine-

Tonsillektomien. Zur Gewinnung von tonsillären mononukleären Zellen (engl. tonsillar

mononuclear cells, TMC) wurde tonsilläres Gewebe mit einem Skalpell fein geschabt

und durch ein 100 m Sieb (Becton Dickinson (BD), Heidelberg) gepresst.

Gewebereste wurden mittels Filterung durch engmaschige Siebe entfernt. Nach

einem Waschschritt mit 40 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), der 0,5%

Rinder-Serum-Albumin (BSA) zugesetzt werden, erfolgte eine Standard-Ficoll-

Dichtegradientenzentrifugation (Amersham). Die gewonnenen TMC wurden in

PBS/BSA 0,5% resuspendiert und CD19-positive B-Zellen durch magnetische

Zellseparation (eng. magnetic cell sorting) über eine MACS-LS Säule (Miltenyi,

Bergisch Gladbach) nach Herstellerangaben angereichert. Für die Isolierung von

GCB im Allgemeinen wurde die Zellsuspension mit CD20-FITC-, CD27-PE- und

CD38-APC- Antikörpern (alle BD) gefärbt. Sortiert wurden CD20++, CD27+ und

CD38int Zellen. Für die Gewinnung von CD30+ GC-B-Zellen wurden die TMC nach

Depletion CD3-positiver Zellen über eine MACS-LD Säule (Miltenyi Biotech, Bergisch

Gladbach) über eine MACS-LS-Säule (Miltenyi Biotech) angereichert und die

gesammelten Eluate anschließend mit anti-CD30-PE, anti-CD20-FITC und anti-

CD38-APC (BD) nach Herstellerangaben gefärbt. Sortiert wurden CD20++, CD30+

und CD38int B-Zellen. Die gewünschten Zellen wurden mittels eines FACS DIVA

Zellsortierers (BD) in Aliquots von 400 Zellen in 12 µl H2O (0,1% Triton-x-100)

sortiert.


37

2.4 Arbeiten mit Zellen

2.4.1 Zellkultur

Zelllinie Ursprung Literatur

L-1236 HL peripheres Blut (Wolf et al., 1996)

L-428 HL Pleural-Erguss (Drexler, 1993)

DEV NLPHL Pleural-Erguss (Maggio et al., 2002; Poppema et al., 1985)

HDLM2 HL Pleural-Erguss (Drexler, 1993)

KM-H2 HL Pleural-Erguss (Drexler, 1993)

SUP-HD1 HL Pleural-Erguss (Naumovski et al., 1989)

U-HO1 HL Pleural-Erguss (Mader et al., 2007)

Raji BL (Pulvertaft, 1964)

BL-2 BL (Bertrand et al., 1981; Denepoux et al., 1997)

2.4.2 Kultivierung von Zellen

Alle verwendeten Zelllinien wurden in einer 37°C und 5% CO2-Atmosphäre kultiviert.

Suspensionszellen wurden in RPMI1640, versetzt mit Glutamax-1, 20% fötalem

Kalbsserum (engl. fetal calve serum, FCS, beides PAA) und 100 U/ml

Penicillin/Streptomycin, gehalten. U-HO1 Zellen wurden in 80% IMDM + 20%

RPMI1640 versetzt mit Glutamax-1, 20% FCS und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin

kultiviert. Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 300 x g und 4°C

gesammelt. Je nach Zelllinie und zu erreichender Zelldichte wurde eine

entsprechende Menge Medium abgesaugt und durch frisches Medium ersetzt.


38

2.4.3 Zellzahlbestimmung

Die Anzahl der Zellen wurde durch Auszählen entsprechender Verdünnungen von

Zellsuspensionen in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Zur Unterscheidung

zwischen vitalen und schadhaften Zellen wurde das gleiche Volumen einer 0,5%igen

Trypanblau-Lösung zugegeben. Die Substanz wird von lebenden Zellen nicht

aufgenommen, abgestorbene Zellen dagegen nehmen den Farbstoff auf und werden

dadurch dunkelblau angefärbt.

2.4.4 Durchflusszytometrische Analyse und Zellsortierung (FACS)

Die durchflusszytometrische Analyse und Sortierung von HRS-Zellen wurde an

einem FACS DIVA-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, Heidelberg)

durchgeführt. Die mittels Zentrifugation gesammelten Zellen wurden mit 1 ml PBS

gewaschen, der Überstand abgesaugt und in 0,5-1 ml PBS aufgenommen. Zur

Auflösung von Zellaggregaten wurde die Suspension vor der Soertierung durch ein

Zellsieb (Cell-Tric) mit einer Maschengröße von 45 μm gesiebt.Für die Sortierung

lebender HRS-Zellen für miRNA-TLDA-Analysen wurden die Zellen mit 5 μg/ml

Propidiumiodid (PI) angefärbt. Aliquots von je 400 PI-negativen Zellen wurden in 12

µl H2O (0,1% Triton-x-100) sortiert.

2.5 Statistik

2.5.1 Statistische Auswertung der miRNA-TLDA

Zur statistischen Auswertung der miRNA-TLDA wurden zwei unterschiedliche

Software-Applikationen verwendet, für die verschiedene Normalisierungsmethoden

angewandt wurden.

2.5.1.1 Auswertungen mit Genespring GX

2.5.1.1.1 Normalisierung der Datensätze

Für die Analyse von qPCR-Rohdaten mittels des Programms Genespring GX 7.3.1

(Agilent, Böblingen) wurden die erhaltenen Ct-Werte zunächst entlogarithmisiert, der

Kehrwert errechnet und der Wert für alle nicht detektierten miRNAs (Ct-Wert 40, da


39

bis zum letzten Zyklus 40 der PCR keine Fluoreszenz oberhalb des Hintergrundes

detektiert wurde) somit auf 1 gesetzt.

Formel: (1/(2 Ct)) x 240

Danach wurde ein sogenannter Scaling Factor (SF) für die einzelnen TLDAs

berechnet, der die mittlere Signalstärke der Arrays einander angleicht

(Normalisierung). Diese Normalisierung ist nötig, um Unterschiede in der

Gesamtintensität einzelner Arrays auszugleichen.

Formel für die SF Berechnung: ( 𝑥 aller Signale eines Arrays ) ( 𝑥 der Signale aller Arrays )

𝑥 = Mittelwert

Anschließend wurden die Signalwerte der einzelnen miRNAs durch den für das

entsprechende Array errechneten SF dividiert.

2.5.1.1.2 Hierarchische Gliederung

In einer hierarchischen Gliederung (engl. Cluster Analysis) werden einzelne

Datensätze (cluster) anhand ihrer Ähnlichkeiten zueinander zu Gruppen

zusammengefasst. Der verwendete Algorithmus ist die Average-Linkage-Methode.

Diese fasst die einander ähnlichsten cluster jeweils zu einer nächsthöheren

Gruppierung zusammen (agglomeratives Gruppieren). Als Maß für die Ähnlichkeit

wird die Pearson-Korrelation verwendet. Um die Richtigkeit eines solchen Clustering-

Verfahrens zu testen wird ein bootstrapping-Verfahren aus 100 willkürlichen

Austauschen einzelner Komponenten der Datensätze unter Berechnung der Stabilität

einzelner cluster (engl. confidence level, entspricht der Frequenz einer identischen

Anordnung) angewandt.

2.5.1.1.3 Paarweise Vergleiche

In paarweisen Vergleichen werden Gene anhand ihrer differentiellen Ausprägung

zwischen zwei verschiedenen Datensätzen (z.B. Tumor- gegen Referenzgewebe)

angeordnet. Um die statistische Signifikanz zu ermitteln wird ein parametrischer T-

Test mit ungleichen Varianzen durchgeführt. Werden mehr als zwei Datensätze


40

verglichen so wird die Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey’s post-hoc test genutzt.

Die Genlisten, die paarweisen Vergleichen zugrunde liegen, werden unsupervised

nach Standardabweichung und p-Werten zusammengestellt.

2.5.1.1.4 Prinzipielle Komponenten Analyse (PCA)

Die PCA ist ein Verfahren der multivariaten Statistik, mit der sich die Variation vieler

Datensätze in wenigen Dimensionen darstellen lässt. Sie dient dazu, umfangreiche

Datensätze zu strukturieren, zu vereinfachen und zu veranschaulichen, indem eine

Vielzahl statistischer Variablen durch eine geringere Zahl möglichst aussagekräftiger

Linearkombinationen (die „Hauptkomponenten“) genähert wird. Eine PCA kann

sowohl beaufsichtigt oder unbeaufsichtigt (engl. supervised / unsupervised) erfolgen,

d.h. es werden entweder nur differentiell ausgeprägte Gene aus bestimmten

Konditionen betrachtet oder eine willkütlich festgelegte Genliste der PCA zugrunde

gelegt.

2.5.1.2 Auswertungen mit R

Für die Auswertungen der TLDA-Daten wurde unter anderem die Standardsoftware

R verwendet. R ist eine Programmiersprache zur statistischen Datenanalyse und

deren grafischer Darstellung. Unter anderem bietet R die Möglichkeit der Erweiterung

durch Pakete und Schnittstellen zu diverser Software, wie SPSS, MS Office,

Datenbanken etc. In diesem Projekt wurden zur erweiterten miRNA-Datenanalye die

Softwarepakete HTqPCR, Geneplotter und Gplots des Bioconductor project genutzt

(Gentleman et al., 2004). Zur Normalisierung der Daten wurde die quantile

Normalisierung verwendet (Bolstad et al., 2003). In die hierarchischen Gliederungen

nur solche miRNAs einbezogen, deren Interquartilsabstand (Differenz zwischen

Quantil25 und Quantil75, beinhaltet 50% aller Meßwerte) > 1 betrug (IQR-

Normalisierung). Des Weiteren wurden alle miRNAs ausgeschlossen, deren Meßwert

in mehr als 5 Proben über Ct 35 lag. Als Algorithmus wurde die Average-Linkage-

Methode unter Berücksichtigung der euklidischen Distanz verwendet.

http://de.wikipedia.org/wiki/Linearkombination

ERGEBNISSE

41

3. Ergebnisse

3.1 Etablierung eines RT-qPCR-Protokolls für microRNA aus geringen

Zellmengen

Um eine verlässliche miRNA-Expressionsanalyse mittels TLDA durchführen zu

können, werden nach dem Standard-Protokoll von Applied Biosystems zwischen 50

und 100 ng RNA benötigt. Soll diese Methode mit mikrodissektierten HRS-Zellen

durchgeführt werden bedeutet dies, dass bei einem angenommenen RNA-Gehalt

von 3 pg pro Zelle mehr als 15.000 HRS-Zellen isoliert werden müssen. Da dies vom

Zeit- und Arbeitsaufwand her kaum durchführbar ist, wurde innerhalb dieser Arbeit

ein Protokoll etabliert, mit dessen Hilfe miRNA aus wenigen hundert

mikrodissektierten Zellen revers transkribiert und anschließend präamplifiziert

werden kann, so dass eine nachfolgende miRNA-Expressionsanalyse mittels TLDA

möglich wird (Abb. 5). Im Folgenden sollen die wichtigsten Schritte der

Etablierungsarbeit beschrieben werden.

Abb. 5: Schematische Übersicht der Arbeitsschritte der miRNA-Expressionsanalyse aus wenigen Zellen. 400 mikrodissezierte oder sortierte Zellen werden durch einen Hitzeschock lysiert und das Lysat direkt in eine Multiplex-RT eingegeben. Im nachfolgenden Schritt wird die miR-cDNA präamplifiziert. Das Präamplifikat wird auf der TLDA-Karte mittels qPCR amplifiziert und die so erhaltenen Fluorszenzsignalwerte (Ct-Werte) können statistisch ausgewertet werden.

Mikrodissektion

95°C

Hitzeschock miR-RT (480 miRs)

miR-Präamplifikation

(480 miRs)TLDA-Card(360 miRs)

Datenanalyse

ERGEBNISSE

42

3.1.1 Etablierungsexperimente mit Zelllinien

Zur Etablierung einer sensitiven RT-qPCR-Methode zur Amplifikation von miRNAs

aus geringen Zellmengen wurde zunächst getestet, ob es möglich ist, miRNA direkt

aus Hitzeschock-behandelten Zellen ohne eine zusätzliche Extraktion kleiner RNA zu

amplifizieren. Die Klärung dieser Frage war für die Etablierung von entscheidender

Bedeutung, da bei den üblichen RNA-Isolierungsmethoden ein Materialverlust durch

die Elution über Extraktionssäulen auftritt, der bei der Analyse geringer Zellmengen

möglichst vermieden werden sollte. Mittels RT-qPCR wurden 2 verschiedene

Zelllinien (Raji und BL2 (BL)) auf ihre Expression der Referenz-snoRNA (engl. small

nucleolar RNA) RNU48 hin analysiert. In die RT wurde entweder durch Hitzeschock

generiertes Zell-Lysat oder mit einem miRneasy-Kit (Qiagen) extrahierte RNA aus

jeweils 10, 100, 1000 oder 10000 Zellen eingesetzt. Die Hitzeschock-Lysate erzielten

niedrigere Ct-Werte, was eine höhere Ausgangskonzentration von miRNA in diesen

Proben indiziert. Auch die Varianz der erhaltenen Ct-Werte war geringer als in Kit-

extrahierten Proben (Abb. 6). RNU48 konnte auch im sehr niedrigen Zellzahlbereich

detektiert werden.

Abb. 6: Auftragung der durch RT-qPCR ermittelten Ct-Werte für RNU48 in den Zelllinien L-428 (HL), Raji (BL) und BL2 (BL) gegen die Anzahl der für die RT verwendeten Zellen. Eingesetzt wurden entweder Hitzeschocklysate (HS) oder Kit-extrahierte RNA (KIT). Aufgetragen sind die Mittelwerte der jeweiligen Ansätze (Duplikate) gegen die für die Hitzeschock-Lyse bzw. RNA-Extraktion verwendete Anzahl von Zellen, sowie die korrespondierende Standardabweichung. Im Falle der Hitzeschock-Proben war diese so gering, dass die Fehlerindikatoren nicht sichtbar sind. Die Y-Achse zeigt die Zahlenwerte in umgekehrter Reihenfolge, da ein niedrigerer Ct-Wert einer hohen Expression entspricht.

17

20

23

26

29

10 100 1000 10000

Ct-W

ert

Zellen in RT

KIT Raji

KIT BL2

HS Raji

HS Bl2

ERGEBNISSE

43

Aufgrund dieser Ergebnisse wurden alle weiteren Experimente mit Hitzeschock-

Lysaten durchgeführt. Im Anschluss wurde getestet, inwiefern die Verwendung

unterschiedlich großer Zellmengen Einfluss auf den ΔCt-Wert (d.h. auf den zu einem

Referenzgen normalisierten Ct-Wert) von miRNAs nimmt. Hierzu wurden 100 bzw.

1000 L-428 Zellen mittels Hitzeschock lysiert und die Expression der miRNAs 15a,

16, 146a und 155 analysiert. Die Analyse zeigte, dass die ΔCt-Werte bei niedrigen

Zellzahlen meist etwas niedriger waren, die Varianz gegenüber der höheren Zellzahl

jedoch im üblichen Streuungsbereich von +/- 1 ΔCt lag (Abb. 7).

Abb. 7: Auftragung der durch RT-qPCR ermittelten ΔCt-Werte für miR-15a, miR-16, miR-146a und miR-155 in L-1236. Alle Ansätze wurden als Duplikate pipettiert. Gegeben sind Mittelwert der ΔCt-Werte (Ct-Werte der jeweiligen miRNAs normalisiert zum Ct des Referenzgens RNU48) und Standardabweichung. Schwarze Säulen zeigen die aus 1000 Zellen erhaltenen Werte, weiße Säulen die aus 100 Zellen erhaltenen Werte. Die Y-Achse zeigt die Zahlenwerte in umgekehrter Reihenfolge, da ein niedrigerer ΔCt-Wert einer hohen Expression entspricht.

Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass eine Amplifikation von miRNA aus

einer sehr geringen Anzahl von Zellen möglich ist. Die Verwendung von Hitzeschock-

Zelllysaten in der RT führte zu Ergebnissen, die sich nur geringfügig von denen aus

äquivalenten Experimenten mit extrahierter kleiner RNA unterschieden. Auch die

Verwendung unterschiedlich großer Zellmengen zeigte kaum Einfluss auf die

relativen Expressionswerte der analysierten miRNAs.

0

2

4

6

8

10

miR-15a miR-16 miR-146a miR-155

ΔC

t

HS L1236 1000Z

HS L1236 100Z

ERGEBNISSE

44

3.1.2 Etablierungsexperimente mit mikrodissektierten Zellen aus HL-Fällen

In weiterführenden Etablierungarbeiten mit mikrodissektierten HRS-Zellen wurde der

Einfluss verschiedener experimenteller Parameter auf die Expressionsanalysen von

miRNAs untersucht. Zunächst wurde getestet, ob die Verwendung von

Formalinfixierten, Paraffineingebetteten (FFPE) Proben im Vergleich zu

Gefriermaterial zu abweichenden Ergebnissen führt. Analysen von mRNA aus FFPE-

Proben sind nur schwer durchführbar, da die Formalinfixierung zur Kreuzvernetzung

der bis zu mehrere kb langen Moleküle führt und nach RNA-Extraktion oft nur

Bruchstücke der ursprünglichen mRNA analysiert werden können. MiRNA ist

aufgrund ihrer geringen Größe weniger anfällig für diesen Effekt, so dass eine

Analyse dieser Molekülklasse auch aus FFPE-Proben möglich sein sollte. Je

50 mikrodissektierte HRS-Zellen aus Gewebeschnitten gefrorener und FFPE-

Lymphknotenbiopsate des selben HL-Falles wurden mikrodissektiert, die Zellen

durch Hitzeschock lysiert und mittels qPCR auf die Expression von RNU48 und miR-

155 hin analysiert. MiR-155 wurde gewählt da ihre Überexpression im HL im

Vergleich zu B-Zellen bekannt ist (Eis et al., 2005; Gibcus et al., 2009). Simultan

wurde getestet, ob die Verwendung adhäsiver und nicht adhäsiver Eppendorf-Cap-

Deckel für die Laserkatapultierung der Zellen Einfluss auf die nachfolgenden

Analysen nimmt. Dies war von Interesse, da in adhäsive Caps keine Flüssigkeit

(Wasser oder Pufferlösung) eingegeben werden muss, in die die Zellen katapultiert

werden; sie haften stattdessen an der adhäsiven Deckeloberfläche und werden erst

nach Abschluss der Mikrodissektion mit Flüssigkeit überschichtet, in der

anschließend die Zelllyse durch Hitzeschock durchgeführt wird. Der Vorteil dieser

Methode ist, dass Komplikationen wie das Verdunsten der Flüssigkeit, oder

versehentliches Benetzen des Schnittes mit derselben, ausbleiben, und die Zellen in

einer genau definierten Menge Flüssigkeit aufgenommen werden können.

Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Abbildung 8 dargestellt.

ERGEBNISSE

45

Abb. 8: MiR-155-Expression in Proben aus Gefrier- und FFPE-Material eines HL-Falles. Je 50 HRS-Zellen wurden entweder in die Deckel adhäsiver Eppendorf-Caps oder in herkömmliche, mit 12 µl H2O (0,1% Triton-X-100) gefüllte Deckel katapultiert und anschließend wie beschrieben prozessiert. Alle Ansätze wurden als Duplikate pipettiert. Gegeben sind Mittelwert der ΔCt-Werte (Ct-Werte der jeweiligen miRNAs normalisiert zum Ct des Referenzgens RNU48) und Standardabweichung. AdhCap: adhäsiver Deckel, normCap: herkömmlicher Deckel. Die Y-Achse zeigt die Zahlenwerte in

umgekehrter Reihenfolge, da ein niedrigerer Ct-Wert einer hohen Expression entspricht.

In Gefrierproben wurde generell eine höhere Expression von miR-155 bestimmt; im

Falle der adhäsiven Caps lag die Abweichung jedoch im normalen Streuungsbereich

von +/- 1 ΔCt, weshalb in nachfolgenden Experimenten aufgrund der besseren

Verfügbarkeit auf FFPE-Proben zurückgegriffen wurde. Die Verwendung von

adhäsiven Caps schien sich nicht nachteilig auf die Analysen auszuwirken; daher

wurden sie aufgrund ihrer einfacheren Handhabbarkeit auch in weiterführenden

Experimenten verwendet. Auch der Einfluss verschiedener Färbungsmethoden auf

die qPCR-Ergebnisse wurde getestet (Cresylviolett- bzw. und Hämalaun- und

Eosinfärbung). Als am effizientesten erwies sich hierbei eine herkömmliche

Hämalaun- und Eosinfärbung mit anschließender kurzer Ethanol-Fixierung der

Schnitte (Daten hier nicht gezeigt). Des Weiteren wurde die Zugabe von RNAse-

Inhibitor und Triton-X-100 in das auf die adhäsiven Caps aufgegebene Wasser, in

dem nachfolgend die Hitzeschock-Lyse durchgeführt wurde, variiert. Das Detergenz

Triton-X-100 wird zugegeben um die Oberflächenspannung des Wassers zu

erniedrigen; dies ermöglicht die Aufgabe geringerer Volumina an H2O in die Cap-

Deckel bei gleichzeitiger vollständiger Bedeckung der adhäsiven Deckel-Oberfläche,

was zu einer höheren Zelldichte in der Flüssigkeit und somit höherer miRNA-

Konzentration im Lysat führt. Die Variation der RNAse-Inhibitorkonzentration zeigte

keinerlei Einfluss auf die qPCR-Ergebnisse wohingegen erhöhte Triton-X-

Konzentrationen die PCR-Effizienz stark erniedrigten (hier nicht gezeigt). Daher

wurde im Folgenden eine sehr geringe Triton-X-Konzentration von 0,1% verwendet.

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

5

adhCap normCap adhCap normCap

Gefrierproben Paraffinproben

∆C

t m

iR-1

55

Fall LK 248

ERGEBNISSE

46

3.1.3 Etablierung des Multiplex-RT und Präamplifikationsprotokolls

Zur Etablierung der sogenannten „Multiplex“-miRNA-RT und Präamplifikation (PA)

wurde eine early-access-Vereinbarung mit der Firma Applied Biosystems

geschlossen. „Multiplex“ bedeutet, dass sowohl in der RT als auch in der PA

Primergemische eingesetzt werden, die 480 verschiedene Oligonukleotide

beinhalten, mittels derer die korrespondierenden miRNAs simultan revers

transkribiert bzw. präamplifiziert werden können. Auf dem für die qPCR verwendeten

TLDA (Version 1.0) befinden sich Primer und Sonden zur Amplifikation und Detektion

360 verschiedener miRNAs. Zum damaligen Zeitpunkt befanden sich die von Applied

Biosystems zur Verfügung gestellten Primergemische für RT und PA in der Beta-

Testphase und waren noch nicht auf dem freien Markt erhältlich. Ziel der

Etablierungsexperimente war es herauszufinden, ob (a) die Voramplifikation die

Ergebnisse der anschließenden qPCR-Analysen im Hinblick auf die miRNA-

Expressionswerte verzerrt und (b), ob die Ergebnisse in verschiedenen Ansätzen

stabil reproduzierbar sind. Zu diesem Zweck wurden 400 sortierte U-HO1-Zellen (HL-

Zelllinie) per Hitzeschock lysiert, mit dem RT-Primergemisch revers transkribiert und

anschließend die miR-cDNA mit dem PA-Primergemisch präamplifiziert. Als

Referenzprobe wurde extrahierte kleine RNA aus ca. 106 U-HO1 Zellen verwendet,

die ebenfalls mit dem RT-Primergemisch revers transkribiert, jedoch nicht

präamplifiziert wurde. Die Ergebnisse werden in Abbildung 9 grafisch dargestellt.

Abb. 9: Vergleich der ΔCt-Werte für die miRNAs 15a, 146a und 155 aus präamplifizierter und nicht präamplifizierter miR-cDNA der HL-Zelllinie U-HO1. Die weißen Säulen zeigen die ΔCt-Werte (bezogen auf das Referenzgen RNU48) präamplifizierter Proben (Hitzeschock-Lysat aus 400 Zellen); dieses Experiment wurde in zwei Parallel-Ansätzen durchgeführt. Gegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen. Die grauen Säulen zeigen die Ergebnisse eines korrespondierenden Ansatzes mit extrahierter kleiner RNA aus 10

6 U-HO1-Zellen (Einzelexperiment). Alle Ansätze wurden

simultan pipettiert und auf derselben 96-Well-Platte aufgetragen. Die Y-Achse zeigt die Zahlenwerte in umgekehrter Reihenfolge, da ein niedrigerer Ct-Wert einer hohen Expression entspricht.

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

miR-15a miR-146a miR-155 miR-15a miR-146a miR-155

U-HO 400 U-HO pos. Ctrl.

ΔC

t

ERGEBNISSE

47

Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass sowohl die Reproduzierbarkeit der

Präamplifikation als auch eine Vergleichbarkeit von amplifizierten und nicht-

präamplifizierten Proben gegeben ist. Im Folgenden wurde getestet, ob das

Einsetzen unterschiedlicher Zellmaterialien bzw. Zellmengen in die Multiplex-RT-PA-

Prozessierung Konsequenzen für die darauf folgenden qPCR-Analysen hat. Hierfür

wurden 80, bzw. 400 Zellen der HL-Linie L-1236 sowie 400 mikrodissektierte HRS-

Zellen aus einem HL-Primärfall verwendet und nach Multiplex-RT-PA-Prozessierung

mittels qPCR analysiert (Abbildung 10).

Abb. 10: Vergleich der ΔCt-Werte für die miRNAs 15a, 146a und 155 aus präamplifizierter und nicht präamplifizierter miR-cDNA der HL-Zelllinie L-1236 und dem primären HL-Fall K836-07. Die grauen Säulen zeigen die ΔCt-Werte (bezogen auf das Referenzgen RNU48) präamplifizierter L-1236 Proben aus 80 bzw. 400 Zellen (links und Mitte). Die schwarzen Säulen zeigen die Ergebnisse eines korrespondierenden Ansatzes mit 400 mikrodissektierten HRS-Zellen. Alle Ansätze wurden simultan als Duplikate pipettiert und auf derselben 96-Well-Platte aufgetragen. Die Y-Achse zeigt die Zahlenwerte in umgekehrter Reihenfolge, da ein niedrigerer Ct-Wert einer hohen Expression entspricht.

Die Auswertung der Ergebnisse ergab, dass ein Unterschied von Faktor 5 in der für

die RT eingesetzten Zellmenge nur zu geringfügigen Änderungen der ΔCt-Werte in

der qPCR führte. Im Falle der stark exprimierten miRNAs 146a und 155 lag die

Varianz innerhalb des üblichen Streungsbereichs von +/- 1 ΔCt. Die Varianz für miR-

15a lag deutlich höher, was vermutlich an der ohnehin schwachen Ausprägung

dieser miRNA liegt, die zu einer höheren Streuung der Messwerte führt. In den

mikrodissektierten HRS-Zellen von Fall 836-07 konnte miR-15a nicht nachgewiesen

werden; dies liegt vermutlich in der Tatsache begründet, dass bei der Mikrodissektion

aus Gewebeschnitten nur Teile des Zellkörpers gewonnen werden können, was in

einem niedrigeren RNA-Gehalt resultiert. Die stark exprimierten miRNAs -146a und

-10

-6

-2

2

6

10

14

15a 146a 155 15a 146a 155 15a 146a 155

L1236 HS 80Z L1236 HS 400 Z K 836-07 400 Z

∆Ct

ERGEBNISSE

48

-155 konnten jedoch auch aus dieser Probe amplifiziert werden. Ihre ΔCt-Werte

wichen stark von den aus Zelllinien ermittelten ab; dieser Effekt könnte jedoch aus

der biologischen Diversität von HL-Zelllinien und Primärfällen resultieren.

3.1.4 Reproduzierbarkeit der TLDA-Analysen

Zur Ermittlung der Reproduzierbarkeit von TLDA-Analysen wurden zwei 400-Zell-

Aliquots der HL-Zelllinie U-HO1 mittels FACS sortiert (Sortierung mit PI, nur lebende,

d.h. PI-negative Zellen werden in die Analyse miteinbezogen) und dem bereits

etablierten miR-RT-PA-Protokoll entsprechend prozessiert. Anschließend wurden die

beiden Replikate separat mittels TLDA auf die Expression 360 reifer miRNAs hin

analysiert und die Ergebnisse in der Software Excel (Microsoft, Redmond, USA)

ausgewertet. Die Ergebnisse der miRNA-Expressionsanalysen der beiden

biologischen Replikate sind als Streudiagramm in Abbildung 11 dargestellt.

Abb. 11: Streudiagramm der TLDA-Analysen Multiplex-RT-PA-prozessierter 400-Zell-Aliquots

der HL-Zellline U-HO1. Gezeigt sind Rohdaten (alle Ct-Werte <35) beider Proben, die gegeneinander

aufgetragen wurden (x-Achse: Probe 2, y-Achse: Probe1). Ct-Werte >35 wurden von der Analyse

ausgeschlossen, da ab Ct-Wert 35 die Streuung deutlich zunimmt. R2: Bestimmtheitsmaß (0 = 0%

Korrelation, 1 = 100% Korrelation).

Das Streudiagramm zeigt, dass die miRNA-Expression innerhalb der beiden

Duplikate ohne zusätzliche Normalisierung konsistent ist. Dies bestätigte sowohl die

technische als auch die biologische Reproduzierbarkeit von TLDA-Analysen an

geringen Zellmengen. Durch die in diesem Kapitel beschriebenen

R² = 0,8945

15

20

25

30

35

40

15 20 25 30 35 40

CtU

-HO

1 P

rob

e 1

Ct U-HO1 Probe 2

ERGEBNISSE

49

Etablierungsarbeiten konnte somit ein sensitives, reproduzierbares Protokoll für die

miRNA-Expressionsanalyse mittels TLDA aus geringen Zellmengen entwickelt

werden.

3.2 MicroRNA-Expressionsanalysen in HL-Tumorzellen, GC-B-Zellen und

CD30+ GC-B-Zellen

Die der Pathogenese des HL zugrunde liegenden Mechanismen sind bis heute

weitgehend ungeklärt; dies liegt unter anderem in der Seltenheit der malignen Zellen

im Tumorgewebe begründet, die die Gewinnung und Analyse von HRS- und LP-

Zellen erschwert. Durch die Expressionsanalyse 360 verschiedener miRNAs sollten

folgende Fragen geklärt werden: (a) Unterscheidet sich die miRNA-Ausprägung der

HRS- bzw. LP-Zellen von der ihrer Vorläuferzellen, den GC-B-Zellen? (b) Stellen

CD30+ GC-B-Zellen eine eigene Entität innerhalb der GC-B-Zellen dar, und - falls

dies so ist - besteht eine engere Verwandschaft von HRS-Zellen zu CD30+ GC-B-

Zellen als zu normalen GC-B-Zellen? (c) Können das cHL und das NLPHL anhand

ihrer miRNA-Expressionsprofile differenziert werden? (d) Lassen sich die cHL-

Subgruppen NS und MC anhand ihrer miRNA-Expression unterscheiden? (e) Bilden

NS-Fälle, welche den B-Zell-Marker CD20 ausprägen, eine eigene Subgruppe

innerhalb des cHL? (f) Zeigen die miRNA-Expressionsprofile von HL-Zelllinien und

HL-Fällen eine hohe Übereinstimmung? (g) Welche deregulierten miRNAs sind

eventuell von Bedeutung für die Pathogenese des HL im Allgemeinen, bzw. der

verschiedenen HL-Subtypen?

3.2.1 MiRnome-weite Analyse der miRNA-Expression in HL-Tumorzellen und

GC-B-Zellen

Analog zum englischen Begriff für Genom (genome) wird die Gesamtheit aller

exprimierten miRNAs innerhalb eines Gewebe- oder Zelltyps als miRnom bezeichnet.

Im folgenden Abschnitt sollen globale Analysen der miRnome verschiedener HL-

Subtypen und Referenzproben (GC-B-Zellen) beschrieben werden.

Erstellt wurden miRNA-Expressionsprofile von je 400 mikrodissektierten HRS-Zellen

aus insgesamt 15 cHL-Fällen (davon 6 MC, 4 NS und 5 CD20+ NS) und je 400

mikrodissektierten LP-Zellen aus 5 NLPHL-Fällen. Alle Zellen wurden aus mit

Hämalaun und Eosin gefärbten FFPE-Biopsaten isoliert. Außerdem wurden je 400

FACS-sortierte Zellen der HL-Linien L-428, L-1236, U-HO1, SUP-HD1, KM-H2,

ERGEBNISSE

50

HDLM2 und der NLPHL-Linie DEV analysiert. Desweiteren wurden Profile von je 400

FACS-sortierten tonsillären GC-B-Zellen aus 10 Donoren (davon 5 Proben CD30+

GC-B-Zellen) erstellt. Alle Proben wurden RT-PA-prozessiert und anschließend

einem Qualitätstest mit den qPCR-Einzelassays RNU48 (Referenzgen) und miR-155

unterzogen. Wurde für RNU48 ein Ct-Wert >24 bestimmt so wurde die

entsprechende Probe nicht mittels TLDA analysiert, da in diesem Fall von einer

generell niedrigen PCR-Effizienz auszugehen ist, die zu einer stark verminderten

Anzahl der detektierbaren miRNAs führt. In die im folgenden Abschnitt dargestellten

Analysen wurden nur solche Proben mit einbezogen, deren RNU48-Wert den

Schwellwert von Ct 24 nicht überschritt; 5 weitere Proben wurden von den Analysen

ausgeschlossen. TLDA-Daten wurden entweder in R durch quantile Normalisierung

bearbeitet (Bolstad et al., 2003) oder in Excel einer Scaling Factor- (SF)

Normalisierung unterzogen. Durch den SF werden die mittleren Expressionswerte

eines TLDAs den durchschnittlichen Expressionswerten aller TLDAs rechnerisch

angeglichen, um Differenzen in der qPCR-Effizienz auszugleichen.

Ein unsupervised hirarchical clustering aller generierten TLDA-Analysen (quantile

Normalisierung, R-Software, basierend auf den 200 miRNAs mit größter

Expressionsvariabilität) zeigte, dass sich Tumorzellen und GC-B-Zellen anhand ihres

miRNoms in zwei definierte Gruppen gliedern lassen (Abbildung 12). Eine Gruppe

wird durch die GC-B-Zellen repräsentiert, wobei die CD30+ GC-B-Zellen verstreut in

diesen Arm des Dendogramms integriert sind und somit zumindest innerhalb dieser

Analyse keine eigene Entität darstellen. Der zweite Arm des Dendogramms

beinhaltet beinahe ausschließlich HL-Proben (Ausnahme NS2), wobei eine

grundsätzliche Unterteilung in zwei Subgruppen zu beobachten ist; in der einen

finden sich vornehmlich MC- und NS-CD20+-Fälle, in der zweiten beinahe

ausschließlich NLPHL-Fälle und die HL-Zelllinien, wobei die letzteren beiden

Gruppen erneut 2 separate Unterarme bilden. Die NS-Fälle lassen sich keiner

Subgruppe definiert zuordnen; 2 der Fälle liegen innerhalb der NLPHL-Subgruppe,

einer gruppiert sich unter den MC- und NS-CD20+-Fällen und einer liegt innerhalb

des GC-B-Zell-Arms. Des Weiteren gruppiert sich eine der GC-B-Zell-Proben unter

den HL-Zelllinien-Arm.

ERGEBNISSE

51

Abb. 12: Unsupervised hirarchical clustering aller GC-B-Zell und HL-Proben. Gezeigt sind 5 GC-B-Zell-Proben, 5 CD30+-GC-B-Zell-Proben, 6 MC, 4 NS, 5 CD20+ NS, 5 LP und 7 HL-Zelllinien. Das Clustering basiert auf den 200 miRNAs mit variabelster Expression. Die verschiedenen Zelltypen sind farbcodiert: Hellgrün: GC-B-Zellen, Türkis: CD30+ GC-B-Zellen, Blau: NS, Gelb: MC, Rot: CD20+ NS, Dunkelgrün: NLPHL, Pink: HL-Zelllinien. TLDA-Daten wurden IQR-normalisiert und in R analysiert.

Durch das hier gezeigte unsupervised hirarchical clustering wird deutlich, das anhand

der Analyse der miRNA-Expression nicht nur die Lymphom-Proben von ihren

Vorläuferzellen, den GC-B-Zellen, unterschieden werden können, sondern das auch

eine grobe Einteilung des HL in verschiedene Subgruppen möglich ist. Allerdings

bildet nicht jede HL-Subgruppe eine eigene Entität innerhalb des Clusters.

Überraschenderweise finden sich alle CD20+ NS-Fälle innerhalb eines Arms mit dem

größten Teil der MC-Fälle und gruppieren sich nicht unter die morphologisch

ähnlichen NS-cHL. Diese beiden Gruppierungen innerhalb des clusters blieben bei

Verwendung einer anderen Software (Genespring GX) und Normalisierungsmethode

(SF) weitgehend erhalten. Auch eine Variierung der Anzahl der in die Clustering-

Analysen mit einbezogenen miRNAs (250 und 200 miRNAs) führte zu nahezu

identischen Ergebnissen. Daher kann die im unsupervised clustering beobachtete

Gruppenbildung der HL-Fälle als stabil angenommen werden. Bei Verwendung von

weniger als 200 miRNAs zeigten die Clusterings eine zunehmende Instabilität (Daten

hier nicht gezeigt); dies lässt sich vermutlich auf die äußerst heterogene miRNA-

Expression innerhalb der verschiedenen Subgruppen zurückführen. Um die

Verwandtschaft zwischen den einzelnen HL-Subtypen besser beurteilen zu können,

wurde ein Dendogramm erstellt, welches ausschließlich TLDA-Analysen von HL-

Fällen und -Zelllinien beinhaltet (Abbildung 13).

Dendogramm IQR_qnorm 1_5

NS

2G

CB

3G

CB

1

CD

30

+G

CB

5C

D3

0+

GC

B 4

GC

B 2

GC

B 5

CD

30

+G

CB

3C

D3

0+G

CB

1C

D3

0+G

CB

2

MC

1N

S C

D2

0+

5

MC

4N

S C

D2

0+

1N

S C

D2

0+

3N

S C

D2

0+

5N

S C

D2

0+

4M

C 2

MC

3M

C 5

NS

4N

S 3

NS

1M

C 6

NL

PH

L 3

N

LP

HL

5

NL

PH

L 4

NL

PH

L 1

NL

PH

L 2

U-H

O1

L-4

28

L-1

236

HD

LM

2

KM

-H2

SU

P-H

D1

GC

B C

LD

EV

ERGEBNISSE

52

Abb. 13: Unsupervised hirarchical clustering aller HL-Proben. Gezeigt sind 6 MC, 4 NS, 5 CD20+ NS, 5 LP und 7 HL-Zelllinien. Das Clustering basiert auf 200 miRNAs mit variabelster Expression. Die verschiedenen Zelltypen sind farbcodiert: Blau: NS, Gelb: MC, Rot: CD20

+ NS, Dunkelgrün: NLPHL,

Pink: HL-Zelllinien, Grau: NLPHL-Linie DEV. Die Daten wurden SF-normalisiert und in Genespring GX

analysiert.

Auch in dieser Analyse wird die bereits im vorherigen Dendogramm beobachtete

gemeinsame Gruppierung der MC- und CD20+ NS- sowie der LP- und NS-Fälle

deutlich. Allerdings liegen 4 der 5 CD20+ NS-Fälle in einem separaten Unterarm der

MC/CD20+ NS- Gruppe, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei um eine

eigenständige Subentität des HL handeln könnte. Wieder gruppieren sich sowohl ein

MC- als auch ein NS-Fall entgegengesetzt dieser Gliederung, wobei es sich um die

gleichen Fälle handelt, die auch in der ersten Analyse diese Besonderheit zeigten;

NS4 integriert sich in den MC/CD20+ NS- Arm und MC6 in den NS-NLPHL-Arm. Die

HL-Zelllinien bilden interessanterweise erneut einen separaten Arm im Dendogramm,

was darauf hindeutet, dass sie sich bezüglich ihrer differentiellen miRNA-Expression

deutlich von den Primärfällen unterscheiden. Die NLPHL-Linie DEV integriert sich

jedoch nicht in diesen; sie steht abseits aller anderen Linien und auch der

Primärfälle.

Die differentielle Expression von miRNAs in HL-Proben und GC-B-Proben

beschränkt sich allerdings auf eine geringe Anzahl von Genen. Der Durchschnitt der

detektierten miRNAs pro analysierter Probe belief sich auf ca. 120 -160 Gene. Durch

die Einengung der Clustering-Analysen auf die 200 mit höchster Variabilität

ausgeprägten miRNAs werden die in keiner Probe exprimierten miRNAs

herausgefiltert, es verbleiben jedoch immer noch solche, die z.B. nur in 1-2 Proben

All HL + lines 200 genes

ERGEBNISSE

53

innerhalb einer Subgruppe ausgeprägt werden. Dies kann zu einer Verzerrung, bzw.

Instabilität des Clusters führen. Durch paarweise Vergleiche einzelner Gruppen

sollten die miRNAs identifiziert werden, die tatsächlich durchgehend differentiell

exprimiert werden.

3.2.2 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen und HRS-, bzw.

LP-Zellen

Zunächst wurde die differentielle miRNA-Ausprägung in HL-Fällen und GC-B-Zellen

verglichen. Die verwendeten Genlisten wurden mittels der Software R erstellt und

anschließend zur Analyse der SF- nomalisierten TLDA-Daten in Genespring GX

verwendet, um grafische Darstellungen in Form von Heatmaps zu erhalten.

Tabellarische Übersichten beziehen sich auf in R erstellte Datensätze, die durch eine

quantile Normalisierung angeglichen wurden. Für beide Darstellungsarten wurden die

miRNAs analysiert, für deren Regulation in R ein p-Wert kleiner 0,05 und ein Fold

Change >2 (numerischer Wert der die Stärke der Regulation anzeigt, FC) errechnet

wurde. Ausnahmen von dieser Regel, die nur in sehr seltenen Fällen gemacht

wurden (z.B. falls die Signifikanz eines Wertes durch einen einzigen stark

abweichenden Expressionswert innerhalb einer Subgruppe beeinträchtigt wurde)

werden innerhalb der Tabellen gekennzeichnet. Alle Analysen in R wurden mit

Unterstützung von Frau Dr. Claudia Döring (Senckenberg’sches Institut für

Pathologie, Universitätsklinikum Frankfurt) durchgeführt.

Abbildung 14 zeigt eine Heatmap der 35 in GC-B-Zellen und HL-Proben differentiell

regulierten miRNAs.

ERGEBNISSE

54

Abb. 14: Heatmap der differentiell ausgeprägten miRNAs in GC-B-Zellen und HL-Primärfällen. Gezeigt werden SF-modifizierte lineare Kehrwerte der in der qPCR erhaltenen Ct-Werte, die auf den Median des jeweiligen Gens normalisiert wurden. Die Ct-Werte werden linearisiert, weil die Genespring Software keine logarithmischen Daten verarbeiten kann. Kehrwerte werden verwendet, weil ein niedriger Ct-Wert einer hohen Expression der jeweiligen miRNA entspricht und umgekehrt. Rot zeigt eine hohe Expression der jeweiligen miRNA, grün eine niedrige Expression.

In dieser Analyse zeigte sich, dass die miRNA-Ausprägung sowohl zwischen den

unterschiedlichen HL-Subtypen als auch innerhalb der verschiedenen Fälle einer

Subgruppe sehr heterogen ist. Nur selten ist eine miRNA in allen HL-Proben im

Vergleich zu den GC-B-Zellen konsistent herauf- oder herabreguliert. Ein Beispiel

hierfür ist miR-28, die in allen HL-Fällen herabreguliert ist. MiR-490, -148a und -423

hingegen sind in CD20+ NS, LP und MC schwach ausgeprägt; 4 der 5 NS-Fälle

zeigen jedoch eine Expression dieser miRNAs vergleichbar mit der in GC-B-Zellen.

Konsistent im HL heraufreguliert sind die miRNAs -146b und -24, wobei die

Regulation in 2 der 4 NS-cHL-Fällen sehr gering ist.

All HL vs. GCB (genliste CD)

hsa-miR-28- 4373067

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.2

1.5

2.0

2.5

3.0

4.0

5.0

Trust

ERGEBNISSE

55

Innerhalb dieser Heatmap zeigt sich erneut, das sich die CD20+ NS-Fälle deutlich

von den anderen Subgruppen abgrenzen; viele der in MC, NS und LP

heraufregulierten miRNAs werden in diesem Subtyp nur teilweise, schwach oder gar

nicht ausgeprägt. Die miRNAs -155, -516-5p, -488 und -513 werden vor allem in

CD20+ NS- und MC-Fällen stark ausgeprägt, während sie in GC-B-Zellen und

anderen HL-Subtypen im Vergleich nur schwach exprimiert werden. Trotz der

heterogenen differentiellen miRNA-Ausprägung im HL konnte eine spezifische

„miRNA-Signatur“ ermittelt werden, die alle HL, sowohl Zelllinien als auch cHL- und

NLPHL-Fälle, von GC-B-Zellen unterscheidet. Diese wird in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Differentielle miRNA-Expression im HL. Gezeigt werden FC-Werte bezogen auf die GC-B-Zell-Referenzproben (GCB) sowie die Richtung der Regulation im cHL, im NLPHL und in HL-Zelllinien. Alle p-Werte für die FC lagen im signifikanten Bereich < 0,05.

Signatur HL Regulation FC HL/GCB FC NLPHL/GCB FC HL-Linien/GCB

hsa-miR-28 ↓ -94,30 -169,22 -93,86

hsa-miR-15b ↓ -4,06 -5,14 -2,29

hsa-miR-24 ↑ 5,67 7,15 4,40

hsa-miR-155 ↑ 11,39 3,48 7,57

hsa-miR-146b ↑ 19,59 18,31 10,52

hsa-miR-100 ↑ 377,29 1474,45 71,61

Neben diesen 6 in allen HL-Fällen signifikant regulierten miRNAs wurden noch 19

weitere Gene bestimmt, die in mehr als einer HL-Subgruppe im Vergleich zu GC-B-

Zellen stark reguliert sind. Eine Übersicht dieser miRNAs (FC > 2, p-Wert < 0,05) gibt

Tabelle 2.

Tabelle 2: Differentielle miRNA-Expression im HL. Gezeigt werden FC-Werte der einzelnen HL-Subgruppen bezogen auf die GCB sowie die Richtung der Regulation im HL. * p-Wert > 0,05.

miRNA FC NS/GCB FC CD20+ NS/GCB FC MC/GCB FC NLPHL/GCB Regulation

hsa-miR-490

-5241,22 -1434,24

↓

RNU6B

-232,56 -464,21

↓

hsa-miR-148a

-588,24 -353,92

↓

hsa-miR-15a -3,77 -302,46 -31,20

↓

hsa-miR-296

-30,11 -28,39 ↓

hsa-miR-594

-393,97 -29,71 -15,38 ↓

hsa-miR-16

-4,54 -3,58 -2,91 ↓

hsa-miR-25

-3,14 -4,22 ↓

hsa-miR-301 -3,58 -1264,80

↓

ERGEBNISSE

56

miRNA FC NS/GCB FC CD20+ NS/GCB FC MC/GCB FC NLPHL/GCB Regulation

hsa-miR-146a

5,23 2,37 8,89 ↑

hsa-miR-29c

4,78 5,56 4,56 ↑

hsa-miR-155 8,99 23,14 22,03 3,48 ↑

hsa-miR-513

81,14 82,51

↑

hsa-miR-99a 5757,49

108,26 795,55 ↑

hsa-miR-125b 627,84

127,24 182,31 ↑

hsa-miR-125a 323,59

261,31

↑

hsa-miR-100 5290,32 417,59 303,24 1474,45 ↑

hsa-miR-126

637,37 398,37 ↑

hsa-miR-516-5p

52950,04 11292,42

↑

Diese Analyse zeigt, dass neben der allgemeinen HL-miRNA-Signatur, die sämtliche

HL von GC-B-Zellen unterscheidet und die miRNAs -28, -15b, -24, -155, -146b und

-100 umfasst, in jeder HL-Subgruppe noch weitere miRNAs differentiell exprimiert

werden. Zum Teil werden diese innerhalb mehrerer Subgruppen reguliert; manche

sind jedoch spezifisch in nur einem HL-Subtyp herauf- bzw. herabreguliert. In den

CD20+ NS- und MC-cHL-Fällen konnte eine starke Herabregulation für die von

Applied Biosystems als Referenzgen empfohlene RNU6B beobachtet werden

(FC alle HL zu GC-B-Zellen -182,33). Dieser Befund erklärt, warum präliminäre

vergleichende Analysen der generierten miRNA-Expressionsprofile, die mittels

Normalisierung auf die Referenzgene RNU44, RNU48 und RNU6B durchgeführt

wurden (hier nicht gezeigt), keine klaren Ergebnisse lieferten. RNU44 und RNU48

wurden ebenfalls sowohl zwischen verschiedenen HL-Subtypen als auch zwischen

HL- und GC-B-Zell-Proben als reguliert bestimmt; da die FCs im Allgemeinen jedoch

um +/- 1,5 lagen werden sie in den tabellarischen Übersichten, die nur FCs > 2

beinhalten, größtenteils nicht aufgelistet. Die Signifikanz ihrer Regulation wurde

jedoch durchweg durch einen p-Wert <0,05 bestätigt. Aufgrund dessen wurden alle

Analysen innerhalb dieser Studie mit einer verlässlicheren quantilen oder SF-

Normalisierung durchgeführt.

Die tabellarische Übersicht bestätigt die in der oben gezeigten Heatmap bildlich

dargestellte Heterogenität der miRNA-Ausprägung der verschiedenen HL-Fälle. Zum

einen werden einige miRNAs in manchen Subtypen gar nicht, in anderen jedoch sehr

stark reguliert; Beispiele hierfür sind miR-490 und miR-516-5p, die in CD20+ NS- und

MC-HL eine sehr starke Regulation zeigen, in allen anderen Subtypen jedoch keine.

Zum anderen variiert auch die Stärke der Regulation unter den Subgruppen

ERGEBNISSE

57

beträchtlich; so wurden z.B. für miR-99a FC-Werte ermittelt, die sich innerhalb der

HL-Subgruppen NS, MC und NLPHL um den Faktor 7 (MC und NLPHL) bzw.

Faktor 35 (MC und NS) unterscheiden. Gleichbleibend in allen HL-Fällen ist jedoch

die Richtung der miRNA-Regulation gegenüber den GC-B-Zellen, die ohne

Ausnahme konsistent ist.

Neben der Frage, welche Gemeinsamkeiten die HL-Fälle bezüglich ihrer zu GC-B-

Zellen differentiellen miRNA-Expression zeigen, ist es ebenso von Interesse, die

Gene zu bestimmen, die nur in jeweils einer der Subgruppen reguliert werden. Auf

diese Weise können miRNA-Signaturen ermittelt werden, die spezifisch für

verschiedene Subentitäten des HL sind (s. Tabelle 3).

Tabelle 3: HL-Subtyp-spezifische miRNA-Regulation. Gezeigt signifikante werden Fold Change-(FC) Werte der einzelnen HL-Subgruppen (FC >2, p <0,05) bezogen auf die GC-B-Zell-Referenzproben (GCB) sowie die Richtung der Regulation.

NS Signatur FC zu GCB Regulation NS CD20+ Signatur FC zu GCB Regulation

hsa-miR-20b -16,02 ↓ hsa-miR-324-5p -988,24 ↓

hsa-miR-151 -4,15 ↓ hsa-miR-142-3p -5,21 ↓

hsa-miR-186 3,25 ↑

hsa-miR-517 393,27 ↑

hsa-miR-135b 411,28 ↑

MC Signatur FC zu GCB Regulation NLPHL Signatur FC zu GCB Regulation

hsa-miR-19b -5,70 ↓ hsa-let-7d -8,04 ↓

hsa-miR-18a -2,40 ↓ hsa-miR-106b -3,24 ↓

hsa-miR-345 2,20 ↑ hsa-miR-200c 5,29 ↑

hsa-miR-544 7,17 ↑ hsa-miR-199a 47,47 ↑

hsa-miR-95 32,12 ↑ hsa-miR-31 93,74 ↑

hsa-miR-488 38,87 ↑ hsa-miR-224 237,99 ↑

Aus dieser Tabelle wird ersichtlich, dass nur eine geringe Anzahl von miRNAs

spezifisch für einzelne HL-Subtypen ist. Für das NS-cHL konnte keine miRNA

bestimmt werden, deren differentielle Heraufregulation ausschließlich in diesem

Subtyp gefunden wurde, jedoch sind miR-20b und -151 signifikant (FC >2, p <0,05)

herabreguliert. In den drei anderen Subtypen sind jeweils 2 miRNAs spezifisch

herab- und 4 (MC und NLPHL) bzw. 3 (NS CD20+) heraufreguliert.

ERGEBNISSE

58

3.2.3 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen und HL-

Zelllinien

Interessanterweise sind nur 18 der 35 miRNAs, die in HL-Fällen differentiell zu GC-B-

Zellen exprimiert werden (s. Abb.15), auch in den HL-Zelllinien reguliert (siehe unten,

Tabelle 4). Für einige miRNAs sind außerdem starke Abweichungen der FC-Werte

im Vergleich zu den Primärfällen zu beobachten; so liegt z.B. der FC für miR-100 in

den HL-Linien bei 71,61, während er in den HL-Fällen um ein vielfaches höher ist.

MiR-223 hingegen ist ausschließlich in HL-Zelllinien herabreguliert (FC -372,71)

während sich im NLPHL eine positive Regulation findet (FC 5,32). Die differentielle

miRNA-Expression in HL-Zelllinien im Vergleich zu GC-B-Zellen weicht also

signifikant von der in Primärfällen ab, was die Ergebnisse der globalen unsupervised

Clustering-Analysen, in denen die HL-Linien als eigene Subentität gruppiert sind,

bestätigt.

Tabelle 4: Vergleich der differentiellen miRNA-Expression in HL-Zelllinien und Primärfällen. Gezeigt werden FC-Werte der HL-Linien und HL-Fälle bezogen auf die GC-B-Zell-Referenzproben, sowie die Richtung der Regulation in den HL-Linien. Alle FC beziehen sich auf die Expression der jeweiligen miRNA in GC-B-Zell Referenzproben. Für alle FC Werte wurde ein p-Wert < 0,05 bestimmt.

miRNA FC HL-Linien FC NS FC CD20+ NS FC MC FC NLPHL Regulation

hsa-miR-223 -372,71

5,32 ↓

hsa-miR-28 -93,86 -59,94 -314,50 -94,76 -169,22 ↓

hsa-miR-490 -81,35

-5241,22 -1434,24

↓

hsa-miR-148a -31,09

-588,24 -353,92

↓

hsa-miR-15a -15,77 -3,77 -302,46 -31,20

↓

hsa-miR-645 -13,25

-79,32

↓

hsa-miR-26a -4,95

2,50 ↓

hsa-miR-16 -3,85

-4,54 -3,58 -2,91 ↓

hsa-miR-331 -2,97

-4,11 ↓

hsa-miR-15b -2,29 -6,30 -8,55 -5,63 -5,14 ↓

hsa-miR-99a 106,50 5757,49

108,26 795,55 ↑

hsa-miR-100 71,61 5290,32 417,59 303,24 1474,45 ↑

hsa-miR-504 54,90

25,80

↑

hsa-miR-125b 48,94 627,84

127,24 182,31 ↑

hsa-miR-146b 10,52 34,53 55,96 32,91 18,31 ↑

hsa-miR-155 7,57 8,99 23,14 22,03 3,48 ↑

hsa-miR-24 4,40

10,33 8,53 7,15 ↑

hsa-miR-330 3,68 23,86 ↑

Des Weiteren werden 16 miRNAs ausschließlich in HL-Zelllinien signifikant reguliert

(FC >2, p-Wert <0,05), davon sind 7 herab- und 9 heraufreguliert. Einen Überblick

über diese Zelllinien-spezifischen miRNAs gibt Tabelle 5.

ERGEBNISSE

59

Tabelle 5. Spezifische miRNA-Regulation in HL-Zelllinien. Gezeigt werden FC-Werte der HL-Linien bezogen auf die GC-B-Zell-Referenzproben, korrespondierende p-Werte sowie die Richtung der Regulation.

miRNA FC p-Wert Regulation miRNA FC p-Wert Regulation

hsa-miR-371 -108,96 0,005 ↓ hsa-miR-193a 198,65 0,000 ↑

hsa-miR-133b -19,73 0,017 ↓ hsa-miR-449 77,32 0,003 ↑

hsa-miR-485-3p -19,09 0,018 ↓ hsa-miR-196a 57,45 0,032 ↑

hsa-miR-597 -4,84 0,024 ↓ hsa-miR-505 36,84 0,035 ↑

hsa-miR-197 -3,35 0,007 ↓ hsa-miR-193b 24,54 0,011 ↑

hsa-miR-423 -2,87 0,001 ↓ hsa-miR-422b 14,36 0,041 ↑

hsa-miR-26b -2,15 0,010 ↓ hsa-miR-183 8,81 0,032 ↑

hsa-miR-365 7,80 0,003 ↑

hsa-miR-148b 4,93 0,037 ↑

Eine besonders starke Herabregulation in den HL-Zelllinien zeigte die miRNA-

371(FC -108,96), stark heraufreguliert hingegen sind miR-193a, -449, -196a, -505

und -193b (FC > 20).

3.2.4 Differentielle miRNA-Ausprägung in HL-Subtypen

Vor dem Hintergrund der heterogenen miRNA-Expression innerhalb der primären

HL-Fälle war es ebenfalls von Interesse, die miRNAs zu bestimmen, welche einen

definierten HL-Subtyp von einem anderen unterscheiden, ohne innerhalb der

Analysen Bezug auf die differentielle miRNA-Ausprägung im Vergleich zu GC-B-

Zellen zu nehmen. Hierzu wurden aus paarweisen Vergleichen unterschiedlicher HL-

Subtypen Genlisten in R erstellt. Für grafische Darstellungen wurden SF-

normalisierte Daten mit Genespring GX mittels dieser Genlisten analysiert und als

Heatmaps dargestellt.

3.2.4.1 Differentielle miRNA-Expression im cHL und NLPHL

In Kapitel 3.2.2 wurde bereits gezeigt, dass sich die spezifischen miRNA-Signaturen

von HL und NLPHL (bezogen auf ihre Regulation gegenüber GC-B-Zellen)

unterscheiden. So werden z.B. in NLPHL-Fällen insgesamt 27 miRNAs differentiell

ausgeprägt, während es in CD20+ NS- und NS-cHL-Fällen nur 14 bzw. 9 miRNAs

sind. Aus diesem Grund wurde ein direkter Vergleich der miRNA-Ausprägung in LP-

und HRS-Zellen durchgeführt. Dieser ergab, dass sich LP- und HRS-Zellen in der

Expression 36 verschiedener miRNAs signifikant (FC > 2, p-Wert < 0,05)

unterscheiden. Obwohl die p-Werte durchweg die Signifikanz der Ergebnisse

indizierten, wurde auch in dieser Analyse eine hohe Heterogenität der miRNA-

ERGEBNISSE

60

Expression innerhalb der cHL-Fälle beobachtet; so konnte nur für 3 im LP

heraufregulierte miRNAs (miR-141, -200c und -375) eine durchgängig niedrige

Ausprägung in allen cHL-Fällen gefunden werden. Keine der miRNAs, die in LP-

Zellen nur schwach ausgeprägt werden, wurde durchgehend in allen HRS-Zell-

Proben stark exprimiert; dies liegt vor allem daran, dass die NS-cHL-Fälle die

meisten dieser miRNAs ebenfalls nur schwach ausprägen, was ihre im unsupervised

clustering der HL-Proben beobachtete teilweise Gruppierung unter die NLPHL-Fälle

bestätigt. Ein Beispiel für diesen Effekt gibt der in Abbildung 15 dargestellte

Ausschnitt einer Heatmap, in der die unterschiedliche miRNA-Expression in HL- und

NLPHL-Fällen analysiert wurde. Hier ist deutlich zu erkennen, dass miR-488, -513, -

505 und -155 sowohl im NLPHL als auch im NS-HL schwach exprimiert werden,

wohingegen ihre Ausprägung im MC und CD20+ NS größtenteils höher ist.

Abb. 15: Inkonsistente miRNA-Ausprägung innerhalb der cHL-Fälle im Vergleich zum NLPHL. Gezeigt werden SF-modifizierte lineare Kehrwerte der in der qPCR erhaltenen Ct-Werte, die auf den Median des jeweiligen Gens normalisiert wurden. Die Ct-Werte werden linearisiert weil die Genespring Software keine logarithmischen Daten verarbeiten kann. Kehrwerte werden verwendet, weil ein niedriger Ct-Wert einer hohen Expression der jeweiligen miRNA entspricht und umgekehrt. Rot zeigt eine hohe Expression der jeweiligen miRNA, grün eine niedrige Expression.

Aufgrund dessen wurden separate paarweise Vergleiche für NLPHL-Fälle sowohl

gegen NS- als auch gegen MC-cHL-Fälle generiert und der vorangegangenen

Analyse (alle cHL gegen NLPHL) gegenübergestellt. Es zeigte sich, dass die im

Vergleich zwischen cHL und NLPHL als differentiell exprimiert bestimmten miRNAs

nicht durchgängig auch in den paarweisen Vergleichen einzelner HL-Subgruppen mit

dem NLPHL als signifikant reguliert gefunden wurden (nur 17 von 35 miRNAs).

Zudem sind die betreffenden miRNAs im NLPHL meist nur im Vergleich zu einer der

beiden analysierten HL-Subgruppen (NS oder MC) reguliert. Einen Überblick über die

Ergebnisse dieser Analyse gibt Tabelle 6.

ERGEBNISSE

61

Tabelle 6: Differentielle miRNA-Expression im NLPHL im Vergleich zu den cHL-Sbtypen NS und MC. Gegeben sind der FC im NLPHL verglichen mit allen cHL-Fällen und dessen p-Wert, sowie die

FCs der Vergleiche NLPHL zu NS-cHL, bzw. MC-cHL.

miRNA FC NLPHL/cHL p-Wert Regulation FC NLPHL/NS FC NLPHL/ MC

hsa-miR-141 100,34 0,004 ↑ 545,43 545,43

hsa-miR-200c 53,56 0,000 ↑ 303,89 44,74

hsa-miR-375 44,88 0,018 ↑ 190,04 -

hsa-miR-126 30,68 0,000 ↑ - 27,14

hsa-miR-31 29,65 0,001 ↑ - 45,49

hsa-miR-224 25,20 0,020 ↑ - 83,22

hsa-miR-30e-5p 14,63 0,02 ↑ 1451,78 -

hsa-miR-146a 3,54 0,015 ↑ 4,06 3,74

hsa-miR-26b 2,07 0,020 ↑ - 2,87

hsa-miR-106b -1,92 0,027 ↓ - -2,93

hsa-miR-155 -2,70 0,018 ↓ - -6,33

hsa-miR-362 -10,40 0,006 ↓ - -25,54

hsa-miR-513 -12,68 0,003 ↓ - -82,51

hsa-miR-488 -16,87 0,001 ↓ - -38,87

hsa-miR-504 -19,83 0,001 ↓ - -20,95

hsa-miR-324-5p -33,75 0,015 ↓ - -80,52

hsa-miR-516-5p -612,08 0,001 ↓ - -11292,42

Nur 5 der 17 gezeigten miRNAs sind im NLPHL im Vergleich zum NS-cHL

heraufreguliert; eine Herabregulation von miRNAs konnte hier nicht gezeigt werden.

Im Vergleich zum MC-cHL werden im NLPHL 15 miRNAs differentiell ausgeprägt,

davon sind 7 herauf- und 8 herabreguliert. Nur 3 miRNAs sind in LP-Zellen im

Vergleich zu beiden cHL-Subgruppen heraufreguliert; miR-146a ist dabei eher

moderat reguliert (FC zu NS 4,06, FC zu MC 3,74) während miR-141 eine sehr

starke Expression im NLPHL zeigt (FC zu NS und MC 545,34). Der identische FC

kommt dadurch zustande, dass miR-141 im NS und MC nicht detektiert wurde. in

CD20+ NS-Fällen wurde keine Expression von miR-141 nachgewiesen; daher kann

die Ausprägung dieser miRNA als spezifisch für das NLPHL angesehen werden.

Dies wird auch dadurch bestätigt, das miR-141in der NLPHL-Zelllinie DEV ebenfalls

stark exprimiert wird, während sie in den anderen HL-Linien nicht detektiert werden

konnte. In GC-B-Zellen und CD30+ GC-B-Zellen wird miR-141 ebenfalls nur schwach

oder gar nicht ausgeprägt. MiR-200c wurde ebenfalls als im NLPHL stark

heraufreguliert gefunden (FC zu NS 303,89, FC zu MC 44,74); in allen anderen

Subgruppen, sowie in GC-B-Zellen und CD30+ GC-B-Zellen, ist ihre Ausprägung

deutlich geringer, so dass auch diese miRNA als NLPHL-spezifisch betrachtet

werden kann.

ERGEBNISSE

62

Zusammengefasst zeigen diese Analysen, dass die HL-Untergruppen cHL und

NLPHL anhand der differentiellen Expression von 17 miRNAs unterschieden werden

können. Des Weiteren wurde gezeigt, dass eine hohe Expression von miR-141 und

miR-200c kennzeichnend für das NLPHL ist.

3.2.4.2 Differentielle miRNA-Expression im NS-, NS CD20+- und MC-cHL

Vor dem Hintergrund der inkonsistenten miRNA-Ausprägung innerhalb der

verschiedenen cHL-Typen schien es angebracht, nicht nur HL- und NLPHL-Fälle

einem direkten Vergleich zu unterziehen, sondern auch die verschiedenen cHL-

Subtypen miteinander zu vergleichen. Auf diese Weise sollten auch hier die miRNAs

identifiziert werden, mittels derer sich cHL-Subgruppen voneinander unterscheiden

lassen. Zunächst wurde die differentielle miRNA-Ausprägung zwischen NS- und MC-

cHL-Fällen mittels der Software R bestimmt. Der paarweise Vergleich der

Expressionsanalysen ergab, dass die beiden Subtypen in der Ausprägung von 14

miRNAs signifikant voneinander abweichen (FC >2, p-Wert <0,05), wobei 6 dieser

miRNAs im NS-cHL herabreguliert und 8 heraufreguliert sind. Eine Übersicht der

Ergebnisse gibt Tabelle 7.

Tabelle 7: Differentielle miRNA-Expression in NS- und MC-cHL-Fällen. Gegeben ist der FC im NS-cHL bezogen auf die Expressionswerte im MC-cHL, der korrespondierende p-Wert sowie die Richtung der Regulation im NS-cHL. * p-Wert > 0,05

miRNA FC NS/MC p-Wert Regulation

hsa-miR-30e-5p -1377,57 0,020 ↓

hsa-miR-516-5p* -659,49 0,106* ↓

hsa-miR-182 -53,84 0,049 ↓

hsa-miR-95 -21,20 0,018 ↓

hsa-miR-134 -9,32 0,029 ↓

hsa-miR-544 -6,89 0,028 ↓

hsa-miR-26b 2,71 0,007 ↑

hsa-let-7b 2,93 0,049 ↑

hsa-miR-125b 5,44 0,001 ↑

hsa-miR-296 58,22 0,020 ↑

hsa-let-7c 64,00 0,018 ↑

hsa-miR-99a 66,61 0,005 ↑

hsa-let-7a 87,24 0,015 ↑

RNU6B 182,33 0,014 ↑

Besonders stark herabreguliert im NS sind die miRNAs -30e-5p und -516-5p mit FCs

von -1377,57 bzw. -659,49. Im Falle der miRNA -516-5p indiziert der angegeben p-

Wert keine Signifikanz (p > 0,05); dies liegt jedoch darin begründet, dass einer der

ERGEBNISSE

63

NS-Fälle diese miRNA stark exprimiert, während sie in allen anderen NS-Proben

nicht detektiert werden konnte. Es handelt sich hierbei um den Fall NS4, der sich

bereits in den unsupervised clustering-Analysen in den CD20+ NS- und MC-Arm des

Dendogramms integrierte (s. Kapitel 3.2.1). Daher wird trotz des hohen p-Wertes die

Regulation von miR-516-5p zwischen den beiden Subgruppen als gegeben

angenommen. MiR-182 ist im Vergleich NS-/MC-cHL ebenfalls stark herabreguliert;

da auch NLPHL- und CD20+ NS-Proben nur eine schwache Expression dieser

miRNA zeigten, kann ihre starke Ausprägung als spezifisch für das MC-cHL

betrachtet werden.

In den unsupervised clustering-Analysen wurde gezeigt, dass sich entgegen ihrer

morphologischen Verwandschaft NS- und CD20+ NS-cHL-Fälle unter verschiedene

Arme des Dendogramms gruppierten. CD20 ist ein B-Zell-Marker, der in HRS-Zellen,

die üblicherweise ihren B-Zell-Phänotyp verloren haben, nur selten ausgeprägt wird

(Schmid et al., 1991). Vor diesem Hintergrund war es von Interesse, die miRNA-

Expression dieser beiden Subtypen ebenfalls einem paarweisen Vergleich zu

unterziehen. Die Ergebnisse dieser Analysen werden in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 8: Differentielle miRNA-Expression in NS- und CD20+ NS-cHL-Fällen. Gegeben ist der FC

im NS-cHL bezogen auf die Expressionswerte im CD20+ NS-cHL, der korrespondierende p-Wert

sowie die Richtung der Regulation im NS-cHL. *p-Wert > 0,05

miRNA FC NS/CD20+NS p-Wert Regulation

hsa-miR-516-5p* -3380,09 0,062* ↓

hsa-miR-30e-5p -2138,87 0,016 ↓

hsa-miR-181b -1209,07 0,048 ↓

hsa-miR-9 -161,06 0,025 ↓

hsa-miR-513 -33,43 0,040 ↓

hsa-miR-134 -13,45 0,047 ↓

hsa-miR-186 -2,78 0,048 ↓

hsa-miR-146a -2,28 0,018 ↓

hsa-miR-16 2,41 0,048 ↑

hsa-miR-103 50,71 0,036 ↑

hsa-miR-148a 67,71 0,034 ↑

hsa-miR-15a 68,64 0,022 ↑

RNU6B 100,04 0,048 ↑

hsa-let-7c 144,57 0,012 ↑

hsa-miR-301 304,06 0,001 ↑

hsa-miR-99a 314,98 0,028 ↑

hsa-miR-324-5p 573,85 0,000 ↑

hsa-let-7a 581,92 0,001 ↑

hsa-miR-93 600,52 0,046 ↑

ERGEBNISSE

64

Im Vergleich zu CD20+ NS-Fällen wurden in den NS-Fällen 19 miRNAs differentiell

exprimiert; davon sind 8 herab- und 11 heraufreguliert. Auffällig sind die besonders

hohen FC-Werte: für 11 der miRNAs wurde ein +/- FC größer 100 bestimmt. Wie im

Vergleich NS/MC sind auch hier die miRNAs -516-5p und -30e-5p am stärksten

herabreguliert; da miR-30e-5p auch im NLPHL hoch exprimiert ist (s. Tabelle 4) kann

das Fehlen ihrer Ausprägung als spezifisch für den HL-Subtyp NS-cHL betrachtet

werden.

Innerhalb der unsupervised clustering-Analysen aller Proben bildeten MC- und

CD20+ NS-cHL-Fälle eine eigene Subgruppe. Der paarweise Vergleich dieser HL-

Subtypen zeigt, dass sie sich nur in der Expression weniger signifikant miRNAs

unterscheiden (Tabelle 9).

Tabelle 9: Differentielle miRNA-Expression in CD20+ NS- und MC-cHL-Fällen. Gegeben ist der FC

im CD20+ NS-cHL bezogen auf die Expressionswerte im MC-cHL, der korrespondierende p-Wert

sowie die Richtung der Regulation im NS-cHL.

miRNA FC CD20+ NS/MC p-Wert Regulation

hsa-miR-324-5p -568,74 0,00001 ↓

hsa-miR-301 -157,50 0,00552 ↓

hsa-miR-330 -23,86 0,01422 ↓

hsa-miR-146a 2,14 0,04813 ↑

hsa-miR-30e-3p 4,54 0,02142 ↑

hsa-miR-618 22,95 0,04063 ↑

Insgesamt ist die differentielle miRNA-Expression zwischen CD20+ NS- und MC-

Fällen weniger ausgeprägt als zwischen anderen Subtypen; nur 6 miRNAs werden

hier unterschiedlich exprimiert. Dies bestätigt die in unsupervised clustering und PCA

gezeigte Verwandtschaft der beiden Subgruppen. Hochsignifikant ist die

Herabregulation der miRNAs -324-5p und -301 in den CD20+ NS-Fällen (FC -568,47

und -157,5), es wurden jedoch auch 3 heraufregulierte miRNAs bestimmt (miR-618,

miR-30e-5p und miR-146a).

Zusammengefasst zeigen die in diesem Kapitel vorgestellten Analysen, dass die

unterschiedlichen HL-Subgruppen nicht nur anhand ihrer differentiellen miRNA-

Ausprägung im Vergleich zu GC-B-Zellen unterschieden werden können, sondern

das auch eine Regulation von miRNAs zwischen den einzelnen Subentitäten

nachweisbar ist.

ERGEBNISSE

65

3.2.5 Verwandtschaft von GC-B-Zellen, CD30+ GC-B-Zellen und HL-

Tumorzellen

Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob die CD30-exprimierende

Subpopulation der GC-B-Zellen möglicherweise eine engere Verwandtschaft zu den

ebenfalls CD30 ausprägenden HRS-Zellen aufweist als GC-B-Zellen im Allgemeinen.

Um diese Frage zu klären, wurde zunächst eine unsupervised PCA über die 200 mit

höchster Variabilität exprimierten miRNAs aller SF-normalisierten TLDA-Datensätze

durchgeführt (Abb. 16).

Abb. 16: PCA aller untersuchten Zelltypen über die 200 am variabelsten ausgeprägten miRNAs. Die Lage im Koordinatensystem reflektiert die Ähnlichkeit der Populationen, definiert durch einen möglichst hohen Anteil der Gesamtvarianz (1. und 2. prinzipielle Komponente (PC), Varianzanteil in Klammern, siehe Achsenbeschriftung.)

Die PCA zeigt, dass CD30+ GC-B-Zellen eine engere Verwandtschaft zu GC-B-

Zellen aufweisen als zu den HL-Primärfällen. Wie schon in den unsupervised

clusterings (s. Kap. 3.2.1) ist auch hier eine Assoziation zwischen MC- und CD20+

NS-Fällen zu beobachten. NLPHL- und NS-Fälle liegen ebenfalls nah beieinander

und grenzen sich klar von der MC/CD20+ NS-Subgruppe ab. Auffällig ist, dass die

HL-Zelllinien näher an den CD30+ GC-B-Zellen liegen als an den Primärfällen. Vor

diesem Hintergrund sollte geklärt werden, welche Gemeinsamkeiten die HL-Linien

Alle proben 200 gene

GCB

CD30+ GCB

CD20+ NS

NS

NLPHL

MC

HL-Zelllinien

PC 1 (33,19% Varianz)

PC

2 (

22,3

9 %

Var

ian

z)

ERGEBNISSE

66

bzw. Primärfälle mit CD30+ GC-B-Zellen in ihrer differentiellen miRNA-Expression,

bezogen auf GC-B-Zellen, aufweisen.

Hierzu wurde zunächst die differentielle miRNA-Expression von CD30+ GC-B-Zellen

zu GC-B-Zellen durch den paarweisen Vergleich beider Gruppen bestimmt.

Abbildung 17 zeigt eine Heatmap der differentiellen miRNA Expression in CD30+ GC-

B-Zellen und GC-B-Zellen.

Die Analyse zeigt, dass die Expression von 15 miRNAs in CD30+ GC-B-Zellen von

der in GC-B-Zellen abweicht, davon sind 5 herauf- und 10 herabreguliert. Um zu

überprüfen, ob CD30+ GC-B-Zellen Gemeinsamkeiten bezüglich ihrer differentiellen

miRNA-Expression mit den HL-Subtypen aufweisen, wurden beide Gruppen

miteinander verglichen. Es zeigte sich, das einige der im HL regulierten miRNAs

auch in CD30+ GC-B-Zellen differentiell im Vergleich zu GC-B-Zellen exprimiert

werden. Die Ergebnisse dieser vergleichenden Analyse werden in Tabelle 10

dargestellt.

GCB

4

GCB

1

GCB

2

GCB

5

GCB

3

CD30

+ G

CB1

CD30

+ G

CB2

CD30

+ G

CB3

CD30

+ G

CB4

CD30

+ G

CB5

Abb. 17: Heatmap der differentiellen miRNA-Expression in CD30

+ GC-B-

Zellen und GC-B-Zellen. Die Spalten bezeichnen die jeweiligen Proben, Zeilen die analysierten miRNAs. Rot entspricht einer hohen, Grün einer niedrigen Expression.

ERGEBNISSE

67

Tabelle 10: Übereinstimmende differentielle miRNA-Expression von CD30+ GCB-Zellen und HL-

Tumorzellen. Gegeben sind die FC von CD30+ GC-B-Zellen, NS-, CD20

+ NS-, MC-, NLPHL-Fällen

und HL-Zelllinien bezogen auf GC-B-Zell-Referenzproben.* p-Wert > 0,05

FC FC FC FC FC FC

miRNA CD30+/GCB NS/GCB CD20

+NS/GCB MC/GCB NLPHL/GCB Linien/GCB

miR-148a -144,61 -588,24 -353,92 -31,09

miR-28* -30,86* -59,94 -314,5 -94,76 -169,22 -93,86

miR-16 -6,27

-4,54 -3,58 -2,91 -3,85

miR-26a -3,65

2,50 -4,95

miR-15b -2,27 -6,30 -8,55 -5,63 -5,14 -2,29

miR-26b -2,17

-2,15

miR-146a -1,49 -0,46 5,23 2,37 8,89 miR-186 2,74

3,25

miR-155 2,95 8,99 23,14 22,03 3,48 7,57

miR-126* 95,74 477,03* 154,14* 637,37 398,37

Auffällig ist, dass unter den hier gezeigten miRNAs auch solche vertreten sind, die in

allen HL-Subgruppen als differentiell exprimiert gegenüber nicht-malignen GC-B-

Zellen bestimmt wurden (s. 3.2.2); hierzu gehören miR-15b, miR-155 und miR-28.

Die Regulation von miR-28 in CD30+ GC-B-Zellen erreichte keine statistische

Signifikanz, da sie in 2 der 5 CD30+ GC-B-Proben nicht detektiert wurde. Weil in

diesem Fall aber eine Herabregulation nachgewiesen werden sollte, und eine nicht

vorhandene Expression gegenüber einer gemessenen Expression eine solche

darstellt, wurde miR-28 in die Auswertung mit einbezogen. Auch die Regulation von

miR-126 erreichte in 2 Subgruppen (NS und CD20+ NS) keine statistische

Signifikanz; da dies aber in beiden Gruppen jeweils nur auf einen stark

abweichenden Wert eines einzelnen Falles zurückzuführen ist, wurde sie in die

tabellarische Übersicht mit einbezogen.

MiR-146a ist zwar sowohl in CD30+ GC-B-Zellen als auch in HL-Subtypen reguliert,

die Richtung der Regulation jedoch wechselt. In CD30+ GC-B-Zellen sowie NS-cHL-

Fällen ist miR-146a geringfügig herabreguliert, in den restlichen HL-Subtypen jedoch

wurde eine Heraufregulation nachgewiesen. Weitere 10 miRNAs wurden in

mindestens einem HL-Subtyp als reguliert bestimmt; eine besonders starke

Regulation wurde für miR-148a (FC < -100 in CD30+ GC-B-Zellen, CD20+ NS und

MC) und miR-126 (FC > 95 in MC und LPHL) beobachtet.

Um die offenbar bestehende Verwandtschaft der HL-Tumorzellen mit CD30+ GC-B-

Zellen weitergehend zu analysieren, wurde eine supervised PCA aller Zelltypen

mittels der aus dem Vergleich CD30+ GC-B-Zellen gegen GC-B-Zellen erhaltenen

Genliste durchgeführt (Abb. 18).

ERGEBNISSE

68

Abb. 18: Supervised PCA aller untersuchten Zelltypen anhand der zwischen GC-B- und CD30+

GC-B-Zellen differentiell ausgeprägten miRNAs (15 Gene). Gegeben sind die Durchschittswerte der einzelnen Populationen. Die Lage im Koordinatensystem reflektiert den Ähnlichkeitsgrad der Populationen, definiert durch einen möglichst hohen Anteil der Gesamtvarianz (1. und 2. prinzipielle Komponente (PC), Varianzanteil in Klammern, siehe Achsenbeschriftung.)

Auch innerhalb dieser Darstellung zeigt sich die bereits in unsupervised clusterings

und PCA vorgefundene gemeinsame Gruppierung der CD20+ NS und MC-Fälle. NS-

und NLPHL liegen hier etwas weiter auseinander als in den anderen Analysen und

unterscheiden sich innerhalb beider Komponenten (PC1 und PC2) deutlich von HL-

Zelllinien und CD30+ GC-B- Zellen. Alle HL-Subgruppen (mit Ausnahme der

Zelllinien) grenzen sich durch ihre Lokalisation im Bereich zwischen 0,3 und 0,7 der

Komponente 1 (x-Achse) deutlich von den GC-B-Zellen ab, die bei -0,6 liegen. Die

Gruppen MC/CD20+ NS und NLPHL/NS unterscheiden sich hauptsächlich durch ihre

Position auf der y-Achse (PC2), wohin gegen ihre Varianz in PC 1 gering ist.

Deutlich wird hier, dass HL-Zelllinien und CD30+ GC-B-Zellen sich in der Ausprägung

der analysierten 15 miRNAs stark ähneln; ihre eng assoziierte Lage im

Koordinatensystem indiziert eindeutig einen hohen Verwandschaftsgrad. Um diesen

noch detaillierter darstellen zu können, wurde erneut eine supervised PCA mit der

gleichen Genliste durchgeführt, die die einzelnen Proben der Subgruppen HL-

Zelllinien, CD30+ GC-B-Zellen und GC-B-Zellen darstellt (Abb. 19).

Genelist GCB vs CD30+

(PC1, 40,95 % Varianz)

(PC1

, 39,

68 %

Var

ianz

)GCB

HL-Zelllinien

CD30+ GCB

CD20+ NS

MC

NLPHL

NS

ERGEBNISSE

69

Abb. 19: Supervised PCA von HL-Zelllinien, GC-B- und CD30+ GC-B-Zellen. Die Analyse erfolgte

anhand der zwischen GC-B- und CD30+ GC-B-Zellen differentiell ausgeprägten miRNAs (15 Gene).

Die Lage im Koordinatensystem reflektiert den Ähnlichkeitsgrad der Populationen, definiert durch einen möglichst hohen Anteil der Gesamtvarianz (1. und 2. prinzipielle Komponente (PC), Varianzanteil in Klammern, siehe Achsenbeschriftung.) Die Populationen sind Farbcodiert: Grün: GC-B-Zellen, Pink: HL-Zelllinien, Türkis: CD30

+ GC-B-Zellen.

Sowohl die HL-Zelllinien als auch die CD30+ GC-B-Zellen zeigen innerhalb dieser

Analyse eine hohe Varianz in beiden Komponenten; deutlich sichtbar wird jedoch,

dass beide Gruppen sich gemeinsam von den GC-B-Zellen abgrenzen, die hier eine

getrennte Population bilden und in Komponente 1 nur eine geringfügige Varianz

aufweisen.

Zusammengefasst wurde in diesem Kapitel gezeigt, dass CD30+ GC-B-Zellen in ihrer

differentiellen miRNA-Expression (im Vergleich zu GC-B-Zellen) Übereinstimmungen

mit HL-Fällen und Zelllinien zeigen. Interessanterweise sind auch solche miRNAs

reguliert, die Bestandteil der in Kapitel 3.2.2 beschriebenen HL-spezifischen miRNA-

Signatur sind. Des Weiteren konnte durch PCA gezeigt werden, dass eine aus 15

Genen bestehende miRNA-Signatur CD30+ GC-B-Zellen von GC-B-Zellen

unterscheidet, und dass mittels dieser Signatur eine Assoziation der CD30+ GC-B-

Zellen mit den HL-Zelllinien bestimmt werden kann.

PC1 (44,23 % Varianz)

PC

2 (

14

,96

% V

aria

nz)

ERGEBNISSE

70

3.4 Mutationsanalyse des Tumorsuppressorgens CYLD im cHL

3.4.1 Hinweise auf eine Tumorsuppressorgen-Funktion von CYLD im cHL

Die konstitutive Aktivierung des NF-κB-Signalwegs ist für das Überleben von HRS-

Zellen von essentieller Bedeutung (siehe 1.4.4.4). Im cHL wird sie durch

verschiedene genetische Anomalien bedingt, unter anderem durch inaktivierende

Mutationen in Genen negativer Regulatoren des NF-κB-Signalwegs, wie IκBα, IκBε

oder A20 (Cabannes et al., 1999; Emmerich et al., 2003; Schmitz et al., 2009).

Die Funktion der Deubiquitinase Cyld als Tumorsuppressor wurde ursprünglich in der

familiären Cylindromatose verifiziert, einer Krankheit, die zur Bildung multipler,

gutartiger Geschwulste der ekkrinen oder apokrinen Zellen der Haut führt (Bignell et

al., 2000). Cyld supprimiert die TNF-Rezeptor-vermittelte Aktivierung des NF-κB-

Signalwegs durch den Abbau Lysin-63 verknüpfter Polyubiquitine am TRAF2-Protein,

wodurch die nachfolgende Aktivierung des IKK-Komplexes, die schließlich zur

Freisetzung und Translokation von NF-κB in den Nukleus führt, verhindert wird

(Trompouki et al., 2003). Homozygote CYLD-Deletionen wurden unter anderem in

Multiplen Myelomen mit deregulierter NF-κB-Aktivität nachgewiesen (Annunziata et

al., 2007; Keats et al., 2007). Auch im cHL gibt es Hinweise auf eine mögliche

genetische Inaktivierung von CYLD; so ist der kodierende Bereich des Gens auf

Chromosom 16q12-13 lokalisiert, einer Region, die im cHL rekurrent deletiert ist

(Ohshima et al., 2001). Zudem wurde gezeigt, das in der HL-Zelllinie KM-H2 ein Allel

des CYLD-Gens deletiert ist (Feys et al., 2007). Um zu prüfen, ob eine eventuelle

Inaktivierung von CYLD eine Rolle in der Pathogenese des cHL spielt, wurde

innerhalb dieser Arbeit der Mutationsstatus von CYLD in HL-Zelllinien und

mikrodissektierten HRS-Zellen aus Primärfällen untersucht.

3.4.2 Mutationsanalysen von CYLD in cHL-Zelllinien

Der Mutationsstatus von CYLD wurde in 6 cHL-Linien mit B-Zell-Ursprung (L-428, L-

591, L-1236, KM-H2, SUP-HD1, and U-HO1) und 2 cHL-Linien mit T-Zell-Ursprung

(HDLM2, L540) mittels RT-PCR bestimmt. Hierzu wurde Kit-extrahierte RNA mit

Oligo-dT-Primern revers transkribiert. Im Anschluß wurden mit Hilfe exonischer

Primer vier überlappende cDNA-Fragmente amplifiziert. Die Sequenzanalysen von

CYLD-mRNA ergaben, dass in KM-H2 keine Wildtyp-mRNA-Transkripte generiert

werden; stattdessen wurden zwei unterschiedliche Transkripte mit jeweils einer 5

ERGEBNISSE

71

bzw. 8 bp-Deletion zu Beginn des Exons 16 identifiziert. Um die Ursache dieser

aberranten mRNA-Transkribierung zu ermitteln, wurde anschließend eine direkte

Amplifikation der betreffenden Region auf DNA-Ebene durchgeführt. Die

Sequenzierung der Exons 15 und 16 mit intronischen Primern zeigte eine 1 bp-

Deletion an bp-Position g.54506 sowie eine Punktmutation (G A) an Position

g.54508 in der splice acceptor site von Exon 16 (Referenzsequenz:

GenBank/EMBL/DDBJ Eintragsnummer NG_012061.1). Diese führen zu einem

aberranten Spleißvorgang des CYLD-Transkripts, bei dem offenbar zwei kryptische

splice acceptor sites genutzt werden, die beide innerhalb des kodierenden Bereichs

von Exon 16 lokalisiert sind. Daraus resultiert eine Verkürzung der entstehenden

Transkripte um 5 bzw. 8 bp. Abbildung 20 zeigt Elektropherogramme von CYLD

DNA- und cDNA-Sequenzen in KM-H2 und unmutierten Referenzen.

Abb. 20: CYLD-Mutationen in KM-H2. A (links): DNA-Sequenzen von CYLD. Die obere Grafik zeigt eine Wildty-Sequenz der splice acceptor site-Region von Exon 16.Die untere Grafik zeigt die korrespondierende Sequenz in KM-H2, in der die Deletion eines Thymins (linker Pfeil mit abgeflachter Spitze) und der Austausch eines Guanins gegen ein Adenin zu erkennen ist (rechter Pfeil). Die schwarzen Quadrate markieren die Wildtyp- (oben) bzw. die mutierte splice acceptor site (unten). Die roten Quadrate (unten) bezeichnen die aus der Mutation resultierenden kryptischen splice acceptor sites. B (rechts): CYLD-cDNA-Sequenzen der Exon 15/16-Verknüpfungsregion. Die obere Grafik zeigt die Wildtypsequenz. Die mittlere und untere Grafik zeigt repräsentative Klonsequenzen aus KM-H2-Zellen mit einer 5 bp- (Mitte) bzw. einer 8 bp-Deletion (unten). Die vertikale Linie markiert die Exon 15/16-Grenze.

ERGEBNISSE

72

Sowohl die 5 als auch die 8 bp-Deletion innerhalb des CYLD-Transkripts führen zu

einer Verschiebung des Leserasters. Daraus resultieren in beiden Transkripten

prämature Stop-Codons, die die Ubiquitin-spezifische Proteasedomäne (katalytische

Domäne) in der carboxyterminalen Region des CYLD-Proteins zerstören. Diese

Domäne beinhaltet eine Cis-Box (Aminosäure (AA) 590 – 610) und eine His-Box (AA

870 – 890), die für die Deubiquitinierungsaktivität des Enzyms essentiell sind (Nijman

et al., 2005). In KM-H2 ist das prämature Stop-Codon an AA 722 lokalisiert, so dass

die His-Box im verkürzten Transkript nicht präsent ist. Einen schematischen

Überblick über die Auswirkung der in KM-H2 identifizierten Mutation des CYLD-

Proteins gibt Abbildung 21.

Abb. 21: Schematische Darstellung der Konsequenz der CYLD-Mutation auf die Translation des Cyld-Proteins in der HL-Zelllinie KM-H2. Das prämature Stopkodon an AA 722 zerstört die katalytische Domäne, so dass die His-Box im Protein nicht translatiert wird. Dies führt zum Verlust der Deubiquitinierungs-Aktivität von Cyld. CAP: Cap-Gly-Domäne; P: Phosphorylierungsstelle; Cis: Cis-Box, His: His-Box. (Quelle: http://atlasgeneticsoncology.org, modifiziert).

Agarosegel-Analysen von CYLD-RT-PCR-Produkten aus HL-Zelllinien ergaben, dass

in KM-H2 im Vergleich zu drei anderen Linien nur geringe Mengen des CYLD-

Transkripts nachgewiesen werden können (siehe Abbildung 22).

Abb. 22: Agarosegel der RT-PCR der HL-Zelllinien KM-H2, L-1236, SUP-HD1 und U-HO1. Abgebildet sind Banden des 774 bp langen CYLD-cDNA-Fragments 4 (obere Reihe), welches die Exons 12 bis 19 umfasst. Zur Kontrolle wurde ein 305 bp langes GAPDH-Fragment simultan amplifiziert (unten). Als positiv-Kontrolle für die RT wurde RNA von CD19

+ B-Zellen verwendet.

CAP CAP CAP Cis HisP

AA 1 127 203 232 302 472 546 593 956

katalytische DomäneTRAF2-Bindestelle

722

Prämatures Stopcodon

http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_CYLD.html

ERGEBNISSE

73

Da in der RT-PCR von KM-H2-Zellen ein CYLD-mRNA Transkript amplifiziert werden

konnte ist anzunehmen, dass die in Abb. 19 gezeigte schwache Cyld-Expression

vermutlich durch den sogenannten nonsense mediated decay (zellulärer

Abbaumachanismus nicht-funktioneller mRNA) verursacht wird.

In der Zellline L-540 wurde eine „stille“, d.h. die Proteinfunktion nicht beeinflussende,

heterozygote Einzel-Nukleotidaustausch-Mutation (C T) an bp-Position 1473 der

mRNA (GenBank/EMBL/DDBJ Eintragsnummer NM_15247) gefunden. In allen

anderen untersuchten Zelllinien konnte keine Mutation nachgewiesen werden. Die

Ergebnisse der Mutationsanalysen von HL-Zelllinien werden in Tabelle 11

zusammenfassend dargestellt.

Tabelle 11: CYLD-Mutationen in HL-Zelllinien. Für alle Linien wurden Alter und Geschlecht der Patienten, aus denen die Linien gewonnen wurden, der cHL-Subtyp sowie der EBV-Status angegeben.

aGegeben ist die bp-Position in der mRNA-Sequenz (NM_15247).

bGegeben ist die bp-

Position in der DNA-Sequenz (NG_012061.1).

HL-Linie Subty

p

EBV-

Status

Alter

Patient

Geschlecht

Patient

Mutation

CYLD

L-428 NS - 37 W keine

L-1236 MC - 34 M keine

L-591 NS + 31 W keine

L-540 NS - 20 W heterozygoter Einzel-Nukleotidaustausch

(c.1473 C > Ta)

HDLM-2

KM-H2

NS

MC

-

-

74

37

M

M

Keine

Ein Allel deletiert; im anderen Allel Mutation

der splice acceptor site an der Exon 15/16-

Verbindung (g54506delT, g.54508 G > Ab)

3.4.3 Mutationsanalyse von CYLD in HRS-Zellen

Um den Mutationsstatus von CYLD in mikrodissektierten HRS-Zellen zu ermitteln,

musste zunächst ein sensitives 2-Runden PCR-Protokoll entwickelt werden, mit dem

es möglich ist, CYLD-DNA aus wenigen Zellen zu amlipifizieren. Dies wurde

erfolgreich realisiert; in Testversuchen mit sortierten BL-Zellen konnten alle 16

kodierenden Exons von CYLD selbst auf Einzelzellniveau amplifiziert werden.

ERGEBNISSE

74

Im Anschluss wurden HRS-Zellen aus 10 cHL-Fällen in Pools von 20 Zellen

mikrodissektiert und der Mutationsstatus von CYLD bestimmt. Bis auf Exon 5

konnten auch hier alle kodierenden Exons von CYLD amplifiziert und anschließend

einer Sequenzanalyse unterzogen werden. Da Exon 5 nur 303 bp des insgesamt

2850 bp langen kodierenden Bereichs von CYLD umfasst, und außerdem keine der

Zelllinien eine Mutation innerhalb dieses Bereichs aufwies, wurde Exon 5 von den

weiterführenden Analysen ausgeschlossen. In keinem der untersuchten HL-Fälle

konnte eine CYLD-Mutation nachgewiesen werden. In zwei Fällen wurden

heterozygote Einzel-Nukleotidaustausche (C T) an der bp-Position g.56558 der

CYLD-DNA gefunden (GenBank/EMBL/DDBJ Eintragsnummer NG_012061.1); bei

diesen handelt es sich jedoch wahrscheinlich um einen Polymorphismus. Die

Ergebnisse der Mutationsanalysen von HRS-Zellen werden in Tabelle 12

zusammenfassend dargestellt.

Tabelle 12: CYLD-Mutationen in cHL-Fällen. Angegeben sind Alter und Geschlecht der Patienten,

cHL-Subtyp und EBV-Status. aGegeben ist die bp-Position in der DNA-Sequenz (NG_012061.1).

cHL-

Fall

Subtyp EBV-

Status

Alter Patient Geschlecht

Patient

Mutation CYLD

1805 NS - 47 M Heterozygoter Einzel-Nukleotidaustausch (g.56558 C > T

a)

1817 NS - 70 W keine

1819 NS - 24 W keine

1393 MC - 25 W keine

1269

1696

1701

1710

1716

1810

MC

MC

MC

MC

MC

NS

;

-

+

+

-

+

-

27

76

66

21

34

51

W

W

W

M

M

M

keine

Heterozygoter Einzel-Nukleotidaustausch (g.56558 C > T

a)

keine

keine

keine

keine

DISKUSSION

75

4. Diskussion

4.1 Etablierung einer Methode zur miRNom-Analyse in mikrodissektierten

HRS- Zellen

Das seltene Vorkommen der malignen HRS- bzw. LP-Zellen innerhalb von HL-

Tumoren behinderte lange Zeit ihre Analyse auf molekularer Ebene. Bis heute

wurden nur wenige Studien über die miRNA-Expression im HL veröffentlicht, die

größtenteils auf Analysen von Ganzschnitten von Tumorbiopsaten oder HL-Zelllinien

basieren (Gibcus et al., 2009; Navarro et al., 2008). Analysen von HL-Zelllinien

spiegeln jedoch nur begrenzt die miRNA-Ausprägung in Primärfällen wider;

schließlich haben die Zelllinien ein wesentliches Merkmal der HRS-Zellen, nämlich

ihre Abhängigkeit vom inflammatorischen Mikromilieu innerhalb des Tumors,

verloren. Auch die Analyse des miRNoms von Ganzschnitt-Tumorgewebe ist nicht

repräsentativ für die miRNA-Ausprägung in den HRS- und LP-Zellen selbst, da diese

nur ca. 1% der Tumormasse ausmachen. Vor diesem Hintergrund ist es unerlässlich,

die malignen Lymphomzellen zu isolieren, um einen Einblick in ihre tatsächliche

miRNA-Expression zu erhalten.

Innerhalb dieser Arbeit wurde erfolgreich ein Protokoll zur stabilen Multiplex-RT und

PA von miRNA aus Hitzeschock-generierten Zellysaten mikrodissektierter HL-

Tumorzellen entwickelt, dass sowohl für Gefrierproben als auch für FFPE-Biopsate

geeignet ist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass eine PA der miRNAs die

Analyse ihrer Expression nur geringfügig verzerrt, und somit universal für kleine

Zellmengen angewandt werden kann.

4.2 MicroRNA-Expressionsanalysen in HL-Tumorzellen, GC-B-Zellen und

CD30+ GC-B-Zellen

4.2.1 MiRnome-weite Analyse der miRNA-Expression in HL-Tumorzellen und

GC-B-Zellen

Es existiert zwar bereits eine Studie, in der die differentielle miRNA-Expression von

HRS- und GC-B-Zellen untersucht wurde (van Vlierberghe et al., 2009), diese

umfasst jedoch nur eine sehr geringe Anzahl von Primärfällen und analysiert nicht die

unterschiedliche miRNA-Expression in verschiedenen HL-Subtypen. Des Weiteren

wurden in dieser Publikation pro HL-Fall nur 30 HRS-Zellen für die miRNA-RT-PA-

DISKUSSION

76

Prozessierung isoliert. Vor dem Hintergrund, dass in der vorliegenden Arbeit 400

Zellen pro Fall mikrodissektiert wurden, und trotzdem die PCR-Effizienz in einigen

Primärfällen so niedrig war, dass diese nicht für TLDA-Analysen verwendet werden

konnten, scheint es fraglich, ob eine so geringe Anzahl verwendeter Zellen wie in der

Studie von van Vlierberghe et al. verlässliche Ergebnisse produzieren konnte;

möglicherweise wurde eine nicht unbeträchtliche Anzahl von miRNAs nicht detektiert

oder ihre Expression unterschätzt.

In der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig isolierte maligne Tumorzellen aus

verschiedenen HL-Subtypen auf ihre miRNA-Expression hin untersucht. Von

besonderem Interesse waren dabei die NLPHL und CD20+ NS-HL-Fälle, da diese in

keine der bis heute erschienenen Publikationen mit einbezogen worden waren.

Durch ein unsupervised clustering aller Tumorzellproben konnten sowohl das NLPHL

als auch das CD20+ NS-HL als separate Subentitäten bestätigt werden. Des

Weiteren konnte gezeigt werden, dass die morphologische Verwandtschaft von NS-

und CD20+ NS-HL sich nicht in ihrer spezifischen miRNA-Expression widerspiegelt;

so zeigten die NS-Fälle eine größere Ähnlichkeit zu NLPHL-Fällen als zu den CD20+

NS-HL-Fällen, während letztere eine engere Verwandtschaft zu den (CD20-) MC-HL-

Fällen aufwiesen. Aufgrund der Tatsache, dass NLPHL ebenfalls den B-Zell-Marker

CD20 ausprägen, wäre eventuell eine Assoziation dieses HL-Subtyps mit den CD20+

NS-HL innerhalb des Clusterings zu erwarten gewesen; diese konnte jedoch nicht

gezeigt werden. Auch eine engere Verwandtschaft der GC-B-Zellen zu den CD20+

HL-Subgruppen, verglichen mit den nicht CD20-exprimierenden MC und NS, wurde

nicht beobachtet. Die Expression des B-Zell-Markers CD20 scheint somit keinen

nachweisbaren Einfluss auf die miRNA-Ausprägung im HL auszuüben.

4.2.2 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen und HRS-, bzw.

LP-Zellen

Innerhalb dieser Arbeit wurde eine HL-spezifische miRNA-Signatur bestimmt, die alle

HL-Subgruppen sowie HL-Zelllinien klar von ihren Vorläuferzellen, den GC-B-Zellen,

unterscheidet. Diese beinhaltet die miRNAs -28 und -15b (herabreguliert im HL)

sowie -24, -155, -146b und -100 (heraufreguliert). Ein Teil dieser miRNAs wurde

bereits in anderen Studien als HL-spezifisch identifiziert. MiR-28 wurde innerhalb

eines Vergleichs zwischen Gesamttumor- und reaktivem Lymphknoten- Gewebe

(engl. reactive lymph node, RLN), sowie in einer Analyse der differentiellen miRNA-

DISKUSSION

77

Expression zwischen HL-Zelllinien und LCL ebenfalls als herabreguliert bestimmt

(Gibcus et al., 2009; Navarro et al., 2008). In der Studie von Navarro et al. wurden

noch 24 weitere miRNAs identifiziert, die spezifisch zwischen RLN und HL-

Tumorgewebe unterschieden; jedoch wurden nur 4 dieser miRNAs (miR- 138, -26b,

-135a und -23b) auch innerhalb der vorliegenden Arbeit als differentiell exprimiert

zwischen GC-B-Zellen und HL-Proben bestimmt, wobei sich die Regulation auf

einzelne HL-Subtypen beschränkte. Des Weiteren zeigte sich, dass zusätzlich die

Richtung der Regulation von 2 dieser miRNAs in der Studie von Navarro et al. von

den hier dargestellten Ergebnissen abweicht; so wurden miR-135a und -23b in

Navarros Publikation als herabreguliert beschrieben, während sie in dieser Arbeit als

moderat heraufreguliert bestimmt wurden. Die Überexpression von miR-155 im HL,

die bereits seit längerem bekannt ist und mehrfach verifiziert wurde (Eis et al., 2005;

Gibcus et al., 2009; Kluiver et al., 2005), konnte offenbar in den Ganzschnitt-

miRnom-Analysen Navarros nicht beobachtet werden. Diese diskrepanten

Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass ein Vergleich von Gesamttumormaterial

und RLN nicht repräsentativ für die differentielle miRNA-Expression zwischen

malignen HRS-Zellen und ihren Vorläuferzellen, den GC-B-Zellen, ist.

Auch im Vergleich der vorliegenden Arbeit zu einer vorangegangenen Studie an

mikrodissektierten HRS-Zellen aus Gefriermaterial, deren miRNome mit denen von

CD77+ Zentroblasten verglichen wurden (van Vlierberghe et al., 2009), zeigten sich

nur wenige Übereinstimmungen. Van Vlierberghe et al. definierten eine HL-

spezifische Signatur aus 3 herabregulierten und 12 heraufregulierten miRNAs. Nur 4

dieser miRNAs wurden auch innerhalb der vorliegenden Arbeit als reguliert bestimmt

(miR-155, -196a, miR-16 und -18a), wobei für miR-16 und -18a eine gegenläufige

Regulation beobachtet wurde (herabreguliert in dieser Studie, heraufreguliert bei Van

Vlierberghe et al.). MiR-155 und -196a hingegen sind in beiden Analysen

übereinstimmend heraufreguliert, wobei miR-196a in der vorliegenden Studie keine

durchgängige starke Expression in allen Fällen aufweist, und daher nicht in die

postulierte HL-spezifische miRNA-Signatur aufgenommen wurde.

Tabelle 13 zeigt einen Überblick der in dieser Arbeit definierten HL-spezifischen

miRNA-Signatur und korrespondierende Ergebnisse der oben diskutierten Studien.

DISKUSSION

78

Tabelle 13: Vergleich der in der vorliegenden Arbeit definierten H-spezifischen miRNA-Signatur mit korrespondierenden Ergebnissen anderer Studien. In Klammern werden die in den verglichenen Studien verwendeten Zellmaterialien angegeben. Die Richtung der Regulation im HL im Vergleich zu den verwendeten Referenzproben wird durch die Ausrichtung der Pfeile angegeben.

Signatur HL vorliegende

Arbeit Navarro et al.

(HL/RLN) Gibcus et al.

(HL-/LC-Linien) Vlierberghe et al.

(HRS-/CD77+ GC-B-Zellen)

hsa-miR-28 ↓ ↓ - -

hsa-miR-15b ↓ - ↑ -

hsa-miR-24 ↑ - - -

hsa-miR-155 ↑ - ↑ ↑

hsa-miR-146b ↑ - - -

hsa-miR-100 ↑ - ↑ -

Durch die Tabelle wird ersichtlich, dass 4 der 5 miRNAs, aus denen sich die hier

definierte HL-spezifische miRNA-Signatur zusammensetzt, bereits aus anderen

Studien bekannt sind; allerdings wurde in diesen Studien jeweils nur einzelne

Vertreter dieser Signatur als reguliert bestimmt. Auffällig ist, dass in der Arbeit von

Gibcus et al. miR-15b als überexprimiert beschrieben wurde, während sie in der

vorliegenden Studie als herabreguliert bestimmt wurde. Dies könnte damit

zusammenhängen, dass bei Gibcus EBV-infizierte LCL als Referenzproben

verwendet wurden; es ist bekannt, dass eine Infektion mit EBV die miRNA-

Expression in Zelllinien modifiziert (Cameron et al., 2008a; Cameron et al., 2008b).

Auch ein direkter Vergleich der Studien von Navarro et al. und van Vlierberghe et al.

zeigt kaum Überlappungen der von den jeweiligen Autoren definierten spezifischen

HL-Signaturen; nur 2 miRNAs werden in beiden Studien konsistent als reguliert

beschrieben. Die Regulation von miR-30b jedoch wurde gegensätzlich bestimmt

(herabreguliert bei Navarro, heraufreguliert bei van Vlierberghe et al), während beide

Studien eine Heraufregulation von miR-21 im HL zeigten. MiR-21 wird allerdings

stark in reifen T-Zellen exprimiert (Wu et al., 2007), die im HL oft in rosettierender

Form die HRS-Zellen umgeben; es ist daher anzunehmen, dass dies zumindest in

den Ganzschnittanalysen von Navarro et al. Einfluss auf die ermittelte HL-Signatur

genommen haben könnte.

Um herauszufinden, ob möglicherweise die innerhalb der vorliegenden Arbeit neu

etablierte Methodik für die Diskrepanzen zu den Ergebnissen anderer Studien

verantwortlich ist, wurde die hier bestimmte miRNA-Expression in HL-Zelllinien mit

der einer vorangegangen Studie, die HL-Zelllinien analysierte (Gibcus et al., 2009),

verglichen. Diese Gegenüberstellung ergab, dass für beinahe sämtliche miRNAs, die

DISKUSSION

79

in der Studie von Gibcus et al. als in HL-Zelllinien stark ausgeprägt bestimmt worden

waren, auch in dieser Arbeit eine hohe Expression nachgewiesen wurden. Da auch

die HL-Zelllinien mittels des neu etablierten RT-PA-TLDA-Protokolls aus wenigen

Zellen analysiert wurden, weist die starke Übereinstimmung der Ergebnisse mit

denen von Gibcus et al. darauf hin, dass durch die angewandte Methodik keine

Verzerrung der hier ermittelten Ergebnisse verursacht wurde. Das von Gibcus et al.

definierte HL-typische miRNA-Expressionsmuster beinhaltet (neben weiteren

miRNAs) miR-155, die auch in der vorliegenden Arbeit als Teil der HL-spezifischen

miRNA-Signatur bestimmt wurde. Gibcus et al. zeigen des Weiteren, dass HL-

Zelllinien im Vergleich zu EBV-immortalisierten LCL acht miRNAs differentiell

exprimieren. Für 2 dieser miRNAs konnte auch innerhalb der vorliegenden Studie

eine Regulation zwischen HL-Subtypen und GC-B-Zellen gezeigt werden; es handelt

sich hierbei um miR-100, die Teil der hier definierten HL-spezifischen miRNA-

Signatur und im HL hochgradig heraufreguliert ist, und miR-206, die eine eher

moderate Regulation zeigt, die zudem nicht in allen Subtypen auftritt.

Zusammengefasst zeigt der Vergleich der vorliegenden Arbeit mit vorangegangenen

Studien, dass offenbar die Auswahl des verwendeten Zellmaterials (Tumor-

Ganzschnitte, HL-Zelllinien oder mikrodissektierte HRS-Zellen) einen

entscheidenden Einfluss auf die Ergebnisse der differentiellen miRNA-

Expressionsanalyse im HL ausübt. Der direkte Vergleich mikrodissektierter HRS-

Zellen mit GC-B-Zellen war somit unabdingbar, um die tatsächliche differentielle

Ausprägung von miRNAs zwischen den eigentlichen malignen Tumorzellen des HL

und ihren Vorläuferzellen zu bestimmen.

Alle Komponenten der hier definierten, HL-spezifischen miRNA-Signatur sind bereits

in Zusammenhang mit anderen Krebserkrankungen beschrieben worden. So wurde

gezeigt, dass miR-15b, die in dieser Arbeit als im HL herabreguliert bestimmt wurde,

als Tumorsupressor in Magenkrebs-Zelllinien fungiert, indem sie die Expression des

Onkogens BCL2 supprimiert (Xia et al., 2008) MiR-15b liegt innerhalb des miR-

15b/16-2 Clusters auf Chromosom 3, welches homolog zum miR-15a/16-1-Cluster

auf Chromosom 13 ist. Letzteres reguliert ebenfalls die Expression von BCL2 und

wurde als Tumorsupressorgen in der CLL identifiziert (Cimmino et al., 2005), was

eine ähnliche Wirkungsweise des 15b/16-2 Clusters nahelegt.

MiR-28, die in sämtlichen HL-Fällen stark herabreguliert ist, wird in GC-B-Zellen,

besonders in Zentroblasten, stark ausgeprägt (Ramachandrareddy et al., 2010;

DISKUSSION

80

Zhang et al., 2009b). Die Involvierung dieser miRNA in die Pathogenese

verschiedener Krebserkrankungen wurde in zahlreichen Publikationen

nachgewiesen; allerdings wurde fast ausschließlich eine aberrante Heraufregulation

beschrieben. So wurde eine Überexpression von miR-28 in Nierenzellkarzinomen,

esophagealen Adenokarzinomen und fortgeschrittenen Gliomen beobachtet

(Gottardo et al., 2007; Malzkorn et al., 2010; Yang et al., 2009). Des Weiteren wurde

das LPP- (engl. lim domain containing preferred lipoma partner) Gen, innerhalb

dessen miR-28 kodiert wird, als möglicher Fusionspartner des MLL- (engl. mixed

myeloid leukemia) Gens in der akuten myeloiden Leukämie identifiziert (Daheron et

al., 2001). Allerdings scheint diese miRNA auch als Tumorsupressor agieren zu

können; in einer weiteren Studie wurde gezeigt, dass miR-28 in der Lage ist

Caspase-3 zu aktivieren, und so als pro-apoptototischer Faktor fungieren kann

(Ovcharenko et al., 2007). Möglicherweise könnte die hier beobachtete starke

Herabregulation von miR-28 den HRS-Zellen Schutz vor Caspase-3 induzierter

Apoptose bieten.

MiR-155 ist bereits seit längerem als OncomiR (analog zum Begriff Onkogen) in

verschiedenen B-Zell-Lymphomen, u.a. DLBCL, CLL, PMBCL (engl. primary

mediastinal B cell lymphoma) und HL, bekannt (Eis et al., 2005; Kluiver et al., 2005;

van den Berg et al., 2003). In der CLL korreliert die miR-155-Überexpression mit

aggressivem Wachstum des Tumors (Calin et al., 2004). Im DLBCL ist die erhöhte

Expression von miR-155 mit dem ABC-Subtyp assoziiert, der wiederum mit einer

signifikant schlechteren Prognose einher geht (Eis et al., 2005; Rai et al., 2008).

Transgene Mäuse, in deren B-Zellen miR-155 unter Kontrolle des Eµ-Enhancers

konstitutiv ausgeprägt wird, zeigen zunächst eine prä-leukämische Proliferation von

Prä-B-Zellen in Knochenmark und Thymus, die später in eine lymphoblastische

Leukämie oder hochgradig maligne Lymphome transformiert (Costinean et al., 2006).

Es wurde außerdem gezeigt, das miR-155 in der Lage ist, B-Zell-spezifische Gene

wie AID und PU.1 zu reprimieren (Dorsett et al., 2008; Vigorito et al., 2007); dies

könnte möglicherweise zu dem in HRS-Zellen beobachteten Verlust der B-Zell-

Identität beitragen. Die Transkription des miR-155-Gens wird unter anderem durch

den Transkriptionsfaktor NF-κB induziert, dessen konstitutive Aktivierung ein

Hauptmerkmal des HL ist. Studien mit EBV-infizierten LCL haben gezeigt, dass eine

regulatorische Signalschleife zwischen NF-κB und miR-155 existiert. So bindet NF-

κB an zwei Bindestellen im miR-155-Promoter-Bereich (Gatto et al., 2008), während

DISKUSSION

81

miR-155 die Ausprägung von IKKε, einem positiven Regulator von NF-κB,

supprimiert (Lu et al., 2008). Angesichts dieser regulatorischen Signalschleife scheint

es widersprüchlich, dass im HL sowohl eine konstitutive NF-κB-Aktivität als auch eine

Überexpression von miR-155 zu beobachten sind; vermutlich gerät der

wechselseitige Regulationsmechanismus durch weitere transformierende Ereignisse,

wie Mutationen von negativen NF-κB-Regulatoren (s. Kap. 1.4.4.4), aus dem

Gleichgewicht. MiR-155 ist außerdem in der Lage, die Aktivierung von Caspase-3 zu

unterdrücken (Ovcharenko et al., 2007), und somit eine anti-apoptotische Wirkung

auszuüben. Die starke Heraufregulation von miR-155 könnte den HRS-Zellen durch

diesen Mechanismus möglicherweise Schutz vor Apoptose bieten.

MiR-146b ist ein Homolog der wesentlich intensiver erforschten miR-146a, die als

einer der Hauptregulatoren der zellulären Antwort auf mikrobielle Infektionen

identifiziert wurde (Taganov et al., 2006). Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde

nur miR-146b als in allen HL-Subgruppen heraufreguliert gefunden; da miR-146a

jedoch ebenfalls (mit der Ausnahme von NS-cHL) in allen Tumorproben stark

exprimiert wurde, soll im Folgenden auf beide miRNAs dieser Familie eingegangen

werden. MiR-146a und -146b sind auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert und

unterscheiden sich in ihrer maturen Sequenz durch nur 2 Nukleotide; da diese in der

3‘-Region liegen, und somit keinen Einfluß aus die Seed-.Region haben, legt dies

nahe, dass sie dieselbe Gruppe von mRNA-Zielen regulieren können (Baltimore et

al., 2008). Promoteranalysen haben gezeigt, dass die Transkriptionsaktivierung von

miR-146a/b durch den Toll-like-Rezeptor 4 oder das EBV-kodierte Protein LMP1 von

der Aktivität des NF-κB-Transkriptionsfaktors abhängig ist (Cameron et al., 2008b;

Taganov et al., 2006). Beide miRNAs wiederum supprimieren die positiven NF-κB-

Regulatoren TRAF6 und IRAK1 (Taganov et al., 2006) und schließen so den

regulatorischen Kreislauf. Im HL findet sich jedoch (analog zu miR-155, s.o.) eine

parallele konstitutive NF-κB-Aktivierung und die Heraufregulation von miR-146a/b,

was darauf hinweist, dass weitere transformierende Ereignisse mitverantwortlich für

die Störung der wechselseitigen Regulation von NF-κB und miR-146a/b sein müssen.

Über die Involvierung von miR-146a/b in die Lymphompathogenese ist wenig

bekannt; jedoch scheint ihre Regulation in der Entwicklung solider Tumore eine Rolle

zu spielen. Eine Überexpression von miR-146b wurde in papillären

Schilddrüsenkarzinomen im Vergleich zu nicht-malignem Schilddrüsengewebe

nachgewiesen (He et al., 2005), und in Plattenepithel-Lungenkarzinomen korreliert

DISKUSSION

82

eine erhöhte miR-146b-Ausprägung signifikant mit einer schlechteren Prognose

(Raponi et al., 2009).

MiR-100, die innerhalb der vorliegenden Arbeit die höchste Heraufregulation in HL-

Fällen und Zelllinien zeigte, ist ebenfalls in die Pathogenese anderer

Krebserkrankungen involviert. So wurde gezeigt, dass sie unter anderem in der

pädiatrischen akuten Leukämie und im DLBCL überexprimiert wird (Li et al., 2009;

Zhang et al., 2009a). Es konnte bewiesen werden, dass miR-100 ein negativer

Regulator der mTOR-Signalkaskade ist (Nagaraja et al., 2010), die eine wichtige

Rolle in der Regulation von Zellwachstum und -Zyklus spielt (Hay und Sonenberg,

2004). In HRS-Zellen wurde eine konstitutive Aktivierung dieser Signalkaskade

beschrieben, die vermutlich durch die im HL ebenfalls konstitutive Aktivität des

PI3K/AKT-Signalweges verursacht wird (De und Brown, 2010; Dutton et al., 2005).

MiR-100 sollte also, wie auch miR-155 und -146a/b (s.o.), eigentlich als negativer

Regulator einer anti-apoptotischen Signalkaskade wirken, übt diese Funktion im HL

jedoch offensichtlich nicht aus. Studien haben gezeigt, dass miR-100 außerdem ein

negativer Regulator des Tumorsupressorgens ATM ist (Ng et al., 2010). ATM ist im

pädiatrischen NS-cHL herabreguliert, wobei keine Inaktivierung des Gens durch

Mutationen oder Deletionen nachgewiesen werden konnte (Bose et al., 2007). In

EBV+ HL wird die Supprimierung von ATM unter anderem durch die LMP1-vermittelte

Heraufregulation von Bmi-1 reguliert (Dutton et al., 2007). Möglicherweise stellt die

Heraufregulation von miR-100 einen alternativen Weg zur Unterdrückung von ATM

im EBV- HL dar. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden beinahe ausschließlich

EBV- HL-Fälle analysiert, die alle eine sehr hohe miR-100 Expression aufweisen; im

einzigen deutlich EBV+ HL-Fall (MC 2) hingegen wurde diese miRNA nicht detektiert.

Es wäre daher von Interesse, weitere EBV+ HL-Fälle auf ihre Expression von miR-

100 hin zu analysieren und mit EBV--Fällen zu vergleichen.

Auch miR-24, welche in allen hier analysierten HL-Fällen und Zelllinien

heraufreguliert ist, wurde bereits als OnkomiR in verschiedenen Erkrankungen

beschrieben. Ihre Überexpression wurde unter anderem in oralen Karzinomen

nachgewiesen (Lin et al., 2010). In Zelllinien des hepatozellulären Karzinoms kann

eine verstärkte Expression von miR-24 durch eine Stimulation der Zellen mit dem

Fibroseassoziierten Wachstumsfaktor TGF-β angeregt werden (Huang et al., 2008).

Da HRS-Zellen TGF-β sekretieren (Poppema et al., 1998) scheint es denkbar, dass

ihre hohe Expression von miR-24 durch eine autokrine Stimulation induziert wird.

DISKUSSION

83

Das onkogene Potential von miR-24 beruht auf ihrer Fähigkeit, eine ganze Reihe von

Genen zu supprimieren, die an der Kontrolle proliferativer zellulärer Mechanismen

beteiligt sind. So wurde gezeigt, dass Tumorsupressorgene wie CHEK1 (involviert in

den G2-M checkpoint des Zellzyklus), BRCA1 (aktiviert die DNA-Doppelstrang-

Reparatur), VHL (Tumorsuppressor im Von-Hippel-Lindau-Syndrom) und CDKN1B

(Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor 1B, alias p27kip1) von miR-24 negativ reguliert

werden (Chhabra et al., 2010). Immunohistochemische Analysen haben bewiesen,

dass die Cyclin-abhängige Kinase 1 (CDK1) in einigen HL-Fällen überexprimiert wird

(Bai et al., 2005); möglicherweise wird dies unter anderem durch die miR-24

vermittelte Suppression von CDKN1B verursacht.

4.2.3 Differentielle miRNA-Ausprägung zwischen GC-B-Zellen und HL-

Zelllinien

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich die differentielle miRNA-

Expression der HL-Zelllinien (bezogen auf GC-B-Zellen) von der in Primärfällen

unterscheidet. Nur 18 der 35 miRNAs, die in HL-Fällen differentiell exprimiert werden,

sind auch in den HL-Zelllinien reguliert. Des Weiteren wurden 16 miRNAs in den HL-

Zelllinien als reguliert bestimmt, für die in den Primärfällen keine differentielle

Expression nachgewiesen werden konnte. Dies erklärt die Gruppierung der HL-

Zelllinien in einen separaten Arm der mittels unsupervised clustering Analysen

erstellten Dendogramme (s. Kapitel 3.2.1), und definiert sie innerhalb dieser Studie

als eigene Entität. Dieser Befund lässt außerdem darauf schließen, dass

Untersuchungen des miRnomes von HL-Zelllinien nicht als umfassend repräsentativ

für die tatsächliche miRNA-Expression in HRS- bzw. LP-Zellen angesehen werden

können. Möglicherweise ist die differentielle miRNA-Ausprägung in HL-Zelllinien

darauf zurückzuführen, dass HL-Zelllinien ein wesentliches Merkmal von HRS-Zellen,

nämlich ihre Abhängigkeit vom inflammatorischen Mikromilieu des Tumorgewebes,

verloren haben. HRS-Zellen zeigen außerdem eine hohe chromosomale Instabilität

(s. Kap. 1.4.4.1); durch die fortwährende Kultivierung kann es zur Akkumulation

chromosomaler Aberrationen und Mutationen kommen, die in Primärfällen nicht

auftreten.

Vor diesem Hintergrund sollten zukünftige Studien, die sich mit der miRNA-

Ausprägung im HL befassen, möglichst nicht nur an Zelllinien vorgenommen,

sondern auch, falls möglich, auf der Ebene von Primärfällen validiert werden.

DISKUSSION

84

4.2.4 Differentielle miRNA-Ausprägung in HL-Subtypen

Neben der bereits diskutierten, in allen HL vorgefundenen miRNA-Signatur wurden

auch für einzelne Subentitäten differentiell zu GC-B-Zellen exprimierte miRNAs

identifiziert. Im Folgenden soll exemplarisch auf einige miRNAs eingegangen

werden, die als besonders stark reguliert bestimmt wurden.

In NS-cHL wurde miR-20b als stark herabreguliert bestimmt. MiR-20b wurde im

Mantelzell-Lymphom (engl. mantle cell lymphoma, MCL) als prognostischer Faktor

definiert, wobei eine schwache Ausprägung signifikant mit einer höheren

Überlebensrate korrelierte (Di Lisio et al., 2010). Interessanterweise ist auch die

Prognose für das NS-cHL besser als für das MC-HL (Gough, 1970), in dem miR-20b

in wesentlich höherem Ausmaß exprimiert wird. Vor diesem Hintergrund wäre es

eventuell interessant zu prüfen, ob die Ausprägung von miR-20b auch im HL einen

prognostischen Faktor darstellt.

Im CD20+ NS-cHL wurde eine starke Herabregulation von miR-324-5p

nachgewiesen. Studien haben gezeigt, dass diese miRNA in Medulloblastomen als

Tumorsuppressor fungiert, indem sie den Transkriptionsfaktor Gli1, der Teil des

Hedgehog- (HH) Signalwegs ist, supprimiert. In Medulloblastomen mit verstärkter

HH-Aktivität wurde eine Herabregulation von miR-324-5p festgestellt (Ferretti et al.,

2008). Gli3, ebenfalls eine Komponente des HH-Signalwegs, wird im HL stark

exprimiert (Greaves, im Druck), was auf eine mögliche Aktivierung des HH-

Signalwegs schließen lässt. Ein weiterer Hinweis auf eine eventuell bestehende HH-

Aktivierung im HL ist die Tatsache, dass in mikrodissektierten HRS-Zellen Zugewinne

der chromosomalen Region 7q36, die u.a. für das Sonic Hedgehog- (SHH) Protein

kodiert, gefunden wurden (Slovak et al., 2011). Möglicherweise trägt der Verlust der

miR-324-5p-Expression im CD20+ NS-cHL zu einer Aktivierung des HH-Signalwegs

bei.

Die Überexpression von miR-135b, die in dieser Arbeit in CD20+ NS-cHL-Fällen

beobachtet wurde, konnte unter anderem auch in kolorektalen Karzinomen

nachgewiesen werden. Es wurde gezeigt, dass miR-135b den Wnt-Signalweg

aktiviert, indem es den Wnt-Inhibitor APC supprimiert (Nagel et al., 2008). Im

Mantelzell-Lymphom (MCL) wurde eine konstitutive Wnt-Aktivierung als Bestandteil

der Pathogenese identifiziert (Gelebart et al., 2008); ob sie allerdings auch im HL

eine Rolle spielt ist bislang nicht bekannt. Da das HL jedoch generell durch die

DISKUSSION

85

aberrante Aktivierung unterschiedlicher Signalwege charakterisiert wird (s. Kapitel

1.4.4.4), ist dies nicht auszuschließen.

Über miR-488 und -95, deren Heraufregulation für das MC-HL kennzeichnend zu

sein scheint, ist bislang nicht viel bekannt. MiR-488 reprimiert offenbar die Androgen-

Rezeptor-mRNA in Prostatakarzinom-Zelllinien und induziert auf diese Weise

Apoptose (Sikand et al., 2010), während miR-95 in kolorektalen Karzinomen

überexprimiert wird (Huang et al., 2011). Über ihre Funktion in weiteren

Krebserkrankungen wurde bisher nicht berichtet.

Die höchstregulierte miRNA im NLPHL ist miR-224. Ihre Überexpression wurde in

heptazellulären Karzinomzelllinien, sowie in hoch aggressiven Pankreaskarzinomen

nachgewiesen. (Li et al., 2010; Mees et al., 2009). Ein validiertes Zielgen von miR-

224 ist der CD40-Rezeptor (Mees et al., 2009); da LP-Zellen jedoch CD40

exprimieren (Rudiger et al., 2002) scheint dieser Mechanismus hier nicht zu greifen.

Welche Funktion miR-224 im NLPHL ausübt bleibt somit unklar.

4.2.4.1 Differentielle miRNA-Expression im cHL und NLPHL

Innerhalb der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich das cHL und das

NLPHL nicht nur in ihrer differentiellen miRNA-Ausprägung im Vergleich zu GC-B-

Zellen, sondern auch in ihrer absoluten miRNA-Expression untereinander deutlich

unterscheiden. Insgesamt wurden 17 miRNAs gefunden, die im NLPHL im Vergleich

zum cHL differentiell exprimiert werden. Zwei dieser miRNAs, miR-141 und -200c,

wurden als für das NLPHL spezifisch definiert, da sie weder in anderen HL-Subtypen,

noch in GC-B-Zellen, hoch ausgeprägt wurden. Im Folgenden sollen diese miRNAs

näher charakterisiert werden.

MiR-141 und -200c sind auf Chromosom 12 lokalisiert und werden innerhalb einer

pri-miRNA gemeinsam transkribiert; dies erklärt, warum beide miRNAs eine hohe

Ausprägung im NLPHL zeigen. Obwohl sich die Seed-Sequenzen von miR-141 und -

200c um ein Nukleotid unterscheiden, haben Studien gezeigt, dass sie gemeinsame

Ziel-mRNAs regulieren (Park et al., 2008). Die Überexpression von miR-141 wurde

bereits in Ovarialkarzinomen nachgewiesen (Iorio et al., 2007). In metastasierenden

Prostatakarzinomen sind miR-141 und miR-200c in der Epithelzellen-Fraktion stark

ausgeprägt, während ihre Ausprägung in Stromazellen nicht detektiert werden

konnte (Mitchell et al., 2008). Dies bestätigt die Ergebnisse der Studie von Park et

al., in der gezeigt wurde, dass miR-200c den Epithel-Phänotyp von Krebszellen

DISKUSSION

86

determinieren, indem sie die E-Cadherin-Repressoren ZEB1 und ZEB2 supprimieren.

Durch diesen Mechanismus wird die Transition von Epithel- zu Mesenchymalzellen

unterdrückt und die Invasivität von Krebszellen vermindert (Park et al., 2008). In

HRS-Zellen, die in dieser Arbeit keine hohe Expression von miR-200c und miR-141

zeigten, wird E-Cadherin nur selten ausgeprägt (Ohshima et al., 2001). Über die

Expression von E-Cadherin in LP-Zellen liegen bislang keine Daten vor. Sie

exprimieren jedoch, im Gegensatz zu HRS-Zellen, den Epithelzellmarker MUC1/EMA

(Mason et al., 1994), und könnten somit möglicherweise noch andere Merkmale

epitheloider Zellen aufweisen. Es könnte also von Interesse sein, die Ausprägung

von E-Cadherin in LP-Zellen zu untersuchen und mit der Expression von miR-200c

zu korrelieren.

Da sowohl miR-141 und -200c als spezifisch im NLPHL hoch ausgeprägt bestimmt

wurden, während ihre Expression in anderen HL-Subtypen gering ist, könnten sie

möglicherweise als diagnostische Marker zur Unterscheidung von NLPHL und cHL

eingesetzt werden.

4.2.4.2 Differentielle miRNA-Expression im NS-, NS CD20+- und MC-cHL

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Expression von miRNAs

zwischen unterschiedlichen cHL-Subgruppen stark variiert. Vor diesem Hintergrund

schien es angebracht, auch die differentielle miRNA-Ausprägung zwischen NS-,

CD20+ NS- und MC-cHL-Fällen eingehender zu untersuchen. Paarweise Vergleiche

ergaben, dass sich NS- und MC-cHL, die zwei histologisch unterschiedliche Entitäten

des cHL repräsentieren, in der Expression von 14 miRNAs signifikant unterscheiden

(FC >2, p <0,05). Im Folgenden sollen einige der am stärksten zwischen den beiden

Subgruppen regulierten miRNAs näher charakterisiert und ihre möglichen

Implikationen in die Pathogenese des HL diskutiert werden.

MiR-30e-5p wurde in allen MC-Fällen ausgeprägt, während sie in 3 von 4 NS-Fällen

nicht detektiert werden konnte. Studien haben gezeigt, dass miR-30e-5p in

Ovarialkarzinomen überexprimiert wird (Dahiya et al., 2008), während sie in Kopf-

und Nacken-Karzinomzelllinien herabreguliert ist (Kozaki et al., 2008). Auch im BL

wurde, im Vergleich zu anderen Lymphomen, eine Herabregulation von miR-30e-5p

gezeigt (Robertus et al., 2010). Über die mRNA-Targets dieser miRNA ist bislang

wenig bekannt. Interessanterweise ergab die in silico-Suche nach möglichen miR-

30e-5p-mRNA-Targets, dass ERK (engl. Elk related tyrosine kinase) ein Zielgen

DISKUSSION

87

dieser miRNA ist; dies wurde mittels zweier verschiedener Algorithmen (MiRANDA,

TargetScan) bestimmt. Der MEK/ERK-Signalweg ist im HL konstitutiv aktiviert (Zheng

et al., 2003); möglicherweise wird diese aberrante Aktivierung in NS-cHL durch die

Herabregulation von miR-30e-5p mit verursacht.

Eine weitere im NS-cHL stark herabregulierte miRNA (sowohl im Vergleich zu MC-

als auch zu CD20+ NS-Fällen) ist miR-516-5p (kürzliche Namensänderung in

miRBase Version 10.0 in miR-516b). Ihre Herabregulation wurde unter anderem in

Ovarialkarzinomen beschrieben (Dahiya et al., 2008). Studien haben gezeigt, dass

miR-516-5p das Gen IGFBP7 (engl. insulin-like growth factor binding protein 7)

negativ reguliert (Mao et al., 2010). Kürzlich wurde berichtet, dass eine aberrante

Heraufregulation dieses Gens kennzeichnend für akute myeloide Leukämien (AML)

ist, und das seine erhöhte Expression signifikant mit Therapieresistenzen und einer

schlechteren Prognose korreliert (Heesch et al., 2010). Über die Expression von

IGFBP7 im HL liegen bislang keine Daten vor; es wäre somit von Interesse, die

Ausprägung von IGFBP7 im HL zu untersuchen, und mit der miR-516-5p-Expression

zu korrelieren. Auf diese Weise könnte eruiert werden, ob IGFBP7 auch im NS-HL

überexprimiert wird, und wenn, ob seine Expression mit der fehlenden Ausprägung

von miR-516-5p assoziiert ist.

Unter den im NS-cHL stark exprimierten Genen fand sich auch die small nucleolar

RNA (snoRNA) RNU6B, die von Applied Biosystems als Referenzgen zur

Datennormalisierung empfohlen wird. Wie bereits in Kapitel 3.2.2 erwähnt, wurden

innerhalb dieser Arbeit die auf den TLDA befindlichen Referenzgene nicht zur

Datenormalisierung genutzt, da für alle 3 snoRNAs (RNU48, RNU44 und RNU6B)

eine Regulation sowohl im Vergleich von Tumor- zu GC-B-Zellen als auch unter den

verschiedenen HL-Subgruppen beobachtet wurde. In Übereinstimmung mit dieser

Beobachtung steht eine kürzlich veröffentlichte Studie, in der gezeigt wurde, dass die

Expression von snoRNAs mit der Pathologie von Tumoren, sowie der Prognose von

Patienten assoziiert ist; eine niedrige snoRNA-Expression korrelierte mit erhöhter

Ausprägung von Markern, die eine hohe Aggressivität des Tumors indizieren (Gee et

al., 2011). Die Expression von snoRNAs im HL ist bislang nicht untersucht worden;

da im HL im Vergleich zu GC-B-Zellen jedoch auch die snoRNAs RNU48 und RNU44

als differentiell exprimiert bestimmt wurden, könnte eine nähere Untersuchung dieser

Molekülklasse aufschlussreich sein.

Ebenfalls im NS-HL stark exprimiert wird let-7a, ein Mitglied der let-7-miRNA-Familie.

DISKUSSION

88

Let-7a wurde bereits in vorangegangenen Studien als onkogene miRNA im HL

identifiziert. Es wurde gezeigt, dass sie in HL-Zelllinien das Tumorsupressorgen

PRDM1 reprimieren kann, und dass in HL-Primärfällen die Ausprägung von let-7a

und PRDM1 negativ korreliert (Nie et al., 2008).

Obwohl sich NS- und CD20+ NS-cHL-Fälle in ihrer histologischen Struktur ähneln,

weichen sie bezüglich ihrer miRNA-Expression deutlich voneinander ab. Der

paarweise Vergleich ergab, dass zwischen diesen beiden Subgruppen 19 miRNAs

differentiell exprimiert wurden, davon waren 8 herabreguliert und 11 heraufreguliert. 7

dieser miRNAs, deren Ausprägung im NS und CD20+ NS größtenteils sehr stark

differiert, wurden auch im Vergleich NS gegen MC als reguliert bestimmt (miR-516-

5p, -30e-5p, -99a, -134, RNU6B, let-7a und let-7c), wobei die Richtung der

Regulation stets die gleiche ist wie bei der Gegenüberstellung von NS und CD20+

NS. Dies liegt darin begründet, dass MC- und CD20+ NS-cHL-Fälle ein ähnliches

miRNA-Profil aufweisen, was durch ihre gemeinsame Gruppierung in den

unsupervised Clustering-Analysen bestätigt wird. In Anbetracht dessen schien es von

Interesse, die miRNAs zu bestimmen, mittels derer zwischen MC- und CD20+ NS-

cHL-Fällen unterschieden werden kann.

Es wurden 6 miRNAs bestimmt, deren Expression im CD20+ NS-HL signifikant von

ihrer Ausprägung im MC-HL abweicht; davon sind 3 herab- und 3 heraufreguliert. Die

höchste Herabregulation im CD20+ NS zeigten miR-324-5p, die bereits in Kapitel

4.2.4 näher charakterisiert wurde, und miR-301. Diese wurden nicht nur im Vergleich

CD20+ NS zu MC, sondern auch zu allen anderen HL-Subtypen sowie GC-B-Zellen

als herabreguliert bestimmt; der Verlust der miR-324-5p- und miR-301-Expression

kann somit als spezifisch für das CD20+ NS-HL angesehen werden. Über die

Implikation von miR-301 in onkogenetische Mechanismen ist wenig bekannt. Studien

zeigten, dass miR-301 im follikulären Lymphom (FL), verglichen mit nicht-malignem

Lymphknotengewebe, überexprimiert wird (Roehle et al., 2008); über eine

Herabregulation von miR-301, wie sie in dieser Arbeit vorgefunden wurde, wurde

bislang nicht berichtet. Welche Rolle der Verlust der miR-301-Expression im CD20+

NS-HL spielen könnte bleibt somit unklar.

Die im Vergleich zum MC-HL am stärksten heraufregulierte miRNA im CD20+ NS-HL

ist miR-618. Es wurde gezeigt, dass miR-618 in der myeloiden Leukämie-Zelllinie

HL-60 im Vergleich zu mononukleären peripheren Blutzellen überexprimiert wird (Vaz

et al., 2010). Möglicherweise ist ihre Heraufregulation im CD20+ NS-HL auf eine

DISKUSSION

89

chromosomale Aberration zurück zu führen; in einer Studie wurde nachgewiesen,

dass in einigen HL-Fällen ein Zugewinn der chromosomalern Region 12q15-21

auftritt, die unter anderem für miR-618 kodiert (Hartmann et al., 2008).

Warum die CD20+ NS-cHL sich bezüglich ihrer miRNA-Expression von den

histologisch ähnlicheren NS-cHL-Fällen abgrenzen, und eher den MC-cHL-Fällen

ähneln, konnte innerhalb dieser Arbeit nicht eruiert werden. Vor dem Hintergrund des

generellen Verlusts der B-Zell-Identität von HRS-Zellen (s. Kap. 1.4.3) stellen die

CD20-exprimierenden HL-Fälle eine sich histopathologisch von anderen cHL-Fällen

abgrenzende Subentität dar. Der B-Zell-Marker CD20 wird nur in einem Teil der cHL-

Fälle von HRS-Zellen ausgeprägt; in verschiedenen Studien wurde der ermittelte

prozentuale Anteil unterschiedlich mit 11, 22 und 35% angegeben (Portlock et al.,

2004; Rassidakis et al., 2002; Watanabe et al., 2000). Welche Bedeutung die CD20-

Expression in HRS-Zellen hat, ist bislang nicht geklärt; Studien, welche die

Korrelation zwischen CD20-Expression und der Prognose der Patienten

untersuchten, führten zu widersprüchlichen Ergebnissen. Rassidakis et al. konnten

keine Verbindung zwischen CD20-Expression und dem Rückfall-freien Überleben der

Patienten nach der Therapie feststellen (Rassidakis et al., 2002), während in einer

anderen Studie gezeigt wurde, dass die CD20-Expression in HRS-Zellen im

Vergleich zu CD20- cHL-Fällen mit einer signifikant schlechteren Prognose korreliert

(Portlock et al., 2004). Interessanterweise ist auch das MC-cHL mit einer

schlechteren Prognose (verglichen zum NS-cHL und NLPHL) assoziiert (Gough,

1970). In der hier durchgeführten unsupervised Clustering-Analyse aller HL-Proben

war eine Gruppierung von CD20+ NS/MC-HL und NS-HL/NLPHL in zwei getrennte

Arme des Dendogramms zu beobachten (s. Kap. 3.2.1), die somit auch eine

Unterteilung in HL mit besserer und schlechterer Prognose darstellen könnte.

Studien mit den HL-Zelllinien L-428 und KM-H2 haben außerdem gezeigt, dass diese

eine kleine Subpopulation monoklonaler, CD20+ B-Zellen beinhalten, die den

Stammzell-Marker ALDH exprimieren, und offensichtlich an der Generierung neuer

HRS-Zellen beteiligt sind. Es wurde vermutet, dass diese Zellen als ‚Initiatorzellen‘

des HL fungieren könnten (Jones et al., 2009). Möglicherweise weist eine CD20-

Expression von HRS-Zellen auf ein erhöhtes onkogenes Potential hin; dies wiederum

könnte im Zusammenhang mit der höheren Aggressivität des CD20+ NS-cHL im

Vergleich zum CD20- NS-cHL stehen.

DISKUSSION

90

4.2.5 Verwandtschaft von GC-B-Zellen, CD30+ GC-B-Zellen und HL-

Tumorzellen

Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob CD30+ GC-B-Zellen

möglicherweise eine engere Verwandtschaft zu HL-Tumorzellen aufweisen als

Gesamt-GC-B-Zellen, und somit als direkte Vorläuferzellen der ebenfalls CD30-

exprimierenden HRS-Zellen in Frage kommen. Durch eine unsupervised PCA konnte

gezeigt werden, dass HRS- und LP-Zellen keine engere Verwandtschaft zu CD30+

GC-B-Zellen als zu Gesamt-GC-B-Zellen zeigen. Es stellte sich jedoch heraus, dass

dies nicht auf die HL-Zelllinien zutrifft, die innerhalb der PCA deutlich näher an den

beiden GC-B-Entitäten als an den HL-Subgruppen lagen, und eng mit den CD30+

GC-B-Zellen assoziiert waren. Um die Gemeinsamkeiten der differentiellen miRNA-

Expression von HL-Tumorzellen und CD30+ GC-B-Zellen im Vergleich zu Gesamt-

GC-B-Zellen herauszuarbeiten, wurden zunächst die in CD30+ GC-B-Zellen

höchstregulierten Gene mittels eines paarweisen Vergleichs zu GC-B-Zellen

ermittelt. Es konnten 15 miRNAs bestimmt werden, deren Expression in CD30+ GC-

B-Zellen signifikant von der in Gesamt-GC-B-Zellen abweicht; darunter befanden sich

3 miRNAs, die Teil der hier ermittelten HL-spezifischen miRNA Signatur sind (miR-

28, -15b und -155). Außerdem konnten noch 3 weitere miRNAs identifiziert werden,

nämlich miR-148a und miR-16 (herabreguliert), sowie miR-126 (heraufreguliert), die

gemeinsam in mindestens 3 HL-Subtypen und den CD30+ GC-B-Zellen im Vergleich

zu Gesamt-GC-B-Zellen als reguliert bestimmt wurden. 2 dieser 3 miRNAs wurden

bereits in vorangegangenen Studien mit der Pathogenese von Krebserkrankungen

assoziiert: miR-148a ist im MCL, verglichen zu reaktiven Lymphknoten,

herabreguliert (Di Lisio et al., 2010) und miR-16 wurde als Tumorsuppressor in der

CLL identifiziert (Cimmino et al., 2005). MiR-126 hingegen ist einer der

Hauptregulatoren in der Angiogenese (Wang et al., 2008) und wird in mobilisierten

hämatopoetischen Stammzellen ausgeprägt (Jin et al., 2008).

Vor dem Hintergrund, dass die HL-spezifische miRNA-Signatur nur 6 Gene umfasst,

von denen 3 auch in den CD30+ GC-B-Zellen gleichgerichtet reguliert sind, und das

maligne HL-Tumorzellen sowie CD30+ GC-B-Zellen eine konsistente Regulation

weiterer potentiell onkogener bzw. tumorsupprimierender miRNAs zeigen, scheint es

denkbar, dass CD30+ GC-B-Zellen eine Vorläuferpopulation der malignen Zellen im

HL darstellen könnten.

DISKUSSION

91

4.3 Mutationsanalyse des Tumorsuppressorgens CYLD im cHL

4.3.1 Mutationsanalysen von CYLD in cHL-Zelllinien

Die konstitutive Aktivierung des NF-κB-Signalwegs ist von entscheidender

Bedeutung für Zellwachstum, Proliferation und Apoptose-Resistenz der malignen

HRS-Zellen im HL (Bargou et al., 1997). Vor dem Hintergrund, dass sowohl in HL-

Zelllinien als auch Primärfällen bereits inaktivierende Mutationen von NF-κB-

Repressoren wie IκBα, IκBε und TNFAIP3 (A20) identifiziert wurden (Cabannes et

al., 1999; Emmerich et al., 2003; Schmitz et al., 2009) war es von Interesse, den

Mutationsstatus des negativen NF-κB-Regulators CYLD im HL zu bestimmen, um zu

klären, ob inaktivierende Mutationen dieses Gens mitverantwortlich für die

konstitutive Aktivierung des NF-κB-Signalwegs im HL sind.

Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurden 6 HL-Zelllinien mittels RT-PCR auf ihren

CYLD-Mutationsstatus hin untersucht. Mit Ausnahme von KM-H2 wies keine der

Zelllinien inaktivierende Mutationen im CYLD-Gen auf. Es wurde bewiesen, dass in

KM-H2 kein Wildtyp-Transkript von CYLD generiert wird, sondern das verkürzte

mRNAs mit einer 5 bzw. 8 bp Deletion zu Beginn des Exons 16 transkribiert werden.

Mittels einer DNA-basierten PCR wurde anschließend gezeigt, dass dieser Effekt auf

einer Mutation der splice acceptor site von Exon 16 zurückzuführen ist, der zur

Nutzung zweier unterschiedlicher, kryptischer splice acceptor sites führt, die bereits

im kodierenden Bereich von Exon 16 lokalisiert sind. Das gänzliche Fehlen von

CYLD-Wildtyp-Transkripten in KM-H2 lässt sich auf die bereits bekannte Deletion

eines Allels von CYLD in KM-H2 zurückführen (Feys et al., 2007). Die hier

beobachteten 5 bzw. 8 bp-Deletionen in Exon 16 führen zu einer Verschiebung des

Leserasters, die in einer Zerstörung der katalytischen Domäne des Cyld-Proteins

durch prämature Stopcodons resultiert; es ist daher anzunehmen, dass Cyld in KM-

H2 seine Deubiquitinierungsfunktion, bzw. seine Rolle als negativer NF-κB-

Regulator, nicht erfüllen kann. Hierfür spricht auch, dass in der RT-PCR von KM-H2-

Zellen im Vergleich zu drei anderen HL-Zelllinien nur eine sehr geringe Expression

von CYLD-mRNA gefunden wurde; vermutlich wird die verkürzte, nicht-funktionelle

mRNA durch den nonsense-mediated decay-Mechanismus degradiert, so dass kaum

Protein translatiert werden kann. Der Versuch, diese Ergebnisse auf Protein-Ebene

zu validieren, misslang; trotz der Verwendung dreier verschiedener Antikörper

konnten im Western-Blot keine Cyld-spezifischen Banden detektiert werden. Es wäre

DISKUSSION

92

daher von Interesse, weitere Cyld-Antikörper zu testen, um die hier gezeigten

Ergebnisse auf Protein-Ebene bestätigen zu können.

4.3.1 Mutationsanalysen von CYLD in HRS-Zellen

Der Befund einer inaktivierenden CYLD-Mutation in der HL-Zelllinie KM-H2 ließ

vermuten, dass eventuell auch in HL-Primärfällen genetische Läsionen dieses Gens

auftreten können. Um dies zu verifizieren, musste zunächst ein sensitives 2-Runden-

PCR-Protokoll etabliert werden, mit dessen Hilfe alle 16 kodierenden Exons von

CYLD aus sehr geringen Zellmengen (1 – 20 Zellen) amplifiziert werden können.

Nach erfolgreicher Etablierung dieses Protokolls wurden 10 cHL-Fälle auf CYLD-

Mutationen hin analysiert; jedoch konnte in keinem der Fälle eine destruktive

Mutation nachgewiesen werden. Dennoch bedeutet dies nicht zwangsläufig, dass

CYLD-Mutationen, wie sie in KM-H2 gefunden wurden, im HL nicht rekurrent sind.

Die hier untersuchte Fallzahl ist relativ klein, und rekurrente genetische Aberrationen

im HL treten häufig nur in geringen Prozentzahlen der Fälle auf; es ist daher nicht

auszuschließen, dass bei einer Untersuchung einer größeren Anzahl primärer Fälle

weitere CYLD-Mutationen gefunden werden könnten. Zudem wurden die meisten der

bekannten Mutationen in negativen NF-κB-Regulatoren (s. Kap. 4.3.1) zunächst in

HL-Zelllinien identifiziert und später, oft in geringerer Frequenz, in Primärfällen

verifiziert. Zum Teil wurde in HL-Zelllinien Mutationen mehrerer NF-κB-Repressoren

beobachtet; so konnten in KM-H2 sowohl Mutationen des TNFAIP3-Gens (A20) als

auch von NFKBIA (IκBα) identifiziert werden (Cabannes et al., 1999; Emmerich et al.,

2003; Schmitz et al., 2009). Funktionelle Analysen zeigten, dass die Mutation beider

Gene zur konstituiven NF-κB-Aktivierung in KM-H2 beiträgt (Schmitz et al., 2009).

Die hier erarbeitete Identifikation eines weiteren mutierten NF-κB-Repressors in KM-

H2, nämlich des Tumorsuppressors CYLD, demonstriert, dass mehrere Mutationen

von NF-κB-Regulatoren in einem HRS-Klon präsent sein können. Dies bestätigt die

Theorie, dass multiple Faktoren zur konstitutiven NF-κB-Aktivierung im HL-beitragen.

Eine weitere Möglichkeit der CYLD-Inaktivierung besteht in epigenetischen

Mechanismen, wie Methylierung der CYLD-Promotorregion, oder post-

transkriptioneller Regulation der CYLD-mRNA durch miRNAs. Zu beiden

Mechanismen (CYLD betreffend) wurden bislang im HL keine Untersuchungen

durchgeführt. Eine vorangegangene Studie hat jedoch gezeigt, dass der

Transkriptionsfaktor STAT3, der im HL konstitutiv aktiv ist, die Transkription von miR-

DISKUSSION

93

181b induziert, und das die Translation von CYLD-mRNA durch miR-181b reprimiert

wird (Iliopoulos et al., 2010). Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde keine

statistisch signifikante Heraufregulation von miR-181b im HL, verglichen mit GC-B-

Zellen, bestimmt; dies liegt jedoch darin begründet, dass 2 der 5 GC-B-Zell-Proben

diese miRNA in hohem Maße exprimieren, während in den restlichen 3 Proben diese

miRNA nicht detektiert werden konnte. Alle MC-, CD20+ NS- und NLPHL-Fälle

jedoch exprimieren diese miRNA in hohem Maße, wohingegen ihre Ausprägung in 3

von 4 NS-cHL-Fällen nicht nachgewiesen werden konnte. Einen grafischen Überblick

über die miR-181b-Expression in HL-Fällen und GC-B-Zellen gibt Abbildung 23.

Abb. 23: MiR-181b-Expression in HL-Primärfällen und GC-B-Zellen. Aufgetragen sind logarithmisierte lineare Kehrwerte (lin. KW) der in der qPCR erhaltenen Ct-Werte, die mittels des Scaling Factors (SF) normlisiert wurden. Werte, die unterhalb der grünen Linie liegen, sind als „nicht detektiert“ zu verstehen; dass sie einen numerischen Wert >0,1 zeigen liegt darin begründet, dass der lineare Kehrwert von Ct 40 (= nicht detektiert in 40 PCR-Zyklen) gleich 1 ist; wird dieser mit den berechneten SFs normalisiert, resultiert dies in den gezeigten Werten zwischen 0,9 und 4,95. Schwarze Punkte zeigen die erhaltenen Einzelwerte für jede Probe, rote Querstriche die Mittelwerte der jeweiligen Gruppe.

Deutlich wird hier, dass die hohen Mittelwerte der NS-Fälle und GC-B-Zell-Proben

aus 1 bzw. 2 „Ausreisser“-Werten resultieren, während in den MC-, CD20+ NS- und

NLPHL-Fällen miR-181b konsistent hoch ausgeprägt wird. Vor diesem Hintergrund

wäre es interessant, die Ausprägung von CYLD und miR-181b in HL-Fällen zu

korrelieren, um zu klären, ob durch miR-181b tatsächlich eine CYLD-Repression im

HL induziert wird.

0,1

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0

100000,0

0 1 2 3 4 5 6

Log

(lin

. KW

Ct)

MC NS LP NS CD20+ GCB

AUSBLICK

94

5. Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe von miRNAs identifiziert, die

möglicherweise eine Rolle in der Pathogenese des HL spielen könnten.

Zunächst sollte die hier bestimmte Deregulation von miRNAs im HL mittels weiterer

Analysen, wie qPCR mit Einzelassays oder miRNA in situ-Hybridisierung (miRNA-

ISH), validiert werden. Zur Bestimmung der tatsächlichen pathogenetischen

Relevanz dieser miRNAs für das HL sollten zusätzlich funktionelle Studien, wie die

Inhibition oder ektopische Überexpression von miRNAs, in HL-Zelllinien durchgeführt

werden. Dies könnte Aufschluß über die regulatorische Funktion der betreffenden

miRNAs im HL geben. In der Diskussion dieser Arbeit wurden gezeigt, dass einige

der miRNAs, die als Teil der HL-spezifischen miRNA-Signatur definiert wurden, in

autoregulatorische Schleifen von im HL aberrant aktivierten Signalkaskaden involviert

sind, wie z.B. den NF-κB-, den mTOR- oder den Hedgehog-Signalweg. Es wäre von

Interesse, die Auswirkunge der Inhibition, bzw. Überexpression der betreffenden

miNAs in HL-Zelllinien auf die Ausprägung von Genen, die ebenfalls Teil dieser

Signalwege sind, zu untersuchen; dies könnte global mittels Genchips oder auf

Einzelmolekülebene mit qPCR-Assays erfolgen. Möglicherweise könnten auf diese

Weise nähere Einblicke in die Mechanismen der aberranten Aktivierung der

beschriebenen Signalwege gewonnen werden.

In dieser Arbeit wurden unter anderem auch solche miRNAs als im HL überexprimiert

bestimmt, die bereits in mehreren vorangegangenen Studien als OnkomiRs

identifiziert wurden; ein Beispiel hierfür ist miR-24, die mehrere

Tumorsupressorgene, wie CHEK, BRCA1 oder CDKN1B, negativ reguliert (Chhabra

et al., 2010). Hier wäre es interessant, durch funktionelle Studien zu prüfen, ob diese

Gene auch im HL durch miR-24 reguliert werden. Der Befund, dass die Expression

von miR-24 in Zelllinien des hepatozellulären Karzinoms durch TGF-β-Stimulation

induziert werden kann (Huang et al., 2008), legt außerden nahe, dass die

Heraufregulation dieser miRNA im HL durch eine autokrine Stimulation bedingt sein

könnte, da HRS-Zellen TGF-β sekretieren. Es wäre somit von Interesse, die

Expression von TGF-β und miR-24 in HRS-Zellen auf ihre Korrelation hin zu

analysieren. Des Weiteren sollte eine umfassende in silico Suche nach Target-

Genen der im HL als dereguliert bestimmten miRNAs erfolgen, um weitere

Erkenntnisse über ihre möglichen Funktionsweisen zu erhalten.

AUSBLICK

95

Neben der hier postulierten, für alle HL spezifischen miRNA-Signatur wurden auch

miRNAs identifiziert, deren Herauf- oder Herabregulation spezifisch für einzelne HL-

Subgruppen zu sein scheint. Dieser Befund sollte an weiteren Primärfällen validiert

werden, z.B. durch miRNA-ISH oder qPCR mit Einzelassays; möglicherweise könnte

die Etablierung solcher Protokolle sich als hilfreich für die zukünftige differentielle

Diagnistik unterschiedlicher HL-Subtypen erweisen.

Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass destruktive Mutationen des

Tumorsupressorgens CYLD keine entscheidende Rolle in der Pathogenese des cHL

spielen. Möglicherweise könnten jedoch epigenetische Mechanismen, wie eine

Promotermethylierung des CYLD-Gens, von Bedeutung für die Deaktivierung dieses

negativen NF-κB-Regulators sein. Eine Methylierung der CYLD-Promoterregion

könnte mittels einer Bisulfit-Sequenzierung analysiert werden. Ein anderer

Mechanismus der CYLD-Reprimierung im HL könnte die Translationsrepression

durch miRNAs sein; innerhalb dieser Arbeit wurde bereits diskutiert, dass CYLD ein

validiertes Target-Gen von miR-181b ist, die in allen HL-Subgruppen, mit Ausnahme

des NS-cHL, stark exprimiert wird. Da eine miRNA-vermittelte Translationsrepression

auch ohne nukleolytische Spaltung der Ziel-mRNA erfolgen kann, wäre sie durch

Analysen auf mRNA-Ebene nicht detektierbar; um eine Korrelation von miR-181b-

Expression und der Protein-Ausprägung von CYLD im HL herstellen zu können,

müßte zunächst ein geeignetes Western-Blot-Protokoll etabliert werden.

Des Weiteren wäre es von Interesse, bisher nicht untersuchte Suppressoren des NF-

κB-Signalwegs auf Mutationen, Promotermethylierung oder eine mögliche Regulation

durch miRNAs hin zu analysieren. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass Polymorphismen

in Regulatoren des NF-κB-Signalwegs einen Einfluss auf die Prognose und die

Überlebensrate von Multiplen Myelom-Patienten zeigen (Du et al., 2011); eine

Involvierung solcher Polymorphismen in NF-κB-Signalwegmolekülen in die

Pathogenese des HL ist somit ebenfalls denkbar, und sollte einer eingehenden

Analyse unterzogen werden.

ZUSAMMENFASSUNG

96

6. Zusammenfassung

Innerhalb der vorliegenden Dissertationsschrift konnten neue Erkenntnisse über

pathogenetische Mechanismen im HL gewonnen werden.

Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Deregulation von miRNAs im HL und

ihrer möglichen Bedeutung für die Pathogenese dieser Erkrankung. Durch die

Etablierung einer stabilen Methode zur Gewinnung und Amplifikation von miRNAs

aus einer geringen Anzahl mikrodissektierter Zellen konnten erstmalig vergleichende

Analysen der miRnome von HRS- und LP-Zellen, sowie ihren Vorläuferzellen, den

GC-B-Zellen, durchgeführt werden. Alle HL-Fälle wiesen eine spezifische miRNA-

Signatur, bestehend aus 6 Genen, auf, die sie grundsätzlich von GC-B-Zellen

unterscheidet. Einige dieser miRNAs sind Bestandteil autoregulatorischer Feedback-

schleifen von Signalwegen, die im HL konstitutiv aktiv sind. Dies bestätigt die

Vermutung, dass die Deregulation von miRNAs eine bedeutende Rolle in der

Pathogenese des HL spielt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich verschiedene

HL-Subtypen anhand der differentiellen Expression weniger miRNAs unterscheiden

lassen; dies könnte in Zukunft von Nutzen in der Diagnostik sein. Anhand der

miRnom-Analysen wurde außerdem festgestellt, dass CD20+ NS-HL offenbar eine

eigene Subentität des HL darstellen, die sich durch ihre differentielle miRNA-

Expression von anderen HL-Subtypen abgrenzen. Ebenfalls konnte gezeigt werden,

dass sich HL-Zelllinien in ihrer miRNA-Expression deutlich von den HL-Fällen

unterscheiden, was die Notwendigkeit von Analysen an Primärfällen unterstreicht.

Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Frage, ob CD30+ GC-B-Zellen bezüglich

ihrer miRNA-Expression eine engere Verwandtschaft zum HL aufweisen als GC-B-

Zellen im Allgemeinen, und somit eventuell als Vorläuferzellen der ebenfalls CD30+

HRS-Zellen in Frage kommen. Es konnte gezeigt werden, dass CD30+ GC-B-Zellen

zwar keine offensichtliche Verwandtschaft zu HL-Primärfällen aufweisen, jedoch in

ihrer miRNA-Expression den HL-Zelllinien ähneln. Weiterführende Analysen ergaben

außerdem, dass einige miRNAs, die in allen HL im Vergleich zu GC-B-Zellen

differentiell exprimiert werden, auch CD30+ GC-B-Zellen gleichgerichtet reguliert

sind; es scheint somit denkbar, dass letztere tatsächlich eine Vorläuferpopulation der

malignen Zellen im HL darstellen könnten.

ZUSAMMENFASSUNG

97

Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die Mutationsanalyse des negativen NF-κB-

Regulators CYLD in HL-Zelllinien und Primärfällen. Es wurde gezeigt, dass die HL-

Zelllinie KM-H2 eine destruktive Mutation im CYLD-Gen aufweist, die zum Verlust der

Deubiquitinierungsfunktion des Proteins führt. Jedoch konnte diese genetische

Läsion weder in anderen HL-Zelllinien noch in mikrodissektierten HRS-Zellen aus

Primärfällen gefunden werden. Dies lässt darauf schließen, dass inaktivierende

CYLD-Mutationen keine tragende Rolle in der Pathogenese des HL spielen.

LITERATUR

98

Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Davis, R.E., Ma, C., Lossos, I.S., Rosenwald, A., Boldrick, J.C., Sabet, H., Tran, T., Yu, X., et al. (2000). Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 403, 503-511.

Allen, C.D., Okada, T., Tang, H.L., und Cyster, J.G. (2007). Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science 315, 528-531.

Alzona, M., Jack, H.M., Fisher, R.I., und Ellis, T.M. (1994). CD30 defines a subset of activated human T cells that produce IFN-gamma and IL-5 and exhibit enhanced B cell helper activity. J Immunol 153, 2861-2867.

Ambros, V. (2004). The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355.

Anagnostopoulos, I., Herbst, H., Niedobitek, G., und Stein, H. (1989). Demonstration of monoclonal EBV genomes in Hodgkin's disease and Ki-1-positive anaplastic large cell lymphoma by combined Southern blot and in situ hybridization. Blood 74, 810-816.

Annunziata, C.M., Davis, R.E., Demchenko, Y., Bellamy, W., Gabrea, A., Zhan, F., Lenz, G., Hanamura, I., Wright, G., Xiao, W., et al. (2007). Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer Cell 12, 115-130.

Atayar, C., Poppema, S., Blokzijl, T., Harms, G., Boot, M., und van den Berg, A. (2005). Expression of the T-cell transcription factors, GATA-3 and T-bet, in the neoplastic cells of Hodgkin lymphomas. Am J Pathol 166, 127-134.

Bai, M., Papoudou-Bai, A., Kitsoulis, P., Horianopoulos, N., Kamina, S., Agnantis, N.J., und Kanavaros, P. (2005). Cell cycle and apoptosis deregulation in classical Hodgkin lymphomas. In Vivo 19, 439-453.

Baltimore, D., Boldin, M.P., O'Connell, R.M., Rao, D.S., und Taganov, K.D. (2008). MicroRNAs: new regulators of immune cell development and function. Nat Immunol 9, 839-845.

Bargou, R.C., Emmerich, F., Krappmann, D., Bommert, K., Mapara, M.Y., Arnold, W., Royer, H.D., Grinstein, E., Greiner, A., Scheidereit, C., et al. (1997). Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin's disease tumor cells. J Clin Invest 100, 2961-2969.

Barth, T.F., Martin-Subero, J.I., Joos, S., Menz, C.K., Hasel, C., Mechtersheimer, G., Parwaresch, R.M., Lichter, P., Siebert, R., und Mooller, P. (2003). Gains of 2p involving the REL locus correlate with nuclear c-Rel protein accumulation in neoplastic cells of classical Hodgkin lymphoma. Blood 101, 3681-3686.

Bechtel, D., Kurth, J., Unkel, C., und Kuppers, R. (2005). Transformation of BCR-deficient germinal-center B cells by EBV supports a major role of the virus in the pathogenesis of Hodgkin and posttransplantation lymphomas. Blood 106, 4345-4350.

Berek, C., Berger, A., und Apel, M. (1991). Maturation of the immune response in germinal centers. Cell 67, 1121-1129.

Bertrand, S., Berger, R., Philip, T., Bernheim, A., Bryon, P.A., Bertoglio, J., Dore, J.F., Brunat-Mentigny, M., und Lenoir, G.M. (1981). Variant translocation in a non endemic case of Burkitt's lymphoma: t (8;22) in an Epstein--Barr virus negative tumour and in a derived cell line. Eur J Cancer 17, 577-584.

LITERATUR

99

Bignell, G.R., Warren, W., Seal, S., Takahashi, M., Rapley, E., Barfoot, R., Green, H., Brown, C., Biggs, P.J., Lakhani, S.R., et al. (2000). Identification of the familial cylindromatosis tumour-suppressor gene. Nat Genet 25, 160-165.

Bohnsack, M.T., Czaplinski, K., und Gorlich, D. (2004). Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs. RNA 10, 185-191.

Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M., und Speed, T.P. (2003). A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19, 185-193.

Bonizzi, G., und Karin, M. (2004). The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol 25, 280-288.

Bose, S., Starczynski, J., Chukwuma, M., Baumforth, K., Wei, W., Morgan, S., Byrd, P., Ying, J., Grundy, R., Mann, J.R., et al. (2007). Down-regulation of ATM protein in HRS cells of nodular sclerosis Hodgkin's lymphoma in children occurs in the absence of ATM gene inactivation. J Pathol 213, 329-336.

Bowman, T., Garcia, R., Turkson, J., und Jove, R. (2000). STATs in oncogenesis. Oncogene 19, 2474-2488.

Braeuninger, A., Kuppers, R., Strickler, J.G., Wacker, H.H., Rajewsky, K., und Hansmann, M.L. (1997). Hodgkin and Reed-Sternberg cells in lymphocyte predominant Hodgkin disease represent clonal populations of germinal center-derived tumor B cells. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 9337-9342.

Bransteitter, R., Pham, P., Scharff, M.D., und Goodman, M.F. (2003). Activation-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4102-4107.

Bräuninger, A., Hansmann, M.L., Strickler, J.G., Dummer, R., Burg, G., Rajewsky, K., und Kuppers, R. (1999). Identification of common germinal-center B-cell precursors in two patients with both Hodgkin's disease and non-Hodgkin's lymphoma. N Engl J Med 340, 1239-1247.

Bräuninger, A., Schmitz, R., Bechtel, D., Renne, C., Hansmann, M.L., und Kuppers, R. (2006). Molecular biology of Hodgkin's and Reed/Sternberg cells in Hodgkin's lymphoma. Int J Cancer 118, 1853-1861.

Brennecke, J., Stark, A., Russell, R.B., und Cohen, S.M. (2005). Principles of microRNA-target recognition. PLoS Biol 3, e85.

Bushati, N., und Cohen, S.M. (2007). microRNA functions. Annu Rev Cell Dev Biol 23, 175-205.

Cabannes, E., Khan, G., Aillet, F., Jarrett, R.F., und Hay, R.T. (1999). Mutations in the IkBa gene in Hodgkin's disease suggest a tumour suppressor role for IkappaBalpha. Oncogene 18, 3063-3070.

Calin, G.A., Dumitru, C.D., Shimizu, M., Bichi, R., Zupo, S., Noch, E., Aldler, H., Rattan, S., Keating, M., Rai, K., et al. (2002). Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 15524-15529.

Calin, G.A., Liu, C.G., Sevignani, C., Ferracin, M., Felli, N., Dumitru, C.D., Shimizu, M., Cimmino, A., Zupo, S., Dono, M., et al. (2004). MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 11755-11760.

LITERATUR

100

Cameron, J.E., Fewell, C., Yin, Q., McBride, J., Wang, X., Lin, Z., und Flemington, E.K. (2008a). Epstein-Barr virus growth/latency III program alters cellular microRNA expression. Virology 382, 257-266.

Cameron, J.E., Yin, Q., Fewell, C., Lacey, M., McBride, J., Wang, X., Lin, Z., Schaefer, B.C., und Flemington, E.K. (2008b). Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 induces cellular MicroRNA miR-146a, a modulator of lymphocyte signaling pathways. J Virol 82, 1946-1958.

Cattoretti, G., Chang, C.C., Cechova, K., Zhang, J., Ye, B.H., Falini, B., Louie, D.C., Offit, K., Chaganti, R.S., und Dalla-Favera, R. (1995). BCL-6 protein is expressed in germinal-center B cells. Blood 86, 45-53.

Chapman, C.J., Wright, D., und Stevenson, F.K. (1998). Insight into Burkitt's lymphoma from immunoglobulin variable region gene analysis. Leuk Lymphoma 30, 257-267.

Chen, P.Y., und Meister, G. (2005). microRNA-guided posttranscriptional gene regulation. Biol Chem 386, 1205-1218.

Chhabra, R., Dubey, R., und Saini, N. (2010). Cooperative and individualistic functions of the microRNAs in the miR-23a~27a~24-2 cluster and its implication in human diseases. Mol Cancer 9, 232.

Cimmino, A., Calin, G.A., Fabbri, M., Iorio, M.V., Ferracin, M., Shimizu, M., Wojcik, S.E., Aqeilan, R.I., Zupo, S., Dono, M., et al. (2005). miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 13944-13949.

Clurman, B.E., und Hayward, W.S. (1989). Multiple proto-oncogene activations in avian leukosis virus-induced lymphomas: evidence for stage-specific events. Mol Cell Biol 9, 2657-2664.

Costinean, S., Zanesi, N., Pekarsky, Y., Tili, E., Volinia, S., Heerema, N., und Croce, C.M. (2006). Pre-B cell proliferation and lymphoblastic leukemia/high-grade lymphoma in E(mu)-miR155 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 7024-7029.

Daheron, L., Veinstein, A., Brizard, F., Drabkin, H., Lacotte, L., Guilhot, F., Larsen, C.J., Brizard, A., und Roche, J. (2001). Human LPP gene is fused to MLL in a secondary acute leukemia with a t(3;11) (q28;q23). Genes Chromosomes Cancer 31, 382-389.

Dahiya, N., Sherman-Baust, C.A., Wang, T.L., Davidson, B., Shih Ie, M., Zhang, Y., Wood, W., 3rd, Becker, K.G., und Morin, P.J. (2008). MicroRNA expression and identification of putative miRNA targets in ovarian cancer. PLoS One 3, e2436.

Damle, R.N., Wasil, T., Fais, F., Ghiotto, F., Valetto, A., Allen, S.L., Buchbinder, A., Budman, D., Dittmar, K., Kolitz, J., et al. (1999). Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 94, 1840-1847.

De, J., und Brown, R.E. (2010). Tissue-microarray based immunohistochemical analysis of survival pathways in nodular sclerosing classical Hodgkin lymphoma as compared with Non-Hodgkin's lymphoma. Int J Clin Exp Med 3, 55-68.

Delabie, J., Chan, W.C., Weisenburger, D.D., und De Wolf-Peeters, C. (1995). The antigen-presenting cell function of Reed-Sternberg cells. Leuk Lymphoma 18, 35-40.

Delabie, J., Shipman, R., Bruggen, J., De Strooper, B., van Leuven, F., Tarcsay, L., Cerletti, N., Odink, K., Diehl, V., Bilbe, G., et al. (1992). Expression of the novel intermediate filament-associated protein restin in Hodgkin's disease and anaplastic large-cell lymphoma. Blood 80, 2891-2896.

LITERATUR

101

Denepoux, S., Razanajaona, D., Blanchard, D., Meffre, G., Capra, J.D., Banchereau, J., und Lebecque, S. (1997). Induction of somatic mutation in a human B cell line in vitro. Immunity 6, 35-46.

Denli, A.M., Tops, B.B., Plasterk, R.H., Ketting, R.F., und Hannon, G.J. (2004). Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 432, 231-235.

Di Lisio, L., Gomez-Lopez, G., Sanchez-Beato, M., Gomez-Abad, C., Rodriguez, M.E., Villuendas, R., Ferreira, B.I., Carro, A., Rico, D., Mollejo, M., et al. (2010). Mantle cell lymphoma: transcriptional regulation by microRNAs. Leukemia 24, 1335-1342.

Di Noia, J.M., und Neuberger, M.S. (2007). Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation. Annu Rev Biochem 76, 1-22.

Dorsett, Y., McBride, K.M., Jankovic, M., Gazumyan, A., Thai, T.H., Robbiani, D.F., Di Virgilio, M., Reina San-Martin, B., Heidkamp, G., Schwickert, T.A., et al. (2008). MicroRNA-155 suppresses activation-induced cytidine deaminase-mediated Myc-Igh translocation. Immunity 28, 630-638.

Drexler, H.G. (1992). Recent results on the biology of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. I. Biopsy material. Leuk Lymphoma 8, 283-313.

Drexler, H.G. (1993). Recent results on the biology of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. II. Continuous cell lines. Leuk Lymphoma 9, 1-25.

Du, J., Huo, J., Shi, J., Yuan, Z., Zhang, C., Fu, W., Jiang, H., Yi, Q., und Hou, J. (2011). Polymorphisms of NF-{kappa}B family genes are associated with development of multiple myeloma and treatment outcome in patients undergoing bortezomib-based regimens. Haematologica.

Du, T., und Zamore, P.D. (2005). microPrimer: the biogenesis and function of microRNA. Development 132, 4645-4652.

Dutton, A., Reynolds, G.M., Dawson, C.W., Young, L.S., und Murray, P.G. (2005). Constitutive activation of phosphatidyl-inositide 3 kinase contributes to the survival of Hodgkin's lymphoma cells through a mechanism involving Akt kinase and mTOR. J Pathol 205, 498-506.

Dutton, A., Woodman, C.B., Chukwuma, M.B., Last, J.I., Wei, W., Vockerodt, M., Baumforth, K.R., Flavell, J.R., Rowe, M., Taylor, A.M., et al. (2007). Bmi-1 is induced by the Epstein-Barr virus oncogene LMP1 and regulates the expression of viral target genes in Hodgkin lymphoma cells. Blood 109, 2597-2603.

Eis, P.S., Tam, W., Sun, L., Chadburn, A., Li, Z., Gomez, M.F., Lund, E., und Dahlberg, J.E. (2005). Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 3627-3632.

Ellis, P.A., Hart, D.N., Colls, B.M., Nimmo, J.C., MacDonald, J.E., und Angus, H.B. (1992). Hodgkin's cells express a novel pattern of adhesion molecules. Clin Exp Immunol 90, 117-123.

Emmerich, F., Theurich, S., Hummel, M., Haeffker, A., Vry, M.S., Dohner, K., Bommert, K., Stein, H., und Dorken, B. (2003). Inactivating I kappa B epsilon mutations in Hodgkin/Reed-Sternberg cells. J Pathol 201, 413-420.

Fenton, J.A., Pratt, G., Rothwell, D.G., Rawstron, A.C., und Morgan, G.J. (2004). Translocation t(11;14) in multiple myeloma: Analysis of translocation breakpoints on der(11) and der(14) chromosomes suggests complex molecular mechanisms of recombination. Genes Chromosomes Cancer 39, 151-155.

LITERATUR

102

Ferretti, E., De Smaele, E., Miele, E., Laneve, P., Po, A., Pelloni, M., Paganelli, A., Di Marcotullio, L., Caffarelli, E., Screpanti, I., et al. (2008). Concerted microRNA control of Hedgehog signalling in cerebellar neuronal progenitor and tumour cells. EMBO J 27, 2616-2627.

Feys, T., Poppe, B., De Preter, K., Van Roy, N., Verhasselt, B., De Paepe, P., De Paepe, A., und Speleman, F. (2007). A detailed inventory of DNA copy number alterations in four commonly used Hodgkin's lymphoma cell lines. Haematologica 92, 913-920.

Filipowicz, W., Bhattacharyya, S.N., und Sonenberg, N. (2008). Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genet 9, 102-114.

Filipowicz, W., Jaskiewicz, L., Kolb, F.A., und Pillai, R.S. (2005). Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Curr Opin Struct Biol 15, 331-341.

Fisher, R.I. (2003). Overview of non-Hodgkin's lymphoma: biology, staging, and treatment. Semin Oncol 30, 3-9.

Fiumara, P., Snell, V., Li, Y., Mukhopadhyay, A., Younes, M., Gillenwater, A.M., Cabanillas, F., Aggarwal, B.B., und Younes, A. (2001). Functional expression of receptor activator of nuclear factor kappaB in Hodgkin disease cell lines. Blood 98, 2784-2790.

Gaidano, G., Ballerini, P., Gong, J.Z., Inghirami, G., Neri, A., Newcomb, E.W., Magrath, I.T., Knowles, D.M., und Dalla-Favera, R. (1991). p53 mutations in human lymphoid malignancies: association with Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 5413-5417.

Gatter, K.C., Warnke, R.A., ed. (2001). Diffuse large B-cell lymphoma. In Eorld Health organization Classification of tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Haematopoietic and Lymphiod Tissues (Lyon, IARC Press).

Gatto, G., Rossi, A., Rossi, D., Kroening, S., Bonatti, S., und Mallardo, M. (2008). Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 trans-activates miR-155 transcription through the NF-kappaB pathway. Nucleic Acids Res 36, 6608-6619.

Gee, H.E., Buffa, F.M., Camps, C., Ramachandran, A., Leek, R., Taylor, M., Patil, M., Sheldon, H., Betts, G., Homer, J., et al. (2011). The small-nucleolar RNAs commonly used for microRNA normalisation correlate with tumour pathology and prognosis. Br J Cancer 104, 1168-1177.

Gelebart, P., Anand, M., Armanious, H., Peters, A.C., Dien Bard, J., Amin, H.M., und Lai, R. (2008). Constitutive activation of the Wnt canonical pathway in mantle cell lymphoma. Blood 112, 5171-5179.

Gellert, M. (2002). V(D)J recombination: RAG proteins, repair factors, and regulation. Annu Rev Biochem 71, 101-132.

Gentleman, R.C., Carey, V.J., Bates, D.M., Bolstad, B., Dettling, M., Dudoit, S., Ellis, B., Gautier, L., Ge, Y., Gentry, J., et al. (2004). Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 5, R80.

Gibcus, J.H., Tan, L.P., Harms, G., Schakel, R.N., de Jong, D., Blokzijl, T., Moller, P., Poppema, S., Kroesen, B.J., und van den Berg, A. (2009). Hodgkin lymphoma cell lines are characterized by a specific miRNA expression profile. Neoplasia 11, 167-176.

LITERATUR

103

Gires, O., Kohlhuber, F., Kilger, E., Baumann, M., Kieser, A., Kaiser, C., Zeidler, R., Scheffer, B., Ueffing, M., und Hammerschmidt, W. (1999). Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus interacts with JAK3 and activates STAT proteins. EMBO J 18, 3064-3073.

Gires, O., Zimber-Strobl, U., Gonnella, R., Ueffing, M., Marschall, G., Zeidler, R., Pich, D., und Hammerschmidt, W. (1997). Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus mimics a constitutively active receptor molecule. EMBO J 16, 6131-6140.

Gisselsson, D. (2002). Tumour morphology--interplay between chromosome aberrations and founder cell differentiation. Histol Histopathol 17, 1207-1212.

Glaser, S.L., und Jarrett, R.F. (1996). The epidemiology of Hodgkin's disease. Baillieres Clin Haematol 9, 401-416.

Goossens, T., Klein, U., und Kuppers, R. (1998). Frequent occurrence of deletions and duplications during somatic hypermutation: implications for oncogene translocations and heavy chain disease. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 2463-2468.

Gottardo, F., Liu, C.G., Ferracin, M., Calin, G.A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., et al. (2007). Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol Oncol 25, 387-392.

Gough, J. (1970). Hodgkin's disease; a correlation of histopathology with survival. Int J Cancer 5, 273-281.

Greaves, W.O., Kim JE, Singh RR, Drakos E, Kunkalla K, Sánchez-Espiridión B, Garcia JF, Medeiros LJ, Vega F. (im Druck). Glioma associated oncogene homologue 3 (GLI3), a Hedgehog transcription factor, is highly expressed in hodgkin and Reed-Sternberg cells of Classical Hodgkin lymphoma. Hum Pathol.

Griffiths-Jones, S. (2007). Annotating noncoding RNA genes. Annu Rev Genomics Hum Genet 8, 279-298.

Grimson, A., Farh, K.K., Johnston, W.K., Garrett-Engele, P., Lim, L.P., und Bartel, D.P. (2007). MicroRNA targeting specificity in mammals: determinants beyond seed pairing. Mol Cell 27, 91-105.

Gumy-Pause, F., Wacker, P., und Sappino, A.P. (2004). ATM gene and lymphoid malignancies. Leukemia 18, 238-242.

Harris, N.L. (1999). Hodgkin's lymphomas: classification, diagnosis, and grading. Semin Hematol 36, 220-232.

Hartmann, S., Martin-Subero, J.I., Gesk, S., Husken, J., Giefing, M., Nagel, I., Riemke, J., Chott, A., Klapper, W., Parrens, M., et al. (2008). Detection of genomic imbalances in microdissected Hodgkin and Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin's lymphoma by array-based comparative genomic hybridization. Haematologica 93, 1318-1326.

Hay, N., und Sonenberg, N. (2004). Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev 18, 1926-1945.

Hayden, M.S., und Ghosh, S. (2008). Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell 132, 344-362.

He, H., Jazdzewski, K., Li, W., Liyanarachchi, S., Nagy, R., Volinia, S., Calin, G.A., Liu, C.G., Franssila, K., Suster, S., et al. (2005). The role of microRNA genes in papillary thyroid carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 19075-19080.

LITERATUR

104

Hecht, J.L., und Aster, J.C. (2000). Molecular biology of Burkitt's lymphoma. J Clin Oncol 18, 3707-3721.

Heesch, S., Schlee, C., Neumann, M., Stroux, A., Kuhnl, A., Schwartz, S., Haferlach, T., Goekbuget, N., Hoelzer, D., Thiel, E., et al. (2010). BAALC-associated gene expression profiles define IGFBP7 as a novel molecular marker in acute leukemia. Leukemia 24, 1429-1436.

Hendrickson, D.G., Hogan, D.J., McCullough, H.L., Myers, J.W., Herschlag, D., Ferrell, J.E., und Brown, P.O. (2009). Concordant regulation of translation and mRNA abundance for hundreds of targets of a human microRNA. PLoS Biol 7, e1000238.

Henke, J.I., Goergen, D., Zheng, J., Song, Y., Schuttler, C.G., Fehr, C., Junemann, C., und Niepmann, M. (2008). microRNA-122 stimulates translation of hepatitis C virus RNA. EMBO J 27, 3300-3310.

Henle, G., Henle, W., und Diehl, V. (1968). Relation of Burkitt's tumor-associated herpes-ytpe virus to infectious mononucleosis. Proc Natl Acad Sci U S A 59, 94-101.

Hinz, M., Lemke, P., Anagnostopoulos, I., Hacker, C., Krappmann, D., Mathas, S., Dorken, B., Zenke, M., Stein, H., und Scheidereit, C. (2002). Nuclear factor kappaB-dependent gene expression profiling of Hodgkin's disease tumor cells, pathogenetic significance, and link to constitutive signal transducer and activator of transcription 5a activity. J Exp Med 196, 605-617.

Hodgkin (1832). On some Morbid Appearances of the Absorbent Glands and Spleen. Med Chir Trans 17, 68-114.

Huang, J.Z., Sanger, W.G., Greiner, T.C., Staudt, L.M., Weisenburger, D.D., Pickering, D.L., Lynch, J.C., Armitage, J.O., Warnke, R.A., Alizadeh, A.A., et al. (2002). The t(14;18) defines a unique subset of diffuse large B-cell lymphoma with a germinal center B-cell gene expression profile. Blood 99, 2285-2290.

Huang, S., He, X., Ding, J., Liang, L., Zhao, Y., Zhang, Z., Yao, X., Pan, Z., Zhang, P., Li, J., et al. (2008). Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer 123, 972-978.

Huang, Z., Huang, S., Wang, Q., Liang, L., Ni, S., Wang, L., Sheng, W., He, X., und Du, X. (2011). MicroRNA-95 Promotes Cell Proliferation and Targets Sorting Nexin 1 in Human Colorectal Carcinoma. Cancer Res 71, 2582-2589.

Hummel, M., Bentink, S., Berger, H., Klapper, W., Wessendorf, S., Barth, T.F., Bernd, H.W., Cogliatti, S.B., Dierlamm, J., Feller, A.C., et al. (2006). A biologic definition of Burkitt's lymphoma from transcriptional and genomic profiling. N Engl J Med 354, 2419-2430.

Hummel, M., Marafioti, T., Ziemann, K., und Stein, H. (1996). Ig rearrangements in isolated Reed-Sternberg cells: conclusions from four different studies. Ann Oncol 7 Suppl 4, 31-33.

Iliopoulos, D., Jaeger, S.A., Hirsch, H.A., Bulyk, M.L., und Struhl, K. (2010). STAT3 activation of miR-21 and miR-181b-1 via PTEN and CYLD are part of the epigenetic switch linking inflammation to cancer. Mol Cell 39, 493-506.

Iorio, M.V., Visone, R., Di Leva, G., Donati, V., Petrocca, F., Casalini, P., Taccioli, C., Volinia, S., Liu, C.G., Alder, H., et al. (2007). MicroRNA signatures in human ovarian cancer. Cancer Res 67, 8699-8707.

LITERATUR

105

Iqbal, J., Greiner, T.C., Patel, K., Dave, B.J., Smith, L., Ji, J., Wright, G., Sanger, W.G., Pickering, D.L., Jain, S., et al. (2007). Distinctive patterns of BCL6 molecular alterations and their functional consequences in different subgroups of diffuse large B-cell lymphoma. Leukemia 21, 2332-2343.

Irsch, J., Nitsch, S., Hansmann, M.L., Rajewsky, K., Tesch, H., Diehl, V., Jox, A., Kuppers, R., und Radbruch, A. (1998). Isolation of viable Hodgkin and Reed-Sternberg cells from Hodgkin disease tissues. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10117-10122.

Jacob, J., und Kelsoe, G. (1992). In situ studies of the primary immune response to (4-hydroxy-3-nitrophenyl)acetyl. II. A common clonal origin for periarteriolar lymphoid sheath-associated foci and germinal centers. J Exp Med 176, 679-687.

Jaffe, E.S., ed. (2001). WHO Classification of Tumors: Pathology and Genetics of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. (Lyon, IARC Press.).

Janeway, C., und Travers, P. (1997). Immunobiology : the immune system in health and disease, 3rd edn (London; San Francisco;New York, Current Biology; Garland Pub.).

Jarrett, R.F., und MacKenzie, J. (1999). Epstein-Barr virus and other candidate viruses in the pathogenesis of Hodgkin's disease. Semin Hematol 36, 260-269.

Jin, P., Wang, E., Ren, J., Childs, R., Shin, J.W., Khuu, H., Marincola, F.M., und Stroncek, D.F. (2008). Differentiation of two types of mobilized peripheral blood stem cells by microRNA and cDNA expression analysis. J Transl Med 6, 39.

Jones, R.J., Gocke, C.D., Kasamon, Y.L., Miller, C.B., Perkins, B., Barber, J.P., Vala, M.S., Gerber, J.M., Gellert, L.L., Siedner, M., et al. (2009). Circulating clonotypic B cells in classic Hodgkin lymphoma. Blood 113, 5920-5926.

Joos, S., Kupper, M., Ohl, S., von Bonin, F., Mechtersheimer, G., Bentz, M., Marynen, P., Moller, P., Pfreundschuh, M., Trumper, L., et al. (2000). Genomic imbalances including amplification of the tyrosine kinase gene JAK2 in CD30+ Hodgkin cells. Cancer Res 60, 549-552.

Joos, S., Menz, C.K., Wrobel, G., Siebert, R., Gesk, S., Ohl, S., Mechtersheimer, G., Trumper, L., Moller, P., Lichter, P., et al. (2002). Classical Hodgkin lymphoma is characterized by recurrent copy number gains of the short arm of chromosome 2. Blood 99, 1381-1387.

Jundt, F., Acikgoz, O., Kwon, S.H., Schwarzer, R., Anagnostopoulos, I., Wiesner, B., Mathas, S., Hummel, M., Stein, H., Reichardt, H.M., et al. (2008). Aberrant expression of Notch1 interferes with the B-lymphoid phenotype of neoplastic B cells in classical Hodgkin lymphoma. Leukemia 22, 1587-1594.

Jundt, F., Anagnostopoulos, I., Forster, R., Mathas, S., Stein, H., und Dorken, B. (2002). Activated Notch1 signaling promotes tumor cell proliferation and survival in Hodgkin and anaplastic large cell lymphoma. Blood 99, 3398-3403.

Jungnickel, B., Staratschek-Jox, A., Brauninger, A., Spieker, T., Wolf, J., Diehl, V., Hansmann, M.L., Rajewsky, K., und Kuppers, R. (2000). Clonal deleterious mutations in the IkappaBalpha gene in the malignant cells in Hodgkin's lymphoma. J Exp Med 191, 395-402.

Kanavaros, P., Vlychou, M., Stefanaki, K., Rontogianni, D., Gaulard, P., Pantelidaki, E., Zois, M., Darivianaki, K., Georgoulias, V., Boulland, M.L., et al. (1999). Cytotoxic protein expression in non-Hodgkin's lymphomas and Hodgkin's disease. Anticancer Res 19, 1209-1216.

LITERATUR

106

Kanzler, H., Kuppers, R., Hansmann, M.L., und Rajewsky, K. (1996). Hodgkin and Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease represent the outgrowth of a dominant tumor clone derived from (crippled) germinal center B cells. J Exp Med 184, 1495-1505.

Kapp, U., Wolf, J., Hummel, M., Pawlita, M., von Kalle, C., Dallenbach, F., Schwonzen, M., Krueger, G.R., Muller-Lantzsch, N., Fonatsch, C., et al. (1993). Hodgkin's lymphoma-derived tissue serially transplanted into severe combined immunodeficient mice. Blood 82, 1247-1256.

Kapp, U., Yeh, W.C., Patterson, B., Elia, A.J., Kagi, D., Ho, A., Hessel, A., Tipsword, M., Williams, A., Mirtsos, C., et al. (1999). Interleukin 13 is secreted by and stimulates the growth of Hodgkin and Reed-Sternberg cells. J Exp Med 189, 1939-1946.

Kato, M., Sanada, M., Kato, I., Sato, Y., Takita, J., Takeuchi, K., Niwa, A., Chen, Y., Nakazaki, K., Nomoto, J., et al. (2009). Frequent inactivation of A20 in B-cell lymphomas. Nature 459, 712-716.

Keats, J.J., Fonseca, R., Chesi, M., Schop, R., Baker, A., Chng, W.J., Van Wier, S., Tiedemann, R., Shi, C.X., Sebag, M., et al. (2007). Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer Cell 12, 131-144.

Kieser, A., Kilger, E., Gires, O., Ueffing, M., Kolch, W., und Hammerschmidt, W. (1997). Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 triggers AP-1 activity via the c-Jun N-terminal kinase cascade. EMBO J 16, 6478-6485.

Kilger, E., Kieser, A., Baumann, M., und Hammerschmidt, W. (1998). Epstein-Barr virus-mediated B-cell proliferation is dependent upon latent membrane protein 1, which simulates an activated CD40 receptor. EMBO J 17, 1700-1709.

Klein, U., und Dalla-Favera, R. (2005). New insights into the phenotype and cell derivation of B cell chronic lymphocytic leukemia. Curr Top Microbiol Immunol 294, 31-49.

Klein, U., und Dalla-Favera, R. (2008). Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nat Rev Immunol 8, 22-33.

Klein, U., Tu, Y., Stolovitzky, G.A., Keller, J.L., Haddad, J., Jr., Miljkovic, V., Cattoretti, G., Califano, A., und Dalla-Favera, R. (2003). Transcriptional analysis of the B cell germinal center reaction. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2639-2644.

Kluiver, J., Poppema, S., de Jong, D., Blokzijl, T., Harms, G., Jacobs, S., Kroesen, B.J., und van den Berg, A. (2005). BIC and miR-155 are highly expressed in Hodgkin, primary mediastinal and diffuse large B cell lymphomas. J Pathol 207, 243-249.

Kozaki, K., Imoto, I., Mogi, S., Omura, K., und Inazawa, J. (2008). Exploration of tumor-suppressive microRNAs silenced by DNA hypermethylation in oral cancer. Cancer Res 68, 2094-2105.

Krenacs, L., Wellmann, A., Sorbara, L., Himmelmann, A.W., Bagdi, E., Jaffe, E.S., und Raffeld, M. (1997). Cytotoxic cell antigen expression in anaplastic large cell lymphomas of T- and null-cell type and Hodgkin's disease: evidence for distinct cellular origin. Blood 89, 980-989.

Kroese, F.G., Timens, W., und Nieuwenhuis, P. (1990). Germinal center reaction and B lymphocytes: morphology and function. Curr Top Pathol 84 ( Pt 1), 103-148.

Kube, D., Holtick, U., Vockerodt, M., Ahmadi, T., Haier, B., Behrmann, I., Heinrich, P.C., Diehl, V., und Tesch, H. (2001). STAT3 is constitutively activated in Hodgkin cell lines. Blood 98, 762-770.

LITERATUR

107

Kupper, M., Joos, S., von Bonin, F., Daus, H., Pfreundschuh, M., Lichter, P., und Trumper, L. (2001). MDM2 gene amplification and lack of p53 point mutations in Hodgkin and Reed-Sternberg cells: results from single-cell polymerase chain reaction and molecular cytogenetic studies. Br J Haematol 112, 768-775.

Kuppers, R. (1999). Identifying the precursors of Hodgkin and Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease: role of the germinal center in B-cell lymphomagenesis. J Acquir Immune Defic Syndr 21 Suppl 1, S74-79.

Küppers, R. (2002). Molecular biology of Hodgkin's lymphoma. Adv Cancer Res 84, 277-312.

Küppers, R., und Dalla-Favera, R. (2001). Mechanisms of chromosomal translocations in B cell lymphomas. Oncogene 20, 5580-5594.

Küppers, R., Hansmann, M.L., und Rajewsky, K. (1998a). Clonality and germinal centre B-cell derivation of Hodgkin/Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease. Ann Oncol 9 Suppl 5, S17-20.

Küppers, R., Rajewsky, K., Bräuninger, A., und Hansmann, M.L. (1998b). L&H cells in lymphocyte-predominant Hodgkin's disease. N Engl J Med 338, 763-764; author reply 764-765.

Küppers, R., Rajewsky, K., Zhao, M., Simons, G., Laumann, R., Fischer, R., und Hansmann, M.L. (1994). Hodgkin disease: Hodgkin and Reed-Sternberg cells picked from histological sections show clonal immunoglobulin gene rearrangements and appear to be derived from B cells at various stages of development. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 10962-10966.

Küppers, R., Zhao, M., Hansmann, M.L., und Rajewsky, K. (1993). Tracing B cell development in human germinal centres by molecular analysis of single cells picked from histological sections. EMBO J 12, 4955-4967.

Kutok, J.L., und Wang, F. (2006). Spectrum of Epstein-Barr virus-associated diseases. Annu Rev Pathol 1, 375-404.

Lam, K.P., Kuhn, R., und Rajewsky, K. (1997). In vivo ablation of surface immunoglobulin on mature B cells by inducible gene targeting results in rapid cell death. Cell 90, 1073-1083.

Lamprecht, B., Kreher, S., Anagnostopoulos, I., Johrens, K., Monteleone, G., Jundt, F., Stein, H., Janz, M., Dorken, B., und Mathas, S. (2008). Aberrant expression of the Th2 cytokine IL-21 in Hodgkin lymphoma cells regulates STAT3 signaling and attracts Treg cells via regulation of MIP-3alpha. Blood 112, 3339-3347.

Landgren, O., und Caporaso, N.E. (2007). New aspects in descriptive, etiologic, and molecular epidemiology of Hodgkin's lymphoma. Hematol Oncol Clin North Am 21, 825-840.

Lee, R.C., Feinbaum, R.L., und Ambros, V. (1993). The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75, 843-854.

Lee, Y., Kim, M., Han, J., Yeom, K.H., Lee, S., Baek, S.H., und Kim, V.N. (2004). MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J 23, 4051-4060.

Lewis, B.P., Burge, C.B., und Bartel, D.P. (2005). Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell 120, 15-20.

LITERATUR

108

Li, C., Kim, S.W., Rai, D., Bolla, A.R., Adhvaryu, S., Kinney, M.C., Robetorye, R.S., und Aguiar, R.C. (2009). Copy number abnormalities, MYC activity, and the genetic fingerprint of normal B cells mechanistically define the microRNA profile of diffuse large B-cell lymphoma. Blood 113, 6681-6690.

Li, Q., Wang, G., Shan, J.L., Yang, Z.X., Wang, H.Z., Feng, J., Zhen, J.J., Chen, C., Zhang, Z.M., Xu, W., et al. (2010). MicroRNA-224 is upregulated in HepG2 cells and involved in cellular migration and invasion. J Gastroenterol Hepatol 25, 164-171.

Lin, S.C., Liu, C.J., Lin, J.A., Chiang, W.F., Hung, P.S., und Chang, K.W. (2010). miR-24 up-regulation in oral carcinoma: positive association from clinical and in vitro analysis. Oral Oncol 46, 204-208.

Lindstrom, M.S., und Wiman, K.G. (2002). Role of genetic and epigenetic changes in Burkitt lymphoma. Semin Cancer Biol 12, 381-387.

Liu, Y.J., Johnson, G.D., Gordon, J., und MacLennan, I.C. (1992). Germinal centres in T-cell-dependent antibody responses. Immunol Today 13, 17-21.

Liu, Y.J., Zhang, J., Lane, P.J., Chan, E.Y., und MacLennan, I.C. (1991). Sites of specific B cell activation in primary and secondary responses to T cell-dependent and T cell-independent antigens. Eur J Immunol 21, 2951-2962.

Lossos, I.S., Alizadeh, A.A., Eisen, M.B., Chan, W.C., Brown, P.O., Botstein, D., Staudt, L.M., und Levy, R. (2000). Ongoing immunoglobulin somatic mutation in germinal center B cell-like but not in activated B cell-like diffuse large cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 10209-10213.

Lu, F., Weidmer, A., Liu, C.G., Volinia, S., Croce, C.M., und Lieberman, P.M. (2008). Epstein-Barr virus-induced miR-155 attenuates NF-kappaB signaling and stabilizes latent virus persistence. J Virol 82, 10436-10443.

MacLennan, I.C., Liu, Y.J., und Johnson, G.D. (1992). Maturation and dispersal of B-cell clones during T cell-dependent antibody responses. Immunol Rev 126, 143-161.

Mader, A., Bruderlein, S., Wegener, S., Melzner, I., Popov, S., Muller-Hermelink, H.K., Barth, T.F., Viardot, A., und Moller, P. (2007). U-HO1, a new cell line derived from a primary refractory classical Hodgkin lymphoma. Cytogenet Genome Res 119, 204-210.

Maggio, E.M., Van Den Berg, A., Visser, L., Diepstra, A., Kluiver, J., Emmens, R., und Poppema, S. (2002). Common and differential chemokine expression patterns in rs cells of NLP, EBV positive and negative classical Hodgkin lymphomas. Int J Cancer 99, 665-672.

Malzkorn, B., Wolter, M., Liesenberg, F., Grzendowski, M., Stuhler, K., Meyer, H.E., und Reifenberger, G. (2010). Identification and functional characterization of microRNAs involved in the malignant progression of gliomas. Brain Pathol 20, 539-550.

Mancao, C., Altmann, M., Jungnickel, B., und Hammerschmidt, W. (2005). Rescue of "crippled" germinal center B cells from apoptosis by Epstein-Barr virus. Blood 106, 4339-4344.

Mancao, C., und Hammerschmidt, W. (2007). Epstein-Barr virus latent membrane protein 2A is a B-cell receptor mimic and essential for B-cell survival. Blood 110, 3715-3721.

Manis, J.P., Tian, M., und Alt, F.W. (2002). Mechanism and control of class-switch recombination. Trends Immunol 23, 31-39.

LITERATUR

109

Mao, Z.G., He, D.S., Zhou, J., Yao, B., Xiao, W.W., Chen, C.H., Zhu, Y.H., und Wang, H.J. (2010). Differential expression of microRNAs in GH-secreting pituitary adenomas. Diagn Pathol 5, 79.

Marafioti, T., Hummel, M., Anagnostopoulos, I., Foss, H.D., Falini, B., Delsol, G., Isaacson, P.G., Pileri, S., und Stein, H. (1997). Origin of nodular lymphocyte-predominant Hodgkin's disease from a clonal expansion of highly mutated germinal-center B cells. N Engl J Med 337, 453-458.

Mason, D.Y., Banks, P.M., Chan, J., Cleary, M.L., Delsol, G., de Wolf Peeters, C., Falini, B., Gatter, K., Grogan, T.M., Harris, N.L., et al. (1994). Nodular lymphocyte predominance Hodgkin's disease. A distinct clinicopathological entity. Am J Surg Pathol 18, 526-530.

Mathas, S., Hinz, M., Anagnostopoulos, I., Krappmann, D., Lietz, A., Jundt, F., Bommert, K., Mechta-Grigoriou, F., Stein, H., Dorken, B., et al. (2002). Aberrantly expressed c-Jun and JunB are a hallmark of Hodgkin lymphoma cells, stimulate proliferation and synergize with NF-kappa B. EMBO J 21, 4104-4113.

Mees, S.T., Mardin, W.A., Sielker, S., Willscher, E., Senninger, N., Schleicher, C., Colombo-Benkmann, M., und Haier, J. (2009). Involvement of CD40 targeting miR-224 and miR-486 on the progression of pancreatic ductal adenocarcinomas. Ann Surg Oncol 16, 2339-2350.

Meggetto, F., Muller, C., Henry, S., Selves, J., Mariame, B., Brousset, P., Saati, T.A., und Delsol, G. (1996). Epstein-Barr virus (EBV)-associated lymphoproliferations in severe combined immunodeficient mice transplanted with Hodgkin's disease lymph nodes: implications of EBV-positive bystander B lymphocytes rather than EBV-infected Reed-Sternberg cells. Blood 87, 2435-2442.

Mitchell, P.S., Parkin, R.K., Kroh, E.M., Fritz, B.R., Wyman, S.K., Pogosova-Agadjanyan, E.L., Peterson, A., Noteboom, J., O'Briant, K.C., Allen, A., et al. (2008). Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 10513-10518.

Mottok, A., Renne, C., Seifert, M., Oppermann, E., Bechstein, W., Hansmann, M.L., Kuppers, R., und Brauninger, A. (2009). Inactivating SOCS1 mutations are caused by aberrant somatic hypermutation and restricted to a subset of B-cell lymphoma entities. Blood 114, 4503-4506.

Mottok, A., Renne, C., Willenbrock, K., Hansmann, M.L., und Brauninger, A. (2007). Somatic hypermutation of SOCS1 in lymphocyte-predominant Hodgkin lymphoma is accompanied by high JAK2 expression and activation of STAT6. Blood 110, 3387-3390.

Mueller, N.E.a.G., S., ed. (1999). Hodgkin's disease (Philadelphia, Lippencott Williams & Wilkins).

Munoz, N., Davidson, R.J., Witthoff, B., Ericsson, J.E., und De-The, G. (1978). Infectious mononucleosis and Hodgkin's disease. Int J Cancer 22, 10-13.

Muramatsu, M., Kinoshita, K., Fagarasan, S., Yamada, S., Shinkai, Y., und Honjo, T. (2000). Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell 102, 553-563.

Müschen, M., Rajewsky, K., Brauninger, A., Baur, A.S., Oudejans, J.J., Roers, A., Hansmann, M.L., und Kuppers, R. (2000a). Rare occurrence of classical Hodgkin's disease as a T cell lymphoma. J Exp Med 191, 387-394.

Müschen, M., Re, D., Brauninger, A., Wolf, J., Hansmann, M.L., Diehl, V., Kuppers, R., und Rajewsky, K. (2000b). Somatic mutations of the CD95 gene in Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Cancer Res 60, 5640-5643.

LITERATUR

110

Nagaraja, A.K., Creighton, C.J., Yu, Z., Zhu, H., Gunaratne, P.H., Reid, J.G., Olokpa, E., Itamochi, H., Ueno, N.T., Hawkins, S.M., et al. (2010). A link between mir-100 and FRAP1/mTOR in clear cell ovarian cancer. Mol Endocrinol 24, 447-463.

Nagel, R., le Sage, C., Diosdado, B., van der Waal, M., Oude Vrielink, J.A., Bolijn, A., Meijer, G.A., und Agami, R. (2008). Regulation of the adenomatous polyposis coli gene by the miR-135 family in colorectal cancer. Cancer Res 68, 5795-5802.

Naumovski, L., Utz, P.J., Bergstrom, S.K., Morgan, R., Molina, A., Toole, J.J., Glader, B.E., McFall, P., Weiss, L.M., Warnke, R., et al. (1989). SUP-HD1: a new Hodgkin's disease-derived cell line with lymphoid features produces interferon-gamma. Blood 74, 2733-2742.

Navarro, A., Diaz, T., Martinez, A., Gaya, A., Pons, A., Gel, B., Codony, C., Ferrer, G., Martinez, C., Montserrat, E., et al. (2009). Regulation of JAK2 by miR-135a: prognostic impact in classic Hodgkin lymphoma. Blood 114, 2945-2951.

Navarro, A., Gaya, A., Martinez, A., Urbano-Ispizua, A., Pons, A., Balague, O., Gel, B., Abrisqueta, P., Lopez-Guillermo, A., Artells, R., et al. (2008). MicroRNA expression profiling in classic Hodgkin lymphoma. Blood 111, 2825-2832.

Newbury, S.F., Muhlemann, O., und Stoecklin, G. (2006). Turnover in the Alps: an mRNA perspective. Workshops on mechanisms and regulation of mRNA turnover. EMBO Rep 7, 143-148.

Ng, W.L., Yan, D., Zhang, X., Mo, Y.Y., und Wang, Y. (2010). Over-expression of miR-100 is responsible for the low-expression of ATM in the human glioma cell line: M059J. DNA Repair (Amst) 9, 1170-1175.

Nie, K., Gomez, M., Landgraf, P., Garcia, J.F., Liu, Y., Tan, L.H., Chadburn, A., Tuschl, T., Knowles, D.M., und Tam, W. (2008). MicroRNA-mediated down-regulation of PRDM1/Blimp-1 in Hodgkin/Reed-Sternberg cells: a potential pathogenetic lesion in Hodgkin lymphomas. Am J Pathol 173, 242-252.

Nijman, S.M., Luna-Vargas, M.P., Velds, A., Brummelkamp, T.R., Dirac, A.M., Sixma, T.K., und Bernards, R. (2005). A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell 123, 773-786.

O'Grady, J.T., Stewart, S., Lowrey, J., Howie, S.E., und Krajewski, A.S. (1994). CD40 expression in Hodgkin's disease. Am J Pathol 144, 21-26.

Ohshima, K., Haraoka, S., Yoshioka, S., Kawasaki, C., Tutiya, T., Suzumiya, J., und Kikuchi, M. (2001). Chromosome 16q deletion and loss of E-cadherin expression in Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Int J Cancer 92, 678-682.

Oscier, D.G., Thompsett, A., Zhu, D., und Stevenson, F.K. (1997). Differential rates of somatic hypermutation in V(H) genes among subsets of chronic lymphocytic leukemia defined by chromosomal abnormalities. Blood 89, 4153-4160.

Oudejans, J.J., Kummer, J.A., Jiwa, M., van der Valk, P., Ossenkoppele, G.J., Kluin, P.M., Kluin-Nelemans, J.C., und Meijer, C.J. (1996). Granzyme B expression in Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease. Am J Pathol 148, 233-240.

Ovcharenko, D., Kelnar, K., Johnson, C., Leng, N., und Brown, D. (2007). Genome-scale microRNA and small interfering RNA screens identify small RNA modulators of TRAIL-induced apoptosis pathway. Cancer Res 67, 10782-10788.

LITERATUR

111

Park, S.M., Gaur, A.B., Lengyel, E., und Peter, M.E. (2008). The miR-200 family determines the epithelial phenotype of cancer cells by targeting the E-cadherin repressors ZEB1 and ZEB2. Genes Dev 22, 894-907.

Parker, R., und Song, H. (2004). The enzymes and control of eukaryotic mRNA turnover. Nat Struct Mol Biol 11, 121-127.

Peters, L., und Meister, G. (2007). Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. Mol Cell 26, 611-623.

Petersen, C.P., Bordeleau, M.E., Pelletier, J., und Sharp, P.A. (2006). Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Mol Cell 21, 533-542.

Phan, R.T., und Dalla-Favera, R. (2004). The BCL6 proto-oncogene suppresses p53 expression in germinal-centre B cells. Nature 432, 635-639.

Phan, R.T., Saito, M., Kitagawa, Y., Means, A.R., und Dalla-Favera, R. (2007). Genotoxic stress regulates expression of the proto-oncogene Bcl6 in germinal center B cells. Nat Immunol 8, 1132-1139.

Pinkus, G.S., Pinkus, J.L., Langhoff, E., Matsumura, F., Yamashiro, S., Mosialos, G., und Said, J.W. (1997). Fascin, a sensitive new marker for Reed-Sternberg cells of hodgkin's disease. Evidence for a dendritic or B cell derivation? Am J Pathol 150, 543-562.

Poppema, S., De Jong, B., Atmosoerodjo, J., Idenburg, V., Visser, L., und De Ley, L. (1985). Morphologic, immunologic, enzymehistochemical and chromosomal analysis of a cell line derived from Hodgkin's disease. Evidence for a B-cell origin of Sternberg-Reed cells. Cancer 55, 683-690.

Poppema, S., Potters, M., Visser, L., und van den Berg, A.M. (1998). Immune escape mechanisms in Hodgkin's disease. Ann Oncol 9 Suppl 5, S21-24.

Portlock, C.S., Donnelly, G.B., Qin, J., Straus, D., Yahalom, J., Zelenetz, A., Noy, A., O'Connor, O., Horwitz, S., Moskowitz, C., et al. (2004). Adverse prognostic significance of CD20 positive Reed-Sternberg cells in classical Hodgkin's disease. Br J Haematol 125, 701-708.

Pulvertaft, J.V. (1964). Cytology of Burkitt's Tumour (African Lymphoma). Lancet 1, 238-240.

Rai, D., Karanti, S., Jung, I., Dahia, P.L., und Aguiar, R.C. (2008). Coordinated expression of microRNA-155 and predicted target genes in diffuse large B-cell lymphoma. Cancer Genet Cytogenet 181, 8-15.

Rajewsky, K. (1996). Clonal selection and learning in the antibody system. Nature 381, 751-758.

Ramachandrareddy, H., Bouska, A., Shen, Y., Ji, M., Rizzino, A., Chan, W.C., und McKeithan, T.W. (2010). BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 11930-11935.

Raponi, M., Dossey, L., Jatkoe, T., Wu, X., Chen, G., Fan, H., und Beer, D.G. (2009). MicroRNA classifiers for predicting prognosis of squamous cell lung cancer. Cancer Res 69, 5776-5783.

Rassidakis, G.Z., Medeiros, L.J., Viviani, S., Bonfante, V., Nadali, G.P., Vassilakopoulos, T.P., Mesina, O., Herling, M., Angelopoulou, M.K., Giardini, R., et al. (2002). CD20 expression in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin's disease: associations with presenting features and clinical outcome. J Clin Oncol 20, 1278-1287.

LITERATUR

112

Re, D., Muschen, M., Ahmadi, T., Wickenhauser, C., Staratschek-Jox, A., Holtick, U., Diehl, V., und Wolf, J. (2001). Oct-2 and Bob-1 deficiency in Hodgkin and Reed Sternberg cells. Cancer Res 61, 2080-2084.

Revy, P., Muto, T., Levy, Y., Geissmann, F., Plebani, A., Sanal, O., Catalan, N., Forveille, M., Dufourcq-Labelouse, R., Gennery, A., et al. (2000). Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell 102, 565-575.

Robertus, J.L., Kluiver, J., Weggemans, C., Harms, G., Reijmers, R.M., Swart, Y., Kok, K., Rosati, S., Schuuring, E., van Imhoff, G., et al. (2010). MiRNA profiling in B non-Hodgkin lymphoma: a MYC-related miRNA profile characterizes Burkitt lymphoma. Br J Haematol 149, 896-899.

Roehle, A., Hoefig, K.P., Repsilber, D., Thorns, C., Ziepert, M., Wesche, K.O., Thiere, M., Loeffler, M., Klapper, W., Pfreundschuh, M., et al. (2008). MicroRNA signatures characterize diffuse large B-cell lymphomas and follicular lymphomas. Br J Haematol 142, 732-744.

Rudiger, T., Gascoyne, R.D., Jaffe, E.S., de Jong, D., Delabie, J., De Wolf-Peeters, C., Poppema, S., Xerri, L., Gisselbrecht, C., Wiedenmann, S., et al. (2002). Workshop on the relationship between nodular lymphocyte predominant Hodgkin's lymphoma and T cell/histiocyte-rich B cell lymphoma. Ann Oncol 13 Suppl 1, 44-51.

Saini, H.K., Enright, A.J., und Griffiths-Jones, S. (2008). Annotation of mammalian primary microRNAs. BMC Genomics 9, 564.

Scheeren, F.A., Diehl, S.A., Smit, L.A., Beaumont, T., Naspetti, M., Bende, R.J., Blom, B., Karube, K., Ohshima, K., van Noesel, C.J., et al. (2008). IL-21 is expressed in Hodgkin lymphoma and activates STAT5: evidence that activated STAT5 is required for Hodgkin lymphomagenesis. Blood 111, 4706-4715.

Schmid, C., Pan, L., Diss, T., und Isaacson, P.G. (1991). Expression of B-cell antigens by Hodgkin's and Reed-Sternberg cells. Am J Pathol 139, 701-707.

Schmitz, R., Hansmann, M.L., Bohle, V., Martin-Subero, J.I., Hartmann, S., Mechtersheimer, G., Klapper, W., Vater, I., Giefing, M., Gesk, S., et al. (2009). TNFAIP3 (A20) is a tumor suppressor gene in Hodgkin lymphoma and primary mediastinal B cell lymphoma. J Exp Med 206, 981-989.

Schrader, C.E., Linehan, E.K., Mochegova, S.N., Woodland, R.T., und Stavnezer, J. (2005). Inducible DNA breaks in Ig S regions are dependent on AID and UNG. J Exp Med 202, 561-568.

Schwab, U., Stein, H., Gerdes, J., Lemke, H., Kirchner, H., Schaadt, M., und Diehl, V. (1982). Production of a monoclonal antibody specific for Hodgkin and Sternberg-Reed cells of Hodgkin's disease and a subset of normal lymphoid cells. Nature 299, 65-67.

Schwering, I., Brauninger, A., Klein, U., Jungnickel, B., Tinguely, M., Diehl, V., Hansmann, M.L., Dalla-Favera, R., Rajewsky, K., und Kuppers, R. (2003). Loss of the B-lineage-specific gene expression program in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of Hodgkin lymphoma. Blood 101, 1505-1512.

Seitz, V., Hummel, M., Marafioti, T., Anagnostopoulos, I., Assaf, C., und Stein, H. (2000). Detection of clonal T-cell receptor gamma-chain gene rearrangements in Reed-Sternberg cells of classic Hodgkin disease. Blood 95, 3020-3024.

Sen, R. (2006). Control of B lymphocyte apoptosis by the transcription factor NF-kappaB. Immunity 25, 871-883.

LITERATUR

113

Shiramizu, B., und Magrath, I. (1990). Localization of breakpoints by polymerase chain reactions in Burkitt's lymphoma with 8;14 translocations. Blood 75, 1848-1852.

Sikand, K., Slaibi, J.E., Singh, R., Slane, S.D., und Shukla, G.C. (2010). miR 488* inhibits androgen receptor expression in prostate carcinoma cells. Int J Cancer.

Skinnider, B.F., Kapp, U., und Mak, T.W. (2001). Interleukin 13: a growth factor in hodgkin lymphoma. Int Arch Allergy Immunol 126, 267-276.

Skinnider, B.F., und Mak, T.W. (2002). The role of cytokines in classical Hodgkin lymphoma. Blood 99, 4283-4297.

Slovak, M.L., Bedell, V., Hsu, Y.H., Estrine, D.B., Nowak, N., Delioukina, M.L., Weiss, L.M., Smith, D.D., und Forman, S.J. (2011). Hodgkin and Reed-Sternberg cells at disease onset harbor distinct recurring DNA copy number alterations in chemosensitive versus primary refractory Hodgkin lymphoma. Clin Cancer Res.

Sontheimer, E.J., und Carthew, R.W. (2005). Silence from within: endogenous siRNAs and miRNAs. Cell 122, 9-12.

Stanelle, J., Doring, C., Hansmann, M.L., und Kuppers, R. (2010). Mechanisms of aberrant GATA3 expression in classical Hodgkin lymphoma and its consequences for the cytokine profile of Hodgkin and Reed/Sternberg cells. Blood 116, 4202-4211.

Staudt, L.M. (2003). Molecular diagnosis of the hematologic cancers. N Engl J Med 348, 1777-1785.

Stein, H., Marafioti, T., Foss, H.D., Laumen, H., Hummel, M., Anagnostopoulos, I., Wirth, T., Demel, G., und Falini, B. (2001). Down-regulation of BOB.1/OBF.1 and Oct2 in classical Hodgkin disease but not in lymphocyte predominant Hodgkin disease correlates with immunoglobulin transcription. Blood 97, 496-501.

Sun, S.C., Ganchi, P.A., Ballard, D.W., und Greene, W.C. (1993). NF-kappa B controls expression of inhibitor I kappa B alpha: evidence for an inducible autoregulatory pathway. Science 259, 1912-1915.

Taganov, K.D., Boldin, M.P., Chang, K.J., und Baltimore, D. (2006). NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 12481-12486.

Torlakovic, E., Tierens, A., Dang, H.D., und Delabie, J. (2001). The transcription factor PU.1, necessary for B-cell development is expressed in lymphocyte predominance, but not classical Hodgkin's disease. Am J Pathol 159, 1807-1814.

Trompouki, E., Hatzivassiliou, E., Tsichritzis, T., Farmer, H., Ashworth, A., und Mosialos, G. (2003). CYLD is a deubiquitinating enzyme that negatively regulates NF-kappaB activation by TNFR family members. Nature 424, 793-796.

Ushmorov, A., Leithauser, F., Sakk, O., Weinhausel, A., Popov, S.W., Moller, P., und Wirth, T. (2006). Epigenetic processes play a major role in B-cell-specific gene silencing in classical Hodgkin lymphoma. Blood 107, 2493-2500.

Ushmorov, A., Ritz, O., Hummel, M., Leithauser, F., Moller, P., Stein, H., und Wirth, T. (2004). Epigenetic silencing of the immunoglobulin heavy-chain gene in classical Hodgkin lymphoma-derived cell lines contributes to the loss of immunoglobulin expression. Blood 104, 3326-3334.

LITERATUR

114

van den Berg, A., Kroesen, B.J., Kooistra, K., de Jong, D., Briggs, J., Blokzijl, T., Jacobs, S., Kluiver, J., Diepstra, A., Maggio, E., et al. (2003). High expression of B-cell receptor inducible gene BIC in all subtypes of Hodgkin lymphoma. Genes Chromosomes Cancer 37, 20-28.

van den Berg, A., Visser, L., und Poppema, S. (1999). High expression of the CC chemokine TARC in Reed-Sternberg cells. A possible explanation for the characteristic T-cell infiltratein Hodgkin's lymphoma. Am J Pathol 154, 1685-1691.

van Vlierberghe, P., De Weer, A., Mestdagh, P., Feys, T., De Preter, K., De Paepe, P., Lambein, K., Vandesompele, J., Van Roy, N., Verhasselt, B., et al. (2009). Comparison of miRNA profiles of microdissected Hodgkin/Reed-Sternberg cells and Hodgkin cell lines versus CD77+ B-cells reveals a distinct subset of differentially expressed miRNAs. Br J Haematol 147, 686-690.

Vasudevan, S., und Steitz, J.A. (2007). AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2. Cell 128, 1105-1118.

Vasudevan, S., Tong, Y., und Steitz, J.A. (2007). Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science 318, 1931-1934.

Vaz, C., Ahmad, H.M., Sharma, P., Gupta, R., Kumar, L., Kulshreshtha, R., und Bhattacharya, A. (2010). Analysis of microRNA transcriptome by deep sequencing of small RNA libraries of peripheral blood. BMC Genomics 11, 288.

Vigorito, E., Perks, K.L., Abreu-Goodger, C., Bunting, S., Xiang, Z., Kohlhaas, S., Das, P.P., Miska, E.A., Rodriguez, A., Bradley, A., et al. (2007). microRNA-155 regulates the generation of immunoglobulin class-switched plasma cells. Immunity 27, 847-859.

Wang, S., Aurora, A.B., Johnson, B.A., Qi, X., McAnally, J., Hill, J.A., Richardson, J.A., Bassel-Duby, R., und Olson, E.N. (2008). The endothelial-specific microRNA miR-126 governs vascular integrity and angiogenesis. Dev Cell 15, 261-271.

Watanabe, K., Yamashita, Y., Nakayama, A., Hasegawa, Y., Kojima, H., Nagasawa, T., und Mori, N. (2000). Varied B-cell immunophenotypes of Hodgkin/Reed-Sternberg cells in classic Hodgkin's disease. Histopathology 36, 353-361.

Weber-Matthiesen, K., Deerberg, J., Poetsch, M., Grote, W., und Schlegelberger, B. (1995). Numerical chromosome aberrations are present within the CD30+ Hodgkin and Reed-Sternberg cells in 100% of analyzed cases of Hodgkin's disease. Blood 86, 1464-1468.

Weiss, L.M., Movahed, L.A., Warnke, R.A., und Sklar, J. (1989). Detection of Epstein-Barr viral genomes in Reed-Sternberg cells of Hodgkin's disease. N Engl J Med 320, 502-506.

Weiss, L.M., Warnke, R. and Hansmann, M.L., ed. (2007). Pathology of Hodgkin Lymphoma. (Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins).

Weniger, M.A., Melzner, I., Menz, C.K., Wegener, S., Bucur, A.J., Dorsch, K., Mattfeldt, T., Barth, T.F., und Moller, P. (2006). Mutations of the tumor suppressor gene SOCS-1 in classical Hodgkin lymphoma are frequent and associated with nuclear phospho-STAT5 accumulation. Oncogene 25, 2679-2684.

Wightman, B., Ha, I., und Ruvkun, G. (1993). Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 75, 855-862.

LITERATUR

115

Wolf, J., Kapp, U., Bohlen, H., Kornacker, M., Schoch, C., Stahl, B., Mucke, S., von Kalle, C., Fonatsch, C., Schaefer, H.E., et al. (1996). Peripheral blood mononuclear cells of a patient with advanced Hodgkin's lymphoma give rise to permanently growing Hodgkin-Reed Sternberg cells. Blood 87, 3418-3428.

Wu, H., Neilson, J.R., Kumar, P., Manocha, M., Shankar, P., Sharp, P.A., und Manjunath, N. (2007). miRNA profiling of naive, effector and memory CD8 T cells. PLoS One 2, e1020.

Wuerffel, R.A., Du, J., Thompson, R.J., und Kenter, A.L. (1997). Ig Sgamma3 DNA-specifc double strand breaks are induced in mitogen-activated B cells and are implicated in switch recombination. J Immunol 159, 4139-4144.

Xia, L., Zhang, D., Du, R., Pan, Y., Zhao, L., Sun, S., Hong, L., Liu, J., und Fan, D. (2008). miR-15b and miR-16 modulate multidrug resistance by targeting BCL2 in human gastric cancer cells. Int J Cancer 123, 372-379.

Yang, H., Gu, J., Wang, K.K., Zhang, W., Xing, J., Chen, Z., Ajani, J.A., und Wu, X. (2009). MicroRNA expression signatures in Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Clin Cancer Res 15, 5744-5752.

Yung, L., und Linch, D. (2003). Hodgkin's lymphoma. Lancet 361, 943-951.

Zenz, T., Mertens, D., Kuppers, R., Dohner, H., und Stilgenbauer, S. (2010). From pathogenesis to treatment of chronic lymphocytic leukaemia. Nat Rev Cancer 10, 37-50.

Zhang, H., Luo, X.Q., Zhang, P., Huang, L.B., Zheng, Y.S., Wu, J., Zhou, H., Qu, L.H., Xu, L., und Chen, Y.Q. (2009a). MicroRNA patterns associated with clinical prognostic parameters and CNS relapse prediction in pediatric acute leukemia. PLoS One 4, e7826.

Zhang, J., Jima, D.D., Jacobs, C., Fischer, R., Gottwein, E., Huang, G., Lugar, P.L., Lagoo, A.S., Rizzieri, D.A., Friedman, D.R., et al. (2009b). Patterns of microRNA expression characterize stages of human B-cell differentiation. Blood 113, 4586-4594.

Zheng, B., Fiumara, P., Li, Y.V., Georgakis, G., Snell, V., Younes, M., Vauthey, J.N., Carbone, A., und Younes, A. (2003). MEK/ERK pathway is aberrantly active in Hodgkin disease: a signaling pathway shared by CD30, CD40, and RANK that regulates cell proliferation and survival. Blood 102, 1019-1027.

LITERATUR

116

Teilpublikationen:

Annette Schmidt, Roland Schmitz, Maciej Giefing, Jose Ignacio Martin-Subero,

Stefan Gesk, Inga Vater, Anne Massow, Ewerton Maggio, Markus Schneider,

Martin-Leo Hansmann, Reiner Siebert and Ralf Küppers

Rare Occurrence of Biallelic CYLD Gene Mutations in Classical Hodgkin

Lymphoma

Genes Chromosomes Cancer. 2010 Sep;49(9):803-9.

Eingereichte Veröffentlichungen aus anderen Themengebieten:

Jan Peveling-Oberhag, Giuliana Crisman, Annette Schmidt, Claudia Döring, Marco

Lucion, Luca Arcaini, Sara Rattotti, Sylvia Hartmann, Albrecht Piiper, Wolf Peter

Hofmann, Marco Paulli, Ralf Küppers, Stefan Zeuzem, and Martin Leo Hansmann

Dysregulation of Global microRNA Expression in Splenic Marginal Zone

Lymphoma and Influence of Chronic Hepatitis C Virus Infection

ANHANG

117

Anhang:

Patientendaten der für die microRNA-Analysen verwendeten HL-Primärfälle:

HL-Fall Eingansnummer Subtyp EBV-Status Geschlecht Geburtsjahr

MC1 K10859/07 MC - M 1952

MC2 K12797/08II2 MC + M 1957

MC3 K635/08 MC - W 1967

MC4 K1152/09 MC - W 1949

MC5 K218/08 MC - W 1960

MC6 K373/09 MC - M 1951

NS1 K836/07 NS - M 1977

NS2 K535/07 NS - M 1972

NS3 K828/08 NS - M 1985

NS4 K841/10 NS - W 1977

LP1 K3112/05 LP - n.b. n.b.

LP2 K14/09 LP - M 1998

LP3 K3776/97 LP - M 1982

LP4 K563/08 LP - M 1961

LP5 K578/08 LP - M 1962

CD20+ NS1 K1385/08 CD20+ NS - W 1987

CD20+ NS2 K391/08 CD20+ NS - M 1977

CD20+ NS3 K396/09 CD20+ NS - M 2000

CD20+ NS4 K639/05 CD20+ NS - W 1983

CD20+ NS5 K640/09 CD20+ NS - M 1930

n.b.= nicht bekannt

Danksagung:

Ich bedanke mich herzlich bei Prof. Dr. Ralf Küppers für eine hervorragende

Betreuung, seine stetige Diskussionsbereitschaft und seine Unterstützung.

Frau Kerstin Heise danke ich für ihre technische Assistenz im CYLD-Projekt und die

angenehme, sehr freundschaftliche Zusammenarbeit.

Bei Dr. Marc Seifert möchte ich mich für die Sortierung der Keimzentrums-B-Zellen

und Unterstützung bei den statistischen Auswertungen der Daten bedanken.

Danken möchte ich ebenfalls den Mitarbeitern unserer Kooperationsgruppe des

Senckenbergschen Instituts für Pathologie: Prof. Dr. Hansmann für seine

Diskussionsbereitschaft und Ermutigung, Dr. Silvia Hartmann und Isabelle Girke für

ihre Unterstützung bei der Laser-Mikrodissektion, Dr. Claudia Döring für die Hilfe bei

den statistischen Analysen und Ekaterini Hadzoglou für die Anfertigung der

Gewebeschnitte.

Vielen Dank auch an Prof. Dr. Reiner Siebert und seiner Arbeitsgruppe in der

Humanen Genetik im Universitätsklinikum Kiel für die die Durchführung der FISH-

Analysen im CYLD-Projekt.

Ebenso danke ich meiner Arbeitsgruppe; eine bessere Atmosphäre kann man sich

kaum wünschen, und ich freue mich, auch weiterhin mit euch arbeiten zu dürfen.

Sehr dankbar bin ich meinen Eltern, die mich während meines Studiums und der

Doktorarbeit stets unterstützt haben.

Ein großes Dankeschön schulde ich auch meinen Freunden, die an mich geglaubt

haben, und meinem Lebensgefährten Andre, für seine umfassende Unterstützung,

die Ermutigung und den Rückhalt, den er mir gegeben hat.

Lebenslauf

Name Schmidt

Vorname Annette

Akademischer Grad Master of Science

Geburtsdatum 9. Juli 1976

Geburtsort Essen

Familienstand ledig

Staatsangehörigkeit deutsch

Anschrift Bramkampstrasse 12

45147 Essen

Schulbildung

1982 - 1986 Overberg-Grundschule, Kamp-Lintfort

1986 - 1995 städtisches Gymnasium, Kamp-Lintfort

___________________________________________________________________

Berufliche Laufbahn

1995 - 1996 Engagement am Theater am Ebertplatz, Oberhausen 1997 - 1999 Jazzgesangstudium an der Folkwang-Hochschule

Essen 1999 – 2001 Freischaffende Musikerin und Komponistin in

verschiedenen Projekten 2001 – 2006 Studium „Water Sciences: Chemie, Analytik,

Mikrobiologie“ and der Universität Duisburg-Essen Abschlüsse: Bachelor (2004) & Master of Science

(2006) 2006 – 2011 Promotionsarbeit im Labor von Prof. Dr. Ralf

Küppers, Institut für Zellbiologie, Universitätsklinikum Essen

2006 bis 2009 Stipendiatin des Graduiertenkollegs „Transcription, Chromatin Structure & DNA Repair in Development and Differentiation“ (GRK1431, DFG)

___________________________________________________________________ Essen, den ____________ ________________________________________ Annette Schmidt

Einige der in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wurden in enger

Zusammenarbeit mit verschiedenen Kooperationsgruppen erzielt. Hierauf wird bei

der Vorstellung der Ergebnisse an den entsprechenden Stellen hingewiesen.

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. § 6 Abs. 2, f der Promotionsordnung der Math.-Nat.-

Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich das Arbeitsgebiet, dem das

Thema „Deregulation von microRNA und Mutationen des Tumorsupressorgens

CYLD im Hodgkin Lymphom“ zuzuordnen ist, in Forschung und Lehre vertrete und

den Antrag von Annette Schmidt befürworte.

Essen, den __________ _____________________________

Prof. Dr. Ralf Küppers

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. § 7 Abs. 2, c und e der Promotionsordnung der Math.-Nat.-

Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich die vorliegende Dissertation

selbständig verfasst und mich keiner anderen als der angegebenen Hilfsmittel

bedient habe und alle wörtlich oder inhaltlich übernommenen Stellen als solche

gekennzeichnet habe.

Essen, den __________ _____________________________

Annette Schmidt

Erklärung:

Hiermit erkläre ich, gem. § 7 Abs. 2, d und f der Promotionsordnung der Math.-Nat.-

Fakultäten zur Erlangung des Dr. rer. nat., dass ich keine anderen Promotionen bzw.

Promotionsversuche in der Vergangenheit durchgeführt habe,dass diese Arbeit von

keiner anderen Fakultät abgelehnt worden ist, und dass ich die Dissertation nur in

diesem Verfahren einreiche.

Essen, den __________ _____________________________

Annette Schmidt

Documents

Deregulation von microRNA und Mutationen des ... · Deregulation von microRNA und Mutationen des Tumorsuppressorgens CYLD im Hodgkin Lymphom Inaugural-Dissertation zur Erlangung des