Embed Size (px)
Citation preview
POTENSI ANTIBAKTERI FRAKSI KLOROFORM- ETANOL-ASAM
ASETAT DARI EKSTRAK ETANOL-ASAM ASETAT KULIT BATANG
KEMIRI [Aleurites moluccana (L.) Willd] TERHADAP Staphylococcus
aureus
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
P. Silih Widhiandhisti
NIM : 038114069
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2007
i
ii
iii
Ketika satu pintu tertutup, ada pintu lain
yang terbuka. Namun, kita sering kali
hanya menyesali yang tertutup, sehingga
tak menyadari yang terbuka buat kita!
(Alexander Graham Bell)
Karya ini kupersembahkan untuk: Tuhan Yesus & Bunda Maria
Bapak dan Ibuku yang terkasih
Adikku dan keluarga besar
Juga orang-orang yang tersisih dan terlupakan
iv
v
INTISARI Di Jawa, kulit batang kemiri ( Aleurites moluccana L. Willd ) digunakan untuk mengobati diare dan disentri. Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni. Tujuannya untuk mengetahui fraksi aktif dalam ekstrak etanol kulit batang kemiri yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan identitas fraksi aktif tersebut. Ekstraksi kulit batang kemiri dilakukan menggunakan pelarut etanol dengan metode remaserasi. Fraksinasi kulit batang kemiri menggunakan kromatografi kolom dengan pelarut kloroform-etanol-asam asetat. Uji potensi antibakteri dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumuran untuk pemilihan fraksi aktif. Fraksi aktif ekstrak serbuk kulit batang kemiri diuji dengan bioautografi kontak untuk mengetahui potensinya terhadap S. aureus. Metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dilakukan untuk mengetahui identitas senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi kloroform-etanol-asam asetat (90:5:5) merupakan fraksi aktif. Pada uji KLT diperoleh dugaan bahwa senyawa yang terkandung dalam fraksi aktifnya adalah alkaloid golongan indol. Pada pengujian dengan bioautografi kontak tidak menunjukkan adanya potensi antibakteri dari alkaloid. Kata kunci : Aleurites moluccana L. Willd, Staphylococcus aureus, ekstrak etanol, fraksi kloroform-etanol-asam asetat, kromatografi kolom, bioautografi kontak, KLT, alkaloid.
vi
ABSTRACT
In Java, Candelnut (Alleurites moluccana L. Willd) bark is used to cure diarrhea and dysentery. This experiment was pure experimental research. The purpose of this research is know antibacterial potency of chloroform-ethanol-acetic acid fraction from ethanol extract of candelnut bark againts Staphylococcus aureus and identity of the active fraction. Extraction of candelnut bark was done by remaseration method using ethanol. Fractionation of candelnut bark by Coloum Chromatography using a moving phase chloroform-ethanol-acetic acid. An antibacterial potency test was done by diffusion method to get active fraction. The active fraction of candelnut bark powder extract tested by contact bioautography method to know antibacterial potency againts S. aureus. Thin Layer Chromatography (TLC) method was done to know identity of substance that has antibacterial potency.
The result shows that chloroform–ethanol–acetic acid (90:5:5) fractions is an active fraction. In TLC test, it is estimated that the active compound is indole alkaloida. Potential testing by using contact bioautography method does not show any antibacterial potency of alkaloid. Keywords : candelnut bark (Aleurites moluccana L. Willd), Staphylococcus
aureus, ethanol extract, chloroform–ethanol–acetic acid fraction, Coloum Chromatography, contact bioautography, Thin Layer Chromatography, alkaloid.
vii
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas
berkat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul POTENSI ANTIBAKTERI FRAKSI KLOROFORM- ETANOL-
ASAM ASETAT DARI EKSTRAK ETANOL-ASAM ASETAT KULIT
BATANG KEMIRI [Aleurites moluccana (L.) Willd] TERHADAP
Staphylococcus aureus. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk
memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Ilmu Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
Skripsi ini dapat berjalan dan diselesaikan dengan baik berkat bantuan,
dukungan dan kerjasama dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin
menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma.
2. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah
meluangkan waktu untuk memberi bimbingan dan motivasi, terima kasih
pak…
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah
meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan masukan, kritik dan saran
kepada penulis.
viii
4. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang telah
meluangkan waktu untuk menguji dan memberikan masukan, kritik dan saran
kepada penulis.
5. Bapak dan Ibu dosen Fakultas Farmasi yang telah membimbing saya selama
saya belejar di Universitas Sanata Dharma.
6. Segenap karyawan Universitas Sanata Dharma Yogyakarta khususnya
karyawan Fakultas Farmasi yang telah membantu saya.
7. Bapak dan Ibuku terkasih, terima kasih atas segala doa dan dukungan,
kesabaran, semangat dan kasih sayang yang tiada habisnya sehingga skripsi ini
dapat diselesaikan dengan baik.
8. Adikku Mayang, terima kasih atas segala doa, dorongan, semangat dan
dukungan yang selama ini telah diberikan.
9. Keluarga besarku, terutama almarhum simbah putri, terima kasih atas restumu
di alam sana.
10. Teman dekat dan curhatku Nia, terimakasih atas pertemanan yang indah ini,
aku berharap bisa abadi Ni….
11. Maria Goretti, terima kasih sudah jadi temanku.
12. Teman-temanku Essy, Fani, Hani, Endah, Dessy, Tata, yang senantiasa
memberiku semangat, dan Wewen
13. Teman seperjuangan di lab mikro Vian, Rosa, Tina, Nella, Devi, Oca, Titin
dll, akhirnya kita lulus.
ix
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................ i
HALAM PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN .............................................................. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................ iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................ v
INTISARI ............................................................................................. vi
ABSTRACT ............................................................................................ vii
KATA PENGANTAR .......................................................................... viii
DAFTAR ISI ......................................................................................... xi
DAFTAR TABEL .................................................................................. xv
DAFTAR GAMBAR ............................................................................. xvi
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xvii
BAB I. PENGANTAR ........................................................................... 1
A. Latar Belakang ........................................................................ 1
1. Permasalahan .................................................................... 3
2. Keaslian Penelitian ............................................................ 3
3. Manfaat Penelitian ............................................................ 4
B. Tujuan Penelitian ................................................................... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ................................................... 6
A. Deskripsi Tanaman ................................................................. 6
xi
1. Keterangan Botani ......................................................... 6
2. Pertelaan Morfologi ....................................................... 6
3. Kandungan kimia tanaman kemiri ................................ 7
4. Khasiat ........................................................................... 7
B. Alkaloid ................................................................................... 7
C. Staphylococcus aureus ............................................................ 8
D. Penyarian ................................................................................. 9
1. Cara Penyarian ............................................................... 9
2. Maserasi ........................................................................ 10
E. Metode Pengukuran Potensi Antibakteri ............................... 12
F. Fraksinasi ............................................................................... 13
1. Pengendapan ................................................................. 14
2. Ekstraksi pelarut-pelarut ............................................... 14
3. Destilasi ......................................................................... 15
4. Dialisis .......................................................................... 15
5. Elektroforesis ............................................................... 15
6. Kromatografi .............................................................. 16
G. Kromatografi Lapis Tipis ........................................................ 17
H. Bioautografi ............................................................................ 18
I. Landasan Teori ........................................................................ 20
J. Hipotesis ................................................................................. 21
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................. 22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................. 22
xii
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ......................... 22
1. Variabel Penelitian ......................................................... 22
2. Definisi Operasional ...................................................... 23
C. Bahan dan Alat Penelitian ....................................................... 24
1. Bahan ............................................................................. 24
2. Alat ................................................................................. 25
D. Tata Cara Penelitian ................................................................ 25
1. Identifikasi Tanaman ..................................................... 25
2. Pengumpulan Bahan ...................................................... 26
3. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk ............................. 26
4. Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif Kulit Batang
Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) dengan Uji
Tabung ........................................................................... 26
5. Ekstraksi Kulit Batang Kemiri ........................................ 27
6. Preparasi Sampel, Fase diam, dan Fase gerak
Kromatografi Kolom .................................................
7. Fraksinasi Ekstrak Etanol-Asam Asetat dengan
Kromatografi Kolom...................................................
8. Uji Potensi Antibakteri Tiap Fraksi dan Pemilihan
Fraksi Aktif.................................................................
9. Uji Kualitatif Fraksi Aktif dengan Metode KLT
.....................................................................................
28
29
30
30
xiii
10. Uji Potensi Senyawa Aktif Dari Fraksi Aktif Terhadap
Staphylococcus aureus dengan Metode Bioautografi
Kontak ............................................................................ 31
E. Analisis Hasil ……………………………………………….. 34
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN …………….. 36
A. Identifikasi Tanaman ……………………………………….. 36
B. Pengumpulan Bahan ………………………………………... 36
C. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk ………………………... 37
D. Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif Kulit Batang Kemiri
(Aleurites moluccana L. Willd) dengan Uji Tabung
................................................................................................... 38
E. Ekstraksi Kulit Batang Kemiri ................................................. 39
F. Preparasi Sampel, Fase diam, dan Fase gerak Kromatografi
Kolom ..................................................................................... 42
G. Fraksinasi Ekstrak Etanol-Asam Asetat dengan Kromatografi
Kolom ...................................................................................... 43
H. Uji Potensi Antibakteri Tiap Fraksi dan Pemilihan Fraksi
Aktif.......................................................................................... 45
I. Uji Kualitatif Fraksi Aktif dengan Metode KLT
.................................................................................................. 48
J. Uji potensi antibakteri senyawa aktif dari fraksi aktif (fraksi
V) terhadap Staphylococcus aureus dengan metode
Bioautografi Kontak................................................................. 55
xiv
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................... 57
A. Kesimpulan ............................................................................. 57
B. Saran ....................................................................................... 57
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 58
LAMPIRAN ........................................................................................... 61
BIOGRAFI PENULIS............................................................................. 70
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
39 Tabel I. Hasil uji tabung serbuk kulit batang kemiri .......................... Tabel II. Rerata diameter zona hambat fraksi kloroform-etanol-asam
asetat dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri terhadap Staphylococcus aureus............................................. 47
Tabel III. Hasil identifikasi senyawa alkaloid kuaterner fraksi
kloroform:etanol:asam asetat (90:5:5) dari ekstrak etanol-asam asetat dengan fase gerak kloroform : etanol : asam asetat (60:20:20)...................................................................... 49
Tabel IV. Hasil identifikasi senyawa alkaloid tersier fraksi
kloroform:etanol:asam asetat (90:5:5) dari ekstrak etanol-asam asetat dengan fase gerak kloroform:etanol:asam asetat (60:20:20)................................................................... 51
Tabel V. Hasil Uji potensi antibakteri fraksi aktif (fraksi V) terhadap
Staphylococcus aureus dengan metode Bioautografi Kontak..................................................................................... 56
xvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Skema penelitian potensi antibakteri fraksi kloroform-etanol-asam asetat dari ekatrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri terhadap Staphylococcus aureus ................................................................................................ 34
Gambar 2. Kromatogram alkaloid kuaterner fraksi aktif [kloroform :
etanol : asam asetat (90 : 5 : 5)] dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri (Aleurites moluccana L. Willd)..................................................................................... 50
Gambar 3. Kromatogram alkaloid tersier fraksi aktif [kloroform :
etanol : asam asetat (90 : 5 : 5)] dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri (Aleurites moluccana L. Willd)..................................................................................... 52
Gambar 4. Reaksi piridin dengan pereaksi CAS .................................... 53 Gambar 5. Reaksi pembentukan senyawa kompleks oleh alkaloid indol
dengan pereaksi CAS.............................................................
54
54 Gambar 6. Struktur gugus amin pada alkaloid tersier dan kuartener .
xvii
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
Lampiran 1. Surat Pengesahan Determinasi …………………………. 61
Lampiran 2. Foto Tanaman Kemiri [Aleurites moluccana (L.) Willd].... 62
Lampiran 3. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Fraksi Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom Terhadap Staphylococcus aureus Secara Difusi Sumuran ............................................................................................. 63
Lampiran 4. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Piridin sebagai Kontrol
Positif Terhadap Staphylococcus aureus Secara Difusi Sumuran ............................................................................. 64
Lampiran 5. Foto Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Piridin
dengan Fase Gerak Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20) ......................................................................... 65
Lampiran 6. Foto Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Alkaloid
Tersier dengan Fase Gerak Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20) .............................................................. 66
Lampiran 7. Foto Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Alkaloid
Kuartener dengan Fase Gerak Kloroform : Etanol : Asam (60:20:20) ........................................................................... 67
Lampiran 8. Hasil Uji Potensi Antibakteri Alkaloid Tersier Fraksi V
[Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)] Kulit Batang Kemiri dengan Metode Bioautografi Kontak Terhadap Staphylococcus . aureus .................................... 68
Lampiran 9. Hasil Uji Potensi Antibakteri Alkaloid Kuartener fraksi V
[Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)] Kulit Batang Kemiri Dengan Metode Bioautografi Kontak Terhadap Staphylococcus aureus ..................................... 69
xviii
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Staphylococcus aureus bersifat patogen dan invasif menghasilkan enzim
koagulase dan pigmen kuning yang bersifat hemolitik. Bakteri ini merupakan
patogen utama bagi manusia. Hampir setiap orang mengalami infeksi oleh
S.aureus di sepanjang hidupnya, bervariasi beratnya (Jawetz et al., 1996). Saat ini,
S.aureus merupakan bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik golongan
penisilin (MRSA) karena infeksi nosokomial yang terjadi di rumah sakit
(Anonim, 2006).
Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) merupakan tanaman yang dapat
tumbuh di Indonesia. Tanaman ini tergolong dalam familia Euphorbiaceae. Di
Jawa, kulit batang kemiri digunakan untuk mengobati diare dan disentri (Anonim,
1995).
Senyawa alam digunakan sebagai obat atau untuk memproduksi dan
menemukan obat baru (Samuelsson, 1999). Berbagai macam khasiat dari kemiri
dikarenakan kandungan senyawa-senyawa aktif yang dimilikinya antara lain
polifenol, tanin, alkaloid (Arief, 1996). Kandungan senyawa aktif tersebut, ada
yang bersifat polar dan non polar (Anonim, 1986).
Pada penelitian ini dilakukan pengujian potensi antibakteri fraksi kloroform-
etanol-asam asetat dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri terhadap
S.aureus menggunakan metode bioautografi kontak. Penelitian ini merupakan
1
2
lanjutan dari penelitian terdahulu (Melinda, 2005) tentang potensi antibakteri
fraksi etil asetat dan fraksi etanol kulit batang kemiri terhadap Staphylococcus
aureus dan diketahui bahwa fraksi etanol kulit batang kemiri memiliki potensi
antibakteri terhadap S.aureus.
Kulit batang kemiri mengandung senyawa tanin (Duke, 1999). Walaupun
demikian, menurut penelitian terdahulu (Melinda, 2005) diduga fraksi aktif dari
fraksi etanol dan fraksi etil asetat kulit batang kemiri yang berpotensi sebagai
antibakteri adalah alkaloid golongan piridin-piperidin dengan KHM fraksi etil
asetat 10 mg/ml. Alkaloid merupakan senyawa yang bersifat non polar, larut
dalam etanol (Anonim, 1986a), oleh sebab itu, digunakan pelarut etanol.
Biasanya alkaloid diperoleh dengan cara maserasi (Robinson, 1995).
Kromatografi kolom digunakan untuk fraksinasi ekstrak etanol-asam asetat yang
didapat. Ada 3 macam fase gerak yang digunakan yakni kloroform-etanol (95:5)
(Cordell, 1981), kloroform-etanol-asam asetat (90:8:2) dan kloroform-etanol-asam
asetat (90:5:5) yang didapat dari orientasi. Digunakan 3 macam fase gerak dengan
perbandingan yang berbeda-beda bertujuan agar jumlah senyawa yang terkandung
dalam tiap fraksi menjadi lebih sedikit sehingga dapat diketahui fase gerak yang
lebih optimal untuk menyari senyawa antibakteri terhadap S.aureus.
Metode yang digunakan untuk uji potensi antibakteri adalah metode difusi
sumuran. Sedangkan metode yang digunakan untuk uji senyawa aktif dari fraksi
aktif hasil pemisahan pada KLT digunakan metode bioautografi kontak.
Pembanding yang digunakan adalah piridin hasil sintesis karena menurut
penelitian terdahulu (Melinda, 2005), diduga senyawa yang terkandung dalam
3
ekstrak etanol kulit batang kemiri yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap
S.aureus adalah alkaloid golongan piridin-piperidin.
Berdasarkan keterangan di atas, maka dapatlah dilakukan penelitian untuk
mengetahui beberapa fraksi aktif dalam fraksi kloroform-etanol-asam asetat hasil
kromatografi kolom dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri yang
berperan sebagai antibakteri terhadap S.aureus.
1. Permasalahan
a. Apakah fraksi kloroform : etanol (95:5), fraksi kloroform : etanol : asam
asetat (90:8:2), dan fraksi kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5) dari
ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri mempunyai potensi
antibakteri terhadap S.aureus?
b. Fraksi mana yang terdapat dalam ekstrak etanol-asam asetat serbuk kulit
batang kemiri yang aktif terhadap S.aureus?
c. Identitas senyawa apakah yang terdapat dalam fraksi aktif antibakteri
S.aureus secara KLT?
d. Apakah dengan metode bioautografi kontak alkaloid yang terdapat dalam
fraksi aktif mempunyai potensi antibakteri terhadap S.aureus?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh penelusuran dan informasi yang diperoleh penulis, penelitian
mengenai potensi antibakteri fraksi kloroform-etanol-asam asetat dari ekstrak
etanol-asam asetat kulit batang kemiri terhadap Staphylococcus aureus belum
4
pernah dilakukan di Universitas Sanata Dharma.
3. Manfaat Penelitian
a. Manfaat Praktis :
Memberikan informasi kepada masyarakat tentang fraksi manfaat kulit
batang kemiri yang berkhasiat untuk alternatif pengobatan tradisional
sebagai antibakteri terhadap S.aureus.
b. Manfaat Teoritis :
Menambah informasi untuk mengembangkan ilmu pengetahuan khususnya
di bidang kesehatan tentang senyawa aktif dalam kulit batang kemiri yang
berpotensi sebagai antibakteri terhadap S.aureus yang diharapkan dapat
dijadikan acuan untuk penelitian selanjutnya.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
a. Mengetahui apakah fraksi kloroform : etanol (95:5), fraksi kloroform : etanol :
asam asetat (90:8:2), dan fraksi kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5) dari
ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri mempunyai potensi antibakteri
terhadap S.aureus.
b. Mengetahui fraksi mana yang terdapat dalam ekstrak etanol-asam asetat kulit
batang kemiri yang aktif terhadap S.aureus.
c. Mengetahui identitas senyawa apakah yang terdapat dalam fraksi aktif
antibakteri S.aureus secara KLT.
5
d. Mengetahui apakah dengan metode bioautografi kontak alkaloid yang terdapat
dalam fraksi aktif mempunyai potensi antibakteri terhadap S.aureus.
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Deskripsi Tanaman
1. Keterangan Botani
Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) termasuk dalam suku
Euphorbiaceae dengan sinonim Aleurites triloba Forst. Di Sumatra, kemiri
disebut kereh, kumili, hambiri, kembiri, gambiri, buwa, kare, buwah keras,
buwah tondeh, buwa hare, dudulaa, sapiri; masyarakat Jawa biasa menyebut
kemiri dengan nama kemiri, muncang, derekan, pidekan; di Nusatenggara
disebut derekan, kamere, kawilu; di Sulawesi disebut bintalo, dan di Maluku
disebut kamili, buah kareh, kemiling, saketa (Anonim, 1995).
2. Pertelaan Morfologi
Pohon dengan tinggi 25-30 m, batang tegak, berkayu, permukaan banyak
lentisel, percabangan simpodial, pada batang sebelah atas terdapat tonjolan
bekas melekatnya tangkai daun, coklat. Daun tunggal, berseling, lonjong, tepi
rata, bergelombang, ujung runcing, pangkal tumpul, pertulangan menyirip,
permukaan atas licin, bawah halus, panjang 18-25 cm, lebar 7-11 cm, tangkai
silindris, panjang 10-15 cm, hijau. Bunga majemuk, bentuk malai, berkelamin
dua, diujung cabang, tangkai silindris, panjang 2-3, 5 cm, hijau kecoklatan,
kelopak lonjong, permukaan bersisik rapat, hijau, benang sari jumlah
5-8 buah, tangkai sari bulat, merah, kepala sari bentuk kerucut, merah, putik
bulat, putih, mahkota putih. Buahnya kotak, bulat telur, beruas-ruas, panjang
6
7
± 7 cm, lebar ± 6,5 cm, masih muda hijau setelah tua coklat, berkeriput. Biji
bulat, berkulit keras, berusuk atau beralur, diameter ± 3,5 cm, berdaging,
berminyak, putih kecoklatan. Akar tunggang, coklat (Hutapea dkk, 1993).
3. Kandungan kimia tanaman kemiri
Kulit batang kemiri mengandung senyawa tanin (Duke, 1999). Fraksi
etanol dan fraksi etil asetat kulit batang kemiri mengandung alkaloid piridin–
piperidin (Melinda, 2005). Kulit batang kemiri mengandung senyawa
acetylalueritolic acid (Kardono dkk, 2003).
4. Khasiat
Di Jawa, kulit batang kemiri digunakan untuk mengobati diare dan disentri
(Duke, 1999). Kulit batang kemiri dapat digunakan untuk obat berak darah,
sariawan dan mencret (Anonim, 1986b).
B. Alkaloid
Alkaloid merupakan metabolit sekunder yang memiliki satu atau lebih
atom nitrogen di dalam strukturnya dan biasanya atom ini terdapat dalam cincin
heterosiklik. Pasangan elektron bebas pada atom nitrogen menyebabkan alkaloid
bersifat basa. Kerana sifat basanya, alkaloid dapat bereaksi dengan asam mineral
membentuk garam yang larut dalam air dan berbentuk alkaloid bebas oleh adanya
basa kuat. Alkaloid memiliki aktivitas fisiologi tertentu dan banyak digunakan
dalam produksi obat (Mursyidi, 1990).
8
Biasanya alkaloid diperoleh dengan cara maserasi menggunakan air yang
telah diasamkan sehingga akan melarutkan garam alkaloid, atau dengan
membasakan bagian tumbuhan (misal dengan natrium karbonat), kemudian
alkaloid bebas diekstraksi dengan pelarut organik seperti kloroform, eter, dll
(Robinson, 1995).
Alkaloid berbentuk kristal padat tanwarna, namun ada pula yang berupa
cairan (efedrin, koniin, dan spartein berupa cairan pada suhu kamar) dan alkaloid
yang berwarna pun langka (berberina dan serpentine berwarna kuning) (Robinson,
1995). Alkaloid berasa pahit dan sukar larut dalam air tetapi larut dalam pelarut
organik yang non polar yang tidak campur dengan air seperti kloroform, eter, dll.
Garam alkaloid larut dalam air tetapi tidak larut dalam pelarut organik (Mursyidi,
1990).
C. Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif, anaerob fakultatif
yang tidak membentuk spora, tidak bergerak, dinding selnya mengandung
peptidoglikan dan asam teikoat. Selnya berbentuk bola dengan diameter kira-kira
1 μm tersusun berkelompok menyerupai buah anggur. S.aureus tumbuh paling
cepat pada suhu 37oC. S.aureus relatif tahan terhadap panas (50oC selama
30 menit) dan tahan terhadap 9% natrium klorida, tetapi dapat dihambat oleh zat
kimia tertentu seperti 3% heksaklorofen (Jawetz et al., 1996).
S.aureus yang bersifat patogen dan invasif menghasilkan katalase, enzim
koagulase, dan pigmen kuning yang bersifat hemolitik. S.aureus yang tinggal
9
dalam folikel rambut menimbulkan nekrosis jaringan (faktor dermonekrotik)
(Jawetz et al., 1996).
D. Penyarian
1. Cara Penyarian
Secara umum, cara penyarian dibedakan menjadi dua, yakni dengan
pemanasan dan dengan cara dingin. Penyarian dengan pemanasan terdiri dari
infundasi dan penyarian berkesinambungan. Sedangkan penyarian dengan cara
dingin meliputi perkolasi dan maserasi.
Infundasi digunakan untuk menyari bahan nabati seperti glikosida, dll.
Infundasi dilakukan dengan cara mencampur serbuk simplisia dengan air
dalam panci, kemudian dipanaskan pada suhu 90oC selama 5 menit. Sediaan
cair yang didapat disebut infus. Penyarian dengan cara seperti ini akan didapat
infus yang tidak stabil dan mudah ditumbuhi kapang. Karena itu,
penyimpanannya tidak boleh lebih dari 24 jam (Anonim, 1986a).
Penyarian berkesinambungan disebut juga Soxhletasi, menggunakan alat
yang disebut “Soxhlet”. Pada prinsipnya, cairan penyari dipanaskan hingga
mendidih, uap akan naik ke atas dan mengembun karena adanya pendingin
balik. Embun turun dan melalui serbuk simplisia dan menyari zat-zat yang
dapat larut didalamnya. Proses ini terjadi berulang. Untuk senyawa yang rusak
pada pemanasan biasa, dapat digunakan destilasi uap. Destilasi uap dapat
menyari senyawa yang memiliki titik didih tinggi pada tekanan normal
(Mursyidi, 1990).
10
Perkolasi merupakan suatu cara penyarian dengan cara mengalirkan cairan
penyari melalui serbuk simplisia. Serbuk simplisia ditempatkan pada suatu
bejana silinder dengan pada bagian bawah bejana terdapat suatu sekat yang
berpori. Cairan penyari dialirkan melalui serbuk simplisia dan akan
melarutkan zat aktif sampai keadaan jenuh. Cairan penyari dapat mengalir
karena adanya gaya berat dan cairan diatasnya dikurangi gaya kapiler yang
cenderung menahannya. Alat yang digunakan disebut perkolator. Serbuk
simplisia yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan dalam perkolator,
tetapi dimaserasi terlebih dahulu pada tempat tertutup. Ini penting untuk bahan
yang mudah mengembang bila terkena air (Anonim, 1986a).
Etanol dipertimbangkan sebagai penyari karena: lebih selektif, kapang dan
kuman sulit tumbuh dalam etanol 20% keatas, tidak beracun, netral,
absorbsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala
perbandingan, panas yang diperlukan untuk pemekatan lebih sedikit.
Kekurangannya, etanol mahal harganya. Etanol dapat melarutkan alkaloid
basa (Anonim,1986a).
2. Maserasi
Maserasi adalah cara penyarian yang sederhana yakni dengan merendam
serbuk simplisia dalam cairan penyari. Dinding sel serbuk akan ditembus
cairan penyari, cairan penyari akan sampai pada rongga yang berisi zat aktif
dan melarutkannya. Karena adanya perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar
sel, maka zat aktif akan terbawa, berpindah keluar sampai terjadi
11
kesetimbangan konsentrasi di dalam dan di luar sel. Cara penyarian ini
digunakan untuk zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mudah
mengembang.
Keuntungan cara penyarian ini adalah pengerjaan dan peralatan yang
sederhana dan mudah untuk dilakukan. Sedangkan kerugiannya adalah
pengerjaan yang lama serta penyarian yang kurang sempurna. Pada maserasi,
diperlukan pengadukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir
simplisia sehingga derajat perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar sel tetap
terjaga.
Maserasi dapat dimodifikasi menjadi :
a. Digesti dengan menggunakan pemanasan lemah 40-50oC untuk simplisia
yang tahan terhadap pemanasan.
b. Maserasi dengan mesin pengaduk, dilakukan untuk mempersingkat waktu
ekstraksi yakni 6-24 jam dengan adanya mesin pengaduk yang berputar
terus menerus.
c. Remaserasi, dengan membagi cairan penyari menjadi 2 bagian. Serbuk
simplisia dimaserasi dengan cairan penyari pertama, dan setelah
dienaptuangkan dan diperas, ampas dimaserasi dengan cairan penyari
kedua.
d. Maserasi melingkar, dengan cairan penyari dapat bergerak dan menyebar,
penyari akan mengalir kembali secara berkesinambungan melalui simplisia
dan melarutkan zat aktif.
12
e. Maserasi melingkar bertingkat dilakukan karena maserasi melingkar tidak
dapat dilakukan secara sempurna karena pemindahan massa berhenti bila
keseimbangan telah terjadi (Anonim, 1986a).
E. Metode Pengukuran Potensi Antibakteri
Metode pengukuran antibakteri dapat dibedakan menjadi 2 yaitu:
1. Metode dilusi
Ada dua macam cara yaitu dilusi cair dan dilusi padat. Pada prinsipnya
antibiotik diencerkan sehingga diperoleh beberapa macam kadar. Pada dilusi cair,
tiap-tiap kadar sampel obat ditambahkan pada suspensi kuman dalam media. Pada
dilusi padat setiap kadar obat dicampur dengan media agar kemudian ditanami
kuman. Pengamatannya adalah ada tidaknya pertumbuhan kuman atau bila
mungkin tingkat kesuburan kuman. Metode dilusi ini dapat digunakan untuk
menentukan KHM dan KBM (Anonim, 1993).
2. Metode difusi
Merupakan salah satu metode yang digunakan untuk mengukur potensi
antibakteri berdasarkan pengamatan luas zona jernih yang terbentuk di sekitar
tempat penginokulasian obat karena berdifusinya obat (Jawetz et al., 1996).
Dilakukan dengan cara menempatkan obat pada media padat yang telah
ditanami dengan biakan bakteri. Metode difusi ada beberapa cara :
a. Cara Kirby Bauer
Metode ini dilakukan dengan mengoleskan permukaan media agar dengan
kapas yang telah dicelupkan ke dalam suspensi bakteri, kemudian diletakkan
13
kertas samir yang mengandung antibakteri diatasnya, diinkubasikan pada 37°C
selama 18-24 jam. Hasilnya dibaca berupa zona radikal dan irradikal. Zona radikal
adalah suatu daerah di sekitar kertas samir (disk) yang tidak ditemukan sama
sekali pertumbuhan bakteri. Sedangkan zona irradikal adalah suatu daerah sekitar
disk yang pertumbuhan bakteri dihambat tetapi tidak dimatikan (Anonim, 1993).
b. Cara sumuran
Penyiapan dilakukan seperti cara Kirby Bauer. Setelah biakan siap, dibuat
sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus terhadap permukaan media, ke
dalam sumuran ini diteteskan larutan uji lalu diinkubasi selama 24-48 jam pada
suhu 37°C. Hasilnya dibaca sama seperti cara Kirby Bauer (Anonim, 1993).
c. Cara pour plate
Suspensi bakteri yang telah memenuhi standar konsentrasi bakteri
(108 CFU/ml) diambil 1 ose dan dimasukkan ke dalam 4 ml media agar base 1,5%
yang mempunyai suhu 50°C. Setelah suspensi kuman tersebut homogen, dituang
pada media agar Mueller Hinton, ditunggu sebentar agar membeku, disk
diletakkan di atas media, diinkubasi selama 15-20 jam pada suhu 37°C, dibaca
hasilnya sesuai cara Kirby Bauer (Anonim, 1993).
F. Fraksinasi
Fraksinasi merupakan salah satu proses untuk memisahkan campuran
komponen seperti ekstrak dari organisme hidup yang dipisahkan dalam beberapa
kelompok dengan sifat fisikokimia yang sama. Proses ini dapat dilakukan dalam
berbagai metode antara lain :
14
1. Pengendapan
Pengendapan terjadi ketika konsentrasi bahan dalam larutan melebihi
kelarutan maksimumnya. Campuran dapat diendapkan dengan berbagai metode.
Pengendapan dapat digunakan untuk memindahkan bahan penting atau
memindahkan material yang tidak diinginkan dan mempertahankan bahan yang
penting dalam larutan. Metode yang paling sederhana adalah dengan menurunkan
temperatur larutan. Komponen yang kurang larut dapat diendapkan dan
dipisahkan dengan sentrifugasi atau filtrasi. Cara lainnya yaitu dengan mengubah
polaritas pelarut dengan menambahkan pelarut yang dapat bercampur dengan
polaritas yang berbeda. Salting out juga merupakan salah satu cara fraksinasi
dengan pengendapan yaitu dengan menambahkan ekstrak berair dengan larutan
elektrolit yang sangat larut air sehingga bahan non-ionik akan terendapkan
(Houghton, 1988).
2. Ekstraksi pelarut-pelarut
Ketika cairan ditambahkan pada ekstrak yang dilarutkan pada cairan lain
yang tidak saling campur, akan terbentuk dua lapisan. Masing-masing komponen
dalam campuran akan terlarut pada masing-masing fase lapisan dan kemudian
konsentrasinya mencapai titik keseimbangan. Pelarut yang mudah menguap tidak
boleh digojog dengan cairan panas atau hangat. Ini akan meningkatkan tekanan
uap yang dapat menyebabkan tutup corong terdorong dan isinya tersemprot
keluar. Beberapa fase organik sangat mudah membentuk emulsi dengan larutan
yang mengandung air contohnya pelarut kloroform dan diklorometan. Sehingga
penggunaan pelarut ini sebaiknya dihindari, namun bila tetap digunakan
15
sebaiknya campuran digojog dengan lembut. Cara fraksinasi ini menggunakan
corong pisah (Houghton, 1988).
3. Destilasi
Metode ini digunakan untuk memisahkan campuran komponen volatile.
Cara ini dilakukan secara ekstensif dalam industri, namun penggunaannya terbatas
untuk fraksinasi ekstrak tanaman dan hanya dapat dipakai untuk minyak volatile
(minyak esensial). Alat yang digunakan adalah destilator (Houghton, 1988).
4. Dialisis
Metode dialisis digunakan untuk pemisahan komponen dalam suatu
campuran berdasarkan ukuran molekulnya. Bagian yang penting dari prosedur ini
adalah membran semipermeabel yang tipis yang mengandung polimer dengan
pori-pori tertentu yang memberikan jalan untuk molekul kecil (massa molekul
< 1000 dalton). Molekul dengan ukuran yang lebih besar tidak mungkin dapat
lewat. Tekanan osmotik yang mendekati molekul berukuran kecil dalam suatu
campuran mampu melewati membran sedangkan molekul yang lebih besar
tertinggal (Houghton, 1988).
5. Elektroforesis
Elektroforesis digunakan sebagai metode analisis suatu campuran dalam
jumlah kecil yang mengandung molekul bermuatan terutama protein, peptida dan
asam amino. Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan substansi dari
suatu campuran yang mengandung energi listrik. Dibawah pengaruh energi listrik,
masing-masing molekul akan bergerak dengan kecepatan berbeda-beda
berdasarkan pada ukuran, bentuk, dan total energi listrik (Houghton, 1988).
16
6. Kromatografi
Kromatografi merupakan teknik yang digunakan pada fraksinasi ekstrak
untuk isolasi banyak senyawa alam. Kromatografi terdiri dari dua fase yaitu fase
diam dan fase gerak. Fase diam biasanya berupa padatan. Proses kromatografi
terjadi akibat adanya kesetimbangan dinamik zat terlarut pada dua fase.
Kromatografi dibagi menjadi dua yaitu adsorpsi dan partisi. Adsorpsi
merupakan distribusi senyawa diantara permukaan padat dan cairan. Partisi
merupakan distribusi senyawa diantara dua cairan yang tidak saling campur.
Kromatografi kolom merupakan teknik yang paling tua. Kromatografi kolom
merupakan bentuk kromatografi cair yang digunakan untuk memisahkan
campuran dalam jumlah besar. Sebuah tabung diisi dengan fase diam padat,
sampel diletakkan di bagian atas kolom (tabung kaca atau plastik) dan fase gerak
dialirkan ke bawah melewati kolom. Biasanya fase diam dibuat dalam bentuk
suspensi dan dimasukkan ke dalam kolom. Campuran senyawa (cuplikan)
dialirkan di atas fase diam dan fase gerak dibiarkan mengalir karena adanya
pengaruh gaya gravitasi atau karena adanya tekanan rendah, melewati cuplikan
dan fase diam dan membawa serta senyawa yang larut didalamnya. Dengan
demikian, senyawa dalam cuplikan dapat dipisahkan dan dikumpulkan sebagai
fraksi (Gritter, 1991).
Pemilihan fase diam pada kromatografi kolom bergantung pada sifat/
polaritas dan tingkat keaktifan fase diam. Gugus hidroksi pada permukaan polar
berfungsi untuk menarik molekul senyawa dari cuplikan yang kompleks karena
adanya antaraksi dipol-dipol dan ikatan hidrogen. Jika semua titik telah ditempati
17
air atau pelarut berproton seperti alkohol atau amina, fase diam dikatakan tidak
aktif, maka harus dilakukan pengaktifan dengan pemanasan untuk menghilangkan
air. Fase diam yang paling sering digunakan adalah alumina dan silika gel,
merupakan fase diam yang paling berguna dan mudah didapat. Pemilihan fase
gerak merupakan hal yang penting karena harus dapat menentukan pelarut yang
sesuai untuk dapat menghasilkan pemisahan yang diinginkan (Gritter, 1991).
G. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
KLT merupakan salah satu metode yang digunakan untuk memisahkan
komponen-kompenen. Pada dasarnya, KLT menggunakan dua fase, yaitu fase
diam (stationary) dan fase gerak (mobil). Fase diam berupa zat padat, sedangkan
fase gerak berupa zat cair. Karena itu, KLT dikenal sebagai kromatografi serapan
(absorption chromatography). Pada kromatografi, senyawa yang dipisahkan akan
terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam (Sastrohamidjojo, 1985).
KLT digunakan untuk tujuan kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Secara
kualitatif, KLT digunakan untuk melihat ada atau tidaknya suatu senyawa di
dalam cuplikan. Pada kromatogram KLT dikenal istilah faktor retardasi (Rf) yang
didefinisikan :
Rf =eluenrambat Jarak bercakrambat Jarak (Mulja dan Suharman, 1995).
Secara kuantitatif, KLT digunakan untuk melihat jumlah masing-masing
komponen dalam campuran. Sedangkan secara preparatif, KLT digunakan untuk
memperoleh senyawa dalam jumlah yang memadai (miligram sampai gram)
dalam keadaan murni (Gritter, 1991).
18
Pemilihan fase diam didasarkan pada polaritasnya. Fase diam yang banyak
digunakan adalah silika gel. Silika gel G merupakan silika gel yang dicampur
dengan CaSO4 lebih kurang 13%. CaSO4 berfungsi sebagai perekat gypsum pada
pelat. Pemilihan fase gerak didasarkan pada polaritas sampel, untuk sampel non
polar, dipilih fase gerak yang non polar dan sebaliknya (Mulja dan Suharman,
1995).
H. Bioautografi
Merupakan salah satu cara yang digunakan untuk mendeteksi aktivitas
antibakteri suatu senyawa dengan kromatogram hasil pemisahan senyawa uji pada
KLT. Caranya dengan menempelkan kromatogram hasil pemisahan pada KLT
pada media agar dalam cawan petri yang telah diinokulasikan bakteri yang akan
diuji. Setelah itu, dilakukan inkubasi selama 15-20 jam pada 37oC. Senyawa pada
kromatogram akan berdifusi ke dalam media agar dan akan tampak zona jernih di
sekitar kromatogram jika senyawa tersebut memiliki daya antibakteri sedangkan
daerah yang jauh dari bercak akan tampak keruh (Zweig dan Whitaker, 1971).
Bioautografi merupakan metode universal untuk mengetahui antibiotik yang
belum diketahui komponennya (Stahl, 1969). Metode ini membutuhkan waktu
6-16 jam tergantung dari pertumbuhan mikroorganisme. Deteksi kimia dengan
reaksi warna spesifik digunakan sebagai pembanding hasil bioautografi sehingga
kedua metode diatas saling melengkapi (Stahl, 1969).
Bioautografi dibagi dalam tiga kategori, yakni bioautografi kontak,
bioautografi immersi dan bioautografi langsung. Pada bioautografi kontak,
19
antimikrobia berdifusi dari plat yang diinokulasikan ke media agar. Kromatogram
diinokulasikan pada media agar dan didiamkan beberapa menit atau jam untuk
memberi kesempatan untuk berdifusi. Kromatogram diangkat dan media agar
diinkubasikan. Zona hambat akan tampak pada permukaan media agar di sekitar
bercak kromatogram. Kerugian metode ini adalah kesulitan dalam
menyempurnakan kontak antara agar dan plat kromatogram dan kemampuan
penyerapan pada permukaan media agar (Choma, 2005).
Pada metode bioautografi immersi dan bioautografi langsung dibutuhkan
larutan tetrazolium yang digunakan untuk mendeteksi zona hambat. Daerah yang
ditumbuhi oleh organisme akan berwarna merah sedangkan daerah hambatan akan
berwarna jernih. Bioautografi langsung dilakukan dengan mencelupkan atau
menyemprot suspensi bakteri yang dicampur dengan larutan tetrazolium.
Kemudian plat diinkubasi. Cara ini yang paling rumit dan alat yang digunakan
lebih mahal dibandingkan bioautografi kontak (Choma, 2005).
Pada bioautografi immersi kromatogram ditutup dengan agar yang masih
cair. Setelah agar memadat kemudian diinkubasi. Kekurangan dari bioautografi
immersi yaitu adanya pengenceran antibakteri pada lapisan agar selama agar
masih berbentuk cair sehingga zona hambat yang terjadi dapat menyebar (Choma,
2005).
Selain larutan tetrazolium, dapat juga digunakan larutan 2,3,5-
trifeniltetrazolium klorida dan larutan 2,6-diklorofenol indofenol setelah 4 jam
diinkubasi. Kemudian media tersebut diinkubasi lagi selama 30 menit. Zona
20
hambat akan berwarna biru (Zweig dan Whitaker, 1971 ; Wagman dan Weinstein,
1973).
I. Landasan Teori
Kulit batang kemiri digunakan untuk mengobati diare dan disentri
(Anonim, 1995). Salah satu senyawa kimia yang terkandung dalam kemiri adalah
alkaloid (Arief,1996). Alkaloid dapat tersari dalam etanol dan memiliki aktivitas
fisiologi sebagai antibakteri terhadap S.aureus (Melinda, 2005) dengan S.aureus
merupakan bakteri flora normal dalam hidung manusia (Jawetz et al., 1996). Saat
ini, S.aureus merupakan jenis bakteri yang sudah resisten terhadap antibiotik
golongan penisilin [MRSA (Methicilin-Resistant Staphylococcus aureus)].
Bakteri ini merupakan patogen utama bagi manusia. Piridin-piperidin merupakan
golongan alkaloid yang mempunyai aktivitas antibakteri yang kuat maupun lemah
( Roberts, 1998).
Metode yang digunakan untuk penyarian alkaloid adalah remaserasi
kinetik karena alkaloid mudah larut dalam pelarut organik. Dengan metode ini,
diharapkan senyawa yang terdapat dalam serbuk kulit batang kemiri dapat tersari
seluruhnya karena adanya pengulangan maserasi dengan penggantian pelarut
setiap 24 jam dan pengadukan (Mursyidi, 1990). Metode fraksinasi dilakukan
dengan kromatografi kolom karena cuplikan yang akan dipisahkan tersedia dalam
jumlah yang besar. Fraksinasi ini bertujuan untuk memisahkan ekstrak menjadi
beberapa fraksi (Cordell, 1981) sehingga memudahkan dalam pengidentifikasian.
Menurut Cordell (1981) fase gerak untuk alkaloid piridin adalah kloroform :
21
metanol : asam asetat (60:10:1). Namun pada penelitian ini fase gerak yang
digunakan adalah kloroform : etanol (95:5), kloroform : etanol : asam asetat
(90:8:2), dan kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5). Etanol digunakan sebagai
pengganti metanol karena metanol bersifat toksik. Karena metanol mempunyai
nilai kepolaran 5,1 dan etanol 5,2 maka perbandingan jumlah etanol yang
digunakan lebih sedikit. Hal ini bertujuan supaya kepolaran fase gerak yang
digunakan mendekati kepolaran fase gerak kloroform : metanol : asam asetat
(60:10:1) sehingga alkaloid tersari di fase gerak ini.
Untuk memilih fraksi yang aktif sebagai antibakteri, digunakan metode
difusi. Bioautografi dilakukan untuk mengetahui apakah senyawa yang terdapat
dalam fraksi aktif berpotensi sebagai antibakteri terhadap S.aureus dengan
mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT dan reaksi warna pada
kromatogram KLT dan nilai Rf antara zona hambat yang terbentuk dengan nilai
Rf pembanding (piridin) digunakan untuk mendapatkan identitas fraksi aktif
sebagai antibakteri.
J. HIPOTESIS
Fraksi-fraksi kloroform-etanol-asam asetat dapat berfungsi sebagai
antibakteri terhadap S.aureus.
22
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian rancangan eksperimental murni dengan
rancangan penelitian acak lengkap pola searah. Penelitian ini dilakukan di
Laboratorium Farmakognosi Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Opersional
1. Variabel Penelitian
a. Variabel bebas
Beberapa fraksi hasil pemisahan kromatografi kolom.
b. Variabel tergantung
Zona hambat yang terbentuk di sekitar lubang sumuran pada metode difusi
padat atau yang terbentuk di sekitar bercak pada kromatogram hasil
bioautografi kontak.
c. Variabel terkendali
Umur tanaman kemiri ± 6 tahun dari lingkungan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, suhu pengeringan 60°C, waktu
maserasi 24 jam, waktu inkubasi bakteri uji 24 jam, suhu inkubasi bakteri
uji 370C, volume dan jenis media pertumbuhan mikroba uji yaitu nutrien
agar.
22
23
2. Definisi Operasional
a. Kulit batang kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) adalah bagian luar dari
dahan dan cabang pohon kemiri yang berbatasan dengan kambium batang
dan pohon kemiri yang digunakan berada di lingkungan Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta dengan usia ± 6 tahun.
b. Potensi antibakteri adalah kemampuan fraksi kloroform : etanol (95:5),
fraksi kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2), dan fraksi kloroform :
etanol : asam asetat (90:5:5) dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang
kemiri untuk menghambat atau membunuh bakteri S.aureus.
c. Ekstrak etanol-asam asetat adalah semua senyawa yang terkandung dalam
kulit batang kemiri yang dapat tersari dalam pelarut etanol-asam asetat.
d. Fraksi adalah hasil pemisahan dari kromatografi kolom dalam berbagai
variasi perbandingan pelarut yaitu fraksi I [kloroform : etanol (95:5)],
fraksi III [kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2)], dan fraksi V
[kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5)].
e. Fraksi kloroform-etanol adalah fraksi yang mengandung senyawa hasil
pemisahan dari kromatografi kolom yang dapat tersari dalam pelarut
kloroform-etanol.
f. Fraksi kloroform-etanol-asam asetat adalah fraksi yang mengandung
senyawa hasil pemisahan dari kromatografi kolom yang dapat tersari
dalam pelarut kloroform-etanol-asam asetat.
g. Fraksi aktif adalah fraksi yang mengandung senyawa hasil pemisahan dari
kromatografi kolom yang memiliki aktivitas antibakteri terbesar terhadap
24
S.aureus ditunjukkan dengan diameter zona hambat terbesar pada difusi
padat dengan metode sumuran.
h. Zona hambat adalah zona jernih pada media agar yang telah ditanami
bakteri uji, yang terbentuk di sekitar lubang sumuran atau di sekitar bercak
plat kromatogram karena potensi antibakteri yang ditimbulkan oleh fraksi
aktif.
i. Difusi sumuran adalah metode yang digunakan untuk menguji potensi
antibakteri fraksi kloroform : etanol (95:5), fraksi kloroform : etanol :
asam asetat (90:8:2), dan fraksi kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5)
dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri terhadap S.aureus.
j. Bioautografi kontak adalah metode untuk mendeteksi bercak senyawa
aktif pada kromatogram hasil KLT yang mempunyai potensi sebagai
antibakteri terhadap bakteri S.aureus dengan cara menempelkan
kromatogram pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri uji.
C. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah kulit batang kemiri yang didapat dari
lingkungan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Petroleum
eter t.k, etanol t.k, asam asetat 10%, aquadest steril. Kultur murni Staphylococcus
aureus yang didapat dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Media Nutrien agar (NA) dan Nutrien
Broth (NB), alumunium silika gel G 254 (E. Merck) p.a, glass wool, larutan
25
standar Mc Farland II (setara dengan kepadatan bakteri 6.108 CFU/ml), kloroform
p.a, etanol p.a, asam asetat p.a, pereaksi semprot CAS (Cerium Amonium Sulfat),
pereaksi Bourchardat, Dragendorff, dan Mayer, HCl 1%, Na2CO3 1 M, NaSO4
anhidrat.
2. Alat
Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas yaitu Erlenmeyer, bekker
glass, tabung reaksi, corong, labu ukur, pipet tetes, pHmeter, cawan petri, batang
pengaduk, gelas ukur, sendok, pelubang sumuran, shaker (Innova 2100, New
Brunswick Scientific), corong Buchner (New Cartle, Staffs, England),
rotaevaporator (Janke dan Kunkel, Ika-Labotechnik, RV 05-ST), autoclave
(Model KT-40, ALP Co. Ltd Hamurasi Tokyo Japan); oven (memmert),
waterbath (Mammert), alat kromatografi kolom, corong pisah, inkubator
(Mammert, tipe BE 400, GmbH+CoKG-D91126, Swahaban FRG
Germanymicrobiological safety cabinet), neraca analitik (Scaltec Instruments
Heiligen Stadt Germany), lampu spiritus, jarum ose, flakon, tempat
pengembangan (Chamber) KLT, mikrokapiler, penyangga lempeng kaca, kertas
saring dan penyemprot reagen penampak, lampu UV 254 nm dan UV 365 nm.
D. Tata Cara Penelitian
1. Identifikasi Tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan secara makroskopis di Laboratorium
Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
26
Yogyakarta dengan cara mendeterminasi bagian tanaman (bagian bunga dan
daun) dengan buku panduan Selected Medical Plant Monographic and
Description (Kardono dkk, 2003).
2. Pengumpulan Bahan
Kulit batang kemiri didapat dari pohon kemiri di lingkungan Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang berumur ± 6 tahun
pada bulan Februari sampai bulan Maret. Bagian yang diambil adalah bagian
cabang batang yang berdiameter antara 4–12 cm. Kulit batang dicuci dengan
air mengalir untuk menghilangkan pengotor kemudian ditiriskan untuk
menghilangkan sisa-sisa air cucian. Selanjutnya dipotong kecil-kecil dan
dikeringkan.
3. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk
Pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven pada suhu 600C selama
± 2 hari. Pengeringan dilakukan hingga kulit batang tersebut mudah
dipatahkan. Lalu diserbuk dan diayak dengan ayakan dengan nomor mesh 28
hingga didapat serbuk yang halus.
4. Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif Kulit Batang Kemiri (Aleurites
moluccana L. Willd) dengan Uji Tabung
a. Uji Alkaloid
Dua gram serbuk kulit batang dipanaskan dalam tabung reaksi
27
dengan 10 ml HCl 1% selama 30 menit. Suspensi disaring dengan kapas.
Eluen dibagi ke dalam tiga tabung reaksi A, B, dan C sama banyak. Ke
dalam tabung reaksi A ditambah 3 tetes pereaksi Dragendorff, ke dalam
tabung reaksi B ditambah pereaksi Mayer, dan ke dalam tabung reaksi C
ditambah pereaksi Bourchardat. Jika terbentuk endapan dengan
penambahan ketiga pereaksi tersebut, menunjukkan adanya alkaloid.
b. Uji Polifenol
Dua gram serbuk kulit batang kemiri dipanaskan dengan 10 ml air
selama 10 menit dalam penangas air mendidih. Disaring panas-panas,
setelah dingin, ditambah 3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Didapatkan
warna hijau-biru menunjukkan adanya polifenol.
5. Ekstraksi Kulit Batang Kemiri
Serbuk ditimbang sebanyak ± 250 gram dan dibagi ke dalam 5 buah
Erlenmeyer masing-masing berisi 50 gram serbuk. Tiap Erlenmeyer
ditambahkan pelarut petroleum eter sampai serbuk terendam ± 150 ml,
kemudian ditutup dan digojog menggunakan shaker selama 1 jam. Lalu
disaring dengan corong Buchner, filtrat yang didapat dibuang sedangkan
ampas dikeringkan dengan oven pada suhu 400C untuk menghilangkan sisa
petroleum eter. Ampas yang didapat dimaserasi menggunakan etanol-asam
asetat 10% sampai pHnya 4-5. Kemudian digojog menggunakan shaker
dengan kecepatan 170 rpm selama ± 24 jam. Disaring dengan corong
Buchner, akan didapat filtrat I dan ampas I. Ampas I diremaserasi dengan
28
menggunakan etanol-asam asetat 10%, seperti cara diatas. Kemudian disaring
dengan corong Buchner hingga didapat filtrat II dan ampas II. Ampas II
diremaserasi seperti cara diatas hingga didapat filtat III dan ampas III. Ampas
III buang sedangkan filtrat III dijadikan satu dengan filtrat I dan filtrat II,
kemudian diuapkan dengan rotaevaporator hingga volume filtrat berkurang
sepertiga dari volume sebelumnya. Setelah itu diuapkan diatas waterbath,
sampai didapat ekstrak etanol-asam asetat kental.
6. Preparasi sample , Fase diam, dan Fase Gerak Kromatografi Kolom
Ekstrak kental diencerkan dengan etanol-asam asetat 10%, kolom dicuci
dengan aquadest dan dibilas dengan etanol, glass wool dimasukkan
secukupnya dengan bantuan pinset dan lidi. Kolom dipasang pada statif
setinggi ± 20 cm, keran ditutup. Ke dalam kolom, dimasukkan sedikit fase
gerak kloroform : etanol (95:5). Pembuatan fase diam dilakukan dengan
mencampuar 20 gram silika gel G 254 dengan kloroform : etanol (95:5) di
dalam bekker glass 100 ml, kemudian diaduk. Bila terbentuk buih
dihilangkan. Suspensi silika gel G 254 dimasukkan ke dalam kolom, kolom
ditepuk hingga pengepakan homogen dan gelembung yang terbentuk hilang.
Sesudah homogen, ditambah NaSO4 anhidrat. Keran dibuka pada bagian
bawah kolom, biarkan fase gerak menetes. Fase diam dicuci dengan 50 ml
fase gerak kloroform : etanol (95:5) kemudian dibiarkan menetes hingga fase
gerak yang tertinggal di atas fase diam ± 0.5 cm, kemudian keran bawah
ditutup.
29
7. Fraksinasi Ekstrak Etanol-Asam Asetat dengan Kromatografi Kolom
Ke dalam kolom, sebanyak 1,0 ml sample dimasukkan secara hati-hati.
Ketika sampel hampir masuk semua, keran dibuka dan fase gerak kloroform
: etanol (95:5) dialirkan melalui dinding kolom. Fase gerak dialirkan terus
menerus sehingga di atas fase diam selalu terdapat eluen 0,5-1 cm. Di dalam
Erlenmeyer, eluen ditampung hingga didapat eluen sebanyak 90 ml (fraksi I).
Setelah didapat 90 ml eluen, bagian bawah keran ditutup. Fase gerak diganti
dengan fase gerak kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2) yang ditempatkan
pada corong pisah. Fase gerak kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2)
dialirkan dari corong pisah (keran bagian bawah kolom dalam keadaan
terbuka) dan dipastikan tinggi volume fase gerak di atas fase diam selalu 0.5-
1 cm. Di dalam Erlenmeyer 2, eluen ditampung sampai kira-kira fase gerak
sebelumnya habis, ± 20 ml (fraksi II). Setelah itu, ke dalam Erlenmeyer 3,
eluen ditampung hingga didapat eluen sebanyak 80 ml (fraksi III). Keran
bagian bawah ditutup, fase gerak diganti dengan fase gerak kloroform :
etanol : asam asetat (90:5:5) yang ditempatkan pada corong pisah. Fase gerak
kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5) dialirkan dari corong pisah (keran
bagian bawah kolom dalam keadaan terbuka) dan dipastikan tinggi volume
fase gerak diatas fase diam selalu 0.5-1 cm. Di dalam Erlenmeyer 4, eluen
ditampung sampai kira-kira fase gerak sebelumnya habis, ± 20 ml (fraksi IV).
Setelah itu, ke dalam Erlenmeyer 5, eluen ditampung hingga didapat eluen
sebanyak 90 ml (fraksi V).
30
8. Uji Potensi Antibakteri Tiap Fraksi dan Pemilihan Fraksi Aktif
a. Pembuatan Suspensi bakteri Staphyloccocus aureus
Ke dalam 5 ml nutrien broth, bakteri uji dari kultur murni diinokulasikan
sebanyak 1 ose dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah 24 jam, kepadatan
bakteri uji disamakan dengan larutan standar Mc Farland II (setara dengan
kepadatan bakteri 6.108 CFU/ml).
b. Pembiakan bakteri uji secara pour plate
Ke dalam tabung reaksi yang berisi agar cair yang telah didinginkan pada
suhu 450C, sebanyak 1,0 ml suspensi bakteri diinokulasikan. Tabung
reaksi di vortex, campuran dituang ke dalam cawan petri steril dan
dibiarkan memadat. Inkubasikan terbalik.
c. Pengujian dan penentuan fraksi aktif
Pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri S.aureus, dibuat lubang
sumuran. Ke dalam tiap lubang dimasukkan berbagai macam fraksi yang
didapat (satu lubang satu fraksi). Inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.
Setelah 24 jam, zona hambat yang terbentuk diamati. Zona hambat dengan
diameter terbesar dipilih sebagai fraksi aktif.
9. Uji Kualitatif Fraksi Aktif Dengan Metode KLT
Fraksi kental hasil penyarian serbuk kulit batang kemiri secara
kromatografi kolom disari dengan HCl 1% sebanyak 3 ml di atas waterbath
pada suhu 50oC selama 5 menit. Filtrat yang didapat ditambah Na2CO3 1 M
dengan pH 8-9 kemudian disari dengan kloroform 3 ml. Didapat dua lapisan
31
cairan, lapisan atas dinetralkan dengan asam asetat dan merupakan larutan
untuk uji alkaloid kuaterner. Lapisan bawah disari dengan HCl 1% dan
didapat dua lapisan cairan. Lapisan atas digunakan untuk uji alkaloid tersier
dan lapisan bawah disingkirkan. Larutan uji alkaloid kuaterner dan tersier
tersebut masing-masing dipekatkan di atas waterbath kemudian dilarutkan
dengan air beberapa tetes untuk uji KLT. Pada KLT, digunakan fase diam
silika gel G 254, fase gerak yang digunakan adalah fase gerak kloroform :
etanol : asam asetat (60:20:20). Setelah fraksi aktif ditotolkan pada fase diam,
dimasukkan ke dalam tabung pengembang yang telah berisi fase gerak.
Pengembangan dilakukan dua kali yakni 5 cm dan 10 cm sehingga jarak elusi
fase gerak 15 cm. Setelah itu, fase diam diangkat kemudian diangin-anginkan
sampai kering setelah itu dideteksi dengan UV 254 nm dan 365 nm.
Dilakukan uji identifikasi senyawa hasil KLT dengan pereaksi warna CAS,
kemudian hasilnya dibandingkan dengan pembanding.
10. Uji Potensi Antibakteri Senyawa Aktif Dari Fraksi Aktif Terhadap
Staphylococcus aureus dengan Metode Bioautografi Kontak
Fase diam yang telah dikembangkan dalam pengembang diangkat,
kemudian plat kromatogram yang diperoleh dihilangkan fase geraknya
dengan didiamkan selama 24 jam, kemudian diinokulasikan pada permukaan
media agar dalam petri yang telah diinokulasikan bakteri S.aureus selama
1 jam. Diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC. Akan didapat zona
jernih pada media agar bila senyawa dapat berdifusi ke daam lapisan tersebut
32
dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri, sedangkan lapisan yang
ditumbuhi bakteri akan berwarna buram. Hasil tersebut dibandingkan dengan
hasil identifikasi kualitatif senyawa aktif dengan metode reaksi warna pada
KLT sebelumnya. Parameter yang diukur adalah nilai Rf yang terdapat pada
plat kromatogram dengan nilai Rf pada media agar yang terjadi
penghambatan (terbentuk zona hambat) di daerah yang sesuai dengan lokasi
bercak pada plat kromatogram.
33
Pengeringan dan pembuatan serbuk
- diameter 4-12 cm
Identifikasi tanaman
Pengumpulan kulit batang
- makroskopis
Pembuatan ekstrak etanol-asam asetat
Maserasi menggunakan pelarut etanol-asam asetat
Uji tabung
- uji alkaloid - uji polifenol
- Pengeringan dengan oven 600C - Penyerbukan dan Pengayakan
Fraksinasi ekstrak etanol-asam asetat dengan kromatografi kolom
- fase diam : silika gel GF 254 - fase gerak :
1. kloroform : etanol (95:5) 2. kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2) 3. kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5)
Uji potensi antibakteri tiap fraksi dengan metode sumuran
34
Identifikasi kualitatif fraksi aktif dengan metode KLT
- fase diam : silika gel GF 254 - fase gerak : kloroform : etanol : asam asetat (60:20:20) - deteksi UV 254 dan UV 365 - pereaksi semprot CAS - pembanding: Piridin
Uji potensi antibakteri fraksi aktif terhadap S.aureus
dengan metode Bioautografi kontak
Analisis hasil
Gambar 1. Skema Penelitian Potensi Antibakteri Fraksi Floroform-Etanol-Asam Asetat dari Ekstrak Etanol-Asam Asetat Kulit Batang Kemiri Terhadap Staphylococcus aureus
E. Analisis Hasil
Uji potensi antibakteri fraksi kloroform : etanol (95:5), fraksi kloroform :
etanol : asam asetat (90:8:2), dan fraksi kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5)
dari ekstrak etanol serbuk kulit batang kemiri ditunjukkan dengan diameter zona
hambat yang diperoleh dengan metode pengujian menggunakan difusi sumuran.
Potensi dilihat dari ada tidaknya zona hambat disekitar sumuran. Kandungan
senyawa dalam fraksi aktif kulit batang kemiri diperoleh dengan uji tabung.
Penentuan fraksi aktif ditentukan berdasarkan zona hambat terbesar
dengan cara membandingkannya dengan kontrol positif. Data senyawa yang
berupa nilai Rf dan warna bercak diperoleh berdasarkan uji KLT dari fraksi aktif.
35
Potensi antibakteri fraksi aktif diperoleh dengan melihat ada tidaknya zona
hambat yang ditimbulkan oleh bercak kromatogram yang diletakkan pada media
agar yang telah diinokulasi bakteri uji S.aureus.
Pengamatan nilai Rf dilakukan terhadap bercak yang dihasilkan dengan
deteksi pada lampu UV 254 nm, 365 nm dan pereaksi semprot CAS serta dapat
dilihat perolehan nilai Rfnya. Hasil dan data penelitian yang diperoleh
dibandingkan dengan pustaka menurut Cordell (1981).
36
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi Tanaman
Langkah pertama yang dilakukan dalam penelitian ini adalah identifikasi
tanaman kemiri (Aleurites moluccana L. Willd). Langkah ini dilakukan dengan
tujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang diteliti benar-benar merupakan
tanaman yang diharapkan, yakni tanaman kemiri (Aleurites moluccana L. Willd).
Dari hasil identifikasi, dapat dipastikan bahwa tanaman yang akan diteliti
merupakan tanaman kemiri (Aleurites moluccana L. Willd).
B. Pengumpulan Bahan
Dalam penelitian ini, bahan yang akan diteliti adalah bagian kulit batang
tanaman kemiri di lingkungan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta yang berumur ± 6 tahun. Pengambilan bahan dilakukan antara bulan
Februari sampai dengan Maret 2005. Kulit batang kemiri yang akan diteliti
didapat dari batang yang berdiameter antara 4-12 cm karena batang dengan
diameter tersebut dapat dianggap sudah cukup tua/ dewasa dan diharapkan zat
kimia yang terkandung sudah cukup banyak untuk penelitian. Selain itu, batang
dengan diameter 4-12 cm akan lebih mudah untuk dikuliti daripada yang
berukuran kurang atau lebih dari kisaran tersebut. Kulit batang yang didapat
dicuci dengan air mengalir dengan tujuan untuk membersihkan kotoran-kotoran
yang menempel yang jika tidak dibersihkan akan mengganggu jalannya penelitian
yakni pada saat identifikasi senyawa. Digunakan air mengalir agar kotoran-
36
37
kotoran yang menempel langsung terbawa oleh air meninggalkan kulit batang
kemiri. Kemudian ditiriskan untuk menghilangkan sisa-sisa air cucian.
Selanjutnya kulit batang kemiri dipotong kecil-kecil untuk memudahkan pada saat
penyerbukan.
C. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk
Langkah selanjutnya adalah pengeringan dan pembuatan serbuk. Pengeringan
dilakukan dengan tujuan untuk mengurangi kadar air yang terkandung dalam kulit
batang kemiri karena air merupakan media yang baik untuk pertumbuhan jamur,
kapang, dan bakteri sehingga adanya air yang berlebih dapat menyebabkan kulit
batang kemiri ditumbuhi mikroorganisme. Jika hal itu terjadi, dikhawatirkan zat
kimia yang terkandung dalam kulit batang kemiri akan terurai. Penguraian ini
akan mengganggu pada saat pengidentifikasian karena zat kimia yang terkandung
dalam ekstrak bukan yang sebenarnya, karena hasil penguraian. Pengeringan
dilakukan sampai kadar air tidak lebih dari 10% (Anonim, 1985). Ini ditandai
dengan mudah patahnya simplisia jika diremas dengan tangan. Pengeringan
dilakukan dengan menggunakan oven dengan kipas penghembus udara sehingga
terjadi sirkulasi yang baik pada suhu 60oC hingga bahan yang dikeringkan mudah
hancur jika diremas dengan tangan. Setelah bahan kering, langkah selanjutnya
adalah penyerbukan menggunakan mesin penyerbuk. Penyerbukan dilakukan
dengan tujuan untuk memperoleh bahan dengan ukuran partikel yang lebih kecil
karena semakin kecil ukuran partikel, berarti semakin besar luas permukaan
sehingga akan memperbesar kontak dengan cairan penyari pada saat penyarian, ini
38
akan meningkatkan efektifitas penyarian karena zat yang tersari akan lebih banyak
dan penyarian dapat berlangsung lebih cepat. Setelah bahan diserbuk, selanjutnya
bahan diayak untuk memperoleh serbuk yang halus untuk meningkatkan
efektifitas penyarian. Ayakan yang dipakai adalah ayakan dengan nomor mesh 28.
Serbuk halus yang telah didapat selanjutnya disari menggunakan pelarut yang
telah ditentukan.
D. Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif Kulit Batang Kemiri (Aleurites
moluccana L. Willd) dengan Uji Tabung
Sebelum memasuki langkah selanjutnya, terlebih dahulu dilakukan uji tabung
serbuk kulit batang kemiri. Tujuan dilakukan uji ini adalah untuk mengetahui zat
kimia yang terkandung dalam serbuk kulit batang kemiri. Uji tabung yang
dilakukan adalah uji alkaloid dan uji polifenol karena mengacu pada penelitian
sebelumnya (Melinda, 2005) bahwa dalam kulit batang kemiri mengandung
alkaloid dan polifenol. Uji alkaloid dilakukan untuk lebih memastikan adanya
alkaloid dalam kulit batang kemiri yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap
S.aureus. Pengendapan akan terjadi bila alklaoid bereaksi dengan metal atau
metaloid seperti bismuth (terdapat pada pereaksi Dragendorff), merkuri (terdapat
pada pereaksi Mayer) dan iodium (terdapat pada pereaksi Bourchardat) (Bruneton,
1994). Dari hasil uji alkaloid didapatkan hasil bahwa kulit batang kemiri
mengandung alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan coklat merah pada
penambahan pereaksi Dragendorff dan endapan putih kekuningan pada
penambahan pereaksi Mayer. Endapan juga terbentuk pada penambahan pereaksi
39
Bourchardat. Pada uji polifenol, didapatkan hasil yang positif. Artinya simplisia
mengandung polifenol ditandai dengan filtrat menjadi berwarna hijau biru pada
penambahan FeCl3.
Tabel I. Hasil Uji Tabung Serbuk Kulit Batang Kemiri
No. Pengujian Pengamatan Hasil1. Uji Alkaloid
Filtrat 1 + Dragendorff LP Filtrat 2 + Mayer LP Filtrat 3 + Bourchardat LP
Terbentuk endapan coklat merah Terbentuk endapan putih kekuningan Terbentuk endapan coklat kemerahan
+ + +
2. Uji Polifenol Filtrat + FeCl3
Hijau biru
+
Hasil uji tabung sesuai dengan penelitian terdahulu (Melinda, 2005) bahwa
kulit batang kemiri mengandung alkaloid dan polifenol. Kedua zat tersebut
memiliki potensi sebagai antibakteri. Menurut penelitian Melinda (2005), zat yang
terkandung dalam kulit batang kemiri, yang berpotensi sebagai antibakteri
terhadap S.aureus adalah alkaloid. Oleh karena itu, penelitian ini akan membahas
alkaloid sebagai antibakteri terhadap S.aureus.
E. Ekstraksi Kulit Batang Kemiri
Penyarian merupakan cara yang dilakukan untuk mendapatkan ekstrak dari
simplisia. Pada penelitian ini, metode penyarian yang digunakan untuk
mendapatkan ekstrak etanol-asam asetat adalah metode maserasi dengan pelarut
etanol 70%-asam asetat 10% dengan pH 4-5. Etanol merupakan pelarut organik
yang bersifat semi polar sampai polar. Etanol dipilih sebagai penyari karena sifat-
sifatnya, antara lain selektif karena hanya menyari zat-zat yang memiliki polaritas
40
yang hampir sama dengan polaritas etanol, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam
etanol 20% keatas karena itu dipakai etanol 70%, tidak beracun, netral,
absorpsinya baik, etanol dapat bercampur dengan air pada segala perbandingan,
panas yang dipakai untuk pemekatan lebih sedikit (Anonim, 1986a). Etanol dapat
melarutkan alkaloid basa (Anonim, 1986a) karena penelitian ini lebih ditekankan
pada pengidentifikasian alkaloid yang terkandung dalam kulit batang kemiri yang
berpotensi sebagai antibakteri terhadap S.aureus (Melinda, 2005).
Cara remaserasi kinetik digunakan dalam penelitian ini karena mudah dan
pengerjaannya sederhana yakni hanya merendam serbuk simplisia dalam cairan
penyari yang sesuai serta dilakukan pengadukan. Dinding sel serbuk akan
ditembus cairan penyari, cairan penyari akan sampai pada rongga yang berisi zat
aktif dan melarutkannya. Karena adanya perbedaan konsentrasi di dalam dan di
luar sel, maka zat aktif akan terbawa, berpindah keluar sampai terjadi
kesetimbangan konsentrasi di dalam dan di luar sel. Keuntungan cara penyarian
ini adalah senyawa yang terkandung dalam serbuk kulit batang kemiri dapat
tersari secara optimal karena adanya pengulangan maserasi setiap 24 jam dan
pengadukan. Sedangkan kerugiannya adalah pengerjaan yang lama, penggunaan
pelarut yang cukup banyak serta penyarian yang kurang sempurna yakni untuk
mendapatkan hasil yang maksimal harus dilakukan maserasi berulang kali. Pada
maserasi, diperlukan pengadukan untuk meratakan konsentrasi di luar butir
simplisia sehingga derajat perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar sel tetap
terjaga.
41
Pada proses penyarian, sebelum dilakukan penyarian dengan cairan
penyari etanol 70%, sebelumnya simplisia dimaserasi terlebih dahulu
menggunakan petroleum eter. Maserasi menggunakan petroleum eter ini bertujuan
untuk memisahkan ekstrak dari senyawa non polar seperti lemak dan senyawa non
polar lainnya (lilin, damar, klorofil) yang mungkin terkandung di dalam kulit
batang kemiri karena petroleum eter dapat digunakan untuk menyari senyawa non
polar tersebut sehingga diperoleh ekstrak yang bebas dari senyawa non polar. Ini
akan menguntungkan pada saat identifikasi karena ekstrak tidak mengandung
banyak zat. Selain itu lemak harus dihilangkan karena akan mengganggu pada
proses pengidentifikasian senyawa. Alkaloid merupakan senyawa semi polar,
namun demikian, alkaloid tidak larut pada petroleum eter (Mursyidi, 1990).
Penggojogan menggunakan shaker dimaksudkan untuk meratakan kandungan zat
aktif di luar sel sehingga perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar sel yang
merata tetap terjaga. Karena adanya perbedaan konsentrasi di dalam dan di luar
sel, maka zat aktif akan terbawa, berpindah keluar sampai terjadi kesetimbangan
konsentrasi di dalam dan di luar sel. Hasil maserasi disaring menggunakan corong
Buchner, penyaringan dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan filtrat dan
filtrat yang didapat, yang mengandung lemak dibuang, sedangkan ampasnya
dikeringkan menggunakan oven pada suhu 40oC untuk menghilangkan sisa
petroleum eter. Ampas yang didapat diremaserasi kinetik. Remaserasi ini
dilakukan untuk menyari kembali zat aktif yang mungkin masih tertinggal di
dalam ampas yang belum tersari sehingga penyarian menjadi lebih optimal.
Penyarian menggunakan etanol dilakukan selama 3 x 24 jam. Penguapan
42
dilakukan dengan menggunakan rotaevaporator hingga volume filtrat berkurang
sepertiga dari volume sebelumnya. Penggunaan rotaevaporator untuk
mempercepat pemisahan cairan penyari dengan ekstrak. Setelah itu diuapkan di
atas waterbath pada suhu 50oC, sampai didapat ekstrak etanol-asam asetat kental.
Berat ekstrak etanol-asam asetat kental yang diekstrak secara maserasi dari 250
gram serbuk kulit batang kemiri adalah 2,12 gram. Ekstrak ini yang nantinya akan
dikromatografi kolom untuk mendapatkan fraksi-fraksi dengan zat-zat yang tersari
dari kulit batang kemiri terbagi dalam fraksi-fraksi tersebut sesuai dengan
polaritasnya.
F. Preparasi Sampel, Fase Diam, dan Fase Gerak Kromatografi Kolom
Sampel yang akan diuji merupakan fraksi-fraksi yang didapat dari
kromatografi kolom ekstrak etanol-asam asetat kental. Kromatografi kolom ini
termasuk dalam kromatografi fase normal karena fase gerak yang digunakan
bersifat lebih non polar daripada fase diamnya, penggunaan glass wool bertujuan
untuk menahan fase diam keluar dari kolom pada saat kromatografi berlangsung.
Fase diam yang digunakan adalah silika gel G 254. Sebelum digunakan, terlebih
dahulu dilakukan pengaktifan silika gel yakni dengan dipanaskan di dalam oven
pada suhu 100oC selama 15 menit. Tujuan pengaktifan ini adalah untuk
menghilangkan air yang mungkin ada di dalam silika gel karena adanya air akan
menghambat proses kromatografi. Selain itu pengaktifan dilakukan untuk
mengembangkan pori-pori silika gel untuk memperlancar proses kromatografi.
Pembuatan fase diam dilakukan dengan mencampur 20 gram silika gel G 254
43
dengan fase gerak kloroform : etanol (95:5) sampai terbentuk bubur silika gel.
Bila terbentuk buih dihilangkan karena adanya buih akan menyebabkan
terbentuknya rongga udara pada fase diam sehingga akan mengganggu proses
pemisahan. Suspensi silika gel G 254 dimasukkan ke dalam kolom, kolom
ditepuk-tepuk untuk memperoleh lapisan yang seragam sehingga pengepakan
homogen dan gelembung-gelembung yang terbentuk hilang. Sesudah homogen,
ditambah NaSO4 anhidrat. Penggunaan NaSO4 anhidrat bertujuan untuk mengikat
H2O yang mungkin terkandung dalam fase gerak dan menyerap O2 sehingga
mencegah kolom agar tidak terisi oleh udara dan H2O. Adanya H2O dapat
mengganggu fase gerak dalam membawa zat aktif yang larut di dalamnya karena
H2O dapat menempati rongga-rongga tempat merembesnya fase gerak untuk
membawa zat aktif. Selain itu, penambahan NaSO4 bertujuan untuk melindungi
fase diam agar tidak rusak saat cuplikan dan fase gerak di tuang ke kolom. Fase
diam dicuci dengan fase gerak kloroform : etanol (95:5) kemudian dibiarkan
menetes hingga volume fase gerak yang tertinggal di atas fase diam ± 0,5 cm agar
permukaan fase diam tidak kering.
G. Fraksinasi Ekstrak Etanol-Asam Asetat Dengan Kromatografi Kolom
Sampel yang akan dipisahkan secara kromatografi kolom dimasukkan ke
dalam kolom secara hati-hati karena jika tidak hati-hati dapat menyebabkan
ketidakhomogenan permukaan fase diam sehingga dapat mempengaruhi
homogenitas pada saat pemisahan oleh fase gerak. Jumlah sampel sebanyak
1,0 ml dengan kosentrasi 10%. Namun semakin tinggi konsentrasi sampel yang
44
digunakan akan semakin baik karena itu berarti jumlah zat yang terkandung di
dalam fraksi-fraksi terpisah lebih banyak pula sehingga akan lebih memudahkan
pada uji kualitatif selanjutnya. Fase gerak dialirkan terus menerus sehingga di atas
fase diam selalu terdapat eluen 0,5-1,0 cm agar permukaan fase diam tidak kering.
Fase gerak dialirkan melalui dinding kolom untuk menjaga agar permukaan fase
diam tetap rata/ homogen karena jika diteteskan dapat menyebabkan permukaan
fase diam menjadi tidak rata. Fase gerak yang digunakan untuk menyari alkaloid
piridin adalah kloroform : metanol : asam asetat (60:10:1) (Cordell, 1981). Namun
pada penelitian ini fase gerak yang digunakan adalah kloroform : etanol (95:5),
kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2), dan kloroform : etanol : asam asetat
(90:5:5). Etanol digunakan sebagai pengganti metanol karena metanol bersifat
toksik. Karena metanol mempunyai nilai kepolaran 5,1 dan etanol 5,2 maka
perbandingan jumlah etanol yang digunakan lebih sedikit. Hal ini bertujuan
supaya kepolaran pelarut mendekati kepolaran fase gerak kloroform : metanol :
asam asetat (60:10:1) sehingga alkaloid tersari di fase gerak ini. Masing-masing
fase gerak diperlukan sebanyak 100 ml. Tujuan digunakan 3 macam fase gerak
dengan variasi perbandingan adalah untuk mendapatkan pemisahan yang lebih
baik sesuai dengan polaritasnya. Ini akan lebih menguntungkan pada saat
pengidentifikasian.
Dari hasil kromatografi kolom, didapat 5 fraksi. Tiga fraksi nantinya akan
digunakan untuk uji potensi antibakteri dan juga uji kualitatif dengan pereaksi
warna dan bioautografi kontak. Fraksi yang akan digunakan adalah fraksi I, fraksi
III, dan fraksi V. Masing-masing fraksi didapat volume: fraksi I = ± 90 ml, fraksi
45
III = ± 80 ml, dan fraksi V = ± 90 ml. Fraksi II dan fraksi IV (masing-masing
fraksi didapat volume ± 20 ml) tidak digunakan karena fraksi II diperkirakan
merupakan fraksi peralihan dari fase gerak I ke fase gerak III sedangkan fraksi IV
diperkirakan merupakan fraksi peralihan dari fase gerak III ke fase gerak V.
Namun demikian, belum ada bukti kualitatif yang menyatakan bahwa fraksi II dan
fraksi IV merupakan fraksi peralihan. Dari ketiga fraksi ini dipilih salah satu yang
memberikan potensi yang paling besar sebagai antibakteri. Selanjutnya fraksi ini
akan digunakan untuk uji kualitatif secara KLT dengan pereaksi warna dan
bioautografi kontak.
H. Uji Potensi Antibakteri Tiap Fraksi dan Pemilihan Fraksi Aktif
Pengujian potensi antibakteri dilakukan menggunakan metode difusi
sumuran. Bakteri yang digunakan adalah S.aureus. Pertimbangan penggunaan
bakteri ini adalah karena bakteri ini merupakan bakteri gram positif yang bersifat
patogen dan merupakan bakteri flora normal bagi beberapa orang karena empat
puluh sampai lima puluh persen manusia merupakan pembawa S.aureus dalam
hidung dan dalam folikel rambut (Jawetz et al., 1996). Selain itu S.aureus
merupakan bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik golongan penisilin
(MRSA) karena seringnya terjadi infeksi nosokomial. Pengujian ini dilakukan
untuk mengetahui apakah fraksi yang didapat memiliki potensi antibakteri
terhadap S.aureus, juga untuk menentukan fraksi mana yang memberikan daya
hambat yang paling besar diantara fraksi-fraksi yang telah didapat. Fraksi yang
memiliki daya hambat terbesar inilah yang nantinya akan digunakan untuk
46
langkah selanjutnya, dengan fraksi ini akan dicari identitas zat aktif yang
terkandung di dalamnya yang berpotensi sebagai antibakteri. Pemilihan fraksi
aktif dilakukan dengan melihat zona jernih di sekitar lubang sumuran yang
memiliki diameter yang terbesar. Larutan standar kepadatan bakteri uji yang
digunakan adalah larutan standar Mc Farland II (setara dengan kepadatan bakteri
6.108 CFU/ml) karena partikel pada larutan standar Mc Farland II memiliki
ukuran partikel yang hampir sama dengan ukuran partikel sel bakteri S.aureus.
Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri uji yang berumur 24-48 jam karena
pada waktu tersebut, pertumbuhan bakteri sedang memasuki fase logaritmik/
eksponensial. Pada fase ini, bakteri sedang tumbuh secara optimal sehingga waktu
tersebut merupakan waktu yang optimal untuk dilakukan pengujian dan hasil
pengamatan yang didapat benar-benar obyektif karena bakteri uji yang mati
disebabkan oleh zat aktif yang terkandung dalam fraksi, bukan karena umur
bakteri yang sudah tua. Pembiakan bakteri uji dilakukan menggunakan cara pour
plate karena S.aureus merupakan bakteri gram positif, bersifat anaerob fakultatif
yang tidak membentuk spora, tidak bergerak (Jawetz et al., 1996) sehingga
dengan metode pour plate diharapkan S.aureus dapat tersebar merata dalam media
uji, tidak hanya tumbuh di permukaan. Inkubasi terbalik yang dilakukan bertujuan
untuk menghindari titik-titik air yang terbentuk dari uap panas media agar
sehingga dapat menghalangi pengamatan.
Konsentrasi fraksi yang digunakan adalah 10 mg/ml karena menurut
penelitian terdahulu (Melinda, 2005), ini adalah konsentrasi terkecil yang masih
bisa menghambat pertumbuhan bakteri. Metode pengukuran potensi antibakteri
47
menggunakan metode sumuran agar fraksi yang diuji tidak hanya berdifusi di
permukaan media saja tetapi merata ke dalam media, pada metode ini, zat aktif
akan berdifusi ke dalam media agar NA dan ke dalam sel bakteri sehingga ada
faktor yang menentukan zat aktif dapat berdifusi, yakni sifat polaritas dari zat
aktif. Media agar NA yang digunakan bersifat polar, demikian pula dinding sel
S.aureus karena tersusun atas polisakarida, asam teikoat dan protein (Jawetz et al.,
1991) sehingga zat-zat yang bersifat polar akan lebih mudah untuk berdifusi dan
menembus dinding sel bakteri. Pelarut fraksi akan membantu berdifusinya zat
aktif ke dalam media agar NA sehingga pelarut yang bersifat polar akan lebih
mudah membawa zat aktif berdifusi ke dalam media agar NA. Kontrol positif
yang digunakan adalah piridin. Konsentrasi piridin yang digunakan adalah 5%.
Kontrol negatif yang digunakan adalah DMSO. Kontrol kontaminasi berupa
media agar untuk memastikan bahwa media agar yang digunakan tidak
terkontaminasi.
Tabel II. Rerata Diameter Zona Hambat Fraksi Kloroform-Etanol-Asam Asetat dari Ekstrak Etanol-Asam Asetat Kulit Batang Kemiri Terhadap Staphylococcus aureus
Fraksi Etanol-Asam Asetat
Diameter zona hambat (cm) Rerata
x ± SD I II III Fraksi I - - - - Fraksi III 0,9 0,7 0,8 0,8 ± 0,1 Fraksi V 1,5 1,4 1,4 1,43 ± 0,06 Kontrol (+) 1,2 1,2 1,2 1,2 ± 0
Dari uji ini dapat ditentukan fraksi aktif yang akan digunakan pada uji
selanjutnya, yakni uji identifikasi dengan melihat zona hambat yang terbesar.
48
Melihat hasil yang didapat, fraksi aktif dari fraksi kloroform-etanol-asam asetat
dari ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri adalah fraksi V yang memiliki
rerata diameter zona hambat lebih besar dari fraksi I dan fraksi III dengan rerata
diameter zona hambat sebesar 1,43 cm. Karena diameter zona hambat fraksi aktif
lebih besar daripada diameter zona hambat kontrol positif, maka fraksi aktif ini
berpotensi untuk dikembangkan.
I. Uji Kualitatif Fraksi Aktif Dengan Metode KLT
Uji KLT dilakukan untuk mencari identitas dari zat aktif yang berpotensi
sebagai antibakteri berdasarkan nilai Rf dan warna bercak dilihat pada UV 254,
UV 365, dan pereaksi semprot CAS, pada kromatogram yang telah dikembangkan
secara KLT. KLT yang digunakan merupakan kromatografi fase normal karena
fase gerak yang digunakan lebih bersifat non polar daripada fase diamnya. Fase
diam yang digunakan adalah silika gel G 254 karena bersifat polar dan fase gerak
yang digunakan adalah kloroform : etanol : asam asetat dengan perbandingan
60:20:20. Fraksi kental hasil penyarian serbuk kulit batang kemiri secara
kromatografi kolom disari dengan HCl 1% sebanyak 3 ml di atas waterbath pada
suhu 50oC selama 5 menit. Penggunaan HCl 1% bertujuan untuk membentuk
garam alkaloid (dalam bentuk basa) agar larut dalam air dengan cara menarik
alkaloid, karena alkaloid memiliki pasangan elektron bebas pada atom N sehingga
dapat mengikat asam membentuk garam. Alkaloid netral akan larut dalam HCl.
Filtrat yang didapatkan ditambah dengan Na2CO3 1 M dengan pH 8-9 kemudian
disari dengan kloroform. Penambahan Na2CO3 bertujuan untuk membebaskan
49
garam alkaloid menjadi alkaloid bebas yang larut dalam pelarut non polar yakni
kloroform. Pada tahap ini, akan didapatkan dua lapisan cairan, yakni untuk uji
alkaloid tersier dan alkaloid kuaterner. Untuk uji KLT, pelarut yang digunakan
adalah air karena apabila digunakan DMSO (pelarut yang digunakan pada uji
potensi antibakteri) akan sulit menguap sehingga akan memperlama pada saat
pengeringan dan kemungkinan besar akan menimbulkan pengekoran setelah
proses elusi. Hal ini kemungkinan disebabkan karena adanya pengotor dalam
DMSO sehingga menyebabkan bercak tampak mengekor. Pengembangan
dilakukan dua kali. Pengembangan pertama berjarak 5 cm dan pengembangan
kedua berjarak 10 cm. Tujuan dilakukan pengembangan sebanyak dua kali agar
senyawa dapat terpisah dengan baik dilihat dari bercak KLT yang terpisah jelas.
Pembanding yang digunakan adalah piridin hasil sintesis. Pembanding dan fraksi
tidak ditotolkan dalam satu plat karena setelah dilakukan pengembangan bercak
kromatogram piridin memiliki hasil yang melebar sehingga dikhawatirkan bercak
kromatogram piridin dan bercak kromatogram fraksi akan menumpuk. Identifikasi
senyawa hasil KLT dilakukan dengan sinar UV 254, UV 365 dan pereaksi warna
CAS.
Tabel III. Hasil Identifikasi Senyawa Alkaloid Kuaterner Fraksi Kloroform– Etanol - Asam Asetat (90 : 5 : 5) Dari Ekstrak Etanol-Asam Asetat dengan Fase Gerak Kloroform– Etanol - Asam Asetat (60:20:20)
Deteksi Nama Senyawa Rf
UV 254 UV 365 CAS Alkaloid kuaterner 0,56 Terjadi
pemadaman Tak
tampak Berwarna coklat
kekuningan Piridin 0,47 Terjadi
pemadaman Tak
tampak Tak tampak
50
Rf
Gambar 2. Kromatogram Alkaloid Kuaterner Fraksi Aktif [Kloroform : Etanol : Asam Asetat (90 : 5 : 5)] dari Ekstrak Etanol-Asam
Asetat Kulit Batang Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) Fase diam : silika gel G 254 Fase gerak : kloroform : etanol : asam asetat (60:20:20)
Kromatogram alkaloid kuaterner ekstrak etanol-asam asetat kulit batang
kemiri memiliki nilai Rf 0,56. Pada pengamatan dengan UV 254 nm, terjadi
pemadaman pada alkaloid kuaterner sehingga berwarna ungu kehitaman,
sedangkan pengamatan dengan UV 365 nm tidak memberikan warna. Pada
penyemprotan dengan pereaksi CAS (Cerium Amonium Sulfat), alkaloid tersier
memberikan warna coklat kekuningan.
51
Tabel IV. Hasil Identifikasi Senyawa Alkaloid Tersier Fraksi Kloroform – Etanol - Asam Asetat (90 : 5 : 5) Dari Ekstrak Etanol-Asam Asetat dengan Fase Gerak Kloroform – Etanol - Asam Asetat (60:20:20)
Deteksi Nama Senyawa Rf UV 254 UV 365 CAS
Alkaloid tersier 0,57 Terjadi pemadaman
Tak tampak
Berwarna coklat kekuningan
Piridin 0,47 Terjadi pemadaman
Tak tampak
Tak tampak
Kromatogram alkaloid tersier ekstrak etanol-asam asetat kulit batang
kemiri memiliki nilai Rf 0,57. Pada pengamatan dengan UV 254 nm, terjadi
pemadaman pada alkaloid tersier sehingga berwarna ungu kehitaman, sedang pada
UV 365 nm tidak memberikan warna. Pada penyemprotan dengan pereaksi CAS,
alkaloid tersier memberikan warna coklat kekuningan.
52
Rf
Gambar 3. Kromatogram Alkaloid Tersier Fraksi Aktif [Kloroform : Etanol : Asam Asetat (90 : 5 : 5)] dari Ekstrak Etanol-Asam Asetat Kulit Batang Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd)
Fase diam : silika gel G 254 Fase gerak : kloroform : etanol : asam asetat (60:20:20)
Pada hasil uji KLT, piridin tidak menimbulkan warna dengan
penyemprotan pereaksi CAS. Ini disebabkan karena piridin merupakan suatu ligan
yang lebih lemah dibandingkan alkaloid indol (gambar 4) sehingga piridin tidak
dapat membentuk kompleks dengan cerium, karena itu tidak terbentuk kompleks
warna. Piridin memiliki satu atom N dengan pasangan elektron bebas (PEB)
53
(Cordell, 1981), karenanya piridin memiliki sifat penarik elektron yang lebih kuat
dibandingkan alkaloid indol. Piridin akan lebih menstabilkan cincin aromatisnya
sehingga sulit memberikan PEB untuk membentuk kompleks. Pereaksi CAS dapat
menimbulkan warna (kuning-jingga) pada alkaloid indol, namun itu tergantung
pada gugus kromofor yang terdapat pada alkaloid tersebut, juga pada struktur
alkaloid (Cordell, 1981). Jadi dapat disimpulkan bahwa alkaloid yang terkandung
di dalam fraksi kloroform-etanol-asam asetat dari fraksi etanol-asam asetat kulit
batang kemiri bukan alkaloid piridin dan kemungkinan adalah alkaloid indol. Ini
dapat dilihat pada hasil uji KLT bercak kromatogram menimbulkan warna coklat
kekuningan pada penyemprotan dengan pereaksi CAS. Warna ditimbulkan
karena adanya ikatan antara logam berat dengan pereaksi semprot (logam Ce pada
CAS) dengan alkaloid membentuk senyawa kompleks (gambar 5).
N
+
piridin CAS
Ce[NH4 (SO4)]2 tidak bereaksitidak terbentuk kompleks warna
Gambar 4. Reaksi Piridin dengan Pereaksi CAS
54
2NH 3
NH N
2
Ce
N 2
Alkaloid Indol CAS
Senyawa komplekberwarna
2
H2SO4++
Ce [NH4 (SO4)]2+
Gambar 5. Reaksi Pembentukan Senyawa Kompleks oleh Alkaloid Indol
dengan Pereaksi CAS
Dari hasil kromatografi, dapat disimpulkan bahwa alkaloid tersier lebih
bersifat non polar daripada alkaloid kuaterner. Ini dapat dilihat dari nilai Rf yang
didapat. Nilai Rf alkaloid tersier lebih besar (0,57) daripada nilai Rf alkaloid
kuaterner (0,56). Ini disebabkan karena alkaloid tersier lebih terikat pada fase
gerak daripada fase diam. Karena adanya perbedaan struktur alkaloid tersier dan
kuaterner (gambar 6) (pada alkaloid kuaterner terdapat N+) menyebabkan alkaloid
kuaterner bersifat lebih elektronegatif dibandingkan alkaloid tersier sehingga
alkaloid kuaterner bersifat lebih polar dibandingkan alkaloid tersier.
N..
N+
alkaloid tersier alkaloid kuaterner
Gambar 6. Struktur gugus amin pada alkaloid tersier dan kuaterner
55
J. Uji Potensi Antibakteri Senyawa Aktif dari Fraksi Aktif Terhadap
Staphylococcus aureus Dengan Metode Bioautografi Kontak
Metode bioautografi merupakan salah satu cara yang digunakan untuk
mendeteksi aktivitas antibakteri kromatogram hasil pemisahan pada KLT (Zweig
dan Whitaker, 1971). Dengan metode ini dapat diketahui identitas senyawa yang
memiliki potensi antibakteri yang sebelumnya telah ditentukan berdasar nilai Rf
dan berdasar reaksi warna yang terjadi. Metode ini dapat menentukan fraksi yang
diuji aktif atau tidak. Sebelum diinokulasikan pada media agar, fase diam yang
telah dikembangkan, dihilangkan fase geraknya terlebih dahulu dengan diangin-
anginkan selama 24 jam agar fase gerak benar-benar telah hilang sehingga pada
waktu penginokulasian tidak terdapat zona hambat yang disebabkan oleh fase
gerak. Hal ini dapat menyebabkan hasil penelitian kurang optimum karena zona
hambat yang terbentuk bukan murni karena zat aktif, tetapi juga disebabkan oleh
fase gerak yang tertinggal. Setelah benar-benar kering, kromatogram
diinokulasikan pada permukaan media agar NA dalam petri yang telah
diinokulasikan bakteri S.aureus. Petri yang digunakan adalah petri yang
berdiameter 14 cm karena jika digunakan petri yang berukuran kecil, plat KLT
tidak dapat ditempelkan ke dalam petri karena ukuran petri yang terlalu kecil. Plat
KLT yang digunakan adalah plat alumunium p.a silika gel G 254 karena lebih
ringan daripada lempeng kaca sehingga tidak merusak media agar NA. Akan
didapatkan zona jernih pada media agar NA di sekitar bercak jika senyawa dapat
berdifusi ke dalam lapisan tersebut dan dapat menghambat pertumbuhan bakteri,
sedangkan lapisan yang ditumbuhi bakteri akan berwarna buram. Hasil penelitian
56
menunjukkan hasil negatif. Fraksi kloroform-etanol-asam asetat (90:5:5) dari
ekstrak etanol-asam asetat kulit batang kemiri tidak berpotensi sebagai antibakteri
terhadap S.aureus.
Tabel V. Hasil Uji Potensi Antibakteri Fraksi Aktif (fraksi V) Terhadap Staphylococcus aureus dengan Metode Bioautografi Kontak
NAMA SENYAWA ZONA HAMBAT Kontrol positif (piridin) Pada nilai Rf 0,47
Alkaloid kuaterner - Alkaloid tersier -
57
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. KESIMPULAN
1. Fraksi I [kloroform : etanol (95:5)] tidak mempunyai potensi antibakteri
terhadap Staphylococcus aureus, fraksi kloroform : etanol : asam asetat
(90:8:2), dan fraksi kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5) dari ekstrak
etanol-asam asetat kulit batang kemiri mempunyai potensi antibakteri terhadap
Staphylococcus aureus.
2. Fraksi kloroform-etanol-asam asetat (90:5:5) adalah fraksi aktif dari ekstrak
etanol-asam asetat kulit batang kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) yang
berperan sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.
3. Senyawa yang terdapat dalam fraksi kloroform-etanol-asam asetat (90:5:5)
antibakteri Staphylococcus aureus kemungkinan adalah alkaloid indol.
4. Senyawa golongan alkaloid yang terdapat dalam fraksi kloroform-etanol-asam
asetat (90:5:5) tidak berpotensi sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus
aureus dengan uji secara bioautografi kontak.
B. SARAN
1. Perlu dilakukan ekstraksi kulit batang kemiri menggunakan metode ekstraksi
atau fraksinasi yang lain.
2. Perlu dilakukan penelitian mengenai senyawa lain yang terkandung dalam
fraksi V dari ekstrak etanol asam asetat serbuk kulit batang kemiri yang
berpotensi sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus.
57
58
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1986a, Sediaan Galenik, 8-9, 5-12, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Anonim, 1986b, Medicinal Herb Index In Indoesia, 115, PT. EISAI, Indonesia.
Anonim, 1993, Dasar-dasar Pemeriksaan Mikrobiologi, 27, 110-114, Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UGM, Yogyakarta.
Anonim, 1995, Materia Medika Indonesia, Jilid IV, 10, 14, Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 2006, Piperin, a Phytochemical Potentiator of Ciprofloxacin against
Staphylococcus aureus, http://aac.asm.org/cgi/content/full/50/2/810. Diakses pada 27 September 2006.
Anonim, 2006, Antimicrobial Activity Studies on some Piperidine and Pyrolidine
Substituted Halogenobenzene Derivates, http://www.ingentaconnect.com/ content/tandf/genz/2006/00000021/00000002/art00012?crawber=true. Diakses pada 21 September 2006.
Arief, A., 1996, Tanaman Obat Pilihan, Cetakan I, 129-130, Yayasan Sidowayah,
Jakarta. Brunetom, J., 1994, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Plants, 2nded,
791, Lavoiser Publishing inc, New York. Choma, I., 2005, The Use of Thin-Layer Chromatography with Direct
Bioautography for Antimicrobial Analysis, http//www.lcgceurope.com /lcgceurope/ articel/ articel Detail. Diakses pada 19 Septembar 2005.
Cordell, Geoffrey, A., 1981, Introduction to Alkaloids; A Biogenetic Approach, 8,
11, 17-18, University of Illionois, United State of America. Duke, J. A., 1999, Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Databases,
Taxon: Aleurites moluccana (L.) Willd, http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/duke/ethnobot.pl, Diakses pada 03 Mei 2006.
Gritter, R. J., 1991, Pengantar Kromatografi, 9-10, 17-18, 160, 163, 165, 169,
Penerbit ITB, Bandung. Houghton, P., J., Raman, A., 1998, Laboratory Handbook for The Fractionation
of Natural Extract, 74-84, 1st ed, Thomson Publishing, london.
59
Hutapea, J. R., dkk, 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 23, Depertemen Kesehatan RI Badan Penelitian Dan Pengembangan Kesehatan, Jakarta.
Jawets, E., Melnick, J. L., dan Adelberg, E. A., 1996, Mikrobiologi Untuk Profesi
Kesehatan (Review Medical Mikrobiology), diterjemahkan oleh H. Tonang, , Editor Bonang, Edisi XVI, 239, Kedokteran EGC, Jakarta.
Jawets, E., Melnick, J. L., dan Adelberg, E. A., 1996, Medical Mikrobiology,
diterjemahkan oleh Edi Nugroho, Edisi XX, 214, Kedokteran EGC, Jakarta.
Kardono, I., Areanti, N., Dewiyanti, I., dan Basuki, T., 2003, Selected Medical
Plant Monographic dan Description, 56-63, PT Gramedia Indonesia Jakarta.
Melinda, 2005, Potensi Antibakteri Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Etanol Kulit
Batang Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd) Terhadap Staphylococcus aureus, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Mulja, M., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 225-227, Airlangga
Univercity Press, Surabaya. Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, cetakan pertama, 63-71, Pusat
Antar Universitas Bioteknologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Roberts, Margaret, F., and Wink, Michael, 1998, Alkaloid: Biochemistry, Ecology,
and Medicinal Applications, 87-105, 416, 421-423, Plenum Press, New York.
Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Kimia Tumbuhan Tinggi, diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata, 281, 284, Penerbit ITB, Bandung.
Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, Edisi IV, 15, Apotekarsocieteten, Sweden.
Sastrohamidjojo, H., 1985, Kromatografi, Edisi II, Cetakan I, 1, 34-35, Liberty, Yogyakarta.
Stahl, E., 1969, Thin Layer Chromatography a Laboratory Handbook, 2nd Ed, 4–
17, 568, Springer-Verlag Berlin, New York. Wagman, G. H., and Weinstein, M. J., 1973, Chromatography of Antibiotics, Vol
26, 3-9, Elsivier Scientific Publishing Company, Amsterdam-London, New York.
60
Zweig, G., and Whitaker, J. R., 1971, Paper Chromatography and Electrophoresis, 397-399, Academic Press, London.
61
62
Lampiran 2. Foto Tanaman Kemiri (Aleurites moluccana L. Willd)
63
Lampiran 3. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Fraksi Hasil Pemisahan Kromatografi Kolom Terhadap Staphylococcus aureus Secara Difusi Sumuran
Keterangan :
Fraksi I : fraksi I [kloroform : etanol (95:5)]
Fraksi III : fraksi III [kloroform : etanol : asam asetat (90:8:2)]
Fraksi V : fraksi V [kloroform : etanol : asam asetat (90:5:5)]
Kontrol Kontaminasi : Kontrol Kerja
Kontrol (-) : kontrol negatif [pelarut (DMSO)]
64
Lampiran 4. Foto Hasil Uji Potensi Antibakteri Piridin sebagai Kontrol Positif Terhadap Staphylococcus aureus secara Difusi Sumuran
Keterangan :
Piridin : kontrol positif
KT : kontrol kerja
KP : kontrol pelarut (etanol p.a.)
65
Lampiran 5. Foto Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Piridin dengan Fase Gerak Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)
I II
Keterangan:
Fase diam = Silika Gel G 254 nm
I. Piridin sebagai pembanding alkaloid tersier dengan UV 254 nm
II. Piridin sebagai pembanding alkaloid kuaterner dengan UV 254 nm
66
Lampiran 6. Foto Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Alkaloid Tersier Dengan Fase Gerak Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)
I II Keterangan:
Fase diam = Silika Gel G 254 nm
Deteksi dengan :
I. UV 254 nm
II. Penyemprot CAS
67
Lampiran 7. Foto Hasil Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Alkaloid Kuaterner Dengan Fase Gerak Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)
I II Keterangan:
Fase diam = Silika Gel G 254 nm
Deteksi dengan :
I. UV 254 nm
II. Penyemprot CAS
68
Lampiran 8. Hasil Uji Potensi antibakteri Alkaloid Tersier Fraksi V [Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)] Kulit Batang Kemiri dengan Metode Bioautografi Kontak Terhadap Staphylococcus aureus
69
Lampiran 9. Hasil Uji Potensi antibakteri Alkaloid Kuaterner Fraksi V [Kloroform : Etanol : Asam Asetat (60:20:20)] Kulit Batang Kemiri dengan Metode Bioautografi Kontak Terhadap Staphylococcus aureus
70
BIOGRAFI PENULIS
Penulis bernama lengkap Patricia Silih
Widhiandhisti. Lahir di Sleman, Yogyakarta pada
tanggal 23 April 1986, putri pertama dari dua
bersaudara pasangan Dionisius Sukarman dan
Athanasia Yulia Sumiyem. Penulis Skripsi berjudul
”POTENSI ANTIBAKTERI FRAKSI
KLOROFORM – ETANOL - ASAM ASETAT
DARI EKSTRAK ETANOL-ASAM ASETAT KULIT BATANG KEMIRI
(Aleurites moluccana L. Willd) TERHADAP Staphylococcus aureus” ini
pernah menempuh pendidikan di SD Kanisius Minggir (1991-1997), kemudian
melanjutkan di SMP Pangudi Luhur Kaliduren dan lulus pada tahun 2000. Setelah
itu melanjutkan ke SMU Pangudi Luhur St. Yoseph Yogyakarta, lulus pada tahun
2003. Penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada tahun 2003.
