I

DANKWOORD

Nu het einde van deze thesis en mijn studententijd nadert, wil ik even de tijd nemen om een

paar mensen te bedanken.

Allereerst wil ik Prof. dr. Peter Vandamme bedanken. Dankzij uw lessen heb ik ervoor

gekozen om mij verder te verdiepen in de microbiologie. Het is ook dankzij uw contact met het

ILVO dat het mogelijk was om deze thesis tot stand te laten komen.

Ook wil ik Dr. Marc Hendrickx bedanken, die het mogelijk maakte om mee te werken aan het

onderzoek naar MRSA in varkensbedrijven in het groot labo van de kelder van ILVO

T&V370, alsook voor het vakkundig nalezen van deze thesis.

Verder wil ik graag Dr. Geertrui Rasschaert bedanken voor de tijd en inspanning die ze

gestoken heeft in het lezen en verbeteren van mijn eerste schrijfpogingen tot de uiteindelijke

thesis.

Veel dank ben ik verschuldigd aan mijn begeleidster lic. Marijke Verhegghe. Zonder je

onuitputtelijke steun, je wijsheden, het vele herlezen en alle andere hulp had deze thesis niet

tot stand kunnen komen. Dankzij jouw is deze thesis een werk geworden waar ik trots op kan

zijn.

Bedankingen ook voor de mensen van het groot labo in de kelder van het ILVO T&V 370. Dit

gaat van Rik, die voor dit project met de biggen worstelde, over Karen, voor een

ontspannende babbel, via Dorien en Pieter, voor de sportieve ontspanning, tot Ann en haar

niet zo uitgebreide liedjeskennis, die het labo altijd opfleurden. Maar ook alle anderen

waarmee ik over de middag of tijdens de koffie al eens een babbeltje heb gedaan.

Ook veel dank aan m’n Maandagse Saxvrienden. Gezellig samen in de Sax ééntje drinken, zit

er niet meer in maar we vinden wel een nieuw stamcafé om stoom af te laten na een lange dag

werken.

Natuurlijk moet ik ook nog mijn dank richten aan mijn ouders en m’n Frère.

Frère, je zorgde er altijd voor dat mijn problemen zo nietig leken. Alles werd veel relatiever

dankzij een dikke knuffel van jou.

Mamie en papie, zonder jullie zou niets van dit alles mogelijk geweest zijn. Jullie steunden me

in alles wat ik wou doen en hebben me altijd alle mogelijke kansen gegeven. Jullie waren er

voor me gedurende alle ups en downs tijdens deze thesis, maar ook doorheen mijn hele

universiteitscarrière. Zonder jullie was ik nooit geworden wie ik nu ben! Veel dank vanuit de

grond van mijn hart!

Tot slot wil ik mij ook richten tot mijn vriend en allerbeste maatje, Steven. Dank je wel om er

te zijn voor me toen ik het even niet meer zag zitten, om me te helpen met nuttige adviezen en

tips, om naar me te luisteren als ik aan het zagen was, … maar natuurlijk ook voor de leuke

en ontspannende momenten. Jij gelooft in me zelfs als ik het zelf niet meer doe!

Aan iedereen hier vermeld en aan diegenen die ik misschien vergeten ben:

Veel dank voor al jullie hulp en steun!

INHOUDSTAFEL

II

INHOUDSTAFEL

DANKWOORD............................................................................................................................................................ I

INHOUDSTAFEL ...................................................................................................................................................... II

AFKORTINGENLIJST ........................................................................................................................................... IV

SAMENVATTING ................................................................................................................................................... VI

SUMMARY ...............................................................................................................................................................VII

I. Inleiding ............................................................................................................................................................. 1

1. Inleiding methicilline resistente Staphylococcus aureus ....................................................... 1

1.1. Staphylococcus aureus ................................................................................................................... 1

1.2. Penicilline resistente Staphylococcus aureus ..................................................................... 1

1.3. Methicilline resistente Staphylococcus aureus .................................................................. 3

2. Overzicht van de verschillende MRSA types ............................................................................... 4

2.1. Ziekenhuisgebonden MRSA ........................................................................................................ 4

2.2. Gemeenschapsgebonden MRSA ............................................................................................... 4

2.3. Diergebonden MRSA ...................................................................................................................... 5

3. Typeringsmethoden van MRSA ST398 .......................................................................................... 6

3.1. Multilocus sequentietypering .................................................................................................... 6

3.2. spa typering ........................................................................................................................................ 7

3.3. Multi locus variable number tandem repeat analyse .................................................... 7

3.4. Pulsed Field Gel Elektroforese .................................................................................................. 8

3.5. SCCmec typering .............................................................................................................................. 9

3.6. Antibioticaresistentie ................................................................................................................. 11

3.7. Toxines .............................................................................................................................................. 12

4. Impact op de volksgezondheid ....................................................................................................... 12

II. Doelstelling ................................................................................................................................................... 14

III. Resultaten ................................................................................................................................................. 15

1. Staalname Bedrijf C .............................................................................................................................. 15

2. Screening van de isolaten .................................................................................................................. 17

2.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse ................................................. 17

3. Typering van de geselecteerde isolaten ..................................................................................... 17

3.1. Multi locus sequentie typering .............................................................................................. 17

3.2. spa typering ..................................................................................................................................... 17

3.2. SCCmec typering ........................................................................................................................... 19

3.3. Pulsed Field Gel Elektroforese ............................................................................................... 19

3.4. Antibiogrammen ........................................................................................................................... 20

INHOUDSTAFEL

III

3.5. Overzicht van de typeringen ................................................................................................... 22

IV. Discussie .................................................................................................................................................... 24

4.1. Prevalentie in varkens .................................................................................................................... 24

4.2. Typering van de isolaten ............................................................................................................... 25

4.3. Conclusie ............................................................................................................................................... 28

V. Materiaal en methoden ........................................................................................................................... 29

1. Staalname bedrijf C ............................................................................................................................... 29

1.1. Beschrijving bedrijf C ................................................................................................................. 29

1.2. Beschrijving staalname.............................................................................................................. 30

1.3. Verwerking staalname ............................................................................................................... 31

2. Verwerking verdachte kolonies ..................................................................................................... 31

2.1. DNA extractie ................................................................................................................................. 31

2.2. Triplex PCR ...................................................................................................................................... 31

3. Screening van de isolaten .................................................................................................................. 32

3.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse ................................................. 32

4. Typering van de isolaten .................................................................................................................... 33

4.1. Multi locus sequentie typering .............................................................................................. 33

4.2. spa typering ..................................................................................................................................... 33

4.3. SCCmec typering ........................................................................................................................... 33

4.4. Pulsed Field Gel Elektroforese ............................................................................................... 34

4.5. Antibiogrammen ........................................................................................................................... 35

VI. Referenties ................................................................................................................................................ 36

BIJLAGEN ..................................................................................................................................................................... i

1. Bandenpatronen SCCmec typering op geselecteerde stalen ............................................... ii

2. Afleesresultaten van de antibiogrammen.................................................................................... iv

3. DNA extractie en triplex PCR mecA/ nuc/ 16S rRNA ............................................................vii

4. MLVA ............................................................................................................................................................. ix

5. SCCmec typering ....................................................................................................................................... x

6. PFGE Staphylococcus aureus for 10 plugs ................................................................................... xii

7. PFGE protocol voor Salmonella ....................................................................................................... xv

8. Antibiogram MRSA ............................................................................................................................ xviii

AFKORTINGEN

IV

AFKORTINGENLIJST

AA-MRSA Diergebonden MRSA

Animal associated MRSA

BURP Based upon repeat pattern

CA-MRSA Gemeenschapsgebonden MRSA

Community-acquired MRSA

ccr Cassette chromosome recombinase

CIP Ciprofloxacine

CLR Chloramphenicol

CODA Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie

CSB Cel suspensie buffer

DNA Desoxyribonucleïnezuur

dNTP Deoxyribonucleotide trifosfaat

EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

EET EDTA/EGTA/Tris-HCl

EGTA Ethyleen glycol tetra-azijnzuur

ERYTR Erythromycine

EtBr Ethidiumbromide

FUCID Fucidine

GEN Gentamicine

HA-MRSA Ziekenhuisgebonden MRSA

Hospital-acquired MRSA

HPLC High performance/pressure liquid chromatography

ILVO Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek

ISS Integratie site sequentie

KAN Kanamycine

LINCO Lincomycine

LINEZ Linezolid

MgCl2 Magnesiumdichloride

MHB Muller-Hinton broth

MLST Multi locus sequentie typering

Multi locus sequence typing

MLVA Multi locus variable number tandem repeat analysis

MRSA Methicilline resistente S. aureus

MSSA Methicilline sensitieve S. aureus

MUPIR Mupirocine

NaCl Natriumchloride

OD Optical density

ORSAB Oxacylin resistance screening agar base

PBP (2a) Penicilline bindend proteïne (2a)

Penicillin binding protein (2a)

PCR Polymerase chain reaction

PFGE Pulsed field gel electrophoresis

PSM Phenol-soluble moduline

PVL Panton-Valentine leukocidine

RAPD Random amplification of polymorphic DNA

AFKORTINGEN

V

RIFAM Rifampicine

Rpm Rotation per minute

rRNA Ribosomaal ribonucleïnezuur

SCCmec Staphylococcal cassette chromosome mec

SDS Natriumdodecylsulfaat

SEB Staphylococcal enterotoxin B

SKG Seakem Gold

ST Sequentie type

SSR Short sequence repeat

SSSS Staphylococcal scalded-skin syndrome

SULFA Sulfonamide

SYN Quinupristine/dalfopristine

TBE Tris/Boraat/EDTA

TE Tris-HCl/EDTA

TET Tetracycline

TOBRA Tobramycine

TRIME Trimethoprim

TSA Tryptic soy agar

TSS Toxic shock syndrome

TSST-1 TSS toxin-1

TYLOS Tylosine

UPGMA Unweighted pair Group method with arithmic mea

VNTR Variable number tandem repeat

VRE Vancomycine resistente enterococcen

Wwb Warmwaterbad

SAMENVATTING

VI

SAMENVATTING

MRSA vormt reeds lange tijd een probleem in de gezondheidszorg en de gemeenschap.

Recent werd een derde vorm van deze bacterie gevonden bij dieren. Dit diergebonden MRSA

of MRSA ST398 komt voor bij verschillende dieren, zoals varkens, kippen, runderen, paarden

en huisdieren. Gekoloniseerde dieren vertonen geen ziektesymptomen maar kunnen als vector

dienen voor de overdracht naar de mens, wat sporadisch leidt tot ernstige infecties.

Studies in varkens hebben aangetoond dat MRSA ST398 wijdverspreid is op

varkensbedrijven. Zowel de varkens, als de mensen die op het bedrijf wonen of werken

kunnen MRSA ST398 dragers zijn. Daarnaast zijn dierenartsen en slachthuispersoneel die

frequent in contact komen met gecontamineerde, levende varkens frequent drager van MRSA

ST398. Als één van deze mensen opgenomen wordt in het ziekenhuis, kan de MRSA ST398

in het ziekenhuis verspreid worden als een zogenaamde ‘ziekenhuisbacterie’, die zieke

patiënten kan infecteren. Daarnaast kan door middel van horizontale gentransfer

antibioticumresistentiegenen doorgegeven worden tussen ziekenhuis- en diergebonden

MRSA. Hierdoor kan een nieuw type MRSA ontstaan, dat nog meer verschillende

antibioticum resistentiegenen bevat dan ziekenhuis- of diergebonden MRSA, waardoor de

behandeling nog moeilijker zou worden.

Aangezien gekoloniseerde varkens het slachthuis en het slachthuispersoneel kunnen

contamineren, is kolonisatie van het varkensvlees ook mogelijk. Gecontamineerd vlees zou de

verspreiding van MRSA ST398 in de gemeenschap in de hand kunnen werken. Uit

literatuurgegevens bleek echter dat er een zeer laag kiemgetal van MRSA in varkensvlees te

vinden is, waardoor er geen gevaar zou zijn voor overdracht naar de gemeenschap/mens.

In deze scriptie werd onderzoek uitgevoerd naar de epidemiologie van diergebonden MRSA

in varkens door het bemonsteren van een gesloten kip-varkensbedrijf om het tijdstip van

kolonisatie van de biggen en de bron ervan na te gaan. Op verschillende tijdstippen werden er

stalen genomen van de biggen vanaf het werpen tot in de voormest. Om na te gaan of de

zeugen en hun biggen hetzelfde MRSA type dragen, werden er stalen genomen van de zeugen

in de kraamstal. Om contaminatie uit de omgeving te onderzoeken werden er stalen van de

wand, de vloer en de lucht genomen in de verschillende stallen. Op alle isolaten werd een

screening uitgevoerd door middel van MLVA. Geselecteerde isolaten werden verder

getypeerd aan de hand van MLST, spa typering, SCCmec typering en PFGE. Tot slot werd

het antibioticaresistentieprofiel van de isolaten bepaald.

De resultaten toonden een kolonisatiegraad aan van 97% in de biggen van drie à vier dagen

oud. De biggen waren gekoloniseerd met MRSA isolaten die, op basis van MLVA, een hoge

verwantschap vertoonden. De bron van contaminatie kon echter niet gespecifieerd worden,

aangezien de isolaten van de zeugen in de kraamstal en van de omgeving een hoge

verwantschap vertonen met de isolaten gevonden in de bigstalen. Dit betekent dat de biggen

zowel door de zeugen als de omgeving kunnen gecontamineerd worden. De isolaten

behoorden tot sequentie type 398 en spa type t011, beide veel voorkomend in Belgische

varkens. De MRSA isolaten droegen de SCCmec type V cassette en werden op basis van

pulsed field gel elektroforese samen geclusterd met 92% of meer verwantschap. Aangezien de

meerderheid van de isolaten ook hetzelfde antibioticaresistentieprofiel vertoonden, kan

verwacht worden dat alle gevonden isolaten tot hetzelfde MRSA type behoren.

Als besluit kan gesteld worden dat het onderzochte kip-varkensbedrijf een hoge prevalentie

vertoonde voor MRSA in biggen, zeugen en de omgeving. De onderzochte isolaten waren

sterk verwant en behoren hoogstwaarschijnlijk tot hetzelfde type.

SUMMARY

VII

SUMMARY

Since the 60’s, MRSA has been a major problem in hospitals and later in the community. A

new type of MRSA, the animal associated MRSA, has recently been found in different

animals like pigs, chickens, cattle, horses, cats and dogs. Animal associated MRSA or MRSA

ST398 belongs to the clonal complex CC398, which has sequence type 398 (ST398) as a

basis. Although pigs do not show any sign of infection when they are colonized with MRSA

ST398, they can act as a reservoir. Transmission to humans can occur, which leads

sporadically to severe infections.

Multiple studies showed that this type of MRSA is frequently found on pig farms. Besides the

pigs, people who live and work on the farm can be carriers of MRSA ST398. Veterinarians

and slaughterhouse workers, who have frequently contact with living and contaminated pigs,

can also get an infection with MRSA ST398. When admitted to a hospital, humans can

introduce MRSA ST398 into the hospital and infect patients. On top of this, the possibility

exists that a new type of MRSA arises through horizontal gen transfer of antibiotic resistance

genes between hospital-acquired and animal associated MRSA. This multi resistant MRSA

would be harder to treat than other MRSA.

Since slaughterhouses and slaughterhouse workers can be colonized with MRSA,

contamination of pork can occur while handling the meat. Colonized pork could accelerate the

spread of MRSA ST398 in the community. In literature, studies on the quantity of MRSA

ST398 in pork showed that the colony forming units per kilogram are insufficient to be a

threat for the transmission of MRSA ST398 in the community.

In order to study the epidemiology of animal associated MRSA, a closed pig-poultry farm was

examined for the time and source of colonization of the piglets. During this study samples

were taken of piglets from farrowing until arrival in the finishing stable. Since the aim was to

find the source of contamination, samples were taken of the sows and the environment (the

floor, the wall at the piglets level, the air surrounding the piglets and the air leaving the

stable). All samples were checked for the presence of MRSA and screening by MLVA

occurred. Subsequently, a selection of isolates were typed by MLST, SCCmec typing and

PFGE. The antimicrobial susceptibility of the isolates was also determined.

Three to four days after farrowing, 97% of the piglets were infected with MRSA. Based on

MLVA, a high similarity between the isolates can be found. The source of contamination

cannot be determined since the isolates from sows in the farrowing stables and from the

environment were highly related to the isolates found in the samples of the piglets. So, the

piglets could be contaminated by both the sows and the environment. All isolates belonged to

sequence type 398 and had spa type t011, which are both highly present on Belgian pig farms.

Furthermore, the isolates carried the SCCmec type V cassette and showed a similarity of 92%

based on PFGE. Since the majority of the isolates also had the same antibiotic profile, one can

anticipate that the MRSA isolates all belong to the same MRSA type.

In conclusion, the pig-poultry farm showed a high prevalence for the presence of MRSA. All

the isolates, typed in this study, were most likely related to each other.

INLEIDING

1

I. INLEIDING

1. INLEIDING METHICILLINE RESISTENTE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1.1. Staphylococcus aureus

Het genus Staphylococcus behoort tot de familie van de Micrococcaceae. Het genus omvat

ongeveer 20 species waarvan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis en

Staphylococcus saprophyticus het meest geïsoleerd worden bij de mens als ziekteverwekker.

Deze bacteriën hebben een Gram-positieve celwand en vormen geen sporen. Het zijn

facultatief anaëroben die resistent zijn aan een verminderde wateractiviteit en bijgevolg

tolerant zijn aan uitdroging en hoge zoutconcentraties. Staphylococci kunnen deze droogte- en

halotolerantie een paar uur overleven op oppervlakten in de omgeving. Deling van de cellen

leidt tot vorming van celclusters. Staphylococcen zijn commensalen en parasieten van zowel

mens als dier en komen voor in de normale microbiële flora van de huid en de bovenste

luchtwegen. Infectie resulteert voornamelijk uit de overdracht van een gezond individu, die de

bacterie draagt, naar een vatbaar individu (Brock et al, 2006).

Staphylococcus aureus (S. aureus) werd voor het eerst beschreven in 1880 in het vocht van

een chirurgisch abces (Bowersox, 1999). Infectie met de bacterie kan zeer uiteenlopende

ziektebeelden veroorzaken van milde huidinfecties tot levensbedreigende bacteraemia.

S. aureus is een commensaal van de huid maar komt ook frequent voor in de neus. Preventief

behandelen bij aanwezigheid op het lichaam hoeft niet, aangezien aanwezigheid niet altijd

aanleiding geeft tot infectie en rekolonisatie met de bacterie kan voorkomen. Dieren, zoals

honden, katten en paarden, kunnen als vector dienen bij de overdracht van de bacterie.

Wanneer de huid of het mucosa onderbroken is, kan S. aureus andere weefsels infecteren met

als mogelijke gevolgen zweren, puisten, longontstekingen of artritis. S. aureus stammen

kunnen ook verantwoordelijk zijn voor voedselvergiftigingen door de productie van een

enterotoxine, namelijk het Staphylococcal enterotoxine B (SEB). S. aureus kan op

verschillende manieren verspreid worden door contact met o.a. geïnfecteerd wondvocht, een

geïnfecteerd persoon of objecten die aangeraakt zijn door een geïnfecteerd persoon.

S. aureus stammen, die frequent aandoeningen veroorzaken in mensen, produceren

extracellulaire enzymen en toxines. Een belangrijk gen voor de pathogeniciteit van S. aureus,

het coa gen, codeert voor een coagulase, dat de vorming van fibrineklonters bevordert. Deze

frbirneklonters geven bescherming aan de bacterie wanneer de immuunrespons wordt

opgeroepen. Andere species van het Staphylococcus genus zijn coagulase-negatief.

Een ander belangrijk enzym om staphylococci te onderscheiden van enterococci en

streptococci, is catalase. Dit enzym zet waterstofperoxide om in water en zuurstof (Brock et

al, 2006). Bovendien kan de aanwezigheid van fagen in de bacteriële cel leiden tot een

verhoogde virulentie door de aanwezigheid van het Panton-Valentine leukocidine (PVL) gen

op het genoom van de residerende faag (Voyich et al, 2006).

1.2. Penicilline resistente Staphylococcus aureus

In 1928 ontdekte Alexander Fleming per toeval penicilline. Een vergeten plaat geënt met

S. aureus bleek geïnfecteerd met een schimmel, die de groei van S. aureus inhibeerde. Die

schimmel staat nu bekend als Penicillium notatum en na onderzoek werd het inhiberende

product, geproduceerd door de schimmel, penicilline genoemd (Haven, 1994).

INLEIDING

2

Penicilline behoort tot de β-lactam

antibiotica (Figuur 1). Deze bevatten een

β-lactamring en zijn inhibitoren van de

celwandsynthese. Aangezien het

synthesemechanisme van de celwand en de

celwand zelf uniek zijn voor het koninkrijk

Bacteria, hebben de β-lactam antibiotica

een hoge selectiviteit en zijn ze niet toxisch

voor eukaryote gastheercellen (Brock et al,

2006).

β-lactam antibiotica zijn structurele

analogen van D-alanyl-alanine, die binden

aan transpeptidasen, ook wel penicilline

bindende proteïnen (PBP) genoemd. Het transpeptidase verbindt peptidoglycaanmonomeren

in de bacteriële celwand aan elkaar. Binding van penicilline of een ander β-lactam

antibioticum inhibeert deze werking waardoor de celwand verzwakt. Hierdoor verhoogt de

osmotische druk in het cytoplasma, wat leidt tot cytolyse of celdood. Bovendien stijgt de

concentratie van peptidoglycaan precursoren waardoor de hydrolasen en autolysines van de

bacteriële celwand geactiveerd worden en het aanwezige peptidoglycaan verwijderen. Dit

betekent dat penicilline een betere inhiberende werking heeft tegen Gram-positieve bacteriën

dan tegen Gram-negatieven, aangezien de eersten een meer uitgebreide peptidoglycaanlaag

hebben (Figuur 2) (Brock et al, 2006).

In 1944 werden voor het eerst penicillinase producerende S. aureus stammen beschreven

(Kirby, 1944). Penicillinase is een β-lactamase, dat de β-lactamring van penicilline

openbreekt waardoor het penicilline geïnactiveerd wordt. De stammen, die penicillinase

Figuur 1: Structuurformule van penicilline. R

geeft de variabele groep weer die verschillende

specificiteit geeft aan het antibioticum. De β-

lactamring is aangduid.

Figuur 2: Overzicht van de Gram-positieve en Gram-negatieve celwandstructuur. Naast het verschil in de peptidoglycaanlaag, heeft de Gram-negatieve celwand een extra laag, die bestaat uit o.a. fosfolipiden, lipopolysacchariden en lipoprotëinen.

INLEIDING

3

produceren, waren toen nog weinig voorkomend en werden enkel geïsoleerd uit

ziekenhuispatiënten.

Na de tweede wereldoorlog was penicilline makkelijker te verkrijgen en steeg de prevalentie

van penicillinase producerende S. aureus. Slechts enkele jaren later waren de meeste

S. aureus ziekenhuisstammen resistent tegen penicilline, terwijl gemeenschapsgebonden

S. aureus stammen penicilline sensitief waren (Barber & Rozwadowska-Dowzenko, 1948).

Hieruit werd afgeleid dat behandeling met penicilline de kans verhoogde op het isoleren van

een penicilline resistente stam. Immers, hoe meer S. aureus in contact kwam met penicilline,

hoe meer penicilline sensitieve stammen er afstierven, waardoor een niche gecreëerd werd

voor de penicilline resistente bacteriën, waarin ze konden vermeerderen. In deze eerste studies

werd ook de kolonisatie van het ziekenhuispersoneel en hun rol in de transmissie van de

penicilline resistente S. aureus onderzocht. Men zag dat het ziekenhuispersoneel de vector

kon zijn in de transmissie van de bacteriën tussen patiënten. Deze studies beperkten zich

echter tot ziekenhuisstammen (Chambers, 2001).

1.3. Methicilline resistente Staphylococcus aureus

Door het ontstaan van penicilline resistente

S. aureus konden infecties niet meer

behandeld worden met penicilline.

Daardoor ging men op zoek naar een

alternatieve behandelingsmethode. In 1959

werd, een nieuw semi-synthethisch

antibioticum, namelijk methicilline,

gevonden. Dit is een β-lactam antibioticum,

afgeleid van penicilline (Figuur 3). In

tegenstelling tot penicilline, was

methicilline resistent tegen de werking van

β-lactamasen, waardoor het gebruikt kon

worden als behandeling tegen penicilline

resistente S. aureus (Unan & Young, 2007).

Twee jaar na het eerste therapeutisch gebruik

van methicilline werden de eerste

methicilline resistente S. aureus (MRSA)

stammen geïsoleerd in het Verenigd Koninkrijk (Enright et al, 2002). Gedurende de jaren ’60

werden over heel Europa MRSA stammen geïsoleerd en in het volgende decenium ook in

andere delen van de wereld. In de jaren ’90 werd er een sterke stijging van het aantal infecties

met MRSA gezien. Deze stijging werd voornamelijk veroorzaakt door misbruik van

antibiotica, wat voorschrijven van antibiotica bij virale infectie maar ook het niet opnemen

van voorgeschreven antibiotica omvat. Dit leidt immers tot versnelde resistentie.

Resistentie van S. aureus tegen methicilline wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van het

mecA gen, dat codeert voor het penicilline bindend proteïne 2a (PBP2a). Dit type van PBP

heeft een lagere affiniteit voor β-lactam antibiotica, waardoor deze moeilijk tot niet kunnen

binden. Het mecA gen is gelegen op een mobiel element, het Staphylococcal Cassette

Chromosome mec (SCCmec) element (Ito et al, 2003). Hiervan bestaan verschillende types

die verschillende regio’s bevatten (zie paragraaf 3.5).

Figuur 3: Structuurformule van methicilline .

Methicilline heeft dezelfde algemene structuur

als penicilline, aangevuld met de typische

variabele groep van methicilline. De

β-lactamring is aangduid.

INLEIDING

4

2. OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE MRSA TYPES

2.1. Ziekenhuisgebonden MRSA

Tot een decenium terug vond men MRSA enkel in ziekenhuizen, lange termijn opvang

tehuizen of bij mensen die met één van beide in contact waren geweest. Deze

ziekenhuisgebonden MRSA (hospital-acquired MRSA; HA-MRSA) betekende een groot

probleem in de behandeling van patiënten. Aangezien de β-lactam antibiotica het meest

verspreid en het meest gebruikt zijn in de humane geneeskunde, verkleinen de opties op een

succesvolle behandeling van HA-MRSA met deze antibiotica. Tegenwoordig beschikken

dokters nog over andere antibiotica in de behandeling van MRSA, hoewel sommige MRSA

stammen met de tijd ook hiertegen resistent zijn geworden. Vandaar dat MRSA ook wel

multiresistente S. aureus genoemd wordt. De andere antibiotica hebben echter nadelen: ze

kunnen niet oraal opgenomen worden en zijn minder efficiënt dan de β-lactam klasse

waardoor een succesvolle behandeling langer duurt. Verder veroorzaken ze bijwerkingen die

in sommige gevallen kunnen leiden tot complicaties (Unan & Young, 2007).

Vancomycine krijgt tegenwoordig de voorkeur als behandelingsmiddel tegen HA-MRSA

infecties. Het is nauw verwant aan avoparcine, een antibioticum dat veel gebruikt werd als

groeipromotor in de veeteelt. In 1997 kwam op dit gebruik echter op Europees niveau een

verbod door richtlijn 97/6/EC. Het gebruik van avoparcine was immers de aanleiding voor de

opkomst van vancomycine resistente enterococcen (VRE) in boerderijdieren. Men vreesde dat

het vanA gen, dat zorgt voor resistentie tegen vancomycine, overgebracht zou worden naar

MRSA, wat deze onbehandelbaar zou maken. Ondertussen zijn er meldingen geweest in de

Verenigde Staten waarbij dit het geval was (MMWR, 2002a; MMWR, 2002b; Witte, 2004).

Het vanA gen is gelegen op de ‘van cluster’ en wordt regelmatig gevonden in bacteriën

geïsoleerd uit voeder voor boerderijdieren waaraan vancomycine wordt toegevoegd. Dit

betekent dat het gebruik van avoparcine de opkomst van vancomycine resistente S. aureus

stammen als gevolg zou kunnen hebben (Lu et al, 2004). In Europa werden nog geen

vacomycine resistente MRSA gevonden.

2.2. Gemeenschapsgebonden MRSA

De voorbije twee decennia werd MRSA voornamelijk gevonden in grote ziekenhuizen in de

stad in vergelijking met kleinere medische centra, die een lagere prevalentie vertoonden.

Tijdens de jaren ’90 merkte men een sterke stijging in beide prevalenties (Chambers, 2001).

Bovendien veroorzaakte MRSA ook infecties bij personen buiten ziekenhuizen en andere

verzorgingstehuizen. MRSA infecties in mensen die niet recent een medische ingreep

ondergingen of in contact geweest zijn met ziekenhuizen, worden veroorzaakt door

gemeenschapsgebonden MRSA (community-acquired; CA-MRSA).

Gedurende de laatste 10 jaar is CA-MRSA wereldwijd verspreid geraakt. Dit type ontstond

onafhankelijk van HA-MRSA en is meer virulent dan HA-MRSA, dankzij de aanwezigheid

van verschillende virulentiefactoren (Etienne, 2005), zoals o.a. het PVL toxine en het Phenol-

soluble moduline (PSM) toxine. De aanwezigheid van deze toxines kan aanleiding geven tot

ziekten die vitale organen aantasten, wat vervolgens kan leiden tot infecties over het hele

lichaam, toxic-shock syndroom of necrotiserende longontstekingen (Miller et al, 2005). De

eerste beschrijving van CA-MRSA dateert van 1993 en beschrijft de observatie van

CA-MRSA in Aboriginals uit verschillende gemeenschappen (Udo et al, 1993).

INLEIDING

5

Ongeveer 75% van de CA-MRSA infecties komen voor op de huid en zacht weefsel en zijn

behandelbaar. Naast het feit dat ze meer virulent zijn, kunnen ze zich makkelijker verspreiden

in vergelijking met de traditionele stammen.

De behandeling van CA-MRSA is eenvoudiger dan de behandeling van HA-MRSA infectie

doordat CA-MRSA (tot op heden) minder resistentie vertoont voor bepaalde soorten

antibiotica, waaronder sulfonamiden, tetracyclines en clindamycine (Deurenberg &

Stobberingh, 2008).

2.3. Diergebonden MRSA

De eerste melding van een nieuw type MRSA in varkens kwam uit Nederland in december

2004. Eerst dacht men dat dit een interessante maar eenmalige gebeurtenis was, aangezien er

al eerder rapporten gepubliceerd waren over HA- en CA-MRSA in dieren (Manian, 2003;

Scott et al, 1988).

In juli 2004 voerden artsen in het ziekenhuis van Nijmegen een pre-operatief onderzoek uit op

een meisje van zes maanden dat drager bleek van MRSA. Ondanks verschillende pogingen

om het meisje MRSA vrij te maken, bleef ze gekoloniseerd met de bacterie. Verschillende

testen toonden aan dat de ouders van het meisje eveneens gekoloniseerd waren met MRSA.

Het gezin runde en woonde op een varkensbedrijf. Na onderzoek op enkele van de varkens

van het varkensbedrijf waar het meisje van zes maanden woonde en varkens van andere

varkensbedrijven in diezelfde omgeving, werd bij één van de 30 geteste varkens MRSA

gevonden die identiek was aan het type geïsoleerd op het bedrijf van de familie van het meisje

In oktober 2004 werd een jonge moeder opgenomen in het ziekenhuis met mastitis

veroorzaakt door MRSA. Testen toonden aan dat zowel de man als hun dochter MRSA

dragers waren. Doordat de vader een varkensboer was, werden er stalen genomen bij tien van

zijn varkens en bij drie van zijn werknemers. Alle werknemers en acht van de tien varkens

bleken drager van een MRSA stam met spa type t108.

Begin 2005 werden nog twee gevallen beschreven van MRSA gelinkt aan varkens: het ene

handelde over een varkensboer en het andere over de zoon van een veearts, die veel met

varkens in contact kwam. Hierdoor vermoedde men dat de varkens de bron van de

antibioticum resistente bacteriën zouden kunnen zijn.

Onderzoekers probeerden de MRSA stammen te classificeren door middel van Pulsed Field

Gel Elektroforese (PFGE) met behulp van het SmaI restrictie-enzym, aangezien deze techniek

toen gekend was als de beste methode voor karakterisatie van MRSA stammen. De

geïsoleerde stammen konden hiermee echter niet getypeerd worden. Door middel van random

amplification of polymorphic DNA (RAPD) onderscheidde men ten slotte drie verschillende

stammen. De isolaten van de met MRSA gekoloniseerde familie en de varkens van hun

bedrijf behoorden tot dezelfde stam (spa-type t108) (Voss et al, 2005). Een derde

typeringsmethode, namelijk multi locus sequentie typering (MLST) classificeerde tot slot alle

stammen in het sequentie type ST398. MRSA ST398 wordt ook wel diergebonden MRSA

(animal associated MRSA of AA-MRSA) genoemd. Uit al deze resultaten werd

geconcludeerd dat MRSA overgedragen kon worden tussen mensen en varkens, maar de

richting van transmissie was niet gekend (Huijsdens et al, 2006).

Tegenwoordig is MRSA ST398 wereldwijd verspreid geraakt bij industrieel gekweekte

varkens met onder andere rapporten uit België (Denis et al, 2007), Nederland (Huijsdens et al,

INLEIDING

6

2006), Denemarken (Guardabassi et al, 2007), Duitsland (Meemken et al, 2008), Portugal

(Pomba et al, 2009), Canada (Khanna et al, 2008) en de Verenigde Staten (Smith et al, 2008).

3. TYPERINGSMETHODEN VAN MRSA ST398

3.1. Multilocus sequentietypering

MLST is een uitstekende methode om de moleculaire evolutie van S. aureus te bestuderen.

Deze methode meet de DNA sequentievariatie in een set van huishoudgenen en karakteriseert

stammen op basis van hun unieke allelische profielen. De zeven huishoudgenen die

onderzocht worden voor de karakterisatie van MRSA zijn: arcC, aroE, glopF, gmk, pta, tpi

en yqiL. Er wordt gebruik gemaakt van huishoudgenen omdat de frequentie van mutaties in

deze genen relatief laag is. Een hoge mutatiegraad in huishoudgenen zou kunnen leiden tot

een defect in een genproduct dat essentieel is voor de celwerking.

De techniek omvat PCR amplificatie gevolgd door DNA sequenering. Op basis van de

gevonden allelen wordt een allelisch profiel opgesteld, ook wel een sequentietype (ST)

genoemd. Het sequentietype is een identificatiemerker voor de stam die onderzocht werd.

(Cuny et al, 2010). Het profiel van MRSA ST398 is 3-35-19-2-20-26-39 (www.mlst.net).

Door middel van bio-informatica methoden kan de verwantschap tussen verschillende

sequentietypes en de verschillen tussen de sequentietypes weergegeven worden (Figuur 4).

MLST is een zeer reproduceerbare methode. Materiaal voor ST determinatie kan eenvoudig

uitgewisseld worden tussen laboratoria in verschillende landen en de nodige primersequenties

en protocollen zijn makkelijk elektronisch te vinden. Andere voordelen van MLST zijn de

automatisering ervan en de combinatie van high throughput sequenering en bioinformatica

met populatiegenetica. Verder heeft de methode ook een goed discriminerend vermogen om

isolaten te differentiëren. Nadelig is dat deze methode duur, arbeidsintensief en tijdrovend is

(Deurenberg & Stobberingh, 2008; Leonard & Markey, 2008).

Figuur 4: Genetische verwantschap van MRSA van patiënten en controles, weergegeven als een minimum spanning tree gebaseerd op MLST profielen. Elke cirkel stelt een sequentie type voor.

De getallen onder en rechts naast de lijnen die de types verbinden verwijzen naar het aantal

verschillen in de MLST profielen. De schaduwen rond de cirkels omvatten de complexen van

sequentie types die met minder dan 3 loci verschillen (van Loo et al, 2007).

INLEIDING

7

3.2. spa typering

spa typering karakteriseert bacteriën op basis van variable number tandem repeats (VNTR’s),

het aantal herhalingen die gevonden worden in een bepaalde regio van het genoom. Voor spa

typering wordt er gekeken naar het variabel aantal repeats in de polymorfe X regio van het

proteïne A gen (Figuur 5). Diversiteit van de X regio ontstaat door deleties en duplicaties van

de repetitieve eenheden en door puntmutaties. De functie van het domein gecodeerd door de

X regio is niet gekend maar zou kunnen dienen als verlenging van het N-terminale

immunoglobulin G bindend deel van het proteïne (Shopsin et al, 1999).

Bij spa typering wordt eerst de sequentie van de X regio achterhaald door middel van

sequenering. Vervolgens kan er gebruik gemaakt worden van verschillende soorten software

om de resultaten van de sequenering te verwerken. Wereldwijd worden er twee

nomenclatuursystemen gebruikt, beschreven door Koreen et al (2004) en Harmsen et al

(2003). Dit geeft dikwijls moeilijkheden om vergelijkingen te maken met gepubliceerde spa

types. In Europa wordt voornamelijk gebruik gemaakt van het StaphType software pakket

(Ridom GmbH, Würzburg, Germany), dat ook gebruikt kan worden om een clusteranalyse uit

te voeren op basis van een algoritme gebaseerd op repeat patronen (based upon repeat pattern,

BURP). De data worden gesynchroniseerd op het internet en op de centrale spa server gezet

(http://www.spaserver.ridom.de) (Deurenberg & Stobberingh, 2008).

Gebruik van een single-locus merker, zoals bij spa typering, is minder duur, minder

tijdsrovend en vertoont minder variatie dan multilocus sequeneringstechnieken. De methode

is gestandaardiseerd waardoor vergelijking tussen verschillende labo’s mogelijk is. Verder

heeft spa typering een hoger discriminerend vermogen dan MLST en is minder

arbeidsintensief (Koreen et al, 2004).

MRSA ST398 isolaten vertonen weinig variatie wat betreft spa type. De meeste hebben spa-

type t011, t108 of t034 (Huijsdens et al, 2009).

3.3. Multi locus variable number tandem repeat analyse

Net als spa typering is multi locus variable number tandem repeat analysis (MLVA)

gebaseerd op de aanwezigheid van VNTR’s in het bacterieel genoom. In tegenstelling tot spa

typering, wordt er gekeken naar verschillende loci in het genoom. De VNTR’s in het genoom

kunnen geamplificeerd worden door middel van PCR en worden vervolgens gescheiden.

Doordat verschillende loci een verschillende grootte hebben, zullen ze ook tot op een

verschillende hoogte op het scheidingsgel lopen. Elke primerset is gelabeld met een ander

fluorescent label, waardoor meerdere PCR reacties gelijktijdig gelopen kunnen worden en de

Figuur 5: Overzicht van het proteïne A gen. De blokken geven de segmenten aan van het gen die

coderen voor de signaalsequentie (S), de immunoglobuline G bindende regio’s (A-D), een regio

homoloog aan A-D (E) en de COOH terminus (X), die de short sequence repeats (SSR’s) (X f) en de

celwand aanhechtingssequenties (Xc) bevat. 1095F en 1517R zijn mogelijke primers voor de

amplificatie van de X regio van proteïne A gen.

INLEIDING

8

amplicons kunnen onderscheiden worden na detectie in verschillende kanalen op een

sequencer. Eens de lengte van het amplicon gekend is, kan het aantal repeats berekend

worden door de lengte van het fragment te verminderen met de lengte van de primers en dit te

delen door de lengte van de repeat in het amplicon. Een MLVA profiel kan vervolgens

opgesteld worden op basis van het aantal repeats per amplicon (Lindstedt, 2005).

De MLVA methode is goed reproduceerbaar en heeft een goed discriminerend vermogen.

Bovendien is deze techniek ook goedkoper dan bovenstaande technieken, eenvoudig en

makkelijk te interpreteren. Daarom is MLVA heel bruikbaar als typeringsmethode voor

grootschalige epidemiologische studies (Rasschaert et al, 2009).

MLVA wordt in het kader van deze thesis echter gebruikt als screeningsmethode, waardoor

niet gekeken wordt naar het aantal repeats per amplicon maar naar het bekomen

bandenpatroon. Dit betekent dat de verschillende amplicons hetzelfde fluorescente label

kunnen dragen wanneer de scheiding gebeurt door middel van een sequencer of geen

fluorescent label hoeven te dragen wanneer de fragmenten gescheiden worden op gel.

Rasschaert et al (2009) testten verschillende primersets op hun discriminerend vermogen en

een selectie van deze primerssets wordt gebruikt om een eerste screening uit te voeren op de

lysaten van alle verdachte kolonies bekomen uit de staalnames. Door middel van

BioNumerics version 5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België) wordt op basis van

de bandenpatronen een clustering gemaakt. Hieruit wordt een selectie gemaakt van de

stammen die verder getypeerd zullen worden door middel van verschillende

typeringsmethoden.

3.4. Pulsed Field Gel Elektroforese

Pulsed field gel elektroforese (PFGE) is de gouden standaard voor de typering van MRSA.

Voor PFGE wordt eerst een restrictie uitgevoerd op het volledige chromosomaal DNA

ingebed in agaroseblokjes, die vervolgens geladen worden op een agarosegel. Deze gel wordt

gelopen in een elektrisch veld met een voltage dat periodiek veranderd van richting en tijd.

Wanneer het voltage van richting verandert, moeten de fragmenten hun lading heroriënteren

alvorens ze kunnen migreren in de nieuwe richting. Grotere fragmenten zullen hiervoor meer

tijd nodig hebben, waardoor ze zullen achterblijven ten opzichte van de kleinere fragmenten.

Op deze manier kunnen grote fragmenten tot 2 Mb gescheiden worden. Dit resulteert in een

DNA vingerafdruk van het bacterieel genoom. Een clustering wordt uitgevoerd met

bijvoorbeeld de BioNumerics software van Applied Maths door middel van een Dice

vergelijking met de Unweighted Pair Group Method with Arithmic Mean (UPGMA)

clusteringsmethode. De clustering toont de verwantschap tussen de verschillende onderzochte

stammen (Deurenberg & Stobberingh, 2008).

Voordeel aan PFGE is dat deze methode zeer discriminerend is. Nadelen zijn de tijdsrovende

protocols en de beperkte reproduceerbaarheid tussen verschillende labo’s. Dit laatste wordt

echter opgelost door gebruik te maken van gestandaardiseerde protocols (Struelens et al,

1992), die ook voor MRSA beschikbaar zijn. Het probleem is echter dat MRSA ST398 niet

met deze protocols typeerbaar is. Het enzym SmaI dat gebruikt wordt voor S. aureus is niet

bruikbaar voor MRSA ST398, omdat de knipplaatsen van het enzym gemethyleerd zijn. Er

zijn echter alternatieve restrictie enzymen zoals BstZI, SacII en ApaI (Rasschaert et al, 2009).

INLEIDING

9

3.5. SCCmec typering

Het SCCmec mobiel element is een genetisch element dat codeert voor methicillineresistentie

en dat unieke site-specifieke recombinasen draagt. Er bestaan meerdere structureel

verschillende SCCmec elementen die een aantal karakteristieken delen. Ze dragen allemaal

het mecA gen in een mec gencomplex en cassette chromosome recombinase (ccr) genen in

een ccr gencomplex. Verder kunnen ze integreren op specifieke sites in het Staphylococcus

chromosoom. Deze site wordt de integratie site sequentie (ISS) voor SCC genoemd en is het

target voor ccr-gemedieerde recombinatie. Tot slot bevat het SCCmec mobiel element ook de

flankerende gebieden van het ISS, die nodig zijn voor recombinatie van het element in het

Staphylococcus chromosoom (Katayama et al, 2000).

De herkomst van het SCCmec mobiel element is niet bekend. Een mogelijke afkomst zou

Staphylococcus sciuri kunnen zijn. In deze bacterie werd een PBP gevonden, die 87%

aminozuursequentiegelijkenis vertoont met het PBP2a. De S. sciuri stammen waren

methicillinesensitief, maar in aanwezigheid van methicilline werden ze hier resistent aan door

de verhoogde snelheid van transcriptie van de mecA gen homoloog. Wanneer de onderzoekers

dit mecA gen homoloog introduceerden in methicilinesensitieve S. aureus (MSSA) werden

deze methicilline resistent (Wu et al, 2001).

Tot op heden kunnen acht verschillende SCCmec types onderscheiden worden (zie Figuur 6).

De types worden benoemd met een romeins cijfer of een arabisch cijfer en een letter, die

respectievelijk verwijzen naar het ccr gencomplex en het mec gencomplex (zie Tabel 1). Er

zijn vijf verschillende ccr gencomplexen, type 1 tot 5, en vier verschillende mec

gencomplexen, klasse A tot D. Zo bevat SCCmec type I of 1B het type 1 ccr en het klasse B

mec gencomplex. De andere types die voorkomen zijn: type II of 2A, type III of 3A, type IV

of 2B, type V of 5C2, type VI of 4B, type VII of 5C1 en type VIII of 4A (Ito, 2009). Deze

Figuur 6: Een schematisch overzicht van een aantal SCCmec cassettess die gevonden worden in

MRSA (Ito et al., 2001, 2004; Daum et al., 2002; Oliveira et al., 2006a; Takano et al., 2008). De

belangrijkste elementen van de SCCmec cassette (ccr genes, IS431, IS1272, mecA, mecI/R1, orfX,

pI258, pT181, pUB101 and Tn554) zijn weergegeven (Overgenomen uit Deurenberg et al. (2007).

INLEIDING

10

types kunnen nog onderverdeeld worden in subtypes op basis van de polymorfismen en

variaties in de J regio. Deze regio omvat de niet-essentiële delen van de cassette die niet

behoren tot de ccr of mec gen complexen.

Tabel 1: SCCmec types geïdentificeerd in S. aureus. Elk SCCmec type wordt weergegeven met het

aanwezige ccr en mec gencomplex.

SCCmec type ccr gen complex mec gen complex

I 1 B

II 2 A

III 3 A

IV 2 B

V 5 C2

VI 4 B

VII 5 C1 VIII 4 A

Over het algemeen vindt men de SCCmec types I, II en III in HA-MRSA bacteriën en de

SCCmec types IV en V in CA-MRSA (Baba et al, 2002; Daum et al, 2002). In AA-MRSA

stammen vond men tot nu toe de SCCmec types IVa en V. De SCCmec types IV en V zijn

kleiner dan SCCmec types I, II en III en dragen veelal minder antibiotica resistentiegenen

naast het mecA gen dat nodig is voor de resistentie tegen methicilline (Grundmann et al,

2006; Ito et al, 2004). Hierdoor zijn CA- en AA-MRSA minder resistent tegen andere

antibiotica dan veel HA-MRSA. Uit verschillende studies werd besloten dat SCCmec types IV

en V dragende bacteriën beter aangepast zijn om te overleven in de gemeenschap, waar het

gebruik van antibiotica relatief laag is (Grundmann et al, 2006; Lee et al, 2007; Okuma et al,

2002). De bacteriën kunnen zich sneller vermenigvuldigen en hebben een lager

energieverbruik in vergelijking met SCCmec types I, II en III dragende bacteriën, wat kan

verklaard worden door de kleinere cassettes. Voor de bacterie is een kleinere cassette tevens

een voordeel omdat deze makkelijker doorgegeven kan worden door middel van horizontale

gentransfer. Aangezien CA- en AA-MRSA gelijkaardige cassettes bevatten, betekent dit

echter dat CA- en AA-MRSA eenvoudiger methicillineresistentie kunnen doorgeven aan

andere S. aureus dan HA-MRSA. (Unan & Young, 2007).

Door de snelle evolutie van de MRSA types en subtypes moet de typering van het SCCmec

element continu aangepast worden. Momenteel worden in het labo waar deze thesis doorging

hiervoor drie PCR reacties gelopen. De eerste PCR, ontwikkeld en beschreven door Oliveira

et al (2002), is geschikt voor de identificatie van SCCmec types I tot IV. SCCmec type V,

veel voorkomend in AA-MRSA, kan met deze methode niet geïdentificeerd worden. Ook de

subtypering van SCCmec type IV, van belang in het onderzoek naar AA-MRSA, kan niet

onderscheiden worden. De subtypering van type IV wordt behandeld in de tweede PCR, met

primers beschreven door Milheiriço et al (2007). De derde PCR wordt gelopen met primers

beschreven door Zhang et al (2005) en is bedoeld om SCCmec type V te identificeren maar

dient ook als controle voor de SCCmec types IVb en IVc. Deze drie PCRs worden gelopen en

de geamplificeerde fragmenten worden op gel gescheiden. Van de drie bekomen

bandenpatronen kan afgeleid worden tot welk SCCmec type het isolaat behoort.

INLEIDING

11

Het aflezen van de patronen gebeurt op basis van standaardstammen die verschillend zijn per

primerset (Figuur 7). Wanneer het resultaat van primerset 1 wijst op aanwezigheid van

SCCmec type IV of V, wordt gekeken naar de resultaten van de ander primersets om na te

gaan welk subtype aanwezig is of ter bevestiging van de aanwezigheid van SCCmec type V.

3.6. Antibioticaresistentie

MRSA stammen worden ook getest op hun gevoeligheid voor antimicrobiële agentia.

Volgende antibiotica worden meestal getest: cipofloxacine, erythromycine, fucidine,

gentamicine, linezolid, mupirocine, sulphametoxazole, trimethoprim, tetracycline,

chloramphenicol, vancomycine en quinupristine/dalfopristine (EFSA, 2007). Dit is een

verzameling van antibiotica, die behoren tot verschillende antibioticumklassen. Sommige

worden in de humane geneeskunde gebruikt en andere in de diergeneeskunde. Doordat MRSA

stammen onderling verschillen vertonen in hun antibioticasensitiviteit, kan deze techniek

gebruikt worden als typeringstechniek.

De studie naar de gevoeligheid van MRSA ten opzichte van antibiotica kan op verschillende

manieren gebeuren. Vooreerst kan men enkel kijken naar de resistentie of sensitiviteit van de

bacterie voor een vastgestelde concentratie antibioticum. Dit wordt gedaan door middel van

een agar disk diffusie test. Hiervoor wordt de bacterie geënt op een medium, waarop

vervolgens schijfjes geplaatst worden met een bepaalde concentratie aan antibiotica. Wanneer

de bacterie sensitief is voor het onderzochte antibioticum, zal na incubatie rond het schijfje

een inhibitiezone verschijnen.

Een tweede methode bestaat uit een titerbepaling. Voor deze methode wordt gebruik gemaakt

van strips die een oplopende concentratie van het onderzochte antibioticum bevatten. De

strips worden op een plaat gelegd waar de bacteriën op geënt zijn. Sensitieve bacteriën zullen

kunnen groeien op de plaat tot op de hoogte van de concentratie van het antibioticum die de

groei inhibeert. Uit deze methode kan men dus afleiden voor welke concentratie van het

antibioticum de bacterie resistent is.

Een vermoedelijke resistentie kan ook onderzocht worden door na te gaan of het

resistentiegen aanwezig is in het genoom van de bacterie door middel van een PCR reactie

100 100

L I II III IV V L L III IVa IVb IVc IVd V L L III IVa IVb IVc V L

100

200

500

1000

200

500

1000

0

200

500

1000

Figuur 7: Voorbeeld van een resultaat van SCCmec typering met primerset 1 (links), 2

(midden) en 3 (rechts) uitgevoerd op de standaardstammen. L: 100 bp ladder.

INLEIDING

12

met primers specifiek voor het onderzochte antibioticumresistentiegen (Hakanen et al, 2003;

Lehtopolku et al, 2010).

3.7. Toxines

Het genoom van MRSA codeert voor verschillende virulentiefactoren waaronder toxines.

Deze kunnen onderverdeeld worden in drie groepen volgens hun biologische eigenschappen.

Een eerste groep zijn toxines met exfoliatieve effecten. Deze splitsen de desmosomen die de

huidcellen van de gastheer samenhouden. Verlies van de cel-cel adhesie kan leiden tot

staphylococcal scalded-skin syndrome (SSSS) (Amagai et al, 2000).

De suppuratieve toxines vormen een tweede groep. Een belangrijk lid van deze groep is het

Panton Valentine leukocidin, dat poriën vormt in het buitenste membraan van

polymorphonucleaire leukocyten, waardoor deze apoptose ondergaan. Secretie van PVL leidt

tot de vorming van necrotiserende, etterende letsels. De genen van dit toxine zijn

gelocaliseerd op het genoom van een bacteriofaag.

Tot slot zijn er nog superantigenische toxines die het toxische shock syndroom (TSS)

induceren. Een belangrijk superantigenisch toxine is het TSS toxin-1 (TSST-1). Dit toxine

activeert een grote hoeveelheid T-cellen, die op hun beurt een teveel aan cytokine vrijstellen.

Een ander voorbeeld zijn de enterotoxines van Staphylococcus, die voedselvergiftiging

veroorzaken (Raulin et al, 2010).

De vermoedelijke productie van toxines wordt nagegaan door middel van PCR reacties. Dit

betekent dat het gen dat codeert voor een bepaald toxine geamplificeerd wordt door middel

van specifieke primers. Meestal kunnen meerdere primersets in één reactie gelopen worden

aangezien de lengte van de genen gekend is. Na scheiding van de fragmenten op gel, kan er

gekeken worden naar de aan- of afwezigheid van de toxinegenen (Jarraud et al, 2002).

4. IMPACT OP DE VOLKSGEZONDHEID

Hoe groot het gevaar van MRSA ST398 is voor de volksgezondheid is nog niet geweten. Vast

staat dat mensen die op een bedrijf werken waar de dieren MRSA ST398 dragen, een groter

risico lopen om gekoloniseerd te raken met MRSA ST398. Dit geldt ook voor de mensen die

werken op het varkensbedrijf en voor de dierenartsen die met de varkens in contact komen.

Kolonisatie kan rechtstreeks van het varken naar de mens maar ook onrechtstreeks via de

omgeving. Verder werd er reeds onderzoek gedaan naar de mogelijke overdracht van MRSA

ST398 tussen mensen, die tot nu toe beperkt lijkt (van Loo et al, 2006).

De gemeenschap zou in theorie ook gekoloniseerd kunnen worden met AA-MRSA aanwezig

op gecontamineerd varkensvlees. De contaminatiestatus van de transportwagens waarin de

varkens vervoerd worden van het bedrijf naar het slachthuis werd reeds onderzocht (Broens,

2009). Deze studie toonde aan dat de transportwagens gecontamineerd kunnen worden met

MRSA ST398 gedurende de korte periode waarin de varkens in de transportwagen verblijven.

De studie onderzocht ook de wachtruimtes van het slachthuis. De wachtruimtes waren reeds

na één dag gekoloniseerd, ondanks het feit dat de varkens er twee tot elf uur doorbrengen.

Van Cleef et al (2009) toonde aan dat de werknemers van het slachthuis die in contact komen

met de levende varkens, meer kans hebben op kolonisatie met MRSA ST398. Verschillende

studies concludeerden dat MRSA voornamelijk aanwezig is op de oppervlakten in het

slachthuis waar levende varkens verblijven, maar dat de bacterie verspreid wordt doorheen het

slachthuis tijdens het verwerkingsproces (Mulders et al, 2009; van Cleef et al, 2009). Deze

INLEIDING

13

studies werden uitgevoerd in Nederland, maar ook in België is MRSA ST398 wijdverspreid

op varkensbedrijven en gemengde bedrijven (van Cleef et al, 2009; Verhegghe et al, 2009).

Hoewel de primaire kolonisatiesite bij varkens voornamelijk de neusholte is, zijn de darmen

ook frequent gekoloniseerd met MRSA. Tijdens het slachten kan dus contaminatie gebeuren

van het vlees maar ook van de omgeving (de Boer et al, 2009). De Boer et al. (2009)

onderzocht de prevalentie van MRSA in verschillende types vlees en vond dat 10,7% van de

varkensvleesstalen positief was. Aanwezigheid van MRSA in vlees zou kunnen leiden tot

versnelde verspreiding van MRSA ST398 in de gemeenschap. Dit is echter niet het geval

doordat het lage aantal kolonievormende eenheden per kg aanwezig in het vlees. Men

concludeert hier voorlopig uit dat de contaminatie van vlees zo laag is dat er geen gevaar zou

zijn voor de consument/volksgezondheid (Morgan, 2008).

Contaminatie van mensen, die nauw contact hebben met gekoloniseerde varkens, zoals

varkensboeren, dierenartsen en werknemers van slachthuizen, zorgen voor een verhoogde

aanwezigheid van MRSA ST398 in de gemeenschap, wat op zichzelf reeds een risico voor de

volksgezondheid kan betekenen. Wanneer deze geïnfecteerde mensen bijkomende in contact

komen met HA- of CA-MRSA, zou horizontale gentransfer kunnen voorkomen. Tot nu toe

vertoont AA-MRSA minder resistentie tegen verschillende antibiotica dan HA-MRSA. Dit

wordt verklaard door een verschillend antibioticagebruik in de menselijke gezondheidszorg en

de veeteelt. Gentransfer tussen HA- en AA-MRSA kan er echter voor zorgen dat HA-MRSA

zeer snel resistent wordt aan een nog groter aantal antibiotica waardoor bestrijding van de

bacterie zeer moeilijk wordt (Unan & Young, 2007).

DOELSTELLING

14

II. DOELSTELLING MRSA vormt reeds lange tijd een probleem in de gezondheidszorg en de gemeenschap. In

2004 is een derde vorm van deze bacterie gevonden bij dieren, AA-MRSA genaamd.

Sindsdien werd dit type uitvoerig onderzocht en gekarakteriseerd als MRSA ST398. Varkens

zijn een veel voorkomende drager van MRSA ST398 zonder vertoon van infectie. Deze

bacterie wordt eenvoudig doorgegeven aan de omgeving en aan mensen die in contact komen

met gekoloniseerde varkens, zoals boeren, dierenartsen en slachthuispersoneel. Kolonisatie

van mensen kan sporadisch tot infecties leiden. Het gevaar is bovendien dat MRSA ST398

DNA zou kunnen uitwisselen met HA-MRSA door middel van horizontale gentransfer met de

vorming van een zeer infectueuze en zeer resistente bacterie als gevolg. Aangezien de bacterie

kan overleven op oppervlakten, is het mogelijk dat karkassen en vers varkensvlees

gecontamineerd raken met MRSA ST398. Dit kan leiden tot verspreiding van MRSA ST398

in de gemeenschap. Na onderzoek vond men echter een zeer laag kiemgetal van MRSA in

varkensvlees, waardoor het gevaar voor overdracht via varkensvlees naar de

gemeenschap/mens, eerder klein is.

Het project waarin deze thesis kadert, onderzoekt onder andere de epidemiologie van MRSA

ST398 bij vleesvarkens op twee gesloten varkensbedrijven, twee gesloten kip-

varkensbedrijven en twee gesloten rund-varkensbedrijven. Op deze bedrijven wordt de

kolonisatiestatus van de vleesvarkens onderzocht vanaf het werpen tot het einde van de

afmest. Om de contaminatiebron van de biggen te achterhalen, worden stalen genomen van de

omgeving en van de zeugen in de kraamstal en voor en na het wassen van de zeugen.

Deze thesis onderzocht de kolonisatieleeftijd van biggen met MRSA ST398 op een gesloten

kip-varkensbedrijf. Stalen worden genomen van de biggen op drie à vier dagen en drie weken

na het werpen in de kraamstal, iedere week van het verblijf in de biggenbatterij en gedurende

de eerste week in de voormest. Op drie à vier dagen na het werpen en voor het spenen (drie

weken na het werpen) van de biggen worden ook stalen genomen van de zeugen. Voor het

werpen worden de zeugen gewassen. Om de efficiëntie hiervan na te gaan, worden er

neusstalen en huidstalen genomen voor en na het wassen. Om de contaminatie van de

omgeving na te gaan worden er stalen genomen van de vloer in de stal, de wand ter hoogte

van het varken, de lucht ter hoogte van het staand varken en de lucht die de stal verlaat via het

ventilatiesysteem.

Na uitplaten en uitzuiveren worden er van elk MRSA isolaat een glycerolstock en lysaat

gemaakt voor verder onderzoek. Vervolgens wordt op alle isolaten een screening uitgevoerd

door middel van MLVA typering. Uit deze resultaten wordt vervolgens een selectie van de

isolaten gemaakt die gekarakteriseerd zullen worden door middel van MLST, spa typering,

SCCmec typering en PFGE. Tevens zal het antibioticaprofiel bepaald worden. Aangezien

MLST en spa typering tijdsrovende en arbeidsintensieve technieken zijn, wordt slechts een

beperkt aantal stalen getypeerd door middel van deze methoden. Wegens tijdsgebrek wordt

tevens slechts een deel van de selectie getypeerd door middel van PFGE. De overige

technieken worden toegepast op alle door middel van MLVA geselecteerde isolaten. Een

clustering zal vervolgens worden uitgevoerd om de verschillende isolaten met elkaar te

vergelijken.

RESULTATEN

15

III. RESULTATEN

1. STAALNAME BEDRIJF C

Om na te gaan op welke leeftijd biggen gekoloniseerd worden met MRSA, werden op een

gesloten kip-varkensbedrijf stalen genomen van de biggen/vleesvarkens, de zeugen en de

omgeving op verschillende tijdstippen na werpen. De biggen waren verdeeld over twee

kraamstallen die later biggenbatterij werden. Door het groot aantal positieve stalen werd

besloten om voor deze thesis verder te werken met de helft van de staalnames, namelijk de

staalnames drie à vier dagen na werpen, de weken voor en na het spenen van de biggen en de

weken voor en na het overbrengen van de vleesvarkens naar de voormestafdeling.

Het aantal MRSA positieve en MRSA niet detecteerbare stalen wordt weergegeven in

Tabel 2. Drie à vier dagen na werpen was reeds 97,5% van de biggen drager van MRSA. Dit

percentage daalde niet in de kraamstal of biggenbatterij maar wel bij het overbrengen van de

vleesvarkens naar de voormestafdeling. Op dat moment was slechts 76,4% van de

vleesvarkens MRSA drager. Bij het vergelijken van de aanwezigheid van MRSA bij de

biggen in de kraamstal/biggenbatterij (98%) en bij de vleesvarkens in de voormestafdeling

(76,4%), wass er een verschil van 20% merkbaar. Drie à vier dagen na werpen was 91,7% van

de zeugen MRSA positief. Dit percentage steeg tot 100% drie weken na werpen, wat betekent

gemiddeld 95,2% van de stalen van de zeugen drie à vier dagen en drie weken na werpen

MRSA positief was.

Tabel 2: Aantal vleesvarkens in kraamstal, biggenbatterij en voormest en aantal zeugen in de

kraamstal op verschillende tijdstippen na werpen die MRSA positief waren of waar MRSA niet

gedetecteerd werd. (ND: niet detecteerbaar)

3-4 dagen 3 weken 4 weken 10 weken 11 weken

BIGGEN VLEESVARKENS

Aantal Positief (%) 116 (97,5) 85 (100) 111 (97,4) 107 (98,2) 81 (76,4)

Aantal ND (%) 3 (2,5) 0 (0) 3 (2,6) 2 (1,8) 25 (23,6)

ZEUGEN

Aantal Positief (%) 11 (91,7) 9 (100) - - -

Aantal ND (%) 1 (8,3) 0 (0) - - -

Om na te gaan of de omgeving de contaminatiebron is van de biggen en later van de

vleesvarkens werden per stal omgevingstalen genomen op verschillende tijdstippen na het

werpen van de zeugen. Verdunningsreeksen werden aangelegd van de vloer- en wandstalen en

per luchtstrip werden vier kolonies uitgeplaat. Een omgevingsstaal werd als MRSA positief

beschouwt als één van de verdunningen of één van de vier geënte kolonies MRSA positief

was. Tabel 3 toont de resultaten van de vloer-, wand- en luchtstalen uit

kraamstal/biggenbatterij 7 en 10 en voormestafdeling 7 en 8. Bij de vloer- en wandstalen werd

op alle plaatsen MRSA gedetecteerd. De luchtstalen gaven een verschillend beeld in

kraamstal/biggenbatterij en voormestafdeling. Zeven van de 16 luchtstalen van de

kraamstal/biggenbatterij testten positief voor MRSA aanwezigheid. Bij de luchtstalen in de

voormestafdelingen werd slechts bij één staal MRSA gevonden.

Tot slot werden ook stalen genomen van zeugen voor en na het wassen, om na te gaan of het

wassen van de zeugen verandering geeft in de aanwezigheid van MRSA. Dit gebeurde met

RESULTATEN

16

behulp van neus- en huidstalen genomen voor en na het wassen (Tabel 4). Voor het wassen

werd bij 66,7% van de huidstalen MRSA gedetecteerd. Na het wassen werd er geen verschil

gevonden. Wel was er een lichte daling in de aanwezigheid van MRSA in de neus. Voor het

wassen vond men bij 91,7% van de neusstalen MRSA, terwijl dit na het wassen daalde naar

66.7%.

Bij negen van de 12 zeugen veranderde de contaminatiestatus van de neus niet, in

tegenstelling tot drie zeugen waarvan de neusstalen voor het wassen MRSA positief waren en

na het wassen er geen MRSA gedetecteerd kon worden (Tabel 4). Bij de huidstalen was een

gelijkaardige trend te zien. Bij acht van de 12 zeugen was er MRSA aanwezig op de huid voor

en na wassen. De huid van twee zeugen was voor het wassen MRSA positief, terwijl na het

wassen geen MRSA geïsoleerd werd. De overige twee zeugen hadden een negatief huidstaal

voor het wassen en een MRSA positief huidstaal na het wassen.

Tabel 3: Resultaten van de omgevingstalen op verschillende tijdstippen na de geboorte. MRSA

detectie wordt weergegeven met 1, geen detectie met 0.

OMGEVING 3-4 dagen 3 weken 4 weken 10 weken 11 weken

KRAAMSTAL/BIGGENBATTERIJ 10 VOORMESTAFDELING 7

Vloer 1 1 1 1 1

Wand 1 1 1 1 1

Lucht staand varken 1 1 0 0 0

Uitgaande lucht 0 0 1 0 0

KRAAMSTAL/BIGGENBATTERIJ 7 VOORMESTAFDELING 8

Vloer 1 1 1 1 1

Wand 1 1 1 1 1

Lucht staand varken 0 1 1 0 0

Uitgaande lucht 0 1 1 0 1

Tabel 4: Resultaten van de neus- en huidstalen van de zeugen voor en na het wassen en het

totaal aantal stalen waarin MRSA werd gedetecteerd. Detectie van MRSA wordt weergegeven

met 1, geen detectie met 0.

ZEUG Neus voor Neus na Huid voor Huid na

569 1 1 1 1

563 1 1 1 0

510 1 1 1 1

106 1 1 1 0

560 1 0 1 1

526 1 1 1 1

142 08 1 1 0 1

088 07 1 1 1 1

565 1 0 0 0

149 09 1 1 1 1

519 0 0 0 1

567 1 0 0 0

Totaal Aantal Positief (%) 11 (91,7) 8 (66,7) 8 (66,7) 8 (66,7)

RESULTATEN

17

2. SCREENING VAN DE ISOLATEN

2.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse

Zoals eerder vermeld werd eerst op alle (588) isolaten een screening uitgevoerd door middel

van MLVA. Er werden zes verschillende profielen verkregen. Op basis van deze profielen

werd in BioNumerics een clustering gevormd met de UPGMA clusteringmethode met Dice

coëfficiënt (Figuur 8). De profielen waarvan isolaat 2631 en 2082 voorbeelden zijn

vertoonden een lagere verwantschap met de andere stammen.

Uit de 588 isolaten werden op basis van deze resultaten 54 isolaten geselecteerd die verder

getypeerd werden. Hierbij werd rekening gehouden met de mogelijkheid om te vergelijken

tussen MRSA isolaten van verschillende vleesvarkens komende van dezelfde zeug en van

verschillende zeugen onderling, tussen MRSA isolaten van vleesvarkens en de omgeving en

tussen MRSA isolaten geïsoleerd voor en na het wassen van de zeugen. Een nieuw

dendrogram werd gevormd met de geselecteerde isolaten in BioNumerics met de UPGMA

clusteringmethode met Dice coëfficiënt (Figuur 9). Zoals hierboven vermeld, vertoonde de

clustering zes profielen. Profielen I en II omvatten 44 isolaten die 95% of meer verwantschap

vertoonden. Profiel III bevatte vijf isolaten en vertoonde 85% similariteit met profielen I en II,

terwijl dit slechts 74% was voor profiel IV, dat twee isolaten omvatte. Profiel V en VI

bevatten respectievelijk twee en één isola(a)t(en) en waren 84% verwant met elkaar, maar

minder dan 70% met de overige profielen.

3. TYPERING VAN DE GESELECTEERDE ISOLATEN

3.1. Multi locus sequentie typering

Door middel van MLST kan nagegaan worden tot welk sequentie type de 54 geselecteerde

MRSA isolaten behoren. Door de arbeidsintensiviteit en hoge kostprijs van de methode

worden slechts twee isolaten (1480 en 1984) door middel van deze techniek onderzocht. Het

resulterende profiel van de onderzochte isolaten was 3-35-19-2-20-26-39, wat overeenkomt

met sequentie type ST398.

3.2. spa typering

spa typering typeert stammen op basis van het aantal VNTR’s aanwezig in de X regio van het

proteïne A gen van MRSA. Opnieuw werd er slechts een beperkt aantal van de geselecteerde

isolaten aan deze techniek onderworpen. Alle isolaten vertoonden allemaal spa type t011.

MLVA-Marijke100

90

80

70

MLVA-Marijke

.

.

.

.

.

.

1875

1958

3057

2839

2631

2082

big 3, 3w

big 80, 3w

Big 3, 11w

big 2, 10w

Zeug 8807, neus na

Lucht U, 3w

Figuur 8: Dendrogram van de verschillende profielen, gevonden na de MLVA screening. Via

Bionumerics werd een clustering gevormd door middel van de UPGMA methode via Dice

vergelijking.

RESULTATEN

18

Figuur 9: Dendrogram van de MLVA profielen van de geselecteerde stalen. De cluster werd

gevormd in BioNumerics door middel van UPGMA via Dice vergelijking. Profielen worden

aangegeven met romeinse cijfers.

MLVA-Marijke

100

90

80

70

MLVA-Marijke

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1551

1975

1733

2839

2910

2674

2612

3193

1567

2066

3330

2961

2078

1971

1979

1480

1481

1482

1546

1725

1873

1874

1875

1939

1943

1948

1984

1985

2840

3056

1556

1959

2690

2659

2677

2663

2624

2626

2614

2619

3181

3169

2045

3057

2898

2949

1570

2965

1958

2057

2631

2678

2082

big 65, 3-4d

Lucht SV, 3w

big 80, 3-4d

big 2, 10w

Big 80, 10w

Zeug 8807, huid voor

Zeug 569, neus voor

Big 80, 11w

Wand, 3-4d

Vloer, 4w

Wand, 11w

Wand, 10w

Wand, 4w

Wand, 3w

Lucht U, 3-4d

zeug 1, 3-4d

big 2, 3-4d

big 3, 3-4d

zeug 7, 3-4d

zeug 8, 3-4d

zeug 1, 3w

big 2, 3w

big 3, 3w

zeug 7, 3w

big 65, 3w

zeug 8, 3w

big 2, 4w

big 3, 4w

big 3, 10w

Big 2, 11w

Vloer, 3-4d

Vloer, 3w

Zeug 8807, huid na

Zeug 569, huid voor

Zeug 569, huid na

Zeug 510, huid voor

Zeug 569, neus na

Zeug 510, neus na

Zeug 510, neus voor

Zeug 8807, neus voor

Big 65, 11w

Vloer, 11w

Big 65, 4w

Big 3, 11w

Big 65, 10w

Vloer, 10w

Lucht SV, 3-4d

Lucht U, 4w

big 80, 3w

big 80, 4w

Zeug 8807, neus na

Zeug 510, huid na

Lucht U, 3w

I

II

III

IV

V

VI

RESULTATEN

19

3.2. SCCmec typering

Door middel van SCCmec typering wordt nagegaan welke SCCmec cassette aanwezig is in

het genoom van het MRSA isolaat. Het resultaat van de SCCmec typering zijn drie

bandenpatronen waaruit het SCCmec type afgeleid kan worden. De 54 geselecteerde isolaten

vertoonden allemaal het SCCmec type V, behalve isolaat 2631 en 3336 (zie bijlage 1). De

combinatie van bandenpatronen voor isolaten 2631 en 3336 gaven geen uitkomst die

vergelijkbaar was met de standaardstammen weergegeven in Figuur 7. Figuur 10 toont de

resultaten van SCCmec typering van een positieve controle voor type IVa en V, een negatieve

controle, isolaat 1481, dat SCCmec type V bevat en isolaten 2631 en 3336 die niet typeerbaar

zijn.

3.3. Pulsed Field Gel Elektroforese

PFGE is de gouden standaard voor de typering van MRSA. Aangezien er reeds aangetoond

werd door middel van MLST en spa typering dat de isolaten behoorden tot MRSA ST398 en

dit sequentietype niet geknipt kan worden door SmaI, werd de restrictie uitgevoerd met BstZI

als restrictie-enzym. Wegens tijdsgebrek werden slechts tien isolaten onderzocht via PFGE.

Vijf isolaten kwamen van big 2 en 3 en hun zeug (zeug 1) en big 65 en de bijhorende zeug

(zeug 7), allemaal bekomen drie à vier dagen na werpen. De overige vijf waren ook afkomstig

van big 2 maar deze zijn bekomen drie, vier, negen, tien en elf weken na werpen. De bekomen

pulsotypes werden verwerkt in BioNumerics en geclusterd door middel van de UPGMA

clusteringsmethode met Dice coëfficiënt (Figuur 11).

Figuur 10: SCCmec profielen bekomen met behulp van drie

PCR mixen van isolaten 2631, 3336 en 1481 met positieve

controles voor SCCmec types IVa en V en een negatieve

controle. (L: 100 bp ladder; 1: controle SCCmec type V; 2:

controle SCCmec type IVa; 3: negatieve controle; 4: isolaat 2631;

5: isolaat 3336; 6: isolaat 1481)

L MIX 1 MIX 2 MIX 3 MIX 1 MIX 2 MIX 3

1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6

5

6

5

6

5

500

300

200

100

400

1000

RESULTATEN

20

De clustering toonde dat zeven van de tien isolaten 100% verwant waren op basis van PFGE

met het BstZI restrictie-enzym. De overige drie isolaten waren minder verwant. Isolaat 3056

had slechts 92% verwantschap met de overige isolaten.

3.4. Antibiogrammen

Antibiogrammen worden uitgevoerd om na te gaan tegen welke antibiotica resistentie

aanwezig is bij het onderzochte isolaat. Zestien verschillende antibiotica werden getest

(originele data bijlage 2). Bij de test werden zes verschillende antibioticumresistentieprofielen

gevonden (Tabel 5). Alle profielen vertoonden resistentie tegen tetracycline en trimethoprim

en sensitiviteit tegen chloramphenicol, fucidine, gentamicine, kanamycine, linezolid,

rifampicine, sulfonamide en tobramycine. Voor de overige zes antibiotica vertoonden de

profielen een verschillende resistentie/sensitiviteit. Profiel zes vertoonde een groot verschil

met de overige profielen door de resistentie tegen erythromycine, lincomycine en mupirocine,

de sensitiviteit voor ciprofloxacine en de intermediaire reactie tegen

quinupristine/dalfopristine. Profiel 1, 3, 4 en 5 waren gelijkaardig. Wanneer profiel 1 als basis

genomen werd, verschilden profiel 3, 4 en 5 met profiel 1 in een intermediaire reactie in

plaats van resistentie voor respectievelijk lincomycine, erythromycine en tylosine. Bij

profiel 2 viel de intermediaire reactie tegen lincomycine en sensitiviteit voor ciprofloxacine

op.

Tabel 6 toont het voorkomen van de verschillende antibioticumresistentieprofielen. Het

dominante profiel was profiel 1, dat bij 87% van de isolaten voorkwam. Profiel 3 kwam drie

keer voor (isolaten 1979, 3330 en 2674). Profielen 2, 4, 5 en 6 werden maar één keer

gevonden in respectievelijk isolaat 2631, isolaat 2949, isolaat 2082 en isolaat 3336.

De reactie van de isolaten ten opzicht van de verschillende antibiotica wordt weergegeven in

Tabel 7. Alle isolaten waren resistent aan tetracycline en trimethoprim en sensitief aan

chloramphenicol, fucidine, gentamicine, kanamycine, linezolid, rifampicine en sulfonamides.

De meeste isolaten (96,2%) waren resistent voor ciprofloxacine, terwijl 92,7% gevoelig was

aan lincomycine. Tot slot vertoonde meer dan 95% van de isolaten een sensitiviteit voor

erythromycine, mupirocine, quinupristine/dalfopristine en tylosine.

PFGE - EagI - 2

100

98

96

94

92

PFGE - EagI - 2

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1480

1481

1482

1546

1873

1984

2839

1551

1874

3056

zeug 1, 3-4d

big 2, 3-4d

big 3, 3-4d

zeug 7, 3-4d

zeug 1, 3w

big 2, 4w

big 2, 10w

big 65, 3-4d

big 2, 3w

Big 2, 11w

Figuur 11: Dendrogram van de profielen bekomen door middel van PFGE. De cluster werd

gegenereerd in Bionumerics door middel van UPGMA clustering via de Dice vergelijking.

RESULTATEN

21

Tabel 5: Overzicht van de antibioticaresistetieprofielen gevonden in de 54 onderzochte

stammen. De isolaten die behoren tot een bepaald profiel waren sensitief (S), intermediair (I) of

resistent (R) voor een bepaald antibioticum.

Profiel 1 Profiel 2 Profiel 3 Profiel 4 Profiel 5 Profiel 6

Chloramphenicol S S S S S S

Ciprofloxacine R S R R R S

Erythromycine S S S I S R

Fucidine S S S S S S

Gentamicine S S S S S S

Kanamycine S S S S S S

Lincomycine S I I S S R

Linezolid S S S S S S

Mupirocine S S S S S R

Quinupristine/dalfopristine S S S S S I

Rifampicine S S S S S S

Sulfonamide S S S S S S

Tetracycline R R R R R R

Tobramycine S S S S S S

Trimethoprim R R R R R R

Tylosine S S S S I S

Tabel 6:Aantal en percentage van de isolaten per antibioticaresistentieprofiel.

Profiel 1 2 3 4 5 6

Aantal 47 1 3 1 1 1

Percentage (%) 87,0 1,9 5,6 1,9 1,9 1,9

Tabel 7: Overzicht van het percentage isolaten die resistent, intermediair of sensitief zijn voor

een bepaald antibioticum.

Resistent (%) Intermediair (%) Sensitief (%)

Chloramphenicol - - 100

Ciprofloxacine 96,2 - 3,8

Erythromycine 1,9 1,9 96,4

Fucidine - - 100

Gentamicine - - 100

Kanamycine - - 100

Lincomycine 1,9 7,5 92,7

Linezolid - - 100

Mupirocine 1,9 - 98,1

Quinupristin/dalfopristin - 1,9 98,1

Rifampicine - - 100

Sulphonamide - - 100

Tetracycline 100 - -

Tobramycine - - -

Trimethoprim 100 - -

Tylosine 1,9 1,9 96,2

RESULTATEN

22

3.5. Overzicht van de typeringen

Op basis van de MLVA profielen werd een dendrogram gemaakt van de 54 geselecteerde

isolaten door middel van de UPGMA clusteringsmethode met Dice coëfficiënt, die de

resultaten van spa typering, SCCmec typering, PFGE en antibioticumresistentieprofilering

bevat (Figuur 12).

Meest opvallend in dit dendrogram was isolaat 3336, dat geen MLVA bandenpatroon

vertoonde, een antibioticumresistentieprofiel had dat sterk verschilt van de overige isolaten en

niet typeerbaar was door middel van SCCmec typering.

In MLVA profiel I vielen isolaten 2674, 3330 en 1979 op door een intermediaire resistentie

voor lincomycine die niet terug werd gevonden bij de overige isolaten in deze cluster. MLVA

profiel II vertoonde geen variatie in SCCmec type, antibioticumresistentieprofiel of spa type.

Enkel op basis van de PFGE was er een verschil op te merken bij isolaten 1874 en 3056. Alle

typeringsmethoden gaven dezelfde resultaten voor de isolaten van MLVA profiel IV. Deze

resultaten werden ook meestal teruggevonden bij de isolaten van MLVA profiel III, met

uitzondering van isolaat 2949, dat een intermediaire resistentie vertoonde voor erythromycine

die niet te zien was bij de andere isolaten.

RESULTATEN

23

MLVA-Marijke

100

80

60

40

20

0

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1551

1975

1733

2839

2910

2674

2612

3193

1567

2066

3330

2078

1971

1979

1480

1481

1482

1546

1725

1873

1874

1875

1939

1943

1948

1984

1985

2840

3056

1556

1959

2690

2659

2677

2663

2624

2626

2614

2619

3181

3169

2045

3057

2898

2949

1570

2965

1958

2057

2631

2678

2082

3336

big 65, 3-4d

Lucht SV, 3w

big 80, 3-4d

big 2, 10w

Big 80, 10w

Zeug 8807, huid .

Zeug 569, neus v.

Big 80, 11w

Wand, 3-4d

Vloer, 4w

Wand, 11w

Wand, 4w

Wand, 3w

Lucht U, 3-4d

zeug 1, 3-4d

big 2, 3-4d

big 3, 3-4d

zeug 7, 3-4d

zeug 8, 3-4d

zeug 1, 3w

big 2, 3w

big 3, 3w

zeug 7, 3w

big 65, 3w

zeug 8, 3w

big 2, 4w

big 3, 4w

big 3, 10w

Big 2, 11w

Vloer, 3-4d

Vloer, 3w

Zeug 8807, huid .

Zeug 569, huid v.

Zeug 569, huid na

Zeug 510, huid v.

Zeug 569, neus na

Zeug 510, neus na

Zeug 510, neus v.

Zeug 8807, neus .

Big 65, 11w

Vloer, 11w

Big 65, 4w

Big 3, 11w

Big 65, 10w

Vloer, 10w

Lucht SV, 3-4d

Lucht U, 4w

big 80, 3w

big 80, 4w

Zeug 8807, neus .

Zeug 510, huid na

Lucht U, 3w

Lucht U, 10w

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cipR, ery I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R, tylo R

ery R, lico R, mup R, syn I, tet R, trim R

II

I

I

I

I

I

I

III

I

IV

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

NT

V

V

NT

MLVA-Marijke

100

80

60

40

20

0

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

1551

1975

1733

2839

2910

2674

2612

3193

1567

2066

3330

2078

1971

1979

1480

1481

1482

1546

1725

1873

1874

1875

1939

1943

1948

1984

1985

2840

3056

1556

1959

2690

2659

2677

2663

2624

2626

2614

2619

3181

3169

2045

3057

2898

2949

1570

2965

1958

2057

2631

2678

2082

3336

big 65, 3-4d

Lucht SV, 3w

big 80, 3-4d

big 2, 10w

Big 80, 10w

Zeug 8807, huid voor

Zeug 569, neus voor

Big 80, 11w

Wand, 3-4d

Vloer, 4w

Wand, 11w

Wand, 4w

Wand, 3w

Lucht U, 3-4d

zeug 1, 3-4d

big 2, 3-4d

big 3, 3-4d

zeug 7, 3-4d

zeug 8, 3-4d

zeug 1, 3w

big 2, 3w

big 3, 3w

zeug 7, 3w

big 65, 3w

zeug 8, 3w

big 2, 4w

big 3, 4w

big 3, 10w

Big 2, 11w

Vloer, 3-4d

Vloer, 3w

Zeug 8807, huid na

Zeug 569, huid voor

Zeug 569, huid na

Zeug 510, huid voor

Zeug 569, neus na

Zeug 510, neus na

Zeug 510, neus voor

Zeug 8807, neus voor

Big 65, 11w

Vloer, 11w

Big 65, 4w

Big 3, 11w

Big 65, 10w

Vloer, 10w

Lucht SV, 3-4d

Lucht U, 4w

big 80, 3w

big 80, 4w

Zeug 8807, neus na

Zeug 510, huid na

Lucht U, 3w

Lucht U, 10w

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cipR, ery I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

linco I, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R

cip R, tet R, trim R, tylo R

ery R, lico R, mup R, syn I, tet R, trim R

2

1

1

1

1

1

1

3

1

4

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

t011

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

V

NT

V

V

NT

Figuur 12: Cluster gebaseerd op de MLVA profielen met de resultaten van de spa typering,

SCCmec typering en antibiogrammen. (NT: niet typeerbaar)

Nr. Herkomst Antibioticumresistentieprofiel PFGE spa SCCmec

I

II

III

IV

V

VI

DISCUSSIE

24

IV. DISCUSSIE MRSA ST398 werd voor het eerst beschreven in Nederland in 2005. Sindsdien zijn

verschillende studies uitgevoerd naar de prevalentie van deze bacterie op varkensbedrijven

en naar de typering van de gevonden stammen. Tijdens deze thesis werd de prevalentie van

MRSA in een gesloten kip-varkensbedrijf onderzocht en werden de isolaten door middel van

MLST, spa typering, SCCmec typering en PFGE getypeerd. Tevens werd het

antibioticumresistentieprofiel bepaald.

4.1. PREVALENTIE IN VARKENS

Onderzoek naar de epidemiologie van MRSA binnen één bedrijf is in België nog niet eerder

gebeurd. In de literatuur werd tot op heden niets gepubliceerd over de contaminatieleeftijd

van biggen. Studies naar de prevalentie van MRSA in varkensbedrijven werden wel

uitgevoerd. Van Duijkeren et al (2008) rapporteerden in Nederland een prevalentie van 11%

in de 310 varkens waarvan stalen genomen werden. De prevalentie van MRSA in gesloten

bedrijven in België is 56% (Denis et al, 2007; Willems et al, niet gepubliceerde data).

Drie à vier dagen na werpen was 97,5% van de stalen afgenomen bij de biggen MRSA

positief, net zoals een groot deel van de omgevingsstalen. In de kraamstal en biggenbatterij

bleven deze observaties terugkeren. Wanneer de vleesvarkens overgebracht waren naar de

voormestafdeling, werd slechts bij 76,4% van de vleesvarkens MRSA dragerschap gevonden

terwijl er geen daling was in het aantal omgevingsstalen die MRSA positief waren. Dit

verschil kan mogelijks verklaard worden door het verhuizen van de vleesvarkens. De MRSA

bacterie kan nog steeds aanwezig zijn op de huid van de vleesvarkens, waardoor de

vleesvarkens de omgeving contamineren maar er geen detecteerbare hoeveelheid MRSA

meer aanwezig is in de neus. Een verlaagde prevalentie in oudere varkens werd reeds

beschreven door Denis et al (2007), Dewaele et al (2007) en Willems et al (niet

gepubliceerde data).

De zeugen in de kraamstal vertoonden een hoge aanwezigheid van MRSA. Drie à vier dagen

na de worp waren 91,7% van de zeugen MRSA positief. Deze contaminatiestatus is niet

consistent met eerdere studies (Denis et al, 2007; Dewaele et al, 2007; Willems et al, niet

gepubliceerde data), waarin gevonden werd dat oudere varkens een lagere prevalentie

vertonen dan biggen. Zeugen zijn minimum zeven maanden oud en behoren dus tot de

oudere varkens, waardoor een verlaagde prevalentie zou kunnen verwacht worden, wat hier

niet het geval is. Het is echter niet geweten of de zeugen reeds voor het werpen

gekoloniseerd waren met MRSA of hiermee gecontamineerd werden in de kraamstal. De

omgevingsstalen waren meestal positief, waardoor de contaminatie van de zeugen

veroorzaakt kan zijn door contact met de omgeving. De zeugen kunnen ook de omgeving

gecontamineerd hebben. Verder onderzoek is nodig naar de prevalentie van MRSA in

oudere varkens en de contaminatiestatus van de zeugen voor ze naar de kraamstal

overgebracht worden.

Bij het verhuizen van de zeugen van de drachtstal naar de kraamstal, worden de zeugen

gewassen om bacteriën, mest, en dergelijke te verwijderen. Op bedrijf C worden de zeugen

gewassen in de kraamhokken waarin ze ook zullen werpen. Bij het wassen worden

tegelijkertijd de kraamhokken schoongemaakt. Men verwacht dat dit leidt tot een

vermindering in prevalentie van MRSA in de stalen van de gewassen zeugen. Bij de

DISCUSSIE

25

neusstalen werd er een daling van 91,7% naar 66,7% opgemerkt maar dit was niet het geval

bij de huidstalen, waar zowel voor als na het wassen een prevalentie gezien werd van 66,7%.

Het wassen van de zeugen leidde dus tot een vermindering van 25% in het voorkomen van

MRSA in de neus. Hoewel het aantal huidstalen, die MRSA positief waren, gemiddeld

gelijk blijft voor en na het wassen, kon opgemerkt worden dat twee zeugen overgegaan zijn

van een positieve naar een niet detecteerbare status terwijl twee andere zeugen MRSA

positief waren geworden na het wassen. Dit onderzoek testte slechts 12 zeugen voor en na

het wassen en zou herhaald moeten worden op een statistisch verantwoord aantal zeugen

voor er echte conclusies kunnen getrokken worden. De daling in prevalentie in de neus kan

te maken hebben met de manier van wassen en het gebruikte reinigingsmiddel. Op bedrijf C

werden de zeugen zorgvuldig ingeschuimd en nadien afgespoten met een hogedrukreiniger.

Inzepen door middel van een borstel zou een beter manier kunnen zijn om MRSA bacteriën

van de huid te verwijderen. Gebruik van een desinfectans in plaats van zeep zou ook een

betere verwijdering van de bacterie kunnen veroorzaken. Onderzoek naar verschillende

reinigingsmethoden, om na te gaan welke methode het meest efficiënt is, is dus nodig.

4.2. TYPERING VAN DE ISOLATEN

Door het groot aantal MRSA positieve stalen werd een screening uitgevoerd met behulp van

MLVA. Zes verschillende profielen werden gevonden en geclusterd (Figuur 8). Aangezien

sommige profielen niet alle banden vertoonden, kan dit aanleiding geven tot een

similariteitsberekening die niet correct is. Dit was waarschijnlijk het geval voor stam 2631

en 2082, waarvan het profiel respectievelijk twee en drie banden vertoont. Een tekort aan

banden kan verklaard worden door een onvolledige PCR reactie of door een te lage DNA

concentratie in de gebruikte lysaten.

Uit de 588 positieve isolaten werd een selectie van 54 isolaten gemaakt waarmee een nieuwe

MLVA clustering gevormd werd (Figuur 9). Profiel I en II omvatten 85% van de

geselecteerde isolaten en vertoonden 95% verwantschap. In profiel III werd gezien dat de

bandenpatronen onvolledig zijn. Slechts vier van de vijf geamplificeerde fragmenten waren

aanwezig. Dit is ook het geval in profiel V en VI die respectievelijk drie en twee fragmenten

tekort hadden in hun bandenpatroon. Er moet nog verder nagegaan worden of dit werkelijk

een genetisch verschil is of een fout in de MLVA-analyse. Het bandenpatroon van profiel IV

vertoonde alle geamplificeerde fragmenten maar was slechts 74% verwant met profiel I en

II. Deze isolaten waren afkomstig van dezelfde big en zijn mogelijks een andere MRSA

stam dan de isolaten in profielen I en II. Aangezien het bandenpatroon zeer gelijkaardig was

aan de bandenpatronen gevonden in profielen I en II maar enkel de banden hoger liggen, is

een tweede verklaring mogelijks dat het verschil in hoogte veroorzaakt is door de sequencer.

Alle stalen worden afzonderlijk gelopen, waardoor een verschil kan optreden tussen

verschillende stalen, ondanks het gebruik van een referentiemerker en normalisatie in

BioNumerics. Ook dit verschil in bandenpatroon moet nog verder onderzocht en eventueel

bevestigd worden.

Van de 54 geselecteerde isolaten werden tien van de elf isolaten, bekomen tijdens de

staalname drie à vier dagen na werpen, geclusterd in de profielen I en II, net zoals negen van

de elf isolaten van drie weken na werpen, vijf van de zeven isolaten van vier weken na

werpen, vier van de zes isolaten van 10 weken na werpen en vijf van de zes isolaten van

11 weken na werpen. Dit betekent dat al deze isolaten een similariteit vertoonden van 95%

of meer waardoor dit waarschijnlijk isolaten zijn van dezelfde MRSA stam. Verdere

DISCUSSIE

26

typering door middel van PFGE bevestigde dit resultaat aangezien negen van de tien

isolaten, die PFGE analyse ondergingen, 98% verwant waren Typering van meer isolaten is

echter nodig om verdere conclusies te kunnen vormen.

De overige isolaten van de verschillende staalnames behoren tot MLVA profielen waar één

of meer fragmenten niet werden geamplificeerd en moeten ook verder onderzocht worden.

Op basis van de MLVA clustering kunnen isolaten geïsoleerd bij verschillende staalnames

van dezelfde big met elkaar vergeleken worden. Per big in de kraamstal/biggenbatterij kon

gezien worden dat over het algemeen de isolaten een verwantschap vertoonden van 95% en

meer. Dit betekent dat de biggen kort na werpen gekoloniseerd werden met een MRSA stam

en deze stam behouden gedurende hun verblijf in de kraamstal en de biggenbatterij. De

isolaten geïsoleerd in de voormest vertoonden onderling een lagere similariteit. Een

verklaring hiervoor zou kunnen zijn dat sommige biggen bij het transport van de

biggenbatterij naar de voormestafdeling de aanwezige MRSA stam verliezen en in de

voormest gekoloniseerd worden met een nieuwe stam, terwijl andere gekoloniseerd blijven

met de MRSA stam die ze in de kraamstal en biggenbatterij hebben. Dit is consistent met de

verschillende soorten dragerschap die voorkomen. Varkens kunnen permanent drager zijn

van MRSA, waardoor alle isolaten van dit varken tot dezelfde stam behoren. Een tweede

mogelijkheid is intermediair dragerschap, waarbij het varken op verschillende tijdstippen

gekoloniseerd is met verschillende MRSA stammen maar die na een bepaalde periode ook

weer verliest. Varkens kunnen ook geen dragerschap vertonen, wat betekent dat er geen

kolonisatie met MRSA optreedt.

Wanneer gekeken werd naar de isolaten afgenomen bij de zeugen en de bijhorende biggen in

de kraamstal, waren 11 van de 14 isolaten 100% verwant. De isolaten vertoonden hetzelfde

SCCmec type en werden ook samen geclusterd op basis van de pulsotypes bekomen door

middel van PFGE. Aangezien dezelfde isolaten ook hetzelfde antibioticumresistentieprofiel

vertoonden, kan besloten worden dat ze behoren tot dezelfde MRSA stam. Een algemene

conclusie kan nog niet getrokken worden door het beperkt aantal isolaten.

Op basis van de MLVA profielen werd ook 100% similariteit gevonden wanneer gekeken

werd naar alle isolaten gevonden in big-, zeug- en omgevingsstalen afgenomen in de

kraamstal. Negentien van de 22 stammen geïsoleerd drie à vier dagen en drie weken na

werpen vertoonden een similariteit van 95% of meer.

Tussen de isolaten van biggen van verschillende zeugen was een verwantschap van 95%,

wat een eerder vreemde observatie was, aangezien de isolaten van de zeugen in de kraamstal

100% verwant waren. Dit kan verklaard worden door eventuele variatie in de analyse of

door een verschillend MRSA type. Verdere typering met meerdere methoden kan eventueel

aantonen dat de isolaten toch afkomstig zijn van dezelfde MRSA stam.

Op basis van de MLVA profielen was te zien dat de isolaten bekomen van de zeugen in de

kraamstal en de omgeving drie à vier dagen en 3 weken na het werpen 95% verwantschap

toonden. Hieruit kan echter niet afgeleid worden of de zeugen de omgeving gecontamineerd

hebben of vice versa. Om dit te kunnen nagaan moeten een studie uitgevoerd worden naar

het moment van contaminatie van de zeugen. Een mogelijke opzet is om een MRSA

negatieve zeug over te brengen naar een MRSA positief bedrijf en vervolgens de

contaminatiestatus op te volgen.

De isolaten, afkomstig van het wassen van de zeugen, vertoonden op basis van de MLVA

profielen een verwantschap van 95% of meer, behalve twee isolaten, die maar twee van de

DISCUSSIE

27

vijf banden vertoonden en dus een twijfelachtig resultaat gaven. Hieruit kan er afgeleid

worden dat de zeugen of gekoloniseerd blijven gedurende het wassen, of geen MRSA meer

dragen maar deze snel weer oppikken door contact met de omgeving. Snelle rekolonisatie is

eerder onwaarschijnlijk aangezien de stalen afgenomen werden 20 min na het wassen.

De onderzochte isolaten behoren tot sequentietype ST398, dat geassocieerd wordt met

AA-MRSA. De isolaten die spa typering ondergingen, hadden spa type t011. Dit is een veel

voorkomend type bij MRSA ST398, naast spa type t108 en t034. Dit werd ook gevonden in

Nederland door Van Duijkeren et al. (2008) en de Neeling et al (2007) en in België door

Denis et al (2007), Rasschaert et al (2009) en Willems et al (niet gepubliceerde data). In alle

geselecteerde isolaten, op twee na, werd SCCmec type V teruggevonden, wat frequent

teruggevonden wordt in MRSA ST398 (de Neeling et al, 2007; Denis et al, 2007; Huijsdens

et al, 2006; Rasschaert et al, 2009; van Duijkeren et al, 2008; Willems et al, niet

gepubliceerde data). De overige twee isolaten vertoonden een niet typeerbaar SCCmec

profiel en worden verder onderzocht.

Tien isolaten werden onderzocht door middel van PFGE met het BstZI restrictie-enzym en

de bekomen pulsotypes werden geclusterd (Figuur 11). Zeven van de tien isolaten waren

100% verwant. Isolaten 1551 en 1874 vertoonden een verwantschap van ongeveer 98% met

de eerste zeven isolaten. Wanneer er naar de bandenpatronen gekeken werd, kon er gezien

worden dat deze zeer gelijkaardig waren aan deze van de isolaten die 100% verwant waren.

Er was echter wel een smeer te zien bij de hoger gelegen banden die de lagere verwantschap

zouden kunnen verklaren. Door de smeer kunnen deze banden op een andere hoogte

gepositioneerd zijn en dus aanleiding geven tot een verlaagde verwantschap. Er kan dus

verwacht worden dat de isolaten 1551 en 1874 ook 100% verwant zullen zijn met de andere

zeven isolaten. Meer isolaten moeten onderzocht worden om te kunnen besluiten of deze

stammen tot hetzelfde MRSA type behoren. Het tiende isolaat (3056) valt op. Dit isolaat

werd geïsoleerd bij een big in de voormest en vertoonde in vergelijking met de andere

isolaten een licht verschillend pulsotype. Dit zou kunnen betekenen dat sommige MRSA

isolaten in de voormestafdelingen een ander pulsotype hebben dan de isolaten in de

kraamstal/biggenbatterij. Aangezien er maar één isolaat uit de voormest onderzocht werd

met PFGE, kan er geen definitief besluit getrokken worden.

Alle antibioticumprofielen vertoonden resistentie tegen tetracycline en trimethoprim. Ook in

andere studies (Denis et al, 2007; Dewaele et al, 2007; Willems et al, niet gepubliceerde

data) is 100% resistentie gevonden van MRSA ST398 tegen deze antibiotica. Tetracycline is

het meest gebruikte antibioticum in de veeteelt, waardoor er een verhoogde blootstelling is

voor bacteriën, die zo resistentie kunnen ontwikkelen. Ciprofloxacineresistentie werd in

96,4% van de stammen gevonden. Dit is merkbaar hoger dan de 33% gevonden door Denis

et al (2007) en Willems et al (niet gepubliceerde data) na onderzoek van 663 MRSA

positieve stalen. In Denis et al (2007) werd ook sensitiviteit aan chloramphenicol, fusidine,

gentamicine, kanamycine, linezolide, rifampicine, sulphonamide en tobramycine gevonden.

Deze resultaten werden ook hier gezien.

Profiel zes vertoonde een sterk verschillend resistentieprofiel. Dit profiel kwam enkel in

stam 3336 voor. Dit luchtstaal uit de voormestafdeling toont tevens een atypisch SCCmec

type, waardoor vermoed kan worden dat het om een ander MRSA type gaat. Verder

onderzoek zal dit moeten bevestigen.

DISCUSSIE

28

In Figuur 12 kon gezien worden dat 42 van de 54 geselecteerde isolaten zeer gelijkaardig

waren op basis van de MLVA profielen, antibioticumresistentieprofielen, PFGE profielen,

spa type en SCCmec type. Om te besluiten dat deze isolaten tot dezelfde MRSA stam

behoren, moeten meer isolaten onderzocht worden met PFGE en eventuele andere

typeringsmethoden. De overige isolaten moeten opnieuw onderzocht worden door middel

van MLVA om na te gaan of deze bij aanwezigheid van de vijf geamplificeerde reactie een

hogere similarteit vertonen met MLVA profielen I en II. Verder onderzoek op isolaat 3336,

dat verschillende karakteristieken vertoont ten opzichte van de andere 54 isolaten, moet

aantonen of isolaat 3336 werkelijk een MRSA isolaat is.

4.3. CONCLUSIE

In het onderzoek naar de epidemiologie van AA-MRSA in varkens, werd in een gesloten

kip-varkensbedrijf een studie gedaan naar het tijdstip van kolonisatie van de biggen en de

bron van contaminatie. De resultaten toonden een hoge kolonisatiegraad in biggen van drie à

vier dagen oud. De biggen waren gekoloniseerd met MRSA isolaten die, op basis van

MLVA, een hoge verwantschap vertoonden. De bron van contaminatie kan echter niet

gespecifieerd worden, aangezien de isolaten van de zeugen in de kraamstal en de omgeving

een hoge verwantschap tonen met de isolaten gevonden in de stalen van de biggen. Dit

betekent dat de biggen zowel door de zeugen als de omgeving gekoloniseerd kunnen zijn

met MRSA. Een selectie van isolaten werd verder getypeerd door middel van MLST, spa

typering, SCCmec typering, PFGE en antibioticaresistentieprofilering. De isolaten

behoorden tot sequentie type ST398 en hadden spa type t011, beide veel voorkomend in

varkens in België en typisch voor het diergebonden MRSA. De isolaten hadden SCCmec

type V en werden op basis van PFGE samen geclusterd met 92% of meer verwantschap.

Zevenentachtig procent van de onderzochte isolaten vertoonden hetzelfde

antibioticumresistentieprofiel, waardoor kan verwacht worden dat al de meeste van de

gevonden isolaten tot dezelfde MRSA stam behoren. Verder onderzoek van meer isolaten en

van meerdere bedrijven moet hiervoor echter uitgevoerd worden. Onderzoek moet ook

gevoerd worden naar de contaminatiestatus van de zeugen bij het binnenbrengen in een

nieuw bedrijf om na te gaan op welk moment de zeugen gecontamineerd worden.

Onderzoek naar de overdracht van MRSA tussen de varkens en de kippen op het bedrijf

wordt momenteel gevoerd in het groter project waarin deze thesis kadert.

MATERIAAL EN METHODEN

29

V. MATERIAAL EN METHODEN

1. STAALNAME BEDRIJF C

1.1. Beschrijving bedrijf C

Bedrijf C is een gemengd veeteeltbedrijf waar zowel varkens als kippen aanwezig zijn. Dit

bedrijf telt ongeveer 180 zeugen, 500 biggen (0-10 weken oud) en 1000 vleesvarkens (ouder

dan 10 weken).

Dit bedrijf is een gesloten varkensbedrijf dat werkt met een één wekensysteem. Een gesloten

bedrijf produceert zelf biggen in tegenstelling tot een open bedrijf dat biggen aankoopt om af

te mesten. Eén of meer wekensystemen zijn gebaseerd op de cyclus van de zeug, die 21

weken duurt. Eén week na het begin van de cyclus wordt de zeug in de meeste gevallen

kunstmatig geïnsemineerd. Na een dracht van ongeveer 16 weken werpen de zeugen.

Afhankelijk van het wekensysteem, worden de biggen drie à vier weken gezoogd en nadien

gespeend. Bij het spenen worden de zeugen gescheiden van hun biggen, waarna de cyclus

opnieuw kan starten (Figuur 13).

Bij een één-wekensysteem wordt er iedere week één groep zeugen geïnsemineerd, wat

betekent dat er op bedrijf C ongeveer 21 groepen van acht zeugen aanwezig zijn. Dit systeem

heeft als voordeel dat er met kleinere groepen gewerkt kan worden, maar het is wel

arbeidsintensiever en vereist vrij veel afdelingen.

Het bedrijf heeft één stal met de kraamafdelingen, de biggenbatterijen en de zeugenstal (=

dekafdeling + drachtstal) en één stal met vleesvarkens in voor- en afmestafdelingen. Eén

week voor het werpen worden de acht zeugen van de drachtstal overgebracht naar de

kraamafdeling, waar ze gewassen worden. Na het werpen verblijven ze in de kraamhokken tot

het spenen, waarna de zeugen verplaatst worden naar de dekafdeling. De biggen blijven in de

kraamstal die op dat moment de biggenbatterij wordt. Ongeveer 10 weken na het werpen

worden de biggen verplaatst naar de voormestafdeling achteraan in de andere stal. Eens ze

circa 40 kg wegen, worden de varkens verhuisd naar de afmestafdeling vooraan in de stal. Na

Figuur 13:Voorstelling van de cyclus van de zeug en het effect

van de cyclus op het één wekensysteem.

MATERIAAL EN METHODEN

30

een zestal maanden bereiken de varkens een gewicht van ongeveer 120 kg en worden ze

afgevoerd naar het slachthuis.

Naast varkens bezit dit bedrijf ongeveer 50.000 braadkippen, die gehuisvest zijn in twee

stallen. Hierin worden de kippen vetgemest tot een leeftijd van zes weken, waarna ze geslacht

worden.

1.2. Beschrijving staalname

Om het moment van MRSA kolonisatie na te gaan, worden de biggen vanaf het werpen

bemonsterd op verschillende tijdstippen (Tabel 8). Tevens worden de zeugen bemonsterd om

na te gaan of hun biggen hetzelfde MRSA type dragen. Van de biggen en de zeugen worden

neusswabs afgenomen aangezien dit een op Europees niveau gestandaardiseerde methode is

(EFSA, 2007). Bovendien is de neus de enige plaats in het lichaam waar er een natuurlijke

spoeling optreedt. Aanwezigheid van MRSA in de neus wijst dus op kolonisatie van de

bacterie en in mindere mate op contaminatie door stof of door de omgeving. Stalen genomen

op andere plaatsen (bijvoorbeeld de huid of het perineum), die in contact zijn met stof en de

omgeving, kunnen door dit contact gecontamineerd zijn met MRSA.

Swabs worden genomen door middel van wattenstaafje, die zich bevinden in een tube met

Mueller-Hinton Broth medium (Oxoid ltd., CM0405, Hampshire, Engeland) aangerijkt met

6,5% NaCl (MHB + 6,5% NaCl). Door de aanwezigheid van het zout gebeurt reeds een eerste

selectie voor MRSA, daar MRSA halofiel is en makkelijker in dit medium zal groeien dan

andere omgevingsbacteriën.

Tabel 8: Overzicht van de staalnames.

STAL TIJDSTIP/LEEFTIJD DIER SOORT STAAL

Kraamstal Voor wassen Zeug Neusswab/Envirospons

Na wassen Zeug Neusswab/Envirospons

3 dagen na werpen Zeug + Big Neusswab

7 dagen na werpen Zeug + Big Neusswab

3 weken na werpen (voor spenen) Zeug + big Neusswab

Biggenbatterij 4 weken na werpen (na spenen) Big Neusswab

5 weken na werpen Big Neusswab

6 weken na werpen Big Neusswab

7 weken na werpen Big Neusswab

8 weken na werpen Big Neusswab

9 weken na werpen Big Neusswab

10 weken na werpen Big Neusswab

Voormest 11 weken na werpen Varken Neusswab

Voor en na het wassen van de zeugen wordt er naast een neusswab ook een huidstaal

afgenomen. Dit gebeurt door middel van een Envirospons (Biotrace International, Bridgend,

Verenigd Koninkrijk), die vooraf bevochtigd werd met 7 ml MHB + 6,5% NaCl om de

opname van bacteriën door de spons te bevorderen.

Om contaminatie uit de omgeving na te gaan worden er stalen van de wand, de vloer en de

lucht genomen in de verschillende stallen. Op die manier kan men ook nagaan of het MRSA

type overeenstemt met de types gevonden in de varkensstalen.

MATERIAAL EN METHODEN

31

De vloer- en wandstalen worden afgenomen met behulp van een Envirosponge en een metalen

rooster. Hierbij wordt er 10 cm² van de vloer en van de wand ter hoogte van de varkens in de

stal afgeveegd.

Per stal worden twee luchtstalen genomen, één van de lucht ter hoogte van het staand varken

en één van de lucht die de stallen verlaat. Luchtstalen worden afgenomen door middel van een

luchtbemonsteringstoestel (Biotest, Hessen, Duitsland), waarin een luchtstrip gebracht wordt.

De luchtstrip wordt vooraf gevuld met Oxacylin Resistance Screening Agar Base (ORSAB)

medium (Oxoid ltd., CM1008, Hampshire, Engeland) dat een supplement bevat dat selectie

geeft voor MRSA (zie Materiaal en methoden paragraaf 1.3). Per staal wordt er gedurende 2

min lucht aangezogen op de luchtstrip, wat overeenkomt met 100 l lucht.

1.3. Verwerking staalname

Na transport naar het labo worden de sponsjes overgebracht in een stomacherzakje en

gewogen. Per gram spons wordt vervolgens 10 g MHB + 6,5% NaCl toegevoegd. Na mengen

wordt per staal een verdunningsreeks aangelegd van 1 g/ml, 0.1 g/ml en 0.01 g/ml in een

falcontube. Deze verdunningsreeks niet gebruikt als semi-kwantificatie maar om zeker te zijn

dat MRSA in de minder verdunde oplossingen niet gemist wordt door aanwezigheid van

andere bacteriën. Samen met de stomacherzakjes met sponsjes en de verdunningsreeks

worden de neusswabs en luchtstrips geïncubeerd bij 37°C gedurende 18 tot 20u.

Van elk staal wordt er na incubatie 1 µl met een entoog uitgeënt op MRSA-ID platen

(bioMérieux, La Balma et Craponne, Frankrijk). Deze platen bevatten een chromogeen

medium dat bij aanwezigheid van MRSA een groene kleur vertoont, wat resulteert in groene

kolonies. Atypische bacteriën kunnen onderscheiden worden door een andere kolonievorm of

–kleur. Het ORSAB medium in de luchtstrips is tevens een chromogeen medium dat blauwe

kolonies geeft. Per luchtstrip worden vier blauwe kolonies opgepikt en uitgeplaat op MRSA-

ID platen.

Alle MRSA-ID platen worden 18 tot 20u geïncubeerd bij 37°C. Na aflezen wordt er per

verdacht staal één kolonie opgepikt en uitgezuiverd op MRSA-ID platen voor verdere

verwerking.

2. VERWERKING VERDACHTE KOLONIES

2.1. DNA extractie

Voor de DNA extractie wordt één verdachte kolonie van de uitzuiveringsplaten overgezet op

Tryptic Soy Agar (TSA) medium (Oxoid ltd., CM0131, Hampshire, Engeland), een universele

bodem. Na 18 tot 20u incubatie bij 37°C wordt één kolonie geresuspendeerd in 45 µl

gedestilleerd water waaraan 5 µl lysostaphine (1 mM) toegevoegd werd. Vervolgens wordt

deze suspensie gedurende 10 min geïncubeerd bij 37°C. Nadien voegt men 5 µl proteïnase K

(2.5 mM) en 150 µl Tris-HCl (0.1 mM) toe. Na incubatie gedurende 10 min bij 60°C wordt

het lysaat 5 min bij 100°C geïncubeerd. Het lysaat wordt vervolgens ingevroren en kan tot één

maand bewaard worden. (Volledig protocol: zie bijlage3)

2.2. Triplex PCR

Om na te gaan of een verdachte kolonie een MRSA isolaat is, wordt er op het lysaat een

triplex PCR uitgevoerd. Bij deze PCR wordt gebruik gemaakt van drie primersets (Tabel 9),

waardoor er detectie gebeurt van drie genen, namelijk het 16S rRNA gen dat specifiek is voor

MATERIAAL EN METHODEN

32

het genus Staphylococcus, het nuc gen dat codeert voor een S. aureus specifiek nuclease en

het mecA gen dat verantwoordelijk is voor de methicillineresistentie.

Tabel 9: Overzicht van de verschillende genen onderzocht in de triplex PCR, de grootte van het

geamplificeerde fragment en de gebruikte primers met hun sequentie.

De PCR mix bevat 2.5 µl 10x PCR buffer, 2 µl MgCl2 (25 mM), 0.25 µl dNTP mix (10 mM),

0.2 µl Goldstar polymerase (5 U/µl), 9.05 µl steriel HPLC water, 1 µl van de mecA primers

en 1.5 µl van de nuc en 16S rRNA primers. Aan deze mix wordt dan 3 µl lysaat toegevoegd.

De gebruikte thermocyclus bestaat uit een initiële denaturatie van 10 min bij 94°C gevolgd

door 30 cycli met 1 min denaturatie bij 94°C, 1 min annealing bij 55°C en 2 min extensie bij

72°C. Tot slot is er een finale extensie van 5 min bij 72°C.

Na PCR wordt 8 µl PCR product gemengd met 2 µl Loading Dye en aangebracht op een 1,5%

Seakem LE agarose gel. Per gel wordt ook één laan geladen met een 1 Kb ladder. Vervolgens

wordt de elektroforese gelopen gedurende 30 min bij 100 V. De bekomen banden op de gel

worden gevisualiseerd met EtBr (25 ml in 250 ml demi water). (Volledig protocol: zie

bijlage 3)

3. SCREENING VAN DE ISOLATEN

3.1. Multi locus variable number tandem repeat analyse

De screening wordt uitgevoerd door middel van MLVA, waarbij er vier genen, namelijk

SIRU21, ClfA, ClfB en sdrCDE geamplificeerd worden in twee PCR mixen (Tabel 10).

De eerste PCR mix bevat 2.5 µl 10x PCR buffer, 1.3 µl MgCl2 (25 mM), 2.5 µl dNTP mix (10

mM), 0.5 µl Taq polymerase (5 U/µl), 14.16 µl steriel HPLC water, 0.12 µl van de SIRU21

primers, 0.18 µl van de ClfA primers en 0.22 µl van de ClfB primers.

De tweede PCR mix bevat dezelfde volumes voor de 10x PCR buffer, MgCl2 (25 mM), dNTP

mix (10mM) en Taq polymerase (5U/µl) maar 14.96 µl steriel HPLC water en 0.22 µl van de

sdrCDE primers. Tot slot wordt aan elke mix nog 3 µl lysaat toegevoegd.

De gebruikte thermocyclus is voor beide PCR reacties dezelfde en bestaat uit een initiële

denaturatie van 5 min bij 94°C gevolgd door 25 cycli met 30 sec denaturatie bij 94°C, 30 sec

annealing bij 55°C en 1 min extensie bij 72°C. Vervolgens is er een finale extensie van 5 min

bij 72°C.

Nadien worden de reactiemixen samengevoegd en geanalyseerd op een 3130xl Genetic

analyzer van Applied Biosystems, gelokaliseerd op de site Plant 21 van het ILVO. De

resultaten worden verwerkt met behulp van BioNumerics version 5.10 (Applied Maths, Sint-

Martens-Latem, België). De bandenpatronen worden gegenereerd en vervolgens wordt een

GEN GROOTTE PRIMER SEQUENTIE

mecA 533 bp Mec A F 5'-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3'

Mec A R 5'-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3'

nuc 279 bp Nuc F 5'-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'

Nuc R 5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3'

16S rRNA staph 750 bp 16S rRNA F staph 5'-GTTATTAGGGAAGAACATATGTG-3'

16S rRNA R staph 5'-CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC-3'

MATERIAAL EN METHODEN

33

clustering uitgevoerd door middel van UPGMA clusteringsmethode met Dice vergelijking.

(Volledig protocol: zie bijlage 4)

Tabel 10: Overzicht van de verschillende genen die geamplificeerd worden door middel van

MLVA, de grootte van het geamplificeerde fragment en de gebruikte primers met hun

sequentie.

4. TYPERING VAN DE ISOLATEN

4.1. Multi locus sequentie typering

De geselecteerde stammen werden opgestuurd naar het CODA waar de MLST werd

uitgevoerd.

4.2. spa typering

Zoals bij MLST, werden de geselecteerde stammen opgestuurd naar het CODA waar de spa

typering werd uitgevoerd.

4.3. SCCmec typering

Voor SCCmec typering worden drie PCR’s uitgevoerd. Voor de drie PCR mixen wordt er

gebruik gemaakt van een 25 µM primer concentratie. Een overzicht van de primers, die

gebruikt worden in de drie PCR reacties, wordt gegeven in bijlage 5.

De eerste PCR mix bevat 25 µl Taq PCR MasterMix Kit (1000 units) (Qiagen, Venlo,

Nederland) en 4 µl HPLC water. Van primers Rif4 F3 en Rif4 R9 wordt 0.4 µl toegevoegd.

Het volume van primers Cif2 F2, Cif2 R2, MecA P4, MecA P7, IS431 P4, pUB110 R1, KDP

F1, KDP R1, Dcs F2, Dcs R1, R1F5 F10, R1F5 R13 en pT181 R1 is 0.8 µl. Tot slot wordt er

1.6 µl van de IS431 P4, Meci P2 en Meci P3 primers toegevoegd.

De tweede PCR mix bevat 25 µl Taq PCR MasterMix Kit (1000 units) (Qiagen, Venlo,

Nederland) en 6.3 µl HPLC water. Van primers IVa F, IVa R, IVb F en IVb R wordt 0.4 µl en

van primers ccrB2 F, IVc F en IVc R is 0.8 µl toegevoegd. Een volume van 1.6 µl van de

ccrB2 R, IVd F en IVd R primers wordt toegevoegd, naast een volume van 1.8 µl van de IVg

F, IVg R, IVh F en IVh R primers.

PCR mix drie bevat 25 µl Taq PCR MasterMix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland),

10.4 µl HPLC water en 2 µl van de IVb F en IVb R primers. Daarnaast wordt er van de IVc F

en IVc R primers 1.6 µl en van de V F en V R primers 1.2 µl toegevoegd.

Tot slot wordt 5 µl lysaat aan elke mix toegevoegd.

GEN GROOTTE PRIMER SEQUENTIE

clfA 800-1000 bp clfA F 5'-GATTCTGACCCAGGTTCAGA-3'

clfA R 5'-CTGTATCTGGTAATGGTTCTTT-3'

clfB 1000-1100 bp clfB F 5'-ATGGTGATTCAGCAGTAAATCC-3'

clfB R 5'-CATTATTTGGTGGTGTAACTCTT-3'

SIRU 21 200-300 bp SIRU21 F 5'-AGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3'

SIRU21 R 5'-GCTCAAGCACCAAAAGAGGA-3'

sdrCDE 100-200 bp en 800 bp sdrCDE2 F 5'-TTACGGATCATGATGATTTCA-3'

sdrCDE2 R 5'-CAYTACCTGTTTCTGGTAATGCTT-3'

MATERIAAL EN METHODEN

34

De drie PCR reacties doorlopen dezelfde thermocyclus. Deze bestaat uit een initiële

denaturatie van 4 min bij 94°C gevolgd door 35 cycli met 30 sec denaturatie bij 94°C, 30 sec

annealing bij 53°C en 1 min extensie bij 72°C. Er is een finale extensie van 4 min bij 72°C.

Na PCR wordt 8 µl PCR product gemengd met 2 µl Loading Dye en aangebracht op een 1,5%

Seakem LE agarose gel. Per gel wordt ook één laan geladen met een 100 bp ladder

(Invitrogen, Merelbeke, België). Vervolgens wordt de elektroforese gelopen gedurende

45 min bij 100 V. Na visualisatie van de banden met EtBr (25 ml EtBr in 250 ml demi water)

wordt de combinatie van de drie bandenpatronen per staal bekeken om na te gaan welk

SCCmec type aanwezig is (Volledig protocol: zie bijlage 5).

4.4. Pulsed Field Gel Elektroforese

Met de hieronder beschreven methode worden 10 stalen verwerkt. Op dag één worden de

stammen geïnoculeerd op TSA platen en overnacht geïncubeerd bij 37°C.

Op dag twee worden kolonies met behulp van een entnaald van de TSA plaat afgeschraapt en

geresuspendeerd in EET buffer (100mM EDTA, 10 mM EGTA, 10mM Tris HCl, pH 8). De

OD610 nm van deze suspensie wordt gemeten, waarbij de buffer als blanco gebruikt wordt. De

concentratie wordt vervolgens aangepast tot een OD610 nm van 0.9 in EET buffer. Deze

verdunning wordt vervolgens gecentrifugeerd bij 4°C gedurende 15 min aan 4000 rpm. Het

supernatans wordt verwijderd en het pellet geresuspendeerd in 1 ml EET buffer. Tweehonderd

µl van deze bacteriële suspensie wordt gemengd met 200 µl 2% InCert agarose, waarvan

ongeveer 300 µl in de plughouder gepipeteerd wordt. Intussen wordt de lysebuffer gemaakt

bestaande uit 8.5 ml EET buffer, 0.5 ml lysostaphine (1mg/ml) en 1 ml lysozyme (10 mg/ml)

en verdeeld over kleine falcontubes, waarin de plugs worden gebracht eens ze gestold zijn. Na

incubatie van 4u bij 37°C worden de plugs overgebracht in de deproteïnatie buffer, die bestaat

uit 17 ml EET Buffer, 2 ml proteinase K oplossing (10 mg/ml) en 1 ml SDS (20%).

Vervolgens wordt er overnacht geïncubeerd bij 50°C.

Op de derde dag wordt de deproteïnatie buffer verwijderd en ondergaan de plugs zeven

wasstappen, waar de TE buffer (10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) telkens na 30 min

schudden bij 37°C ververst wordt. Vervolgens wordt de restrictie van de plugs uitgevoerd.

Hiervoor wordt aan 100 µl restrictie buffer 30 U BstZI toegevoegd. In dit mengsel worden de

agarose plugs overnacht geïncubeerd bij de 50°C, optimale temperatuur van BstZI.

Salmonella Braenderup kolonies worden opgegroeid en verwerkt tot plugs (zie bijlage 7) om

te gebruiken als merker. Deze plugs worden behandeld met het restrictie-enzym XbaI, dat het

genoom van de S. Braenderup gaat knippen in fragmenten met een gekende lengte.

De volgende dag wordt 2 L 0,5X TBE buffer gemaakt, die gekoeld wordt in de ChefMapper

bij 14°C. Honderdzestig ml van deze buffer wordt gemengd met 1% Seakem Gold agarose.

Na het gieten van 150 ml gel en aanbrengen van de plugs in de slotjes, worden de slotjes

afgesloten met de overige 10 ml agarose.

Vervolgens wordt de elektroforese gestart. Deze loopt gedurende 20 u 18 min bij 14°C met

een initiële pulstijd van 0.46 sec, een finale pulstijd van 35.38 sec en een voltage van

6.0 V/cm.

Na afloop wordt de gel 30 min gekleurd in een EtBr oplossing (80 µl EtBr + 400 µl demi

water). Vervolgens wordt de gel gedurende 30 min ontkleurd in demi water. Verwerking van

de gel gebeurt via BioNumerics version 5.10 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België),

MATERIAAL EN METHODEN

35

waarin een clustering gemaakt wordt door middel van UPGMA met Dice vergelijking.

(Volledig protocol: zie bijlage 6)

4.5. Antibiogrammen

De resistentie van de geselecteerde MRSA stammen tegen 16 verschillende antibiotica

(Tabel 11) wordt bepaald. Op dag één worden de stammen geïnoculeerd op TSA medium. De

volgende dag worden enkele kolonies gesuspendeerd in een steriele 0,9% NaCl oplossing tot

een suspensie van 0,5 McFarland bereikt wordt. Binnen 15 min wordt met behulp van een

steriel wattenstaafje een massieve uitstrijk gemaakt op een Mueller-Hinton II agar plaat. De

plaat wordt vervolgens kort gedroogd. Sensitabs (Rosco Diagnostica, Taastrup, Denemarken)

worden op de plaat aangebracht met behulp van een dispenser volgens het patroon

weergegeven in bijlage 8. Na 24u incubatie bij 37°C wordt de diameter van de inhibitiezone

rond de sensitabs gemeten.

Tabel 11: Overzicht van de neosensitabs die gebruikt worden in de antibiogrammen met de

waarden van de inhibitiezones, die de sensitiviteit en resistentie aangeven. De waarden worden

weergegeven in mm.

ANTIBIOTICUM SENSITIEF INTERMEDIAIR RESISTENT

Quinupristine/dalfopristine 15µg ≥ 19 18-16 ≤ 15

Trimethoprim 5,2µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

Gentamicine 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

Tobramycine 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

Kanamycine 100µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

Erythromycine 78µg ≥ 26 25-19 ≤ 18

Ciprofloxacine 10µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

Tetracycline 80µg ≥ 22 21-19 ≤ 18

Rifampicine 30 µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

Mupirocine 10µg ≥ 14 - ≤ 13

Chloramphenicol 60µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

Linezolid 30µg ≥ 21 - ≤ 20

Fucidine 100µg ≥ 28 27-24 ≤ 23

Sulphonamide 240µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

Lincomycine 19µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

Tylosine 150µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

REFERENTIES

36

VI. REFERENTIES

Amagai M, Matsuyoshi N, Wang ZH, Andl C, Stanley JR (2000) Toxin in bullous impetigo and staphylococcal scalded-skin syndrome targets desmoglein 1. Nat Med 6: 1275-1277 Baba T, Takeuchi F, Kuroda M, Yuzawa H, Aoki K, Oguchi A, Nagai Y, Iwama N, Asano K, Naimi T, Kuroda H, Cui L, Yamamoto K, Hiramatsu K (2002) Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA. Lancet 359: 1819-1827 Barber M, Rozwadowska-Dowzenko M (1948) Infection by penicillin-resistant staphylococci. Lancet 2: 641-644 Bowersox J (1999) Experimental Staph Vaccine Broadly Protective in Animal Studies. National Institute of Allergy and Infectious Diseases Brock TD, Madigan MT, Martinko JM (2006) Biology of Microorganisms, Eleventh edn. Broens EM (2009). Transmission of MRSA ST398 during transport of pigs from farm to slaughterhouse and during time spent in lairages at the slaughterhouse. Methicillin-resistant Staphylococci in animals: veterinary and public health implications; London, England. Chambers HF (2001) The changing epidemiology of Staphylococcus aureus? Emerg Infect Dis 7: 178-182 Cuny C, Friedrich A, Kozytska S, Layer F, Nubel U, Ohlsen K, Strommenger B, Walther B, Wieler L, Witte W (2010) Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in different animal species. Int J Med Microbiol 300: 109-117 Daum RS, Ito T, Hiramatsu K, Hussain F, Mongkolrattanothai K, Jamklang M, Boyle-Vavra S (2002) A novel methicillin-resistance cassette in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds. J Infect Dis 186: 1344-1347 de Boer E, Zwartkruis-Nahuis JT, Wit B, Huijsdens XW, de Neeling AJ, Bosch T, van Oosterom RA, Vila A, Heuvelink AE, Food and Consumer Product Safety Authority (VWA) AZ, The Netherlands. enne.de.boer@vwa.n (2009) Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in meat. Int J Food Microbiol 134: 52-56 de Neeling AJ, van Den Broek MJM, Spalburg E, van Santen-Verheuvel MG, dam-Deisz C, Boshuizen HC, van De Giessen AW, van Duijkeren E, Huijsdens X (2007) High prevalence of methicillin resistant Staphylococcus aureus in pigs. Veterinary mMicrobiology: 366-372 Denis O, Hallin M, deplano A, Struelens MJ, Suetens C, Vanoyen H, Ramboer I, Leens E, Quoilin S (2007) Prevalence survey of methicillin resistant Staphylococcus aureus in swine and pig farmers in Belgium compared to other human population. Verslag voor het Ministerie van volksgezondheid Deurenberg RH, Stobberingh EE (2008) The evolution of Staphylococcus aureus. Infect Genet Evol 8: 747-763 Dewaele I, De Man I, Stael A, Delputte P, Butaye P, Vlaemynck G, Heyndrickx M, Rasschaert G (2007) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) on Belgian pig farms. In Antimicrobial Resistance in Zoonotic Bacteria and Foodborne Pathogens. Tours, Frankrijk EFSA (2007) Report of the Task Force on Zoonoses Data collection on a proposal for technical specifications for a baseline survey on the prevalence of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in breeding pigs. The EFSA Journal: 1-14

REFERENTIES

37

Enright MC, Robinson DA, Randle G, Feil EJ, Grundmann H, Spratt BG (2002) The evolutionary history of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci U S A 99: 7687-7692 Etienne J (2005) Panton-Valentine leukocidin: a marker of severity for Staphylococcus aureus infection? Clin Infect Dis 41: 591-593 Grundmann H, Aires-de-Sousa M, Boyce J, Tiemersma E (2006) Emergence and resurgence of meticillin-resistant Staphylococcus aureus as a public-health threat. Lancet 368: 874-885 Guardabassi L, Stegger M, Skov R (2007) Retrospective detection of methicillin resistant and susceptible Staphylococcus aureus ST398 in Danish slaughter pigs. Vet Microbiol 122: 384-386 Hakanen AJ, Lehtopolku M, Siitonen A, Huovinen P, Kotilainen P (2003) Multidrug resistance in Campylobacter jejuni strains collected from Finnish patients during 1995-2000. J Antimicrob Chemother 52: 1035-1039 Haven KF (1994) Marvels of Science : 50 Fascinating 5-Minute Reads, Littleton, Colo. Huijsdens XW, Bosch T, van Santen-Verheuvel MG, Spalburg E, Pluister GN, van Luit M, Heck ME, Haenen A, de Neeling AJ (2009) Molecular Characterisation of Pfge Non-Typable Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus in the Netherlands, 2007. Eurosurveillance 14: 12-16 Huijsdens XW, van Dijke BJ, Spalburg E, van Santen-Verheuvel MG, Heck ME, Pluister GN, Voss A, Wannet WJ, de Neeling AJ (2006) Community-acquired MRSA and pig-farming. Ann Clin Microbiol Antimicrob 5: 26 Ito T (2009) Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrob Agents Chemother 53: 4961-4967 Ito T, Ma XX, Takeuchi F, Okuma K, Yuzawa H, Hiramatsu K (2004) Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrC. Antimicrob Agents Chemother 48: 2637-2651 Ito T, Okuma K, Ma XX, Yuzawa H, Hiramatsu K (2003) Insights on antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from its whole genome: genomic island SCC. Drug Resist Updat 6: 41-52 Jarraud S, Mougel C, Thioulouse J, Lina G, Meugnier H, Forey F, Nesme X, Etienne J, Vandenesch F (2002) Relationships between Staphylococcus aureus genetic background, virulence factors, agr groups (alleles), and human disease. Infect Immun 70: 631-641 Katayama Y, Ito T, Hiramatsu K (2000) A new class of genetic element, staphylococcus cassette chromosome mec, encodes methicillin resistance in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 44: 1549-1555 Khanna T, Friendship R, Dewey C, Weese JS (2008) Methicillin resistant Staphylococcus aureus colonization in pigs and pig farmers. Vet Microbiol 128: 298-303 Kirby WM (1944) Extraction of a Highly Potent Penicillin Inactivator from Penicillin Resistant Staphylococci. Science 99: 452-453

REFERENTIES

38

Koreen L, Ramaswamy SV, Graviss EA, Naidich S, Musser JM, Kreiswirth BN (2004) spa typing method for discriminating among Staphylococcus aureus isolates: implications for use of a single marker to detect genetic micro- and macrovariation. J Clin Microbiol 42: 792-799 Lehtopolku M, Nakari UM, Kotilainen P, Huovinen P, Siitonen A, Hakanen AJ (2010) Antimicrobial susceptibilities of multidrug-resistant Campylobacter jejuni and C. coli strains: in vitro activities of 20 antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 54: 1232-1236 Leonard FC, Markey BK (2008) Meticillin-resistant Staphylococcus aureus in animals: a review. Vet J 175: 27-36 Lindstedt BA (2005) Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria. Electrophoresis 26: 2567-2582 Lu K, Asano R, Davies J (2004) Antimicrobial resistance gene delivery in animal feeds. Emerg Infect Dis 10: 679-683 Manian FA (2003) Asymptomatic nasal carriage of mupirocin-resistant, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a pet dog associated with MRSA infection in household contacts. Clin Infect Dis 36: e26-28 Meemken D, Cuny C, Witte W, Eichler U, Staudt R, Blaha T (2008) [Occurrence of MRSA in pigs and in humans involved in pig production-preliminary results of a study in the northwest of Germany]. Dtsch Tierarztl Wochenschr 115: 132-139 Milheirico C, Oliveira DC, de Lencastre H (2007) Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 51: 3374-3377 Miller LG, Perdreau-Remington F, Rieg G, Mehdi S, Perlroth J, Bayer AS, Tang AW, Phung TO, Spellberg B (2005) Necrotizing fasciitis caused by community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Los Angeles. N Engl J Med 352: 1445-1453 MMWR (2002a) Staphylococcus aureus resistant to vancomycin. Morbidity and Mortality Weekly Report: 565-567 MMWR (2002b) Public Health Rispatsch: Vancomycin-Resistant Staphylococcus aureus. Morbidity and Mortality Weekly Report Morgan M (2008) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and animals: zoonosis or humanosis? J Antimicrob Chemother 62: 1181-1187 Mulders MN, Haenen A, Geenen PL, Poldervaart LE, Bosch T, Huijsdens X, Vesseur PC, Hengeveld PD, Dam-Deisz C, van De Giessen AW (2009). Prevalence of MRSA in dutch broiler slaughterhouses. Methicillin-resistant Staphylococci in animals: veterinary and public health implications; London, England. Oliveira DC, de Lencastre H (2002) Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 46: 2155-2161 Pomba C, Hasman H, Cavaco LM, da Fonseca JD, Aarestrup FM (2009) First description of meticillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) CC30 and CC398 from swine in Portugal. Int J Antimicrob Agents 34: 193-194 Rasschaert G, Vanderhaeghen W, Dewaele I, Janez N, Huijsdens X, Butaye P, Heyndrickx M (2009) Comparison of fingerprinting methods for typing methicillin-resistant Staphylococcus aureus sequence type 398. J Clin Microbiol 47: 3313-3322

REFERENTIES

39

Raulin O, Durand G, Gillet Y, Bes M, Lina G, Vandenesch F, Floret D, Etienne J, Laurent F (2010) Toxin profiling of Staphylococcus aureus strains involved in varicella superinfection. J Clin Microbiol Scott GM, Thomson R, Malone-Lee J, Ridgway GL (1988) Cross-infection between animals and man: possible feline transmission of Staphylococcus aureus infection in humans? J Hosp Infect 12: 29-34 Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, Smith DH, Waddington M, Dodge DE, Bost DA, Riehman M, Naidich S, Kreiswirth BN (1999) Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 37: 3556-3563 Smith TC, Male MJ, Harper AL, Moritz-Koroloev E, Kroeger JS, Diekema DJ, Herwaldt LA (2008) Isolation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) from swine in the Midwestern United States. International Conference on Emerging Infectious Diseases, Atlanta, USA abstract Struelens MJ, Deplano A, Godard C, Maes N, Serruys E (1992) Epidemiologic typing and delineation of genetic relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by macrorestriction analysis of genomic DNA by using pulsed-field gel electrophoresis. J Clin Microbiol 30: 2599-2605 Udo EE, Pearman JW, Grubb WB (1993) Genetic analysis of community isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Western Australia. J Hosp Infect 25: 97-108 Unan C, Young R (2007) MRSA in farm animals and meat, A new threat to human health, report 5 in the series 'The use and misuse of antibiotics in UK agriculture'. Soil Association van Cleef BAGL, Broens EM, Voss A, Huijsdens XW, Zuechner L, van Benthem BH, Kluytmans J, Mulders MN, van de giessen AW (2009). High prevalence of MRSA in slughterhouse workers in contact with live pigs. Methicillin-resistant Staphylococci in animals: veterinary and public health implications; London, England. van Duijkeren E, Ikawaty R, Broekhuizen-Stins MJ, Jansen MD, Spalburg EC, de Neeling AJ, Allaart JG, van Nes A, Wagenaar JA, Fluit AC (2008) Transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains between different kinds of pig farms. Veterinary Microbiology 126: 383-389 van Loo I, Huijsdens X, Tiemersma E, de Neeling A, van de Sande-Bruinsma N, Beaujean D, Voss A, Kluytmans J (2007) Emergence of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus of Animal Origin in Humans. Emerging Infectious Diseases 13: 1834 -1839 van Loo I, Tiemersma E, de Neeling H, Huijsdens X, Van den Broek M, van der Giessen A, Beaujean D, Voss A, Kluytmans J (2006). Emergence of a methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clone from animal origin in the human population. 12th International Symposium on Staphylococci and Staphylococcal Infections; Maastricht, Nederland. Verhegghe M, Pletinckx LJ, Vandersmissen T, Arijs D, Haesebrouck F, Butaye P, Heyndrickx M, Rasschaert G (2009). Prevalence of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ST398 on Belgian pig farms and pig farms with other livestock. Methicillin-resistant Staphylococci in animal: veterinary and public health implications; London, England. Voss A, Loeffen F, Bakker J, Klaassen C, Wulf M (2005) Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in pig farming. Emerg Infect Dis 11: 1965-1966

REFERENTIES

40

Voyich JM, Otto M, Barun Mathema KRB, Adeline R. Whitney, Diane Welty, R. Daniel Long, David W. Dorward, Donald J. Gardner, Gérard Lina, Barry N. Kreiswirth, and Frank R. DeLeo (2006) Is Panton-Valentine leukocidin the major virulence determinant in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus disease? The Journal of Infectious Diseases 194: 1761–1770 Willems G, Dispas M, Hallin M, Denis O, Seutens C, Gordts B, Struelens MJ, Butaye P (niet gepubliceerde data) Prevalance, epidemiology and genetic characteristics of methicillin-resistant Staphylococcus aureus among pigs belonging to different age groups and different types of farm management systems in Belgium. Witte W (2004) Glycopeptide resistant Staphylococcus. J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health 51: 370-373 Wu SW, de Lencastre H, Tomasz A (2001) Recruitment of the mecA gene homologue of Staphylococcus sciuri into a resistance determinant and expression of the resistant phenotype in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 183: 2417-2424 Zhang K, McClure JA, Elsayed S, Louie T, Conly JM (2005) Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 43: 5026-5033

BIJLAGEN

i

BIJLAGEN

BIJLAGEN

ii

1. BANDENPATRONEN SCCMEC TYPERING OP GESELECTEERDE STALEN

GEL 1: GEL 2:

Primerset 1: Primerset 1:

Primerset 2: Primerset 2:

Primerset 3: Primerset 3:

BIJLAGEN

iii

GEL 3:

Primerset 1: Primerset 2: Primerset 3:

Geloverzicht:

GEL 1

100 bp 1481 1874 1984 2839 3056 1482 1875 1985

2840 3057 1551 1943 2045 2898 3181 1733 1958

2057 2910 2626 1480 1873 1546

GEL 2

100 bp 1939 1725 1948 2612 2624 2659 2677 2614

3193 2663 2678 2619 2631 2674 2690 1556 1959

2066 2949 3169 1567 1971 2078

GEL 3

100 bp 2961 3330 1870 1975 1979 2082 2965 3336

MV26 MV172 NEG

BIJLAGEN

iv

2. AFLEESRESULTATEN VAN DE ANTIBIOGRAMMEN

Stam CLR CIP ERYTR FUCID GEN KANAM LINCO LINEZ MUPIR SYN RIFAM SULFA TET TOBRA TRIME TYLOS

1481 31 0 32 35 28 30 34 30 29 24 36 29 0 28 0 28

1874 35 0 33 35 28 30 30 28 26 23 35 31 12 31 0 27

1984 33 0 33 35 28 30 32 30 26 23 34 27 0 30 0 27

2839 35 0 33 37 28 28 30 29 25 24 37 26 12 29 0 27

3056 31 0 33 35 29 30 32 28 25 24 36 26 12 30 0 28

1482 31 0 32 40 26 29 29 26 25 23 35 27 0 26 0 27

1875 35 0 35 35 31 34 35 32 28 26 37 27 12 32 0 32

1985 32 0 34 35 30 31 35 30 28 24 37 27 11 32 0 28

2840 32 0 33 33 28 30 30 30 26 24 37 25 12 28 0 30

3057 32 0 30 35 27 30 30 29 26 26 37 30 11 28 0 27

1551 31 0 30 32 27 30 30 28 28 23 35 28 11 28 0 26

1943 33 0 30 34 29 28 30 30 27 24 36 30 12 28 0 26

2045 32 0 32 32 30 31 30 27 26 25 37 27 0 30 0 28

2898 32 0 32 34 28 31 32 30 27 24 38 26 0 31 0 29

3181 32 0 34 36 31 31 30 32 27 21 40 26 13 32 0 32

1733 31 0 30 34 27 27 30 27 30 26 35 26 11 28 0 28

1958 32 0 31 36 29 29 30 30 26 27 36 26 11 30 0 29

2057 31 0 32 34 30 29 34 36 27 26 38 27 12 30 0 33

2910 32 0 36 38 30 31 36 34 30 26 38 28 13 34 0 30

3193 31 0 32 36 29 30 32 29 28 27 37 25 12 32 0 30

1480 30 0 30 30 27 30 30 28 28 27 35 30 11 28 0 26

1873 32 0 33 35 29 29 30 30 25 25 37 28 11 29 0 28

1546 33 0 31 38 29 31 30 30 27 25 37 30 11 29 0 28

1939 33 0 32 35 29 31 30 30 28 24 39 32 11 30 0 28

1725 33 0 32 36 30 30 32 32 27 26 38 28 11 30 0 29

1948 31 0 33 38 27 29 31 30 26 25 37 26 12 29 0 28

2612 30 0 31 34 29 29 32 28 27 25 36 27 11 29 0 27

BIJLAGEN

v

2624 31 0 32 36 30 31 31 28 26 25 37 28 0 30 0 27

2659 32 11 30 36 30 31 32 28 28 25 40 30 11 30 0 28

2677 29 0 32 40 27 30 30 26 28 26 36 26 0 28 0 28

2614 32 0 27 33 28 29 30 29 26 25 37 29 11 28 0 28

2626 34 12 33 35 31 33 33 32 28 25 38 26 12 32 0 30

2663 34 0 34 32 30 31 28 30 27 27 40 27 12 31 0 28

2678 28 0 30 35 28 30 29 30 26 25 36 29 11 29 0 29

2619 31 0 32 35 29 31 30 28 29 25 36 30 0 30 0 29

2631 35 30 36 30 30 32 24 31 21 21 40 33 18 32 0 32

2674 31 0 36 34 29 30 18 32 27 20 38 30 11 29 0 32

2690 33 0 35 34 31 31 32 36 29 27 40 29 11 31 0 30

1556 33 0 33 30 29 29 32 30 26 22 38 28 0 27 0 29

1959 30 0 32 34 30 31 32 28 25 25 36 24 12 29 0 28

2066 30 0 30 40 28 30 30 30 27 25 35 30 0 30 0 30

2949 30 0 25 30 27 28 30 30 27 36 35 25 0 30 0 30

3169 25 0 30 30 25 30 30 30 25 25 35 25 0 30 0 30

1567 30 0 30 35 30 30 27 30 25 25 35 30 0 30 0 30

1971 36 0 30 30 30 30 30 34 30 25 40 30 0 30 0 30

2078 30 0 30 40 30 30 30 34 30 25 40 30 0 30 0 30

2961 30 0 30 30 28 30 30 30 30 25 40 25 10 30 0 30

3330 30 0 34 34 30 28 18 30 28 21 35 25 10 30 0 30

1570 30 0 34 40 30 32 30 30 25 26 40 30 0 30 0 30

1975 30 0 30 40 30 32 26 30 30 25 40 26 0 30 0 28

1979 40 0 32 35 30 30 18 30 30 20 44 30 0 30 0 30

2082 36 0 31 34 30 30 31 30 26 25 40 28 0 30 0 24

2965 30 0 30 30 30 30 30 30 30 26 40 25 0 30 0 30 3336 40 25 0 34 34 30 0 34 0 17 50 29 18 25 0 0

BIJLAGEN

vi

Legende bij de afleesresultaten van de antibiogrammen:

Sensitief

Intermediair Resistent

CLR Chloramphenicol

CIP Cirprofloxacine

ERYTR Erythromycine

FUCID Fucidine

GEN Gentamicine

KANAM Kanamycine

LINCO Lincomycine

LINEZ Linezolid

MUPIR Mupirocine

SYN Quinupristine/dalfopristine

RIFAM Rifampicine

SULFA Sulphonamide

TET Tetracycline

TOBRA Tobramycine

TRIME Trimethoprim

TYLOS Tylosine

BIJLAGEN

vii

3. DNA EXTRACTIE EN TRIPLEX PCR MECA/ NUC/ 16S RRNA

Maes N. et al, Evaluation of a triplex PCR assay to discriminate Staphylococcus aureus from

coagulase-negative staphylococci and determine methicillin resistance from blood cultures,

Journal of Clinical Microbiology (2002); 40 (4) p 1514-1517.

DNA extractie

Oplossingen:

- Lysostaphine (Sigma; cat.nr L7386): 1 mg/ml

- Proteïnase K: 2,5 mg/ml in gedestilleerd water

- 0,1 M Tris-HCl (pH 8)

Werkwijze:

- Resuspendeer een kolonie in 45 µl gedestilleerd water +

5 µl lysostaphine (werk op ijs)

- Incubeer 10 min bij 37°C

- + 5 µl proteïnase K + 150 µl Tris-HCl

- Incubeer 10 min bij 60°C

- Incubeer 5 min bij 100°C

- Invriezen (max 1 maand houdbaar)

Primer sequenties

MecA 1 5’- AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC –3’

MecA 2 5’- AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC –3’

Nuc 1 5’- GCGATTGATGGTGATACGGTT –3’

Nuc 2 5’- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC –3’

16S rRNA 1 staph 5’- GTTATTAGGGAAGAACATATGTG –3’

16S rRNA 2 staph 5’- CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC –3’

PCR mix (25 µl)

* 10x PCR buffer 2,5 µl

* mecA1 (10 µM) 1 µl

* mecA2 (10 µM) 1 µl

* nuc1 (10 µM) 1 µl

* nuc2 (10 µM) 1 µl

* 16S rRNA1 staph (10 µM) 1,5 µl

* 16S rRNA2 staph (10 µM) 1,5 µl

* dNTP mix (10 mM) 0,25 µl

* MgCl2 (25 mM) 2 µl

BIJLAGEN

viii

* Goldstar polymerase (5u/µl) 0,2 µl

* HPLC water 10,05 µl

* lysaat 3 µl

PCR programma

10 min 94°C 1x

1 min 94°C

1 min 51°C 30x

2 min 72°C

5 min 72°C 1x

15°C ∞

Analyse van de resultaten

1,5% Seakem LE agarose gel

Analyse van de resultaten

MRSA MSSA

nuc (279 bp) + +

mecA (533 bp) + -

16S rRNA staph (750 bp) + +

BIJLAGEN

ix

4. MLVA

Dit protocol wordt uitgevoerd op lysaten. Aan elke mix wordt er 3 µl lysaat toegevoegd.

(Indien er veel stalen zijn, wordt er gebruik gemaakt van PCR platen ipv epjes)

MIX 1 MIX 2

Voor 1 staal (µl) Voor 1 staal (µl)

10x PCR buffer 2.5 10x PCR buffer 2.5

MgCl2 (25mM) 1.3 MgCl2 (25mM) 1.3

dNTP mix (10mM) 2.5 dNTP mix (10mM) 2.5

Taq polymerase (5u/µl) 0.5 Taq polymerase (5u/µl) 0.5

HPLC water 14.16 HPLC water 14.96

SIRU21 F (10µM) 0.12 sdrCDE F (10µM) 0.22

SIRU21 R (10µM) 0.12 sdrCDE R (10µM) 0.22

ClfA F (10µM) 0.18

ClfA R (10µM) 0.18 Totaal: 22µl

ClfB F (10µM) 0.22

ClfB R (10µM) 0.22

Totaal: 22µl

PCR reactie: MLVA-MRSA

Hold 94°C 5:00

Cycle 94°C 00:30

58°C 00:30

72°c 1:00

For 25 cycles

Hold 72°C 5:00

Hold 15°C

Na de PCR reactie worden beide mixen met elkaar gemengd en opgestuurd naar Plant 21 voor

fragmentanalyse.

Primers:

clfA F-MV forward GATTCTGACCCAGGTTCAGA 6-FAM label op 5’

clfA R-MV reverse CTGTATCTGGTAATGGTTCTTT

clfB F-MV forward ATGGTGATTCAGCAGTAAATCC 6-FAM label op 5’

clfB R-MV reverse CATTATTTGGTGGTGTAACTCTT

SIRU21 F-MV forward AGCAGTAGTGCCGTTTGCTT 6-FAM label op 5’

SIRU21 R-MV reverse GCTCAAGCACCAAAAGAGGA

sdrCDE2 F-MV forward TTACGGATCATGATGATTTCA 6-FAM label op 5’

sdrCDE2 R-MV reverse CAYTACCTGTTTCTGGTAATGCTT

BIJLAGEN

x

5. SCCMEC TYPERING

Mix for PCR:

Onderscheid tussen types I, Ia, II, III, IIIa, IIIb en IV

25 µl Taq PCR Master Mix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland)

4 µl HPLC water

0.4 µl van de Rif4 F3 (25 µM) en Rif4 R9 (25 µM) primers

0.8 µl van de Cif2 F2 (25 µM), Cif2 R2 (25 µM), MecA P4 (25 µM), MecA P7 (25

µM), IS431 P4 (25 µM), pUB110 R1 (25 µM), KDP F1 (25 µM), KDP R1 (25 µM),

Dcs F2 (25 µM), Dcs R1 (25 µM), R1F5 F10 (25 µM), R1F5 R13 (25 µM) en pT181

R1 (25 µM) primers

1.6 µl van de IS431 P4 (25 µM), Meci P2 (25 µM) en Meci P3 (25 µM) primers

5 µl DNA

(Oliveira & de Lencastre, 2002)

Onderscheid tussen types IVa – IVh

25 µl Taq PCR Master Mix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland)

6.3 µl HPLC water

0,4 µl van de IVa F (25 µM), IVa R (25 µM), IVb F (25 µM) en IVb R (25 µM)

primers

0.8 µl van de ccrB2 F (25 µM), IVc F (25 µM) en IVc R (25 µM) primers

1.6 µl van de ccrB2 R (25 µM), IVd F (25 µM) en IVd R (25 µM) primers

1.8 µl van de IVg F (25 µM), IVg R (25 µM), IVh F (25 µM) en IVh R (25 µM)

primers

5 µl DNA

(Milheirico et al, 2007)

Type V & bevestiging types IVb + IVc

25 µl Taq PCR Master Mix Kit (1000 units) (Quagen, Venlo, Nederland)

10,4 µl HPLC water

2 µl van de IVb F (25 µM) en IVb R (25 µM) primers

1.6 µl van de IVc F (25 µM) en IVc R (25 µM) primers

1.2 µl van de V F (25 µM) en V R (25 µM) primers

5 µl DNA

(Zhang et al, 2005)

PCR conditions

Denat.: 4 min → 94°C

30 s → 94°C

35 x 30 s → 53°C

1 min → 72°C

Final ext.: 4 min → 72°C

Hold: ∞ → 4°C

BIJLAGEN

xi

PRIMER SEQUENTIE PRIMER SEQUENTIE

Rif4-F3 5'-GTGATTGTTCGAGATATGTGG-3' J IVa F 5'-ATAAGAGATCGAACAGAAGC-3'

Rif4-R9 5'-CGCTTTATCTGTATCTATCGC-3' J IVa R 5'-TGAAGAAATCATGCCTATCG-3'

Cif2-F2 5'-TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG-3' J IVb F 5'-TTGCTCATTTCAGTCTTACC-3'

Cif2-R2 5'-ATTTACCACAAGGACTACCAGC-3' J IVb R 5'-TTACTTCAGCTGCATTAAGC-3'

MecA-P4 5'-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3' J IVc F 5'-CCATTGCAAATTTCTCTTCC-3'

MecA-P7 5'-CCACTTCATATCTTGTAACG-3' J IVc R 5'-ATAGATTCTACTGCAAGTCC-3'

IS431-P4 5'-CAGGTCTCTTCAGATCTACG-3' ccrB2 F 5'-CGAACGTAATAACATTGTCG-3'

pUB110-R1 5'-GAGCCATAAACACCAATAGCC-3' ccrB2 R 5'-TTGGCWATTTTACGATAGCC-3'

KDP-F1 5'-AATCATCTGCCATTGGTGATGC-3' J IVd F 5'-TCTCGACTGTTTGCAATAGG-3'

KDP-R1 5'-CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG-3' J IVd R 5'-CAATCATCTAGTTGGATACG-3'

Dcs-F2 5'-CATCCTATGATAGCTTGGTC-3' Type IVb F 5'-TCTGGAATTACTTCAGCTGC-3'

Dcs-R1 5'-CTAAATCATAGCCATGACCG-3' Type IVb R 5'-AAACAATATTGCTCTCCCTC-3'

R1F5-F10 5'-TTCTTAAGTACACGCTGAATCG-3' Type IVc F 5'-ACAATATTTGTATTATCGGAGAGC-3'

R1F5-R13 5'-GTCACAGTAATTCCATCAATGC-3' Type IVc R 5'-TTGGTATGAGGTATTGCTGG-3'

pT181-R1 5'-GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC-3' Type V F 5'-GAACATTGTTACTTAAATGAGCG-3'

Meci-P2 5'-ATCAAGACTTGCATTCAGGC-3' Type V R 5'-TGAAAGTTGTACCCTTGACACC-3'

Meci-P3 5'-GCGGTTTCAATTCACTTGTC-3'

BIJLAGEN

xii

6. PFGE STAPHYLOCOCCUS AUREUS FOR 10 PLUGS

DAY 1

Inoculate S. aureus on TSA plates and incubate at 37°C overnight (O/N).

DAY 2

Preparations

Prepare EET Buffer (100mM EDTA, 10 mM EGTA, 10mM Tris HCl, pH 8) as follows:

a. 100 ml of 0.5 M EDTA, pH 8

b. 10 ml of 0.5 M EGTA, pH 8

c. 5 ml of 1 M Tris HCl, pH 8

d. Dilute to 500 ml with sterile UP water

Prepare 2% InCert Agarose in EET Buffer for plugs as follows:

a. Weigh 100 mg of agarose and add 5 ml of EET Buffer

b. Melt agarose in tube in cup of water in microwave. Do not overheat.

Rem. Keep agarose in warm water 50°C until use. If not used all, you can reuse it 2-3 times (keep at room

temperature)

Making of plugs

Suspend bacterial colonies in 3 ml EET buffer

Measure OD610 nm (EET buffer is blanc)

Adjust concentration to OD610 nm 0.9 in 1 ml EET buffer

(for example: if OD is 3.6, then x= (1 x 0.9)/3.6= 0.5 ml of bacterial suspension to 0.5 ml EET buffer)

Centrifuge at 4°C for for 15 min at 4000 rpm

Discard supernatans and resuspend pellet in 1 ml EET buffer

Mix 200 µl of this bacterial Suspension with 200 µl InCert agarose.

Mix well and bring it in the wells of the plug holder (washed with javel and ethanol)

Allow plugs to solidify for 15 min. in fridge

Prepare Lysis Buffer (EET buffer, lysostaphine, lysozyme)

8.5 ml of EET buffer

0.5 ml of lysostaphine (stock 1mg/ml)

1 ml of lysozyme (stock 10 mg/ml)

Add to small tubes 1 ml of this lysis buffer

After solidification, bring the plugs in the tubes

Incubate for 4 hours at 37°C.

BIJLAGEN

xiii

During these hours prepare the Deproteinisation Buffer (EET Buffer, Proteinase K, SDS)

can be prepared as follows:

a. 17 ml of EET Buffer

b. 2 ml of Proteinase K solution (10 mg/ml)

c. 1 ml of SDS (20%)

Add 2 ml of the deproteinisation buffer to the bigger tubes

Transfer agarose plugs to these tubes

Incubate overnight in incubator at 50° C

Rem. Incubation time may vary between 2h to 3 days.

DAY 3

Washing of plugs

Prepare TE Buffer (10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8) as follows:

a. 5 ml of 1 M Tris HCl, pH 8

b. 1 ml of 0.5 M EDTA, pH 8

c. Dilute to 500 ml with sterile ultrapure water

Discard carefully Deproteinisation Buffer

Add 2 ml of TE Buffer and shake the tubes at 37°C in warm water bath for minimum

30 min

Pour off TE Buffer and repeat previous step six more times

The last time, add 5 ml TE Buffer to the plugs. These plugs can be stored in the fridge

DAY 3 OR OTHER DAY

Restriction digestion

Add 30 U restriction enzyme to 100 µl Restriction Buffer

Incubate in water bath overnight at appropriate temperature

Do not forget S. Braenderup as marker (XbaI)

DAY 4

Make 2 L 0.5 x TBE

Prepare 160 ml of a 1% Seakem Gold agarose gel using 0.5 x TBE. Use 150 ml to pour

the gel. Keep the other 10 ml in a warm water bath.

Prechill the rest of the TBE buffer (1840 ml) in the ChefMapper at 4°C.

Load the gel, pour the 10 ml agarose over the gel.

Start the electrophoresis:

BIJLAGEN

xiv

o Auto-algoritm

o xK low-xK high,

o calibration 1%

o 0.5 x TBE

o 14°C

o 1% PFGE agarose

o gradient 6.0V/cm

o included angle: 120°

o run time: xx

o switch time: x to x

LOW -HIGH RUN TIME SWITCH TIME

XmaI 30K-700K 18h 2.63s-63.8s

ApaI 5K-200K 16h 0.22s-17.33s

EagI (BstZI) 10K-400K 20.18h 0.46s-35.38s

SacII 10K-500K 20.18h 0.46s-44.69s

Stain 30 min in 80 ul EtBr in 400 ul water

Destain 30 min in water

BIJLAGEN

xv

7. PFGE PROTOCOL VOOR SALMONELLA

Dag 1: Opgroeien isolaten

Zuivere stammen streepenten op TSA, overnacht incuberen bij 37°C.

Dag 2: Plugs maken en lyseren

> Voorbereiding

- spectrofotometer aan

- schudbad op 54°C

- wwb op 50°C

> Maak 1% Seakem Gold: 1% SDS

- weeg 0.25g SKG af en los op in 23.5 ml TE buffer

- voldoende opkoken en in 50°C bad plaatsen

- voor gebruik 1.25 ml 20% SDS (voorverwarmd tot 55°C) toevoegen en mengen

> Celsuspensies maken

-zuiverheid stammen controleren

-label potjes met stamnummers en breng in elk 5 ml Cel Suspensie Buffer

-zeker op ijs werken zolang je OD’s meet!

-voeg voldoende cellen toe met een steriele swab en vortex goed

-meet OD’s aan 610 nm (~800 µl in cuvet)

-voeg cellen toe indien OD < 1.35 + meet opnieuw

-bereken verdunningsfactoren om OD 1.35 (tussen 1.3-1.4) te bekomen (Excel)

-500 µl celsuspensie overbrengen in 2 ml epje en verdunnen met x µl CSB volgens

berekening

> Plugs gieten

- wanneer alle celsuspensies op correcte OD: op kamertemperatuur plaatsen

- plughouder labelen

- breng 400 µl van elke celsuspensie in een gelabeld epje

- voeg 20 µl proteinase K (20 mg/ml) toe en meng met pipet

- haal 1%SKG:1%SDS uit wwb en zet in beker met warm water

- voeg 400 µl agarose-oplossing toe, (snel) opmengen met pipetpunt en overbrengen

in plughouder

- laat de plugs 5 min stollen bij 4°C of op kamertemperatuur (15 min)

> Cellyse in plugs

- mix maken: voor elk staal 5 ml Cel Lyse Buffer en 25 µl proteinase K (20 mg/ml)

(voor 20 plugs: 105 ml CLB + 525 µl prot K)

- 5 ml CLB:prot K uitverdelen per staal in 50 ml falcons

- open plughouder en breng plugs in juiste falcon

- plaats rek met falcons in schudbad (150-175 rpm) bij 54°C en incubeer 2 uur

BIJLAGEN

xvi

> Wassen plugs

- warm voldoende steriel dH2O en TE buffer op in wwb 50°C voor de wasstappen

- verlaag de temperatuur van het schudbad naar 50°C

- verwijder CLB:prot K uit de falcons door afgieten met behulp van groene filterdoppen (zo

goed

mogelijk alles verwijderen-doekje!)

2x wassen met dH2O:

- voeg 10 ml voorverwarmd dH2O toe aan elke falcon en incubeer 10 min in schudbad

- giet dH2O af en was nogmaals 10 min in schudbad met dH2O

4x wassen met TE buffer:

- giet dH2O af, voeg 10 ml steriel TE buffer toe en incubeer 10 min in schudbad

- giet TE buffer af en voeg 10 ml verse toe

- incubeer opnieuw 10 min bij 50°C in schudbad

- was de plugs op deze manier 4x

- breng de plugs over in nieuwe 15 ml falcons met 5 ml TE buffer en bewaar ze bij 4°C

Dag x: DNA restrictie in plugs

> Voorbereiding

- wwb bij 37°C klaarzetten

> Pre-restrictiestap

- label 1.5 ml epjes voor je stammen en standaarden (MB 3389 Salmonella ser. Braenderup

H9812)

- verdun voldoende 10x H buffer 1:10 met HPLC en verdeel 200 µl uit per stam

- snij een stukje van ~ 2 mm breed van elke plug met een spatel en breng over in de epjes

met 10x verdunde restrictiebuffer

- zorg dat de rest van de plug terug in de TE buffer zit!

- incubeer 10 min bij 37°C

- verwijder voorzichtig buffer met pipet

> Restrictie DNA

- verdun 10x H buffer 1:10 met HPLC en voeg XbaI enzyme toe (50 U/plug) voor alle stalen

volgens volgende tabel:

Reagentia µl/plug

HPLC 175

H buffer 20

XbaI (10 U/µl) 5

Totaal volume 200

BIJLAGEN

xvii

- voeg 200 µl toe aan elk epje met plug

- incubeer overnacht bij 37°C

Dag x+1: PFGE gels lopen

> PFGE gels gieten

- voldoende 0.5x TBE buffer maken voor gels en electroferesebakken door 10x TBE buffer

20x te

verdunnen (2 l per gel)

- maak 160 ml 1% SeaKem Gold Agarose in 0.5x TBE (1.6 g in 160 ml) en plaats in wwb bij

50°C

om af te koelen, haal er 10 ml en plaats in 50 ml buis in wwb bij 50°C (voor vullen Wells)

- giet de gel

- laat de gel minstens 30 min stollen voor het laden

- giet ondertussen 2l 0.5x TBE in de electroforesekamer en zet koeling (14°C), CHEF mapper

en

pomp aan (bij 70)

> PFGE gels laden

- laad de plugs in de wells mbv een spatel en vul ze op met het restje 1% SKG agarose en laat

5

min stollen

- haal de gel uit de gietvorm, verwijder goed alle overtollige agarose en plaats het platform

met

de gel in de electroforesekamer

> Electroforese

- CHEF mapper instellen: Auto Algorithm

30 kb – low MW

600 kb – high MW

Initial switch time 2.16 s

Final switch time 54.17 s

Run time 19 h

- start electroforese in de namiddag en loop de gel overnacht

Dag x+2: Kleuren en opname van PFGE gels

- kleur de gel 30 min in 400 ml dH2O met 40 µl ethidium bromide (mag max. 5x hergebruikt

worden)

- ontkleur de gel in 500 ml dH2O gedurende 1 uur, ververs dH2O om de 20 min

- maak een digitale foto van de gel en print af

- bewaar zeker de originele opname!

- converteer de opname ook naar een .tif file voor latere verwerking in BioNumerics (beide

formaten met dezelfde naam opslaan en datum vermelden!)

BIJLAGEN

xviii

8. ANTIBIOGRAM MRSA

Benodigdheden:

Dispenser (ref 8577502)

Neo-sensitabs

Ref Antibioticum Sensitief Intermediair Resistent

8571379 quinupristin/dalfopristin 15µg ≥ 19 18-16 ≤ 15

8571710 trimethoprim 5,2µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

8570665 gentamicin 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

8571696 tobramycin 40µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

8570797 kanamycin 100µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

8570576 erythromycin 78µg ≥ 26 25-19 ≤ 18

8570420 ciprofloxacin 10µg ≥ 20 19-17 ≤ 16

8571637 tetracyclin 80µg ≥ 22 21-19 ≤ 18

8571459 rifampicin 30 µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

8570983 mupirocin 10µg ≥ 14 - ≤ 13

8570390 chloramphenicol 60µg ≥ 25 24-21 ≤ 20

8570861 linezolid 30µg ≥ 21 - ≤ 20

8570614 fucidin 100µg ≥ 28 27-24 ≤ 23

8571556 sulphonamides 240µg ≥ 23 22-20 ≤ 19

8570843 lincomycin 19µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

8571726 tylosin 150µg ≥ 26 25-23 ≤ 22

Mueller Hinton II Agar platen

Steriele swabs

Flesjes met 5 ml 0.9% NaCl-oplossing

Methode:

Dag 1

1 MRSA kolonie (MRSA-ID) uitstrijken op TSA

Dag 2

Mueller Hinton platen eventueel laten drogen

Van TSA enkele kolonies in 0.9% NaCl opsossing suspenderen tot 0.5 McFarland

Binnen 15 min een wattenstaafje in de oplossing brengen en op de plaat strijken en de platen

minimum 3 en maximum 15 minuten laten drogen

Tabs aanbrengen met de dispenser

Overnacht incuberen bij 37°C (24u !!!)

Dag 3

Diameters meten met een lat

BIJLAGEN

xix

Locatie tabs:

! Lincomycine, erythromycine en tylosine in een driehoek naast elkaar plaatsen (synergisme)

Antibiogram 1

Antibiogram 2

Antibiogram 3

Quinu/Dalfo

Tetra

Cipro

Tobra

Kana

Genta

Trimetho

Line

Fuc

Tylo

Linco

Sulpho

Erythro

Chlor

Mupi

Rifamp