MUTAGENEZA DIRIJAT Ă

Curs 7

Genetica studiaz ă două fenomene biologice fundamentale:

- ereditatea;- variabilitatea. Varia ţiile caracterelor bacteriene pot fi grupate

în: - fenotipice;- genotipice. Varia ţiile fenotipice spre deosebire de celegenotipice nu se transmit ereditar. Fenotipul = ansamblul caracterelor observabile;Genotipul = ansamblul genelor raspunzatoare

de aparitia fenotipului.

Gregor Mendel – a sugerat pentru prima dată existenţa genelor (anii 1860) - există în mazăre un factor care trece de la „părinţi la copii”.

Nu a folosit încă termenul de genă. Mendel – primul - a lansat ipoteza distincţiei

dintre dominant şi recesiv, dintre heterozigot şi homozigot şi diferenţa dintre ceea ce mai târziu, s-a numit genotip şi fenotip.

Individ homozigot = linia pura pentru caracterul luat in considerare;

• produce o singura categorie de gameti;

Individ heterozigot = hibridul pentru caracterul luat in considerare;

• produce doua categorii de gameti.

ADN

ADN-ul unei gene codifică structura chimică a proteinelor.

Codul genetic determină secvenţa de aminoacizi care structurează proteinele.

Codificarea unei secvenţe de 3 nucleotide la un aminoacid specific este esenţială pentru toate formele de viaţă cunoscute, de la bacterii la oameni.

Acidul deoxiribonucleic (ADN) este un acid nucleic care conţine instrucţiuni genetice care specifică dezvoltarea biologică a formelor celulare ale vieţii.

Prezentarea schematic ă a ADN

• ADN …. Ereditate• ADN - responsabil de propagarea genetică a

majorităţii caracterelor. • Reproducere - ADN-ul este replicat şi transmis

copiilor. • În bacterii şi în alte celule simple, ADN-ul nu

este separat de citoplasmă prin înveliş nuclear. • În celulele complexe, prin contrast, majoritatea

ADN-ului este localizat în nucleii celulari. • Organele generatoare de energie, cloroplastele şi mitocondriile sunt purtătoare de ADN.

Gene• genele - guvernează celulele în care stau

prin intermediul proteinelor; rolul instrumental al proteinelor = suport mecanic al structurii celulare.

• genele:- controlează in organismele multicelulare

dezvoltarea individuală de la fertilizarea oului;- funcţionarea de zi cu zi a celulelor, ţesuturilor şi organelor.

În 1910, Tomas Hunt Morgan• genele există pe cromozomi specifici. • in celula umana = 23 perechi de cromozomi;• in Drosophila = 4 perechi;• in E. coli = 1pereche in forma de inel.

Mai târziu,• genele ocupă locaţii specifice pe cromozom;se începe prima hartă cromozomială la Drosophila.

În 1928, Frederick Griffith• genele pot fi transferate.

În 1941, George Wells Beadle şi Edward Lawrie Tatum:

• mutaţiile în gene cauzează erori în desfăşurarea cailor metabolice - existenţa de gene specifice codificate pentru proteine specifice.

1944, Oswald Avery, Collin Macleod şi Maclyn McCarty:

• ADN-ul deţine informaţiile genelor1953 - structura moleculară a ADN.

Evolutia geneticii

1928 -Transformarea la pneumococ (Griffith)1939 - Cinetica multiplicării bacteriofagilor

(virusurile bacteriilor). (Ellis, Delbruck)1941- Genetica reacţiilor biochimice la

Neurospora; - Variante auxotrofe la E.coli K12(Beadle,

Tatum)1943 - La bacterii există mutaţii - rezistenţa faţă

de bacteriofagi).(Luria, Delbruck)1944 - ADN purt ătorul eredit ăţii la bacterii

(Avery, MacLeod, McCarty)

1946 - Există mutaţii induse la bacteriofagi (Delbruck)

1946 - La bacterii există recombinare (între mutantele auxotrofe ale E.coli K12); fenomenul de conjugare (Lederberg, Tatum)

1950 - Lizogenie înseamnă persistenţa bacteriofagului în celula bacteriană (Lwoff)

1952 - ADN, purt ătorul eredit ăţii la bacteriofagi (Hershey, Chase)

1952 - Bacteriofagii lizogeni pot transfera gene cromozomiale – transducţie (Zindler, Lederberg)

1952 - Factorii F determină conjugarea; primele culturi Hfr.(Hayes ş.a.)

1972 - prima moleculă recombinată din ADN de la două virusuri (Berg)

1976 - determinarea secvenţei de perechi de baze a unei gene specifice (A,C,T,G).

1980 - Clonarea în E.coli a genelor pentru insulina umană şi a celor pentru interferon.

1982 - vaccin ADN recombinat pentru animale domestice; insulina umană produsă în bacterii modificate genetic, aprobată de către FDA.

1983 - ob ţinerea petuniei modificat ă genetic, demonstrându-se astfel c ă plantele modificate genetic transmit noile caractere la descenden ţii lor (culoarea).

1986 - a fost obţinut prin inginerie genetică primul vaccin uman pentru prevenirea hepatitei B

1987- aprobare pentru testarea în câmp a unor plante de cultur ă modificate genetic: soiuri de tomate şi de cartof rezistente la virusuri.

1989 - aprobare pentru testarea în câmp a bumbacului modificat genetic rezistent la atacurile insectelor (bumbacul Bt);

- debuteaz ă proiectul “Genomul Plantelor”.1990 - Porumbul Bt, drojdiile modificate genetic,

păstrăvul modificat genetic1996,1997 - Comercializarea porumbului

KnockOut, bumbacului Bollgard şi soia roundup Ready; Primul animal clonat – oaia Dolly

1998 Obţinerii de papaia rezistentă la boli.2000- Prima hart ă complet ă a genomului unei

plante: Arabidopsis thaliana2001 - Prima hart ă genomic ă a unei plante

cultivate: orezul

Aceste descoperiri = dogma centrală a biologiei moleculare = proteinele sunt translatate din ARN şi sunt transcrise din ADN.

Excepţii - transcripţia reversibilă în retroviruşi. ARN = produs intermediar în translaţia moleculară a

genelor în proteine doar pentru câteva secvenţe de gene, moleculele ARN sunt produşii finali funcţionali.

moleculele ARN = ribozomi - funcţiuni enzimatice sau rol de reglare.

Secvenţe de ADN, din care sunt transcrise câteva ARN, sunt cunoscute ca gene ARN. Toate organismele vii au genele proprii şi le transmit copiilor prin ADN, numai unii viruşi prin ARN. Pe de altă parte, retroviruşii, cum ar fi cei ai HIV, necesită trascripţia inversă a genomului de la ARN la ADN înainte ca proteinele să fie sintetizate.

- erori rare şi spontane (ex. în replicarea ADN) -pot apărea mutaţii ale secvenţelor de gene -odată propagată la noua generaţie, această mutaţie poate conduce la variaţii în cadrul speciilor.

- Variante ale unei singure gene sunt cunoscute sub termenul de alele; diferenţele în alele pot conduce la diferite caracteristici, de exemplu, culoarea ochilor.

- Cele mai comune alele ale genelor sunt numite “sălbatice” şi cele rare sunt numite “mutante”.

Mutaţia = schimbare a secvenţei de nucleotide din ADN, în absenţa interacţiunii acesteia cu o altă secvenţă.

Mutaţiile = modificări spontane, cu caracter nedirecţionat, care survin la nivel molecular în structura unor determinanţi genetici şi, care, afectând o parte din informaţia genetică a organismului, duc la apariţia unui genotip mutant, care se exprimă printr-un fenotip diferit de cel normal, corespunzător genotipului sălbatic.

Mutaţia - proteina modificata care poate avea o funcţie alterată sau poate fi integral nefuncţională.

Molecula de ADN = foarte stabilă - mutaţiile spontane - foarte rar şi sunt, în general, mascate în cultură, de predominanţa celulelor normale.

Diagrama schematic ă a unei gene. Instronii sunt regiuni g ăsite adesea în genele eucariote care sunt înl ăturate în procesul de divizare: numai exonii codific ă proteinele. Aceasta define şte gena ca o regiune de nu mai mult de 40 de baze. În realitate multe gene sunt mult mai ma ri.

ADN-ul = substratul fizic al informaţiei genetice, fundament al conservării, reproducerii şi evoluţiei speciilor. Conţinutul în ADN = constant în diferitele celule somatice ale unui organism, fiind insă variabil de la o specie la alta, dar este dublu în celulele somatice faţă de cele reproducătoare.

Replicarea ADN-ului

• ADN = structură polimeră permiţând înscrierea în macromolecula sa, sub forma unor secvenţe specifice de baze azotate, a unei cantităţi enorme de informaţie genetică.

• Numai o catenă de 100 de nucleotide poate fi construită sub forma a 4100 variante diferite - enorme posibilităţi de realizare a variaţiilor calitative şi cantitative dintre specii.

• Bazele azotate din structura ADN sunt nucleotidele: adenina, timina, citozina şi guanina - nucleotide care constituie alfabetul genetic.

• O secvenţă de 3 nucleotide consecutive = codon, reprezintă vocabularul codificării proteinelor.

• Genomul uman contine 6 miliarde nucleotide. • Copiii au 50 de mutatii mononucleotidice care-i difera de

parinti.

• Genele = regiuni ale acizilor nucleici care trec de la părinţi la copii în timpul reproducţiei, ca cromozomi în nucleii gameţilor. Aceste entităţi codifică informaţia esenţială pentru fabricarea proteinelor şi a enzimelor sau altor molecule care determină creşterea şi funcţionalitatea organismului.

Organism Gene Perechi de baze Plante <50000 <1011 Oameni 25000 3x109 Muşte 12000 1,6x108 Albine 15000 3×108 Viermi 19000 9.7×107 Mucegaiuri 6000 1.3×107 Bacterii 500–6000 5×105–107 Virus ADN 10–900 5,000–800,000 Virus ARN 1–25 1,000–23,000

Număr de gene în diferite organisme

• Toate genele şi ADN corespunzător = genomul unui organism; în multe specii acesta se divide în două sau mai multe copii.

• Locaţia genelor sau a cromozomilor este arbitrară. • Replicarea, funcţie esenţială a materialului genetic, este un proces biochimic

fundamental pentru lumea vie, comun pentru ADN-ul tuturor sistemelor biologice.

• Replicarea macromoleculei de ADN se bazează pe complementaritatea bazelor azotate şi unirea catenelor complementare prin legaturi de hidrogen.

• metode genetice elaborate în ultimii 30 de ani se bazează pe buna cunoaştere a genomului celulelor vii (structura ADN) şi a proteinelor sau enzimelor pe care acestea le exprimă.

• S-a învăţat cum să se modifice genele prin metode enzimatice, precum şi cum să se transfere şi să se exprime genele în organismul – ţintă. Astfel, există acum o capacitate în permanentă creştere de a accelera reproducerea unor varietăţi de culturi noi şi îmbunătăţite şi de a introduce informaţii genetice complet noi, de exemplu, de la bacterii sau animale la plante.

descoperiri majore care au condus la nivelul actual de cunoştinţe sunt:

• Elucidarea structurii dublu helicoidale a ADN-ului şi a modului în care informaţia genetică este codificată prin secvenţele de nucleotide de-a lungul lanţului ADN-ului;

• Modul în care genele sunt exprimate de către acizii ribonucleici mesageri (mRNA) în proteinele specifice;

• Modul în care ADN-ul poate fi modificat prin utilizarea unor enzime de restricţie, care extrag anumite gene pe care le adaugă genelor din cadrul ADN-ului plasmidic, prin utilizarea ligazelor;

• Modul în care noul ADN recombinant poate fi introdus şi exprimat într-o celulă-ţintă, prin utilizarea unui vector bacterian (Agrobacterium tumefaciens), a unei gene-pistol (metoda biolistică) sau a microinjecţiilor.

• Mutageneza nu este consecinţa recombinării genetice.

• Mutageneza „in vitro” poate fi utilizată pentru modificarea controlată a secvenţei de nucleotide a unei gene, urmată de introducerea acesteia într-o gazdă corespunzătoare şi apoi studierea funcţiilor acesteia.

• organismele sau alimentele modificate genetic reprezintă o parte a naturii, cauzată de transformările spontane ale genelor (mutaţii). De-a lungul ultimilor 10.000 de ani, specia umană a accelerat aceste transformări prin metode de reproducţie tradiţionale.

• Organisme Modificate Genetic pot fi plante, bacterii şi animale, modificate prin intermediul ingineriei genetice

1953 1968

1973 1990 1994 1995

1995 1996 1997 1997 1998 2000 2001 2002

Este descris ă structura ADN Metode enzimatice de tăiere sau recombinare a ADN-ului sau genelor (enzime de restricţie şi ligaze) care produc ADN-ul recombinat Metode de transfer ale genelor / ADN-ului în interiorul celulelor Primele Directive UE privind alimentele MG Comercializarea primelor alimente MG (tomate) în SU A Dezvoltarea fragmentelor de ADN pentru o uşoară identificare a materialului genetic; Dezvoltarea genomului primului organism Aprobarea de c ătre UE a soiei MG Aprobarea de c ătre UE a porumbului MG Directiva UE pentru alimente noi Oprirea temporară de către UE a testării pe teren a culturilor MG Dezvoltarea a aproximativ 40 de genomuri Dezvoltarea genomului uman În aşteptare, Directive UE privind aprobarea, siguranţa, trasabilitatea şi etichetarea alimentelor GM

Istoria alimentelor MG

• Biotehnologie modernă”, „tehnologie ADN recombinant (tehnologie r-ADN)” şi „inginerie genetică”

= transferul genelor dintr-un loc într-altul. În domeniul agroalimentar, modificări genetice - în

principal, pentru a reduce pierderile şi cheltuielile de producţie şi, în ultimii ani, şi pentru a îmbunătăţi calitatea alimentelor, de exemplu gustul sau proprietăţile benefice pentru sănătate.

Industria alimentară - microorganisme transgenice, cum ar fi bacterii sau drojdii: ele pot fi utilizate la producerea brânzei, iaurtului, vinului, pâinii şi cărnii, pentru a îmbunătăţi caracteristicile gustului şi texturii.

• Este posibilă modificarea unei gene a unei plante (rapiţă) şi obţinerea unui produs final care nu este MG (ulei de rapiţă) -pentru îmbunătăţirea proprietăţilor culturilor (de exemplu, toleranţă la pesticide

• doar soia şi porumbul MG au fost aprobate în cadrul pieţii Uniunii Europene, dar şi alte alimente MG au fost notificate Comisiei ca fiind, în mare parte, echivalente soiurilor tradiţionale, conform Directivei pentru alimente noi.

• o serie de aplicaţii se află, în stadii diferite, în procesul de autorizare completă, dar niciuna dintre acestea nu a fost adoptată încă, datorită sistării temporare în 1998 a testărilor pe teren.

• În SUA, peste 50 de alimente obţinute prin tehnologia ADN-ului recombinant (r-ADN) au fost evaluate, de către Administraţia Alimentelor şi Medicamentelor (AAM).

• În afară de recoltele cu noi r-ADN, modificate în vederea îmbunătăţirii parametrilor agrotehnici (toleranţa faţă de erbicide şi insecticide), sunt şi: rapiţă oleaginoasă cu conţinut mare de fitază (BASF), soia cu conţinut ridicat de acid oleic (DuPont), dovlecel rezistent la viruşi (seminţe vegetale Seminis), roşie cu coacere modificată a fructului (Agritope), canola (Calgene) şi roşia rezistentă la înmuiere (Calgene şi Zeneca Plant Science).

• În anul 2000, suprafaţa totală pe plan mondial ocupată de către culturile MG (sau culturi transgenice) era de peste 44 milioane ha, liderul de piaţă fiind SUA (68%), urmat de Argentina (23%). În Europa, datorită deciziilor politice, suprafaţa este aproape nulă.

Sinteza proteinelor (sursa: International Life

Sciences Institute –ILSI)

Agrobacterium infecteaz ă în mod natural unele tipuri de plante şi introducenoul ADN în interiorul acestora. Biologii utilizeaz ă forme speciale deAgrobacterium pentru a modifica plantele din punct de vedere genetic(sursa: International Life Sciences Institute – ILSI)

Organism Caracteristic ă Nouă

Utilizare în alimenta ţie

Aplicant Statut legal

Porumb Toleranţă la insecte şi erbicide

Alimente şi ingrediente alimentare

Ciba-Geigy, Novartis Seeds

A

Soia Toleranţă la erbicide Alimente şi ingrediente alimentare

Monsanto A

Canola Toleranţă la erbicide Ulei procesat Agrevo UK, Plant Genetic Systems, Monsanto, Hoechst Schering

N

Porumb Rezistenţă la insecte Ingrediente alimentare

Monsanto, Pioneer, Overseas Corp.

N

Porumb Toleranţă la erbicide Ingrediente alimentare

AgrEvo N

Roşii Coacere întârziată Roşii procesate

Zeneca C

Cicoare Radicchio (cu miezul

roşu şi verde)

Toleranţă la erbicide şi sterilitate masculină

Legume Bejo-Zaden C

Soia Conţinut ridicat de acid oleic

Ulei EI DuPont Nemours

C

Porumb Toleranţă la erbicide Alimente şi ingrediente alimentare

Monsanto C

Soia Toleranţă la erbicide Seminţe Plant Genetic System

C

Porumb Toleranţă la erbicide şi insecte

Legume, porumb dulce congelat şi praf, ingrediente alimentare

Novartis Seeds, Monsanto, Pioneer Overseas Corp

C

Sfeclă de zahăr

Toleranţă la erbicide Zahăr, ingrediente alimentare din miez

Monsanto, Novartis Seeds

C

Porumb Toleranţă la erbicide şi insecte

Pioneer Overseas Corp

Pioneer Overseas Corp, Mycogen Seeds

C

Sfeclă furajeră

Toleranţă la erbicide Furaj DLF-Trifolium, Monsanto, Danisco seeds

C

Cartofi Compoziţie modificată a amidonului

Amidon şi ingrediente

Amylogen C

Bumbac Toleranţă la erbicide sau insecte

Utilizat ca orice alt bumbac

Monsanto C

Culturi aprobate

(A) notificate (N) şi în curs de

autorizare (C) de către

UE

• În cazul primei generaţii de culturi r-ADN -îmbunătăţirea caracteristicilor agronomice, în vederea reducerii pierderilor şi costurilor de producţie, în special pe toleranţa la erbicide, rezistenţa la insecte, rezistenţa la viruşi - pe viitor vor fi abordate rezistenţa la secetă, rezistenţa la mediul sărat şi tolerarea diferitelor temperaturi.

• În cazul celei de-a doua generaţii, care a fost deja creată - caracteristici calitative, care prezintă un mult mai mare interes pentru consumatori:

1. modificare conţinut de ulei 2. modificare conţinut de proteine 3. modificare conţinut de glucide 4. modificare senzorială 5. îmbunătăţire nutriţională, a ingredientelor alimentare

şi nealimentare.

• La fel ca şi culturile transgenice, microorganismele transgenice (GMM) prezintă interes pentru industria alimentară. Ele pot fi utilizate pe post de culturi starter în alimente (de exemplu, brânză, iaurt, vin, pâine şi carne) sau în fermentaţie pentru producerea de enzime, coloranţi, acizi organici etc.

Chimozină pură pentru producerea brânzei poate fi, în prezent, obţinută din drojdie modificată

genetic (sursa: International Life Sciences Institute – ILSI)

• Culturi starter transgenice nu există, în prezent, pe piaţa europeană, dar în SUA sunt permise.

• multe enzime şi aditivi alimentari sunt produşi de către microorganisme transgenice, cum ar fi chimozină, alfa-amilază, catalază, lipază, glucozizomerază, beta-glucanază şi glucozoxidază. În prezent, acestea sunt exceptate de la etichetarea specifică.

• Modificarea secvenţei de nucleotide se poate face la întâmplare, prin mutageneză „clasica” cu agenţi mutageni obişnuiţi (fizici sau chimici) sau prin inducerea unor greşeli de incorporare a nucleotidelor cu ajutorul unor enzime (ex. reverstranscriptaza produsă de virusul mieloblastozei aviare). Consecinţa acestor tratamente poate fi de tipul deletiilor, adiţiilor, substituţiilor, inversiilor etc.

• În ultimii ani au fost elaborate metode de mutageneză la situs-specific care permit modificarea controlată (prin deleţii, adiţii sau substituţii de nucleotide) a unei secvenţe de ADN.

• Mutageneza în vitro are numeroase aplicaţii:

- caracterizarea unor regiuni ale ADN care controlează exprimarea unei gene;

- modificarea unor gene în produsul natural astfel încât acestea să-şi îndeplinească cat mai bine rolul.

Tehnica de mutagenez ă în vitro

• Tehnologia ADN recombinant face parte din cadrul mai larg al ingineriei genetice.

• Ingineria genetica cuprinde toate procedeele efectuate în vitro, cu gene, cromozomi şi uneori, cu celule întregi, în scopul construirii unor structuri genetice cu proprietăţi ereditare premeditate.

• Denumirea de tehnologia ADN recombinant, propusă de Grobstein în 1977, grupează toate tehnicile care permit sinteza chimică sau izolarea mai multor gene naturale de la un organism, urmată de inserţia lor în informaţia genetică a altei celule.

Pentru exprimarea unor fragmente de ADN exogen în celulele animale, este necesar ca vectorii de clonare să conţină:

• secvenţe derivate din plasmide bacteriene care să le permită multiplicarea şi selecţia în celule bacteriene gazdă (E.coli);

• elemente genetice eucariote care să controleze iniţierea transcrierii;

• secvenţe de poliadenilare a ARN mesager;• gene marker care permit selecţia celulelor

animale ce conţin vectorul recombinat.Vectorii de clonare pentru celula animală derivă de

la virusuri şi retrovirusuri.

Pentru celulele vegetale, vectorii specifici sunt derivaţi ai plasmidelor naturale de la Agrobacterium tumefaciens şi A. rhizogenes. sau de la virusuri specifice celulelor vegetale.

• Ca şi ceilalţi vectori pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt vectori tip navetă, ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona atât în celulele bacteriene (E.coli, Agrobacterium sp), cat şi în celulele eucariote. Pentru exprimarea unor fragmente de ADN exogen în celulele animale, este necesar ca vectorii de clonare să conţină:

• secvenţe derivate din plasmide bacteriene care să le permită multiplicarea şi selecţia în celule bacteriene gazdă (E.coli);

• elemente genetice eucariote care să controleze iniţierea transcrierii;• secvenţe de poliadenilare a ARN mesager;• gene marker care permit selecţia celulelor animale ce conţin vectorul

recombinat.• Vectorii de clonare pentru celula animală derivă de la virusuri şi retrovirusuri. • Pentru celulele vegetale, vectorii specifici sunt derivaţi ai plasmidelor

naturale de la Agrobacterium tumefaciens şi A. rhizogenes. sau de la virusuri specifice celulelor vegetale.

• Ca şi ceilalţi vectori pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt vectori tip navetă, ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona atât în celulele bacteriene (E.coli, Agrobacterium sp), cat şi în celulele eucariote.