Curs 14_Diagnostic de Laborator in Afectiunile Mediate Imun_2013

Immunology 2013. Science can solve problems

Diagnostic de laborator în afecțiunile

mediate imunCurs 14

Immunology 2013. Science can solve problemsImmunology 2013. Science can solve problems

Obiective

• Înțelegerea diferențelor dintre tehnicile imunologice utilizate

pentru diagnosticul afecțiunilor imune și cele folosite pentru

evaluarea afecțiunilor fără implicare imună

• Înțelegerea principiilor care stau la baza procedurilor imunologice

folosite în diagnosticul imunologic de laborator

• Descrierea tehnicilor imunologice relevante care evaluează diverși

parametri ai sistemului imun înnăscut și dobândit, organizate în

teste de screening, teste funcționale și teste specializate

• Identificarea utilității diagnostice a procedurilor imunologice în

condiții clinice specifice, care includ imunodeficiențele, bolile

alergice și bolile autoimune

• Dobândirea unei estimări a viitoarelor testări diagnostice imune și

a importanței acestora în diagnosticul precoce și terapia adecvată


Cuprins

1. Tehnici imunologice pentru diagnosticul afecțiunilor cu funcție

imună modificată

2. Evaluarea imunității înnăscute

3. Evaluarea imunității dobândite

4. Diagnosticul de laborator al afecținilor alergice

5. Diagnosticul de laborator al bolilor autoimune


- Teste ale funcției sistemului imun înnăscut (evaluarea

fagocitelor, celulelor cu rol mediator, NK și complementul)

- Teste ale funcției sistemului imun dobândit (activitatea

limfocitelor T și B)

Clasificarea testelor imunologice încearcă să ofere un algoritm

practic pentru diagnostic în funcție de complexitatea acestora:

1. Teste primare (screening)

2. Teste secundare (funcționale)

3. Teste terțiare (specializate)

Sunt folosite împreună cu alte proceduri clinice sau de laborator

pentru testarea funcției imune în diferite stadii diagnostice de

boală

Bolile autoimune, alergiile, astmul, transplantul de organe și de

măduvă osoasă hematogenă, procesele maligne limfoide, cu

plasmocite sau tumorile solide, imunodeficiențele primare și

secundare


imună modificată


Categorie Componentă Primar

(screening)

Secundar

(funcțional)

Terțiar

(specializat)

Sistem imun înnăscut

Fagocite Mo/Macrofage

Neutrofile

Eozinofile

Celule dendritice

Hemoleucograma Aderență

Chemotaxie

Fagocitoză

Activitate

bactericidă

Molecule de

adeziune

Chemokine

Preluarea

particulelor

Oxidaza NADPH

Specii reactive

ale oxigenului

(ROS)

Celule cu rol

mediator

Mastocite

Bazofile

Hemoleucogramă

tisulară

Triptaza Histamina,

prostaglandine,

leukotriene

Celule NK Perforine /

granzime

ADCC

CD3- /

CD16+CD56+

Activitate citolitică Perforine

Funcția

complementul

ui

C1-C9 CH50, C3, C4 Opsonic (C3b)

Anafilatoxina (C3a,

C5a)

Chemotactic (C5a)

Citolitic (C5-9)


imună modificată


Categorie Componentă Primar

(screening)

Secundar

(funcțional)

Terțiar

(specializat)

Sistem imun dobândit

Funcția

limfocitelor B

Limfocite Hemoleucograma

IgM, IgG, IgA, IgE

IgG1, IgG2, IgG3,

IgG4

Imunofenotipare

CD19, CD20

Răspuns specific

la anticorpi pre-

/post

Funcția

limfocitelor T

Limfocite Hemoleucogramă

Imunofenotipare

diferențială

CD3+/CD4+

CD3+/CD8+

Testarea

hipersensibilității

de tip întârziat in

vitro

Teste de

limfoproliferare in

vivo la antigen și

mitogen

Analiza

citokinică

Activitatea

citolitică


imună modificată



imună modificată

Descoperirile majore ale secolului XX cu cel mai mare impact asupra

diagnosticului imunologic:

- Tehnologia hibridoamelor

• Kohler și Milstein (1975)

• producerea in vitro a unor cantități crescute de anticorpi

omogeni cu o singură specificitate antigenică – anticorpi

monoclonali

-Flowcitometria (FCM) – fluorescent activated cell sorting (FACS)

• tehnologie pentru identificarea moleculară

• utilizarea anticorpilor monoclonali

• detectarea și caracterizarea diferitelor celule și molecule ale

sistemului imun

• epidemia SIDA în 1981 – recunoașterea și măsurarea

limfocitelor T CD4+ (diagnostic, tratament, follow-up al

pacienților infectați cu HIV)

• evaluarea afecțiunilor limfoproliferative, imunodeficiențelor

și alte boli mediate imun


Considerații generale asupra pacienților suspectați cu

imunodeficiențe primare sau secundare

Suspiciune de imunodeficiență

primară (PID)

Antecedente heredocolaterale

Infecții

Tipul agentului infecțios

Localizarea și frecvența infecțiilor

Eșecul antibioterapiei în eradicarea

infecției

Severitatea infecției

Anomalii congenitale

Valori ale parametrilor de laborator

Autoimunitate

Incidența crescută a proceselor

maligne

Condiții clinice asociate

imunodeficiențelor primare (PID)

Infecții

Neobișnuit de severe

Recurente

Agenți patogeni neobișnuiți

Infecții ale sinusurilor

Malabsorpție

Autoimunitate

Boală reumatoidă

Sindroame lupus-like

Abcese, leziuni tegumentare

Diaree cronică

Vindecare incompletă a rănilor

Reacții adverse la vaccinurile vii

Absența ganglionilor limfatici/amigdale

Absența timusului pe Rx


Considerații generale asupra pacienților suspectați cu

imunodeficiențe primare sau secundare

Agenți infecțioși asociați PID

Deficitul de anticorpi

Hemophilus influenzae

Streptococcus pneumonie

Giardia lamblia

Specii de Cryptosporidium

Enterovirusuri

Deficit al imunității celulare

sau combinată

Candida albicans

Pneumocystis carinii (jiroveci)

Specii de Mycobacterium

Cytomegalovirus

Virus Epstein-Barr

Virus Varicella

Enterovirusuri

Agenți infecțioși asociați PID

Deficit al fagocitelor/fagocitozei

Specii Pseudomonas

Specii Klebsiella

Staphylococcus aureus

Serratia marcescens

Specii Nocardia

Specii Aspergillus

Deficit complement sau ale

componentelor complementului

Neisseria meningitides

Neisseria gonorrhoeae


2. Evaluarea imunității înnăscuteIstoric medical

Tipuri de agenți patogeni

Recurența infecțiilor

Rezultate hemoleucogramă și diagnostic diferențial

Evaluarea flowcitometrică a

subpopulațiilor limfocitare

Limfocite B Limfocite T

Cantitație imunoglobuline

Izohemaglutinine

(anti-A, anti-B)

Electroforeza proteinelor

serice

Răspuns la

imunizare specifică

Răspuns la

anticorpi

Examinare

țesut limfoid

Test limfoproliferare

in vitro

Răspuns DHT la

antigene

Producerea de citokine

specific-antigenice

(FCM, ELISA)

Examinare

țesut limfoid

PMN

Testarea fenotipică (FCM)

CD18/CD11

Teste funcționale

Fagocitoză,

chemotaxie,

bactericidie

Efecte respiratorii

NBT, DHR

Complement

CH50

C3, C4

AH50

Cantitație componente C

Nefelometrie

Testarea

funcțională

componente C



2.1. Evaluarea funcției fagocitelor

- Ce? Monocite circulante, macrofage tisulare, celule mieloide circulante

(neutrofile) – fagocitoză, activitate intracelulară bactericidă, inflamație;

celule prezentatoare de antigen (APC)

- Când? Infecții bacteriene recurente

- Cum? Cantitativ și calitativ

Când suspectăm o disfuncție fagocitară?

- Infecții cutanate – S. aureus

- Gingivită

- Afecțiuni periodontale

- Ulcerații orale

Anomalii neutrofilice relevante din punct de vedere clinic:

- Neutropenie

- Anomalii de aderență și locomoție neutrofilică

- Anomalii ale formării granulelor intracitoplasmatice

- Anomalii ale funcției fagocitare



Defecte cantitative ale fagocitelor

Tipul de celulă Defect al

sistemului imun

înnăscut

Exemple Manifestări

clinice

Defect al

numărului de

neutrofile

Neutropenie Congenital,

infecțios, malign,

boli autoimune

Creșterea

susceptibilității la

infecții bacteriene

Defect al

numărului de

macrofage

Splenectomie

Splenectomie

funcțională

Îndepărtarea

chirurgicală a

splinei ca urmare a

unui traumatism

Anemia sickle-cell

(siclemia)

Creșterea

susceptibilității la

infecții bacteriene



Defecte calitative ale fagocitelor

Componentă Defect al sistemului

imun înnăscut

Exemple Manifestări clinice

Granule primare și

secundare

Defecte de formare și de

conținut ale granulelor

Sindrom

Chediak-Higashi

Albinism parțial, lizozomi

uriași, NK și CTL,

scăderea traficului

lizozomal, infecții

bacteriene recurente

Oxidaza NADPH Defecte ale

metabolismului oxidativ

Boală

granulomatoasă

cronică

Formarea granuloamelor,

creșterea susceptibilității la

infecții bacteriene și fungice

Defecte de adeziune

leucocitară (LAD)

Defecte ale aderenței și

chemotaxiei datorate

mutațiilor integrinei,

care duc la defecte ale

CD18 și CD15,

absența/scăderea

adeziunii leucocitare și

migrarea celulară

Deficit de

adeziune

leucocitară tip 1

(LAD1)

Întârzierea separării

cordonului ombilica,

ulcerații tegumentare,

periodontită, leucocitoză

Interferon / IL-12 Defecte ale căii

interferon / IL-12

BCG Susceptibilitate la infecții

cu Salmonella și

mycobacterium



Defectul fagocitar Exemple Analize de laborator

Afecțiuni ale celulelor

mieloide

Neutropenie congenitală

severă

Neutropenia ciclică

Neutropenia X-lincată

Neutropenie persistentă și blocarea

maturării detectate prin studii la nivelul

BM

Neutropenie intermitentă care necesită

determinări seriate (la intervale de 2-3

săptămâni)

Expresie WASP alterată (FCM) sau studii

de mutageneză

Defecte ale formării

granulelor și

conținutului

Sindrom Chediak-Higashi

Sindrom Griscelli tip 2

Incluziuni lizozomale gigantice la nivelul

granulocitelor (albinism parțial)

Neutropenie fără incluziuni citoplasmatice

(albinism parțial)

Defecte ale adeziunii

leucocitare

LAD1

LAD2

LAD3

/- CD18 și CD11 (FCM); leucocitoză

persistentă

Fenotip Bombay, absența expresiei CD15

Analize mutaționale

Defecte ale căilor de

semnalizare citokinice

Sindromul hiper-IgE

Interferon -/IL-12

IgE > 2000 IU/ml, Th17, deficit de STAT

Defecte moleculare ale căii Interferon -

/IL-12, detectate prin FCM

Defecte ale

metabolismului

oxidativ

Granulomatoză cronică Defecte evidențiate prin DHR sau NBT



2.2. Evaluarea funcției celulelor cu rol mediator

- celulele cu rol mediator sunt: bazofile, mastocite și eozinofile (au și

activitate fagocitară)

- au fost identificate 2 tipuri de mastocite:

mucoasa intestinală și țesutul peretelui alveolar – conțin doar triptază

[MC(T)]

tegumentul normal și submucoasa intestinală – conțin triptază și

chimază [MC(TC)]

triptaza este crescută în reacțiile anafilactice și mastocitoză (valoare

diagnostică ca marker al acestor afecțiuni)

- Histamina

mediator vasoactiv potent stocat ca moleculă pre-formată în granulele

citoplasmatice ale bazofilelor și mastocitelor

eliberată împreună cu alți mediatori ai inflamației (leukotriene) în

reacții de hipersensibilitate tip I (imediată)

eliberarea bazofilică de histamină (BHR) - test cantitativ de potență

alergenică (ingestia unui alergen alimentar) și model in vitro de studiu

al factorilor declanșatori ai eliberării mediatorului din bazofile

- Peptidul cationic eozinofilic (ECP) – nivel crescut în spută, ser și secreții

nazale ale pacienților cu infecții parazitare, rinită alergică, astm



2.3. Evaluarea funcției celulelor NK

- Rol important în apărarea anti-tumorală și anti-virală apoptoză (direct

- perforine și granzime; indirect - precipitarea IgG și inducerea ADCC =

antigen-dependent cellular cytoxicity)

- Când suspectăm o disfuncție a NK?

NK în sângele periferic la pacienții cu AIDS, infecții recurente cu

virusul herpetic

NK + CTL sunt asociate cu un răspuns inflamator incontrolabil

indus de infecție injurie multiplă de organe = limfohistiocitoză

hemofagocitică (HLH); un tip de HLH este sindromul limfoproliferativ

X-lincat (XLP) = răspuns imun anormal la infecția cu EBV deces în

cazul în care nu se efectuează transplant de măduvă osoasă

- Investigații de laborator?

imunofenotipare (FCM)

teste de citotoxicitate – eliberarea de 51Cr la 4 ore

evaluarea flowcitometrică intracelulară pentru molecule defective în

XPL1 și XPL2: SLAM-associated protein (SAP), X-linked inhibitor of

apoptosis (XIAP)



2.4. Evaluarea funcției complementului







Când suspecăm o disfuncție a complementului?

Disfuncțiile complemetului sunt rare (0,03% din populație)!!

- Pacienți cu afecțiuni autoimune

- Pacienți cu infecții recurente

- Pacienți cu angioedem cronic recurent

Calea clasică (C1q, C1r, C4 și C2) – simptome lupus eritematos autoimun-

like, cu infecții recurente sino-pulmonare

Defecte ale C3 – infecții bacteriene recurente cu Streptococcus penumoniae

Defecte ale căii lectinei – infecții acute recurente ale tractului respirator,

mai ales la copii (S. Pneumoniae și N. meningitidis), precum și creșterea

incidenței bolii reumatismale

Defecte ale căii alternative – infecții recurente cu N. Meningitidis

Cum evaluăm funcția complementului?

-Complementul hemolitic total – CH50 (calea clasică)

-Funcția căii alternative – AH50

-Nefelometria – prezența și cantitatea componentelor complemetului, dar nu

determină funcția acestora



Standard – imunofenotipare flowcitometrică (FCM)

- Limfocite T citotoxice (CD3+CD8+)

- Limfocite T helper (CD3+CD4+)

- NK (CD16+CD56+)

- Limfocite B (CD19+) (4-10% limfocite)

3.1. Evaluarea funcție limfocitelor B

Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor B?

- Agamaglobulinemia X-lincată (Bruton, 1952)

- Infecții repetate cauzate de microorganisme comune încapsulate: S.

Pneumoniae, S. Aureus, H. Influenzae tip b, N. meningitidis

- Diaree (25% din pacienții) asociată cu infecții cu Giardia lamblia

- Pacienți care nu răspund la imunizarea specifică – tetanos/difteria,

vaccinul anti-H. Influenza tip b (vaccin cu virus atenuat), vaccinul anti-

polio (vaccin cu virus viu administrat oral)



3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B

Evaluarea de laborator a funcției limfocitelor B

Testarea limfocitelor B se face prin teste in vivo - vaccinare

Vaccinurile proteice (tetanos) – evaluează răspunsul imun dependent de

limfocitele T

Vaccinurile polizaharidice (Pneumovax) – evaluează răspunsul imun

independent de limfocitele T

Antigenele recall – anticorpii produși au făcut switching-ul de clasă (IgG)

Neoantigene – antigenul este nou pentru sistemul imun; anticorpii produși

sunt de tip IgM la prima vaccinare și de tip IgG la a doua vaccinare



3.1. Evaluarea funcției limfocitelor B

Teste de screening

- CBC (complete blood count = hemoleucograma)

- Nivelul de imunoglobuline – nefelometrie (IgM, IgG, IgA) și IgE

(ELISA); niveluri < 300 mg/dl la adolescení/adulți și < 95%

valoare de referință la copii deficit imunoglobulinic

- Electroforeza proteinelor serice

- Determinarea anticorpilor naturali anti-grup sanguin

(izohemaglutinine)

- Imunizarea pacientului cu vaccin proteic (tetanos/difteria) și

vaccin polizaharidic (vaccinul penumococic) și determinarea

titrului anticorpilor înainte și la 3-4 săptămâni de la imunizare

Teste specifice

- Flowcitometrie (CD19+, CD20+)

- Teste in vitro de stimulare a proliferării cu agenți mitogeni (PHA,

LPS, Concavalina A)



3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T

Când suspectăm o disfuncție a limfocitelor T?

- diaree, infecții recurente cu agenți patogeni oportuniști (Candida albicans,

Pneumocystis jiroveci, CMV), infecții bacteriene cu localizări multiple,

infecții persistente, în ciuda tratamentului corespunzător

- erupții cutanate

- noduli limfatici nepalpabili, absența timusului (atenție! Stressul poate

induce reducerea imaginii Rx a timusului în 50% cazuri)

Evaluarea de laborator a funcției limfocitelor T

- Teste de screening

- Teste specifice



3.2. Evaluarea funcției limfocitelor T

Nivelul testului

diagnostic

Investigații

Teste de screening CBC

Testare HIV

Imunofenotipare limfocitară

Testare cutanată a hipersensibilității de tip întârziat

Teste specifice Proliferarea limfocitelor T (agenți mitogeni)

Producția de citokine limfocitare (ELISA)

Evaluare flowcitometrică a proteinelor de suprafață sau

intracitoplasmatice – CD40L (CD154 pe suprafața

limfocitelor T activate), lanțul g al IL-2R (CD132), MHC-I,

lanțul a al IL-7R (CD127), lanțurile CD3, WASP (Wiskott-

Aldrich syndrome protein)

Teste enzimatice: adenozin deaminaza

FISH pentru deleția 22q11

Analiza repertoriului TCR

Analize mutaționale

Documents

Curs 14_Diagnostic de Laborator in Afectiunile Mediate Imun_2013