1

STRATEGII IN SINTEZA SI BIOSINTEZA

BIOSINTEZA DIRIJATA SI SEMISINTEZA IN PRODUCEREA ANTIBIOTICELOR

C12

2

ANTIBIOTICE= medicamente chimioterapice produse de microorganisme si au proprietatea

de a incetini multiplicarea unor organisme patogene, implicate etiologic in

diferite boli si sindroame infectioase si de a le distruge.

Agenti patogeni = microorganisme in diferite stadii ale evolutiei biologice (virusi, ricketsii, protoplaste, bacterii)

Se obtin in special prin fermentatie, biosinteza facandu-se cu microorganisme specifice.

Prin antibioza, antonimul termenului de simbioza, se intelege imposibilitatea existentei si dezvoltarii simultane, in aceleasi conditii, a doua sau mai multe organisme vii. Substantele chimice naturale produse de microorganisme si utilizate in tratamente antiinfectioase au fost denumite antibiotice.

3

Pe langa eficienta antimicrobiana se are in vedere faptul ca antibioticele trebuie sa se aproprie cat mai mult de conditia de netoxicitate asupra organismului si in acest scop se considera ideala doza maxima de 500 mg/kg corp.

Antibioticele intervin in metabolismul celulelor bacteriene producand fie stoparea multiplicarii bacteriilor (efect bacteriostatic), fie distrugerea completa a bacteriilor aflate in stare de repaus si a celor aflate in proces de crestere (efect bactericid).

4

Multitudinea antibioticelor, 10% din totalul medicamentelor utilizate in terapeutica medicala, necesita o sistematizare a acestora, iar clasificarea se poate efectua functie de urmatoarele criterii :

a) dupa originea microorganismului producator:- antibiotice produse de bacterii (Schizomycetes): (80% din antibiotice provin din specii de Streptomyces si Actinomyces, iar 5% din specii de Bacillus); - antibiotice produse de fungi (11% din antibiotice sunt produse de Penicilllium si Aspergillus, iar 3% din specii de Cephalosporium)

CLASIFICAREA ANTIBIOTICELOR

b) dupa structura chimica:- antibiotice cu structura alifatica (alicina)- antibiotice cu structura aromatica (acid gladiolic, cloramfenicol)- antibiotice cu structura chinonica (fumigatina, ftiocol)- antibiotice cu cloruri de furan si piran (acid penicilanic) - antibiotice heterociclice cu azot in molecula (acid aspergilic)- antibiotice heterociclice cu azot si sulf in molecula (peniciline)- antibiotice cu structura polipeptidica (gramicidina)- antibiotice cu structura complexa (macrolide)

5

c) dupa biogeneza:- antibiotice derivate din aminoacizi (oxamicina, peniciline, cefalosporine, bacitracina, polimixine) ;- antibiotice derivate partial sau total din unitati de acid acetic activat (eritromicina, grizeofulvina, tetracicline, macrolide, antibiotice polienice, rifampicine);- antibiotice derivate din glucide simple (gentamicina, streptomicina, kanamicina, neomicina).

d) dupa grupul de agenti patogeni asupra carora sunt active antibioticele:

- antibiotice antibacteriene (medicatia antibacterina): Gramicidina, Bacitracina, Polimixinele- antibiotice antifungice (medicatia antimitotica): Penicilinele, Grizeofulvina- antibiotice antituberculoase: Streptomicina- antibiotice antivirale: Aciclovir, Amantadina, Vidarabina- antibiotice cu actiune impotriva protozoarelor si metazoarelor (medicatia antiparazitara): antimalarice, antihelmintice- antibiotice cu actiune antitumorala

6

e) dupa mecanismul de actiune impotriva infectiei:

- actiune asupra peretelui celular, cu efect bactericid (de distrugere a bacteriilor), numai in faza de multiplicare a bacteriilor: Penicilinele G si V, Oxacilina, Ampicilina, Cefalosporinele- actiune asupra membranei citoplasmatice, cu efect bactericid: Polimixina B, Colistina, Amfotericina B.- actiune de inhibare a sintezei proteinelor, la nivelul ribozomilor, cu efect bactericid, in faza de multiplicare si in faza de repaus a bacteriilor si bacteriostatic (oprirea multiplicarii bacteriene): Streptomicina, Tetraciclinele, Eritromicina, Lincomicina- actiune de inhibare a sintezei acizilor nucleici, cu efect bacteriostatic si bactericid: Novobiocina, Rifampicina, Griseofulvina, Acidul nalidixic si alte chinone- actiune competitiva prin substituire de metaboliti analogi, cu efect bacteriostatic si bactericid, desi nu sunt antibiotice: sulfamide

7

Beta-lactamice: Penicilinele, Cefalosporinele

S

CH2-COOHN

OCOOH

CO

OCO

H3N

NH(CH2)3CH

-

+

Cefalosporina

R = benzil C6H5-CH2- Penicilina G (sau II)

heptil CH3-(CH2)5-CH2- Penicilina K (sau IV)

fenoximetil C6H5-O-CH2- Penicilina V (sau V – cinci)

CH

S

N

CH

CH

NH

CO

CH3

CH3R

COOH

OC

Penicilina

Penicillium

Cephalosporium

8

NH

OH

NH

OH

OH

NH2

NH

NH2NH

CH

CH

OHCH

O

CH

CH3

CH

CH

CH

CH

CH

CH2OH

NHCH3

OH

OH

O

O

CO

O

Aminoglicozidice: Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina

Streptomicina

Streptomyces

9

Antibiotice polienice: Nistatina

Tetracicline: Doxiciclina

OH OHO

N(CH3)2

OH

OOH

CONH2

R4 R3 R2R1

O

CH3

O OH OH OH

OH

OH O OH

OH

OH

CH3

CH3

O

COOH

CH3

OH

H H

H

OHH2N

Streptomyces noursei

10

Macrolide: Eritromicina

O

CH3

H

OH

H

H

H CH3

OH

H CH3

H

H

OH

OH

(CH3)2N

O

CH3

CH3

O

OH

CH3

O

CH3 CH3

C2H5

OH

O

O

OCH3

CladinozaD desozamina

Eritronolida

Streptomyces erythreum

11

f) dupa spectrul antimicrobian (totalitatea microorganismelor sensibile la un chimioterapic reprezinta spectrul antimicrobian al acestuia si este caracteristic fiecarei substante):- antibiotice de spectru ingust de tip penicilinic sau de tip streptomicinic- antibiotice cu spectru larg si foarte larg de actiune (Tetracicline, Cloramfenicol, cefalosporine de generatia a II-a si a III-a)- antibiotice de inlocuire (in cazul aparitiei fenomenului de rezistenta, macrolidele, lincosamidele)- antibiotice de rezerva (toxice, ca Vancomicina, sau care produc rezistenta, ca Rifampicina)- antibiotice de exceptie (active pe germeni ”de spital”, Fosfomicina)

In general, bacteriile gram-pozitive sunt mai sensibile decat cele gram-negative. Bacilul tuberculos, ciupercile, virusurile, protozoarele sunt mai sensibile la mai putine substante.

12

Surse de carbon si actiunea lor asupra producerii de antibiotice

AntibioticSurse de carbon cu influenta negativa

Surse de carbon cu influenta pozitiva

Cefalosporina C

Cefamicina

Cloramfenicol

Kanamicina

Penicilina

Neomicina

Novobiocina

Glucoza

Glicerina

Glucoza

Glucoza

Glucoza

Glucoza

Citrat

Zaharoza

Amidon

Glicerina

Galactoza

Galactoza

Maltoza

Glucoza

Sursa de carbon

Anumite surse de carbon care sunt asimilate rapid in timpul biosintezei exercita o influenta negativa asupra biosintezei („efect glucoza” )

In anumite cazuri acest efect este dependent de concentratie si se considera ca fiind optim intervalul de 28-100 mM glucoza.

13

Surse de azot

- organic: aminoacizi si peptide din faina de soia sau porumb → se metabolizeaza lent

pH-ul mediului de cultura (pH-ul optim pentru faza de crestere a masei celulare este de 4,5.....5, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7,0....7,5.

Fosfatul anorganic (0,3 – 300 mg)

MgSO4×7H2O

temperatura ( 25 1 °C)

alte elemente (Mn, Fe, Co, Cu, Zn), iar concentratia optima a acestora este de ordinul µg/l

- anorganic: azotat, fosfat sau sulfat de amoniu

cantitatea de aer (1-1,5 l aer/litru mediu x min)

14

PENICILINE

Peniciline au ca mecanism de actiune:

pot actiona asupra functiei enzimatice a proteinelor, ducand la autoliza unora dintre bacterii (de exemplu, carbenicilina asupra Pseudomonas) sau la inhibarea cresterii, pentru altele (actiunea antibioticelor β-lactamice asupra stafilococului auriu, pneumococului sau a unor streptococi)

impiedicarea formarii peretelui celular (celulele microbiene, lipsite de perete, sint expuse tensiunilor osmotice si mor; bacteriile care nu au perete celular (micoplasme, protoplasti) nu sint sensibile la actiunea penicilinelor) se pot lega covalent de anumite proteine membranare specifice (PBP=penicillin-binding-protein) cu functiile enzimatice

1929 Alexander FLEMING → „penicilina”

15

Activitatea antimicrobiana a penicilinelor este evaluata in unitati internationale de activitate (UI), acestea reprezentand cantitatea minima de penicilina care, dizolvata in 50 ml bulion, inhiba o cultura de 18 ore stafilococ de referinta, Staphylococcus aureus. Pentru penicilina G o

unitate internationala este egala cu 0,6 γ sau un miligram de penicilina contine 1667 U.I.

Activitatea celorlalte peniciline se calculeaza cu relatia:

MM

x

NaG 1667A

)(

unde MG(Na) este masa moleculara a penicilinei G, forma sodiu Mx este masa penicilinei testate

16

Proprietati intalnite la majoritatea penicilinelor si care pot fi considerate ca

definitorii pentru intreaga clasa:

substante solide, de culoare alba sau aproape alba si in general pot fi

obtinute in stare cristalina;

nu au puncte de topire nete si se descompun in timpul incalzirii;

contin in structura lor chimica cel putin o grupare carboxil, care le

confera caracter de acizi, iar taria lor variaza functie de substituenti ;

ca acizi sunt solubile in solventi organici, proprietate care este utilizata la

izolarea si purificarea lor prin extractie lichid-lichid, iar prezenta in molecula

a unei grupe polare, in special a unei grupe amino, reduce sau anuleaza

solubilitatea in solventi organici nepolari;

sarurile de sodiu sau de potasiu ale penicilinelor sunt solubile in solventi

polari, usor solubile in apa si uneori in dimetilformaldehida si metanol;

17

reactia penicilinelor cu baze tari serveste la determinarea chimica a

continutului in penicilina a preparatelor farmaceutice care contin aceste

antibiotice;

anumite bacterii sunt formatoare de beta-lacmataza, au capacitatea de

a deschide hidrolitic inelul beta-lactamic al penicilinelor, facandu-le astfel

ineficiente;

prin spectrul de actiune al unui antibiotic se intelege cate tipuri de

germeni pot fi distruse de o anumita substanta. Cu cat spectru este mai

larg cu atat creste frecventa, intensitatea si complexitatea efectelor

secundare.

18

Sinteza chimica a penicilinelor Cercetarile privind biosinteza penicilinelor sunt numeroase ca numar si au stabilite cu exactitate structura moleculei de penicilina, iar modul de formare este confirmat de sintezele chimice efectuate cu atom de carbon marcat, prima sinteza chimica fiind realizata in anul 1957 de Sheehan. Randamentul acestor reactii este foarte mic ele au rolul de a ilustra ca penicilinele sunt obtinute din trei substante de baza: d-valina, l-cisteina si anumiti acizi acetici α-substituiti.

METODE DE OBTINERE

Sinteza chimica

Biosinteza

Semisinteza

19

NH2

CH3

CH3

COOH Cl COCl

CH3

CH3

CO

COOH

Cl

NH

CH O

CH3

CH3

OCH3

CH3

CH3 COOHSH

COCH3

CH3

CH3 COOHSH

COOH

CH CH + CH2 CH CH NH

Ac2O

C

C

C

H2SCH CH NH

CH3OH

H2O (HXl)

CH CH

Obtinerea D-penicilaminei

20

Biosinteza penicilinelor

! calitatea susei

! compozitia mediului de cultura

In obtinerea biotehnologica a penicilinelor se disting urmatoarele faze:I Prepararea si sterilizarea mediului nutritivII Fermentatia III Separarea produselor de fermentatie cu obtinere de penicilina brutaIV Purificarea, concentrarea si cristalizarea solutiei native in vederea obtinerii penicilinei pure

Sursa de carbon

→ lactoza → amidonul → melasa de sfecla

I Prepararea si sterilizarea mediului nutritiv

21

Intrucat penicilinele contin un atom de azot in nucleul de baza este necesara gasirea mecanismelor prin care sa se asigure aportul constant al acestui element in structura si, in acest scop, sunt utilizati aminoacizi si produse de natura polipeptidica, sub forma de concentrate (peptona) sau sub forma bruta (faina de soia, mazare, porumb).

Surse de azot

pH-ul mediului de cultura: pH-ul optim pentru faza de crestere a masei celulare este de 4,5.....5, iar pentru faza de producere a penicilinelor este de 7,0....7,5 (valoarea optima a acestuia se pastreaza prin introducerea NaOH 10-40%, sau NH3 solutie 25% sau gazos in mediul de cultura)

temperatura ( 25 1 °C)

cantitatea de aer: 1-1,5 l aer/litru mediu x min

22

Doua metode de fermentatie:

- in suprafata (cultivarea ciupercii Penicillium notatum pe medii nutritive lichide, in straturi subtiri de 1-2 cm, in recipienti cu suprafata mare) → cantitati mici de antibiotic - in profunzime (izolat si folosit o anumita tulpina de Penicillium chrysogeum, inalt productiva, cultivata pe medii imbunatatite, in conditii submerse, realizandu-se economie de spatiu, culturi omogene si randamente ridicate in substanta activa

in urma fermentatiei, penicilinele se gasesc in lichidul care trebuie separat de miceliu. Penicilinele se separa din filtrat prin extractii fizice repetate, in urma carora rezulta o solutie cu o activitate de 60-80.000 UI/ml.

durata fermentatiei este de cateva zile (140 – 200 ore), iar controlul procesului se poate aprecia dupa dezvoltarea miceliului.

Produsele de biosinteza se gasesc in lichidul final de fermentatie in concentratii reduse (0,5-8%), fiind, in general, compusi labili chimic si termic. In plus, in lichidele de fermentatie se gasesc numerosi compusi secundari, unii cu caracteristici fizico-chimice asemanatoare cu ale produselor utile.

23

Penicilinele se separa prin extractie lichid-lichid, la un pH al fazei apoase corespunzator formei nedisociate a antibioticului. Pentru a putea fi extrase eficient, produsele de biosinteza trebuie transformate intr-o forma care sa fie solubilizata cu usurinta in solvent.

Fluxul general al separarii penicilinelor de biosinteza cuprinde urmatoarele etape:

1-filtrarea lichidului de fermentatie cu ajutorul filtrelor rotative cu vid, in scopul separarii biomasei de lichidul care contine penicilinele (penicilinele sint produse extracelulare);

2-extractia penicilinelor din filtrate cu un solvent organic in doua sau mai multe stadii, in functie de concentratia lor in solutie;

3- reextractia penicilinelor din solventul organic cu o solutie de carbonat de sodium sau de potasiu;

4-cristalizarea si purificarea, in functie de tipul de penicilina.

In functie de natura chimica, se pot separa prin:

- extractie cu solventi organici

- sorbtie pe schimbatori de ioni

- adsorbtie pe carbune sau alumina

24

Deoarece in majoritatea cazurilor, produsele de biosinteza sint putin stabile in mediu acid sau bazic, contactarea fazelor, transferul de masa si separarea fazelor trebuie sa se realizeze cu viteze ridicate, motiv pentru care se prefera extractoarele centrifugale. Pentru unii produsi foarte solubili in apa, in lichidul de fermentatie se adauga o sare (K2SO4) pana la saturatie, ceea ce determina precipitarea produsului de biosinteza (salting-out) si usurarea extractiei acestuia.

Dupa extractia cu acetat de butil si reextractia cu carbonat de sodiu (potasiu), solutia de benzilpenicilina (penicilina G potasica sau sodica) se trateaza cu carbune activ, iar antibioticul se cristalizeaza prin antrenarea azeotropa a apei cu butanol la 4-6 mm Hg, se filtreaza si se spala cu butanol si cloroform sau acetona. Penicilina V precipitata (cu acid sulfuric sau clorhidric diluat) se filtreaza pe filtru nuce si se usuca la 35 °C, la vid de 100-225 mm Hg, timp de 16-20 de ore.

Pentru extractia produselor de biosinteza polare se utilizeaza alcooli, esteri, cetone, iar pentru cele nepolare eter de petrol, diclormetan, dicloretan, etc. Cel mai adesea se foloseste acetatul de butil sau de izobutil, iar solventul epuizat se regenereaza si se foloseste la o noua extractie.

25

Semisinteza penicilinelor

Penicilinele G sau V, folosite curent in terapeutica, precum si unele produse preparate sub forma de saruri ale penicilinelor naturale nu intrunesc cele patru calitati esentiale pentru utilizare, respectiv acidorezistenta, stabilitate la penicilinaza, spectru larg antibacterian si lipsa fenomenelor alergice.

posibilitatea sintetizarii de noi peniciline, cu spectru larg de actiune antimicrobiana, rezistenta in mediu acid si absortie la administrare orala

1959 → identificarea si izolarea acidului 6-amino-penicilanic, (6-AP) in lichidul de fermentatie, lipsit de precursori a mucegaiului Penicillium

Metode de obtinere a 6-AP

biosinteza directa folosind mutanti de Penicillium chrysogenum nu s-a dovedit avantajoasa din punct de vedere economic, datorita randamentelor mici de biosinteza si a dificultatilor de izolare a acidului

26

- producatori de penicilinaze: fungi (Aspergillus, Cephalosporium), drojdii, actinomicete, bacterii (Escherichia coli, Acetobacter aerogenes, Proteus, Pseudomonas), dintre acestea fiind folosita in procedeele industriale Escherichia coli.

hidroliza cu enzime imobilizate este conditionata de pretul enzimei si de tehnica de imobilizare a acesteia

hidroliza chimica a penicilinei G sau V

Avantaje: - costuri reduse - timpului scurt de cultivare sursele microbiene - se obtin compusi de inalta puritate - randamente ridicate - se elimina neajunsurile inerente proceselor biologice, respectiv infectiile si degradarea tulpinilor de microorganisme

In fabricatia penicilinelor de semisinteza se disting urmatoarele faze tehnologice :I Obtinerea clorurilor acide II Condensarea clorurilor acide cu acidul 6-AP III Separarea, cristalizarea si purificarea penicilinelor de semisinteza

27

Izolarea acidului 6-aminopenicilanic (6-AP) obtinut prin biosinteza si acilarea prin sinteza chimica, cu agenti care sa nu-i afecteze ciclul β-lactamic.

Exemple de peniciline semisintetice antipenicilinazice: - metilicina - nafcilina - izoxazolilpenicilinele

rezistenta la β-lactamaza este favorizata de prezenta radicalilor voluminosi prezenti in molecula

= peniciline antistafilococice → sunt active in infectii provocate de majoritatea stafilococilor

- nu pot traversa peretele exterior al celulei si afinitatea scazuta pentru proteinele membranare specifice → rezistenta unor germeni gram-negativ la acest tip de peniciline

28

Tetraciclinele:

OBTINEREA BIOTEHNOLOGICA A TETRACICLINELOR

= antibiotice cu spectru larg de activitate antibacteriana fata de un domeniu larg de germeni

se caracterizeaza printr-o joasa toxicitate fata de organismele umane.

activitatea antimicrobiana a acestor antibiotice este de cel putin 0,75 U.I.\1mg substanta uscata

active la administrarea orala

una din familiile de agenti chimioterapeutici cu cea mai larga utilizare

- substante solide, cristaline, de culoare galbena

- au caracter amfoter (formand saruri cu bazele si cu acizi)

- cu ionii metalici produc chelati, produsi care pot fi folositi in etapele de purificare si separare a tetraciclinelor, precum si in operatiile de identificare si dozare ale acestora

- se caracterizeaza usor prin spectre electronice de absortie si fluorescenta , fiind singurele antibiotice colorate

29

Tetraciclinele se deosebesc intre ele functie de anumite caracteristici. Astfel:

- din punct de vedere al stabilitatii chimice tetraciclina simpla este

superioara celorlalte tetracicline si de aceea, de multe ori, este utilizata

drept compus de referinta in confectionarea discurilor pentru antibiograme;

- din punct de vedere al tolerantei digestive, tetraciclina simpla prezinta

cele mai putine efecte secundare;

- din punct de vedere al solubilitatii este necesar de subliniat ca au fost

obtinute preparate injectabile numai din tetraciclina si oxitetraciclina;

- din punct de vedere al actiunii antimicrobiene, tetraciclinele prezinta

actiune bacteriostatica, fiind mai active in fazele de metabolism microbian

intens.

Inconvenientele de utilizare a acestor antibiotice constau in:- solubilitatea redusa in apa - instabilitatea hidrolitica a clorhidratilor