Tehnici speciale utilizate in biologia celulara si moleculara

CULTURI CELULARE

Ce sunt culturile celulare?

• Culturile celulare reprezinta cultivarea in vitro a unor fragmente de tesut sau a unor suspensii celulare;naturale sau obtinute prin tehnici de laborator ,in scopul muliplicarii celulare.

Tipuri de culturi de celule

• Dupa felul substratului• Dupa modul de initiere a

culturii• Dupa tipul de material biologic

cultivat

A.Dupa felul substratului

•Pe suport organic nutritiv•Pe suport organic nenutritiv•Pe suport anorganic• In suspensie in mediul lichid

B.Dupa modul de initiere al culturii

Culturi initiate cu fragmente de tesut a)pe suport nutritiv: -culturi in picatura suspendata -culturi in flacoane -culturi in tuburi rotate b)pe suport nenutritiv c)in suspensie in mediu lichid(dar in

acestcaz se obtine numai supravietuirea celulelor)

B.Dupa modul de initiere al culturii

Culturi initiate cu celule dispersate• Culturi de celule libere in mod

natural(culturi de leucocite din sangele periferic,de elemente hematopoietice din maduva osoasa sau de celule recoltate din exudat)

• Culturi de celule obtinute prin dispersia celulelor din fragmente de tesut

C.Dupa tipul de material biologic cultivat

Culturi de organe-reprezinta scoaterea din organism a unuifragment de organ si introducerea acestuia intr-un mediu nutritiv

Culturi de celule-cultura de tesuturi -cultura celulara propriu-zisa(asocierea factorilor chimici-enzime etc)

MATERIALE DE LUCRU

• Cultrile celulare se prepara intr-un spatiu de lucru steril,amenajat special ce include:

-instalatie de apa curenta -gaze -electricitate

Nevoile de baze:

• Arie de lucru sterila• Sticlarie ,instrumente fine• Dispozitive de curatat si sterilizat• Recipiente de stocare pentrumediu,ser,sticlarie• Incubator si hota cu flux laminar• Sursa de apa• Mocroscop,agitator magnetic,balanta analitica• Substante chimice

Regulile tehnicilor aseptice

• Accesul limitat in zona de culturi celulare• Suprafetele se decontamineaza cu etanol

70%inainte si dupa utilizare• Nu se pipeteaza cu gura, nu se mananca,fumeaza

in zona de lucru• Hainele de protectie se folosesc numai in cadrul

incintei,fiind interzisa purtatrea lor si in afara ei• Se spala mainile inainte si dupa peratii,iar parul

se leaga• Se controleaza emisiile de aer, se sterilizeaza

incinta cu lampi UV

MEDIILE DE CULTURA CELULARA

Aceste medii trebuie sa asigure:• Echilibru ionic(obtinut cu substante izotone)• pH optim(mentinut cu substante tampon)• Temperatura optima• Elemente nutritive indispensabile metabolismului

(proteine animale ,aminoacizi esentialai si grasimi)

• Evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice si antifungice

• Stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugare de extracte embrionare

Medii de cultura celulara

CLASIFICARE:• Dupa consistenta: -lichide -semilichide• Dupa compozitie: -naturale -semisintetice -sintetice• Dupa valoarea urmarita si dupa scopul nutritiv: -medii de crestere -medii de mentinere

Medii de cultura celulara

CONTINUT:• O solutie salina -solutie tampon + indicator• Elemente proteice -ser,plasma,lichid amniotic,aminoacizi• Elemente stimulatoare ale cresterii• Vitamine• Antibiotice

Tehnica culturii celulare

Recoltarea se face din variate tesuturi provenite de

la om,animal,insecte,plante;in functie de aceasta

provenienta se impart in :• Tesuturi normale: -embrionare -adulte• Tesuturi tumorale

Tehnica culturii celulare

Pentru recoltare sunt indeplinite anumite conditii ,acestea sunt:

• Sa se evite contaminarea tesuturilor cu microorganisme prin respectarea riguroasa a asepsiei

• Sa se evite traumatizarea in timpul recoltarii si in cursul manevrelor ulterioare

• Sa se realizeze cat mai curand dupa deces• De la recoltare si pana la prepararea culturii

tesutul s epastreaza la rece, intr-o solutie salina cu antibiotice,timp de 3-4 ore

1.Tesuturi embrionare umane

• In acest caz recoltarea se face de la embrioni de 1-3 luni.Acesta se depoziteaza intr-un cristalizor steril,cu capac ce contine o solutie salina cu antibiotice

• Initial tegumentul embrionului este considerat contaminat,iar sterilizarea se realizeaza cu alcool iodat cu precautia ca acesta sa nu patrunda in cavitatile embrionului.

• Fragmentele de tesut embrionar curate se in alta cutie Petri sterila cu solutie alcalina dupa ce au fost inlaturate cheagurile de sange prin intermediul unor pense sterile.

• Dupa ultima spalare fragmentele se aseaza intr-o eprubeta de centrifuga sterila iar prin intermediul unor foarfeci sterili bine ascutiti se obtine o masa cu aspect omogen

• Sub actiunea tripsinei si a agitarii celulele se separa ,iar actiunea acestora se sfarseste in momentul in care solutia se raceste.Separararea celulelor de tripsina se realizeaza prin centrifugare

• Cu o pipeta Pasteur se recolteaza o cantitate de suspensie de tesut embrionar si se intinde pe un recipient de cultura

• Recipientul se lasa cu suprafat ccu suspensie in jos la o temperatua de 37˚,timp de 30- 60 de minute.

• Dupa aceasta perioada se introduce mediul nutritiv,iar recipientele sunt astuparte cu dop de cauciuc si incubate intr-un termostat la 37˚

• Pe perioada incubarii aceste recipiente nu trebuiesc miscate pe o perioada minima de 3-4 zile

2.Tesuturi adulte

• Aceste tesuturi provin prin interventie chirurgicala:

-piele -mucoase -tesut uterin -rinichi -splina si ganglioni etc.• Fragmentele se introduc in solutie salina cu

antibiotice ,unde se lasa 2-3 ore si apoi se efectueaza etapele de prelucrare preliminara identice cu ale embrionului.

Controlul culturii

Acesta este de doua feluri:• Controlul mediilor:-control pentru contaminatii

-control al constantelor fizico-chimice-control de eficienta

• Controlul morfologic:a)Tehnici de microscopie fotonica: -examinarea celulelor in stare vie la microscopul cu contras

defaza -examinarea preparatelor fixate si colorateb)Tehnici de histoautografiec)Tehnici de microscopie electronica

Cultivarea virusurilorCultivarea virusurilor pe culturi

celulare• Virusurile pot fi izolate pe celule vii, receptive.• Cultura celulară: sistem biologic in vitro alcătuit din celule

izolate vii, care îşi păstrează• capacitatea de multiplicare şi nu se organizează în

ţesuturi.• Condiţii necesare pentru păstrarea în viaţă a celulelor din

cultura celulară:• - condiţii aseptice• - mediu nutritiv (mediu de cultură lichid ce conţine

substanţe nutritive, sursă de• energie, factori de creştere, vitamine, sistem tampon,

indicator, antibiotice şi• antifungice) – mediile comercializate Eagle, Hanks, M199• - pH adecvat• - temperatură constantă• - atmosferă cu 10% CO2

• În funcţie de provenienţa celulelor, culturile celulare se clasifică în:

• - culturi de origine animală sau umană• - culturi de celule embrionare sau

adulte• - culturi de celule normale sau tumorale• Culturile celulare primare sunt culturi

realizate direct din ţesuturile sursă.• Liniile celulare stabilizate derivă din

culturile primare, se menţin în viaţă timp nelimitat prin

• subcultivări.

Realizarea culturilor primare din tesuturi solide

• - se prelevă ţesutul sursă în condiţii aseptice• - se fragmentează ţesutul în bucăţi de aprox. 1 mm3, se

spală cu soluţie salină• tamponată (SST) pentru îndepărtarea sângelui• - disocierea enzimatică a celulelor: tripsinizarea

fragmentelor tisulare în soluţie de• tripsină 0,25% (enzimă proteolitică, desface legăturile

peptidice) pe agitator• magnetic – desfacerea legăturilor intercelulare• - colectarea celulelor izolate în vas colector – se face prin

filtrare pentru a obţine• numai celule izolate• - repetare tripsinizării până la epuizarea ţesutului, în

timpul tripsinizării vasul• colector se păstrează la temperatura de 4°C pentru

inactivarea tripsinei

• centrifugarea suspensiei de celule izolate, îndepărtarea supernatantului (tripsina),

• spălare cu SST, în final suspendarea celulelor în mediu nutritiv

• - controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan (se colorează

• celulele moarte) – pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie să fie vii)

• - numărarea celulelor, ajustarea lor la concentraţie de 300000 celule/ml, repartizare

• volume egale în flacoane de culturi celulare• - 2 -• - incubare în poziţie culcată• - urmărirea formării culturii cu microscopul invers• Culturi provenite din celule:• - normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se

multiplică până acoperă• peretele flaconului, realizează o cultură monostrat

(fenomenul inhibiţiei de• contact)• - tumorale: se multiplic şi după acoperirea suprafeţei

disponibile, cresc în mai multe straturi şi în suspensie

Subcultivarea culturilor celulare

• După 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizează substanţele nutritive, sursele de energie, se

• acidifică mediul. Pentru menţinerea celulelor în viaţă, acestea trebuie pasate, subcultivate. Se

• realizează prin versenizare. Celulele se detaşează de pe peretele flaconului cu soluţie de

• EDTA (versen), se centrifughează, se spală cu soluţie SST şi se resuspendează în mediu

• nutritiv. Se verifică viabilitatea celulelor, se numără celulele şi se ajustează la concentraţia optimă. Se repartizează volume egale în flacoane de cultură celulară.

• Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de câteva ori (4-6)

• după care celulele mor (apoptoză)• Cele realizate din ţesuturi embrionare pot fi

subcultivate de mai multe ori (celule• nediferenţiate), 60-80x, după care mor.• Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit.

Aceste se obţin din ţesuturi tumorale (HeLa, KB,• Detroit 6, etc) sau din culturi celulare efectuate

din ţesuturi normale care au suferit• transformare malignă spontană (Vero). Liniile

celulare sunt bine caracterizate, se manevrează• uşor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.

Inocularea suspensiilor virale în culturile celulare, identificarea

izolatelorvirale

• Se îndepărtează mediul nutritiv şi se introduce în flacon suspensia virală pregătită în prealabil.

• După o incubare de 1 oră (penetrarea virusurilor în celulele receptive) suspensia se

• decantează, se adaugă mediu de întreţinere (mai sărac în substanţe nutritive decât mediul

• nutritiv, dar care permite supravieţuirea celulelor), se incubează. În zilele următoare se

• urmăresc modificările survenite în cultura celulară.

• Identificarea izolatelor se face prin metode

nespecifice şi specifice.

• Metode nespecifice:• - urmărirea efectelor citopatice (desprinderea celulelor de pe

suprafaţa pereţilor,• rotunjirea celulelor, agregarea lor în ciorchine, formarea

sinciţiilor)• - detectarea incluziilor virale• - hemadsorbţia – se foloseşte la detectarea replicării virale în cazul

în care virusul nu• produce efect citopatic (virusul ifluenza): membrana celulelor în

care se replică• virusul are structura modificată, hematiile adăugate aderă de

acestea• - interferenţa: se bazează pe faptul, că o celulă deja infectată cu un

virus nu poate fi• infectată cu un alt virus – se foloseşte pentru detectarea virusurilor

neproducătoare• de ecp• - formarea plajelor• - transformarea spontană• - microscopia electronică• Metode specifice• - detectarea antigenelor virale prin reacţii antigen-anticorp• - detectarea acizilor nucleici virali – reacţii de hibridizare, PCR

Izolarea virusurilor pe oul de gaina embrionata