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BiotecnologBiotecnologa Industriala IndustrialProducciProduccin
industrial de Metabolitos n industrial de Metabolitos
BiorreactoresBiorreactores
CONCEPTOS y TECNICAS de CONCEPTOS y TECNICAS de
BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
((FCEyNFCEyN UBA )UBA )
Miryan CassanelloPINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA
E-mail: [email protected]
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Estadstica: ao 2002(Fuente: Kent y Riegel, 2007)
Relevancia econmica de los productos generados industrialmente
mediante procesos biotecnolgicos
Productos Productos biotecnolbiotecnolgicosgicos:: estn en todos
los sectores de la
drogas (genricas y no-genricas)
productos de belleza
procesamiento de alimentos para humanos y animales
procesamiento textil y artculos de limpieza
aplicaciones industriales: produccin masiva de alcohol
suplementos nutricionales
vida diaria:
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Productos Organismo tpico utilizado Mercado mundial(ton/ao)
Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones
Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum
2.000cidosorgnicos
Acido ctrico Aspergillus niger 230.000Acido glucnico Aspergillus
niger 50.000Acido lctico Lactobacillus delbrueckii 20.000
Aminocidos Acido L-glutmico
Corynebacterium glutamicum 300.000
L-lisina Brevibacterium flavum 30.000L-fenilalanina
Corynebacterium glutamicum 2.000L-arginina Brevibacterium flavum
2.000
Antibiticos Penicilinas Penicillium chrysogenum
40.000Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000Tetraciclinas
Streptomyces aureofaciens 10.000
Productos obtenidos mediante procesos biotecnolProductos
obtenidos mediante procesos biotecnolgicosgicos
(Fuente: Doran, 1995)(Fuente: Doran, 1995)
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Producto Organismo tpico utilizado Mercado mundial(ton/ao)
Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600-Amilasa Bacillus
amyloliquefaciens 400Glucoamilasa Aspergillus niger 400Glucosa
isomerasa Bacillus coagulans 100Pectinasa Aspergillus niger 10
Polmeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000Dextrano
Leuconostoc mesenteroides 200
Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10Vacunas Difteria
Corynebacterium diphterie < 50 kg/ao
Ttanos Clostridium tetani PequeaProtenasteraputicas
Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/aoInterfern-2
Escherichia coli recombinante 10Hormona de crecimiento
Escherichia coli recombinante o clulas recombinantes de
mamferos
Pequea
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BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
BiotecnologBiotecnologaaROJAROJA
BiotecnologBiotecnologaaBLANCABLANCA
BiotecnologBiotecnologaaVERDEVERDE
BiotecnologBiotecnologaaAZULAZUL
Biotecnologa BLANCA (o industrial): Aplicacin en la industria en
general, productos qumicos, nuevos materiales, biocombustibles,
etc.
Biotecnologa VERDE: Aplicacin en agro-alimentos
Biotecnologa AZUL: Aplicacin en organismos marinosBiotecnologa
ROJA:
Aplicacin en medicina
IngenierIngenieraa QuQumicamicaQuQumicamicaBiologBiologaa
BioquBioqumicamica
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BIOTECNOLOGIA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALINDUSTRIAL
Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la
aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al
procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer
bienes y servicios. (Definicin de la OECD)
Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y
enzimas.
Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas,
productos medicinales, etc.
Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin de
aguas y tratamiento de efluentes.
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Bibliografa libros de textoBioprocess Engineering. Basic
concepts, Michael L. Shuler, FikretKargi, Prentice Hall Int.
Series, 2nd Ed. 2002.Kent and Riegels Handbook of Industrial
Chemistry andBiotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial
Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A.
Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007.Principios de
Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran, Editorial Acribia
S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998)Biochemical Engineering
Fundamentals, James E. Bailey, David. F. Ollis, McGraw-Hill Int.
Ed., 2nd. Ed. 1986.Biochemical engineering and biotechnology,
Ghasem Najafpour, Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13:
978-0444528452Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen,
John Villadsen, Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10:
0306473496; ISBN-13: 978-0306473494
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Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrialXu, J.,
Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of
pharmaceutical proteins with plant cell suspension cultures.
Biotechnology Advances 29 (2011) 278299Brennan, L., Owende, P.,
Biofuels from microalgaeA review of technologies for production,
processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable
and Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577Huang, T-K.,
McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant
protein production in plant cell suspension cultures. Biochemical
Engineering Journal 45 (2009) 168184Rosche, B., Li, X.Z., Hauer,
B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: a concept for
industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009)
636643Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation
technologies: Development of novel sourdoughs. Food Microbiology,
24 (2007) 155160Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya
sustainable alternative for chemicalindustry. Research review
paper. Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499Butler, M., Animal
cell cultures: recent achievements and perspectives in the
production of biopharmaceuticals. Appl Microbiol Biotechnol, 68
(2005) 283291Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells.
Appl Microbiol Biotechnol, 59(2002) 135142
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Objetivo de la produccin industrial de clulas o de
microorganismos
Producir las mismas clulas o microorganismos (biomasa) en gran
escala
Producir en gran escala compuestos (intracelulares o
extracelulares) resultantes del crecimiento celular
(metabolitos)
Metabolitos Primarios
Metabolitos Secundarios
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Metabolitos primariosMetabolitos primarios-Molculas generalmente
sencillas, que participan de los caminos metablicos esenciales. Son
casi idnticos en todos los organismos.
-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido
de actividad biolgica y frecuentemente son commodities
1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos:
protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y
polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.
2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa,
ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico, ctrico,
actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes (xilitol, etanol,
glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys, Thr, Glu, Trp, Phe),
vitaminas (B2, B12), nucletidos saborizantes (cidos inocnico y
guanlico), polisacridos y polisteres de reserva.
Microorganismos productores: bacterias, levaduras y hongos
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Metabolitos secundariosMetabolitos secundarios-Molculas mas
complejas, que participan de caminos metablicos no-esenciales, pero
confieren capacidades de supervivencia en situaciones de
stress.
-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de
la especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en
condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de
producir alto contenido de actividad biolgica
-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionan
en los organismos que los producen como:1. Armas contra otros
microorganismos (antibiticos, toxinas,
inhibidores enzimticos, pesticidas)2. Factores de crecimiento
(hormonas)3. Ionforos4. Agentes de interaccin microbiana5.
Efectores externos
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PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o PROCESOS BIOTECNOLOGICOS o
FERMENTACIONESFERMENTACIONES
Biorreactoro
Fermentador
Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los
cuales se transforman los sustratos de un medio de cultivo
(materias primas) en metabolitos y/o en biomasa (productos)
empleando para este fin microorganismos, clulas o enzimas.
Operaciones unitarias
Operaciones unitarias
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Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de
un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:
1)Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un
tubo congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o
de una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se
propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen del
medio de cultivo.
EsterilizacinPreparacin de
medios
FermentacinSeparacin
Purificacin
Propagacin de los cultivos
2)Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se
esteriliza. Se siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de
la escala industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador
industrial~10-1000 m3).
Tratamiento de efluentes
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3)Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de
clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin,
adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquido-lquido,
extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de afinidad;
aislamiento y acondicionamiento del producto.
Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de
un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:
EsterilizacinPreparacin de
medios
FermentacinSeparacin
Purificacin
Tratamiento de efluentes
Propagacin de los cultivos
4)No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa
imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el
medio.
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SelecciSeleccin (n (screeningscreening))En la seleccin del
microorganismo/clula, se debe tener en cuenta:
1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.
2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes.
4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de
cultivo de costo reducido.
5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo
sin prdida de sus caractersticas.
6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo
corto.
7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto
rendimiento y de fcil recuperacin a partir del medio de
cultivo.
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Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera
gentica para crear diversidad.
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PreparaciPreparacin de medios de cultivo n de medios de cultivo
EsterilizaciEsterilizacin n
Los componentes de los medios de cultivo son los efectores
externos de naturaleza qumica que deben cumplir con los
requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y
suministrar energa para el mantenimiento celular.
Componentes de un medio de cultivo:
1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes
de C, N, S, P, K y Mg
2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las
sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o
g/L
3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos
que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica
especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas, algunos
aminocidos, etc.)
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PreparaciPreparacin de medios de cultivo n de medios de cultivo
EsterilizaciEsterilizacin n
Los medios pueden clasificarse considerando la naturaleza qumica
de los componentes en:
1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos
2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias
de origen animal o vegetal (ej.: extracto de levadura, macerado de
maz, harina de soja, etc.) que aportan las sustancias fundamentales
pero son qumicamente indefinidas y de composicin variable.
Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar
previamente a ponerse en contacto con el inculo. Esterilizar
significa eliminar toda forma de vida de un medio o material.
Generalmente se llevaa cabo por filtracin o calentamiento.
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SeparaciSeparacin y purificacin y purificacin (n
(downstreamdownstream)): depende de la eficiencia del proceso y del
producto a obtener
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Cintica de crecimiento de biomasaDefinicionesCrecimiento en
cultivos discontinuos o batch: Factores que afectanCuantificacin de
la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin de MonodCrecimiento
en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato
Fermentaciones Fermentaciones -- fermentadores o fermentadores o
biorreactoresbiorreactoresEs el corazn del proceso y debe
optimizarse para evitar posteriores etapas de separacin y
purificacin.
Fermentaciones
Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica
del crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la
velocidad de formacin de los productos deseados.
discontinuas o batchsemicontinuas (fed-batch)continuas
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CinCintica de crecimiento microbianotica de crecimiento
microbiano
nX P X S ++
El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin
auto-cataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la
concentracin de clulas.
biomasa decantidadmayor aresextracelul
productos biomasa ustratoS ++
aumento en el nmero de clulasaumento del tamao de las
clulasCrecimiento
dtdX
X1
neta X: concentracin msica de clulas (g/L)t: tiempo (h)
Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1):
-
La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia
entre la velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de
biomasa por muerte celular o por metabolismo endgeno:
Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la
concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin msica
de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefiere la
concentracin msica.
Formas de medir la concentracin de clulas
DirectosIndirectosMtodos
Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuesta
rpida.
dgneta k=
-
DeterminaciDeterminacin de la concentracin de la concentracin mn
msica de csica de clulas:lulas:Mtodos directos (en ausencia de
otros slidos en suspensin):
Masa de clulas secas
(centrifugado/filtrado/lavado/secado)Volumen de clulas
centrifugadas en condiciones estndarAbsorcin de luz por clulas en
suspensin
Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser
la velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un
producto.
Productos: etanol, CO2Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato
base de C o NPropiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH
Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masa
de clulas.
UZL O ATP uciferinal luciferasa2 ++ Sensible> 10-12
gATP/L
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CinCintica de crecimiento de un cultivo en tica de crecimiento
de un cultivo en batchbatch
Etapas:Etapas:1) de latencia o
induccin2) de crecimiento
exponencial 3) de desacelera-
cin4) estacionario5) de muerte o
declinacin celular
1) 1) LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende
del inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) 2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida
multiplicacin de clulas crecimiento balanceado (composicin de
clulas constante).
3) 3) DesaceleraciDesaceleracin:n: por consumo de un nutriente
esencial o generacin de subproductos txicos crecimiento
desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones
hostiles.
4) 4) Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula.
Las clulas an son activas y pueden producir metabolitos secundarios
(ej. antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin
celular
5) 5) Muerte:Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el
lmite con la etapa anterior.
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1) 1) LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende
del inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptar
ex-situ.
2) 2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida
multiplicacin de clulas crecimiento balanceado (composicin de
clulas constante).
3) 3) DesaceleraciDesaceleracin:n: por consumo de un nutriente
esencial o generacin de subproductos txicos
crecimientodesbalanceado, las clulas deben readaptarse a las
condiciones hostiles.
4) 4) Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula.
Las clulas an son activas y pueden producir metabolitos secundarios
(ej. antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin
celular
5) 5) Muerte:Muerte: baja el nmero de clulas, difcil definir el
lmite con la etapa anterior.
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t0netanetag
netaeXX dtX
dX dtdX
X1 ===
Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas
crecen con la misma velocidad la composicin media de las mismas
permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimiento etapa de
crecimiento exponencialexponencial. En este perodo, la velocidad de
crecimiento es independiente de los nutrientes y resulta en una
cintica de primer orden.
netad0
)2ln( X2X ==Tiempo necesario para duplicar la biomasa:
-
Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no
crecen con la misma velocidad la composicin media se modifica. Esta
situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionariaetapa
estacionariaEl estrs producido por la falta de nutrientes o por la
existencia de subproductos o toxinas inhibidoras que generan un
medio hostil induce una reestructuracin de las clulas para
adaptarse a las nuevas condiciones.
dgnetag k=Puede ocurrir:La concentracin msica de clulas (X) es
constante pero baja el nmero de clulas viables.X baja por lisis de
clulas. Puede aparecer un segundo perodo de crecimiento, los
productos de lisis o las clulas muertas constituyen un sustrato
alternativo (crecimiento crptico).X constante pero su metabolismo
es activo; cambia la regulacin celular produciendo metabolitos
secundarios.
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Coeficiente de mantenimientoCoeficiente de mantenimiento:: se
emplea para definir la velocidad especfica de consumo de sustrato
para energa de mantenimiento.
mdtSd
X1 - m
=EnergEnerga de mantenimientoa de mantenimiento:: necesaria para
mantener la membrana celular activa y el transporte de nutrientes,
y para funciones metablicas esenciales como la movilidad y la
reparacin de estructuras daadas.
Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida
de masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).
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Otras definiciones: Coeficientes de rendimientoOtras
definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base a la
cantidad consumida de otro componente.Rendimiento de formacin de
clulas por masa de sustrato consumida (g clulas/g S)YX/S es un
valor constante en la etapa de crecimiento exponencial.Luego de la
etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser constante, es un
rendimiento aparente porque el sustrato se emplea para otros
fines:
tenimiento-man para
energia
cimiento-cre para
energiaproductos de
formacionbiomasa de
formacion SSSSS +++=
Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros
componentes:
SPY ;
DOXY P/SOX 2
==
/
SXY S/X
=
-
g/g 4,19,0Y ; g/g 6,04,0Y2X/OS/X
==
Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en
glucosa; para la mayora de las bacterias y levaduras:
(en condiciones anaerbicas suelen ser menores)
Los rendimientos dependen del medio y de la fuente de C.
Para la mayora de los casos:
=
consumido C de gbiomasa g
g/g 4,01 Y S/X
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(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria,
donde la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.
RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del
crecimiento de biomasa con la formacin de n de
productos:productos:
gX/PP YdtdP
X1q ==Definimos la velocidad especfica de formacin
de producto, qP
X/PgP Y q ==
+= gP q
Se encuentran 3 situaciones:(a) qP asociada al crecimiento
celular, ej: produccin de una enzima constitutiva de la biomasa
(metabolito primario).
(b) qP parcialmente asociada (etapa de desaceleracin y
estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos
metabolitos secundarios.
0 ;tetanconsq gP ===
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RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del
crecimiento de biomasa con la formacin de n de
productos:productos:
dtdX
X1 Y Y
dtdP
X1q X/PgX/PP ===
gP q = += gP q =PqAsociada Parcialmente asociada No asociada
Metabolitos primarios Metabolitos secundarios
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Factores que influyen Factores que influyen Temperatura del
medioTemperatura del medio
-psicrfilos (Top < 20C)-mesfilos (20
-
Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero de
clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la de
crecimiento.
Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con
Ea 1020 kcal/mol Ed 6080 kcal/molLa muerte celular es ms
sensible a T que el crecimiento (importante para la
esterilizacin)
La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero la
Top y la Ea suelen ser distintas.
Tambin influye sobre el YX/S porque para T>Top, la energa de
mantenimiento es mayor baja YX/SPara organismos inmovilizados puede
cambiar el control.
)/exp(' RTEA ag = )/exp( RTEAk ddd =
-
Factores que influyen Factores que influyen pHpH del mediodel
medio
Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH.
Existe un pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a
7. Se puede
incrementar el rango adaptando las clulas por incrementos
pequeos.
Rango de pH ptimo
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El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la
formacin de producto.
Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo.El
pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.
- levaduras: 3 6 - hongos: 3 7 - clulas vegetales: 5 6 - clulas
animales: 6,5 7,5
Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de
mantenimiento.
El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,
aminocidos, CO2)
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Factores que influyen Factores que influyen
concentraciconcentracin de On de O22 disuelto (DO):disuelto (DO):Es
un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas.Debido a la
baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de la
velocidad de crecimiento. La solubilidad del oxgeno en agua depende
de la presin, de la temperatura y de las sales disueltas (a presin
atmosfrica es 7ppm).La concentracin crtica de oxgeno disuelto
CO2,critica es aquella por debajo de la cual comienza a controlar
la velocidad de crecimiento: 510% de la concentracin de saturacin
para bacterias y levaduras y 1050% de la concentracin de saturacin
para hongos (segn el tamao)
-
Transporte de oxgeno a las clulas
El O2 se introduce por burbujeo y su concentracin depende de la
agitacin.
= bO*OLGL 22 CCakOTR
Velocidad de consumo de oxgeno (OUR):
22 O/X
gO Y
XXqOUR
==
Velocidad de transferencia:
-
Factores que influyen Factores que influyen otros factoresotros
factores
Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta
relacionado con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones
de otros iones.Potencial de reduccin del medio:
Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de
nitrgeno) o por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S,
HCl).
Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para
algunas clulas y necesaria para otras. Se regula modificando la
concentracin en la corriente de burbujeo.
Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y
hacia el interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la
carga de los iones en el medio:
( ) ( ) ( )( )+++= HP060EmVE2O0
loglog,
=i
2ii2
1 ZcFI
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GeneraciGeneracin de calor por crecimiento microbianon de calor
por crecimiento microbiano4050% de la energa suministrada por las
fuentes de C se convierten en ATP (forma en que las clulas acumulan
energa) el resto se libera como calor. El calor liberado se puede
calcular a partir de las entalpas de combustin del sustrato y de la
biomasa formada:
celulas OH CO 22 ++Ciclo entlpicopara calcular el calor
generado
Combustin de las clulasHc (kJ/g)
Crecimiento microbiano y respiracin
1/YH (kJ/g clula)
OH COO Sustrato 22)g/kJ(H sustrato,
del combustion
2S + +
cS/XS
S/XH
Hc
S/X
SHYH
YY
Y1H
YH
=+=
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Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulasYH ~0,42 g/kcal
(glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)
0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)
El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad
de calor que evoluciona por el metabolismo de las clulas.
Para clulas en crecimiento activo, el requerimiento para
mantenimiento es bajo la evolucin de calor est directamente
relacionada con el crecimiento.
Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch
se calcula considerando la velocidad de crecimiento.
En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de
consumo de oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.
VY1X QH
netagenerado =
2OgeneradoQ 12,0 Q =
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Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa
externa (b) serpentn externo (c) serpentn interno helicoidal (d)
serpentn interno tipo deflector (e) intercambiador de calor
externo
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Reactor Reactor batchbatch de de escala laboratorioescala
laboratorio
-
Reactor Reactor batchbatch de de escala industrialescala
industrial
-
EstequiometrEstequiometraa del crecimiento microbiano y
formacidel crecimiento microbiano y formacin de n de
productosproductos Procesos complejos reflejan el transcurso de
miles de reacciones intracelulares.
Es importante poder comparar el rendimiento y la generacin de
calor que se obtiene empleando distintos sustratos la estequiometra
de conversin de sustratos a biomasa y a productos extracelulares se
suele representar por ecuaciones pseudoqumicas simples.
22 32nm CO e OH d NOCH c NH b O a OCH ++++ CHmOn representa un
mol del carbohidrato empleado como sustrato
CHON representa un mol del material celular
La composicin del material celular depende del tipo de
organismo. Un mol de material biolgico es aquel que contiene un
tomogramo de C
-
Composicin elemental de la bacteria Escherichia coliElemento %
en masa seca
C 50O 20N 14H 8P 3S 1K 1Na 1Ca 0.5Mg 0.5Cl 0.5Fe 0.2
Otros 0.3
92% de la masa seca total esta formado por C, O, N, H
Componentes minoritarios no se tienen en cuenta en la frmula
mnima
Por que una frmula mnima escrita como: CHaObNd ?
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Balances elementales:
22 32nm CO e OH d NOCH c NH b O a OCH ++++
= ++=++=+ +=
c 3b :N 2e d c 2a n :O
2d c 3b m :He c 1 :C
Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2 producidos por mol de
O2 consumido provee una indicacin del estado metablico y puede
emplearse para controlar el proceso.
ae
consumidos O molesgenerados CO moles
RQ2
2 ==
Los balances para H y O pueden no dar informacin correcta por la
gran masa de agua que tienen las clulas se requiere informacin
adicional.
Los coeficientes estequiomtricos y la frmula mnima se calculan
planteando balances elementales, la informacin del cociente
respiratorio y un balance de electrones disponibles.
-
Para las reacciones mas complejas, con formacin de productos
extracelulares, se agregan componentes Fhay un coeficiente
estequiomtrico ms y se requiere mayor informacin.Adems, los
balances elementales no se relacionan con los cambios de energa
involucrados en la reaccin.Fse desarroll el concepto de grado de
reduccin, , para poder plantear balances de electrones y protones
en bioreacciones.
Balance de electrones disponibles:
Grado de reduccin: nmero de equivalentes de electrones
disponibles por tomo-gramo de C. Los electrones disponibles son
aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.
= productos,i iisustratos,i iireduccion de grados: ;
costriestequiome.coef: ii
-
CinCintica de crecimiento microbiano: Modelostica de crecimiento
microbiano: Modelos
nX P X S ++ ( )
dtdX
X1kdgneta
biomasa decantidadmayor productos biomasa ustrato ++
aresextracelulS
X: concentracin msica de clulas (g/L)t: tiempo (h)
neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1)g: Velocidad
especfica de crecimiento de biomasa (h-1)kd: constante de muerte
celular o disminucin de masa celular por metabolismo endgeno
(h-1)
-
CuantificaciCuantificacin de la cinn de la cintica de
crecimiento: modelos cintica de crecimiento: modelos
cinticosticosDescripcin detallada Fdebera involucrar
diferenciaciones en la estructura de la clula y la segregacin del
medio de cultivo en unidades que pueden tener diferentes
concentraciones y propiedades fsico-qumicas Fmodelos
estructurados-segregados
Modelos EstructuradosFTienden a representar la estructura de las
clulas. Pueden dividir la clula en sus componentes y considerar las
reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zonade
la clula, como respuesta a cambios en el medio.
Modelos SegregadosFTienen en cuenta que el medio no es homogneo,
permiten variaciones de concentraciones de biomasa y de nutrientes
y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del medio
(viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten considerar la
posibilidad de agregacin de clulas.
-
El grado de realismo y complejidad de un modelo depende del
depende del objetivo objetivo Fse debe elegir el modelo ms simple
capaz de
representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.
No estructurados
No segregados
Estructurados
No segregados
No estructurados
Segregados
Estructurados
Segregados
M
A
Y
O
R
C
O
M
P
L
E
J
I
D
A
D
MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD
Son ms realistas, pero
son complejos y demandantes de
tiempo de clculo.
-
Modelos No-EstructuradosFSuponen una composicin fija de la clula
(equivalente a suponer crecimiento balanceado). -Son estrictamente
vlidos para la etapa de crecimiento exponencial en batch-No andan
bien para transientes, salvo que la respuesta de la clula sea rpida
y/o las perturbaciones sean leves.
Modelos No-SegregadosFConsideran un medio homogneo. -Representan
adecuadamente muchos casos.
Nos restringimos a los modelos
No-estructurados/No-segregados
-
S (M)
g(h-1)
Modelos cinModelos cinticos de crecimiento: controlados por
sustratoticos de crecimiento: controlados por sustrato
FSuponen que la cintica depende solamente de un nico sustrato
esencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no
afectan. Ms difundido FF Modelo de Modelo de MonodMonod
Supone que un Supone que un nico sistema nico sistema
enzimenzimtico controla el consumo de tico controla el consumo
de
sustrato y que dicho sistema sustrato y que dicho sistema
determina la velocidad de determina la velocidad de crecimiento de
biomasacrecimiento de biomasa.
La premisa es generalmente falsa, pero la ecuacin de Monod
ajusta
una amplia gama de resultados experimentales y es la expresin ms
empleada para el diseo de
fermentadores.
SKS s
mg +=
-
S (M)
g(h-1)
SKS s
mg +=
m: mxima velocidad especfica de crecimiento de biomasa
smg KS cuando >>=Ks: constante de saturacin o de
velocidad media
sm21
g KS cuando ==
Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de
crecimiento y baja densidad de clulas. Para cultivos concentrados
se usan expresiones similares, modificando Ks:
SSKS 0S
mg
0+=
SSKK
So 0ss
mg
01++=
-
Nociones de diseNociones de diseo de fermentadores o o de
fermentadores o biorreactoresbiorreactoresLa eleccin del tipo de
reactor y de la estrategia de operacin define la produccin a
obtener y la pureza del producto (nmero y tipo de impurezas,
reactivos sin convertir). Tambin determina si se puede lograr un
producto de calidad constante y una operacin confiable.En
bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.
Tipos de reactores comnmente empleados
Discontinuos o batch: una vez que se carga, el proceso ocurre
sin ingreso de sustrato ni salida de productos.
Continuos (quimiostato): hay alimentacioncontinua de sustrato y
retiro continuo de productos
Semicontinuos (Fed-batch): hay ingreso continuo o intermitente
de sustratos, sin retiro de productos.
-
Reactores discontinuos o batchProduccin de biomasa o de un
producto asociado a crecimiento (metabolito primario):En un batch
se observan 4 etapas:1) Preparacin para la nueva operacin
(limpieza, esterilizacin,
llenado del reactor)2) Sembrado y perodo de induccin3) Perodo de
crecimiento exponencial4) Recuperacin del producto del reactor
La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un
tiempo muerto, tm, a considerar en el diseo del reactor vara con el
tamao del reactor y con el tipo de fermentacin pero generalmente es
del orden de las horas (310 hs)tiempo total de operacin para llegar
a una concentracin final de biomasa Xf :
+= 0
f
netamc X
X1tt ln
-
La concentracin final de biomasa, Xf , depende de la cantidad de
sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:
( )SSYXX 0S/X0f =La mayora de las fermentaciones operan con una
relacin Xf/X0 de aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de
biomasa por operacin del reactor batch, rb , se calcula dividiendo
la masa total que podemos formar por el tiempo que lleva la
operacin:
( ) ( ) m0fneta 0SXb tXX1SY
r += ln/ /
Una operacin en un quimiostato en condiciones ptimas conduce a
una produccin significativamente superior. De todos modos, la De
todos modos, la mayormayora de las fermentaciones son procesos
discontinuosa de las fermentaciones son procesos discontinuos..
smkg
3
3mkg
-
Por qu? En muchos casos no interesa el producto asociado a
crecimiento;el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la
produccin del producto deseado. En esos casos el producto deseado
se genera solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo
de la que lleva a la ptima productividad de biomasa.
Para Para producciproduccin de metabolitos secundarios, la
productividad n de metabolitos secundarios, la productividad en un
en un batchbatch puede superar significativamente a la de un puede
superar significativamente a la de un quimiostatoquimiostato. .
Otra razn importante para que se prefiera la operacin
discontinua es la inestabilidad gentica. Los microorganismos que se
emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienenmenor
velocidad de crecimiento que las originales.
Un Un quimiostatoquimiostato impone una selecciimpone una
seleccin severa cuando hay n severa cuando hay mezclas de cultivo,
conduciendo a la cepa de mayor velocidad mezclas de cultivo,
conduciendo a la cepa de mayor velocidad de crecimiento.de
crecimiento.
-
Por qu? Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la
confiabilidad de la operacin. Los reactores batch conducen a
productos con mucha variabilidad genera problemas en las etapas de
purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla
mecnica o de control de alguna variable de operacin o de la
esterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos.
Las consecuencias de una falla de operaciLas consecuencias de
una falla de operacin son mas graves n son mas graves en un sistema
continuo y las pen un sistema continuo y las prdidas mayores.
rdidas mayores.
La economa de mercado influye en la seleccin del reactor. Un
sistema continuo es un sistema dedicado a un dado proceso unnico
producto.
Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeMuchos
productos de fermentaciones se requieren en pequeas as cantidades y
su demanda es difcantidades y su demanda es difcil de proyectar.
Los sistemas cil de proyectar. Los sistemas batchbatch son mson ms
verss verstiles, el mismo reactor puede emplearse tiles, el mismo
reactor puede emplearse para distintos productos.para distintos
productos.
-
Cultivos continuosCultivos continuosFse agrega un medio con
nutrientes frescos en forma continua, a un volumen de control que
contiene las clulas. Se retiran continuamente productos y parte de
las clulas.-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P
permanecen constantes en un dado punto del reactor.-Los cultivos
continuos proveen un medio de cultivo constante para el crecimiento
de las clulas y para la formacin de productos
FFcalidadcalidad uniforme de los productosuniforme de los
productos-Pueden ser una herramienta importante para determinar
como un microorganismo responde al medio, y para generar un
producto en condiciones ptimas.
Sistemas para lograr cultivos
continuos
Quimiostato
Turbidistato
Flujo Pistn Ideal (FPI): mezclado radial mezclado radial
perfecto y mezclado axial nuloperfecto y mezclado axial nulo; poco
empleado, salvo para inmovilizados
Sistemas con mezclado mezclado perfectoperfecto: Tanques
continuos idealmente agitados (TCIA)
-
Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controlado
por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las
condiciones qumicas del medio son constantes.
-
Turbidistato: la concentracin de clulas en el reactor se
mantiene constante. La alimentacin se regula mediante el monitoreo
de la densidad ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando
la turbidez supera un lmite prefijado. El volumen se mantiene
constante retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se
agrega.Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y
porque el medio cambia.
Puede ser muy til para seleccionar subpoblaciones que puedan
soportar condiciones de stress, porque la concentracin de clulas se
mantiene constante.
-
FPI (Flujo Pistn Ideal):
como no hay retromezclado, los elementos de fluido con clulas
activas no pueden inocular elementos de fluido nuevos aguas arriba
se requiere el reciclo continuo de clulas para inoculacin continua
del medio fresco alimentado.
Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posicin en el
reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.
Equipos con clulas inmovilizadas (trickling filters) se asemejan
a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en
tratamiento de efluentes.
L(+G,S)
L(+G,S)
-
Fotobiorreactor tubular helicoidal de 1000 L (Murdoch
University, Australia)
Recuperacin de microalgas a partir del medio de cultivo por
filtracin
Cyanotech Corporation(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.
-
Cultivos continuos: Quimiostato idealEs un tanque agitado que se
opera con circulacin continua (TCIA) del medio de cultivo. La
mayora requiere control (pH, T y CO2).Se alimenta medio estril (X0=
0) a un tanque perfectamente agitado (y aireado si es fermentacin
aerbica). Se deja salir la suspensin de clulas para mantener las
concentraciones y el volumen de lquido constante.
Burbujeo de gas
FvS0, X0, P0
FvS, X, P
Volumen de lquido = volumen de reactor = V
Las concentraciones a la salida del reactor son
iguales a las del interior por la hiptesis de mezclado
perfecto
-
Balances de masa FEcuaciones de diseoPlanteando balances de masa
para los distintos componentes, se obtienen las ecuaciones de
diseo.
=
+
V.C. del dentro
acumulada Masa
V.C. del dentro
generada Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
reactivos loscon
VC al entra que Masa
productos loscon
VC del saleque Masa
Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO
Un quimiostato opera en estado estacionario F se cancela el
trmino de acumulacin de masa:
+
=
+
V.C. del dentrogenerada Masa
reactivos los con V.C. al entra que Masa
V.C. del dentro consumida Masa
productos loscon V.C. del sale que Masa
-
Gas
FvS0, X0, P0
FvS, X, P
V
Quimiostato - ecuaciones de diseo
Balance de masa de clulas:
+
=
+
V.C. del dentrogenerada Masa
reactivos los con V.C. al entra que Masa
V.C. del dentro consumida Masa
productos loscon V.C. del sale que Masa
XVXFXF neta0VV += ( )XkVXFXF dg0VV += Definiendo el factor de
dilucin como caudal/volumen: D = FV/V( )XkDXDX dg0 += Si se
alimenta medio estril (X0= 0) y el mecanismo endgeno es
despreciable( )XkDXDX dg0 += gD =
FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)
-
Importancia de este resultado: En un quimiostato en EE,
alimentado con medio estril y en condiciones en las que el
metabolismo endgeno es despreciable,la velocidad o factor de
dilucin, D, iguala a la velocidad de crecimiento de clulas
FF se puede manipular la velocidad de crecimiento como un
parmetro independiente modificando las variables de operacin
FF el quimiostato es una herramienta experimental poderosaSi la
velocidad de crecimiento sigue la expresin de Monod
SKS
D sm
g +== S: concentracin de sustrato limitante
del crecimiento de biomasa en EE
Si se impone un factor de dilucin D > m , las clulas no se
podrn reproducir lo suficientemente rpido para mantenerse F se
lavan, o se vaca el quimiostato (washout)
gD =
-
FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)S:
concentracin de sustrato limitante del crecimiento (g/L)V: volumen
del reactor (L)g: velocidad especifica de crecimiento de biomasa
(1/h)X: concentracin de biomasa (g/L)qP (gP/gclulas/h): velocidad
especfica de productos extracelularesYMX/S (g clulas/gS) : mximo
rendimiento de biomasa a partir de SYP/S (gP/gS) : rendimiento de
producto extracelular a partir de S
BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo
endgeno):
0VS/P
PMS/X
gV SF Y1XVq
Y1XV SF =++
+
=
+
V.C. del dentrogenerada Masa
reactivos los con V.C. al entra que Masa
V.C. del dentro consumida Masa
productos loscon V.C. del sale que Masa
Formacin de biomasa Formacin de producto
-
Concentracin msica de clulas en estas condiciones (EE y sin
metabolismo endgeno): ( )
Yq
X Y
X SSDS/P
PM
S/X
g0 +=
Como adems g = D , si la formacin de productos extracelulares es
despreciable: ( ) SSY X 0MS/X =
Estrictamente, depende de la concentracin de sustrato y de la
velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier
S0
MS/XY
La productividad en un fermentador continuo se obtiene como el
producto del factor de dilucin por la
concentracin de clulas, DX (g/Lh)
-
Productividad en un quimiostato, suponiendo vlida Monod (EE sin
metabolismo endgeno ni formacin de productos extracelulares): se
obtiene del producto del factor de dilucin por la concentracin de
clulas, DX (g/Lh):
La velocidad de dilucin que maximiza la produccin de biomasa se
obtiene de derivar DX con respecto a D e igualar a cero:
+= 0ss
m)X(op SKK
1 D
Es muy difcil lograr una operacin estable para D m.
Generalmente, se usa un valor de D algo menor que Dop(X) como
solucin de compromiso para mejorar la estabilidad con buena
productividad.
Normalmente Ks
-
)
= opmsop
0opM
S/Xop D
KDSDY DX
Reemplazando la expresin de Dop en la ecuacin que da la
productividad de biomasa DX:
Se obtiene la mxima productividad de biomasa que se puede
alcanzar en un quimiostato en EE, sin metabolismo endgeno y sin
formacin de productos extracelulares:
) ( )( )0sss00s
sm
MS/Xop SKKKSSK
K1Y DX ++
+=
Normalmente Ks
-
Efecto del factor de dilucin sobre la concentracin de clulas,
concentracin de sustrato y la productividad. D (1/h) S (kg/m3) X
(kg/m3)0.06 0.006 0.427
0.12 0.013 0.4340.24 0.033 0.4170.31 0.04 0.4380.43 0.064
0.4220.53 0.102 0.4270.6 0.122 0.4340.66 0.153 0.4220.69 0.17
0.430.71 0.221 0.390.73 0.21 0.352
0
0.1
0.2
0.3
0 0.2 0.4 0.6 0.8
DX (kg/h.m3)
D (h-1)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0 0.2 0.4 0.6 0.80
0.2
0.4
0.6
0.8
1
X (kg/m3)
S (kg/m3)
D (h-1)
0S
m
-
Algunas aplicaciones de los sistemas continuos:- produccin de
algunas protenas - tratamiento de efluentes, en particular cuando
se emplean
microorganismos o enzimas inmovilizadas.- produccin de etanol-
produccin de productos asociados a crecimiento, especialmente en
gran escala (por ejemplo, cido lctico)
Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en
bioprocesosQuimiostato con reciclo
La generacin de biomasa es autocataliticaF mayor concentracion
de biomasa lleva a mayor velocidad de crecimiento.Para lograr en un
quimiostato una concentracin de biomasa mayor, se pueden reingresar
al reactor las clulas que salen.
-
Quimiostato con reciclo: el reciclo de clulas incrementa la
productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado que
minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes, muy
sujeto generalmente a las variaciones en la alimentacin).
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
Separador de clulas: puede ser por filtracin, centrifugacin o
sedimentacin
: relacin de reciclo basada en caudales volumtricos.
c: factor de concentracin relacin de la concentracin de clulas
en la corriente de reciclo sobre la que sale del reactor
-
Balances de biomasa :
=
+
V.C. del dentro
acumulada Masa
V.C. del dentro
generada Masa
V.C. del dentro
consumida Masa
reactivos loscon
VC al entra que Masa
productos loscon
VC del saleque Masa
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
( ) ( ) 0XV cXF XF XF 1 1neta1V0V1V =++ fresca reciclo
En EE: dX1/dt = 0 y si se alimenta medio
estril X0=0 ( ) ( )1V1V1neta cXFXF 1XV +=
( ) c1Dneta +=
-
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1
[ ] )c1(1Dneta +=Como c > 1 (1-c) < 0
D neta
-
BM sustrato limitante (en EE y en ausencia de productos
extracelulares):
( ) 1V0VS/P
1PMS/X
1g1V SF SF Y1XVq
Y1XV SF1 +=+++
( ) ( ) 1V10VMS/X
1g SF1S SF Y1XV ++=
( )10MS/Xg
1 SSY DX =
[ ] )c1(1D0k Si netagd +=== ( )( )c-11 SSY X 10M
S/X1 +
=
La concentracin de clulas en un quimiostato en EE con reciclo se
incrementa por el factor 1/[1+(1-c)]
-
Si es vlida Monody para kd=0
[ ] +==+= )c1(1D
SKS
netas
mg
( )[ ]( )[ ]Dc-11
Dc-11K S
m
s
++= ( )[ ]
( )[ ]( )[ ]
+++= Dc-11
Dc-11K S
c-11Y
Xm
s0
MS/X
1
sin reciclo
con reciclo
X1,sr
Velocidad de Velocidad de generacigeneracin de n de
biomasabiomasa
c = 2 ; = 0.5
Gas
FvS0,X0,P0
FvS1,X2,P1
V
Fv(1+)S1,X1,P1
FvS1,cX1,P1X1,cr
-
Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones,
particularmente para la produccin de metabolitos secundarios (ej.:
un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento de
biomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones
ptimas son diferentes FF con mcon mltiples ltiples
quimiostatosquimiostatos, se pueden fijar condiciones , se pueden
fijar condiciones distintas en cada uno: distintas en cada uno:
pHpH, temperatura, , temperatura, concconc. de nutrientes. de
nutrientes
por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:-Un
primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa-Un
segundo tanque donde se promueva la formacin de producto(*)
(*) el crecimiento ser desbalanceado y un modelo no-estructurado
no es el ms apropiado. Los resultados sern aproximados.
-
V1 V2
X1S1
X2S2
Fv,X2,S2Fv,X1,S1Fv,S0,X0
Fv,S0,X0Quimiostatos mltiples en cascada:
Primer quimiostato
en EE, vlido Monod y con metabolismo endgeno despreciable
1m
1s1 D
DK S =
( )10MS/X1 S SYX =Segundo quimiostato
BM de biomasa EEen 0dt
dXVXVXF XF 2222,neta22V1V ==+
( )
==
2
122,neta22,neta12
2
V
XX
1D XXXVF
Como X1 < X2 neta,2 < D2
-
Ejemplo de aplicacin de un sistema multietapa con agregado de
una corriente: cultivo de clulas modificadas por ingeniera
gentica
En general se agregan promotores a los sistemas con clulas que
contienen ADN recombinante para inducir la produccin de la protena
de inters. La presencia del promotor favorece la produccin de la
protena pero reduce la velocidad de crecimiento de las clulas que
contienen plsmidos, respecto de las que lo han perdido.
un quimiostato de una nica etapa tendr problemas de
inestabilidad gentica.
empleando un sistema de 2 etapas: Primer quimiostato para
produccin de clulas (sin promotor)Segundo quimiostato para
produccin de la protena (c/promotor):
Se logra mantener la estabilidad gentica por el continuo
agregado de clulas frescas.
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch: En este tipo
de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador en forma
continua o intermitente. Muy apropiado para mitigar problemas de
inhibicin por sustrato
V0
S0,X0,P0
X0,S0,P01)Carga
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin
Xf,Sf,Pf
Vf
Xf,Sf,Pf
3)Recuperacin del producto
1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica,
el sistema se comporta como un batch:
0M
S/Xm SYX =Xm es la mxima X a alcanzar con S0 , que se da cuando
S
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:Cuando X Xm ,
se agrega una corriente de nutrientes frescos con un caudal
volumtrico Fv y de una concentracin S0. La variacin de volumen es:
( ) tFvVV Fv
dtdV
0 +==Durante la realimentacin, el BM de biomasa es:
Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0 (condicin de
estado cuasi-estacionario). Luego: Dneta
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)RealimentacinX,S,P
V
Fv,S0 (X0)
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin
( ) ( )DXdtdX DXDX
dtdV
VXXX
VF
dtdX
netaneta0neta0V +=+=
( )dtdVX
dtdXV
dtVXdXVXF neta0V +==+ acumula segenera seentra =+
Como D porque V, neta va disminuyendo continuamente.
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:BM para el
sustrato:
Si no consideramos la formacin de productos y dado que la masa
de sustrato se mantiene siempre baja y constante:
( ) ( ) ( ) tYSFVXXV YSF XVdtXVd M
S/X0V00M
S/X0Vneta +== (es igual en ausencia de metabolismo endgeno)
Es decir, la masa de clulas generadas es linealmente
proporcional al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un
fed-batch.
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)RealimentacinX,S,P
V
Fv,S0 (X0)
X,S,P
V
Fv,S0 (X0)
2)Realimentacin( )M
S/X
g0V Y
XVSF
=
( )dtVSd
YXVq
Y
XVSF
S/P
PM
S/X
g0V =
acumula se onsumec se entra =
-
Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:
Variacin de las concentraciones de biomasa, sustrato y producto,
y de la velocidad de crecimiento y volumen del cultivo en funcin
del tiempo, para el primer ciclo de un reactor alimentado
(fed-batch):
0
200
400
600
800
1000
0 0.5 1 1.5 20
0.2
0.4
0.6V (mL)
V (mL)X (g/L)P (g/L)
X (g/L)P (g/L)
(h-1)
(h-1)
t (h)
-
Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin de
microorganismos tiene aplicacin si los productos son
extracelulares
Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:Proveen una
alta concentracin de clulasLas clulas se usan en forma continua y
se eliminan costosos procesos de recuperacin y reciclo de clulasSe
eliminan el problema del washout a altas velocidades de dilucinSe
pueden lograr altas productividadesSe puede lograr un medio local
favorable que conduce a mayores rendimientos y una mejor
performance del biocatalizadorEn algunos casos mejora la
estabilidad genticaEn algunos casos disminuye el dao por abrasin de
las clulas
-
Sistemas con microorganismos inmovilizados
Desventajas respecto de los cultivos en solucin:
El problema ms grave es que no se pueden emplear para productos
que no sean excretados de las clulas
La inmovilizacin generalmente conduce a problemas de
limitaciones por transferencia de masa
El sistema se torna muy heterogneo por las limitaciones de
transporte y es difcil de controlar
Si las clulas estn vivas, el crecimiento y la evolucin de gases
ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.
Los mtodos de inmovilizacin son similares a los que se utilizan
para enzimas. Se complica con las clulas vivas.
-
InmovilizacinActiva: captura o unin de clulas por
mtodos fsicos o qumicos
Pasiva: formacin de biofilms, crecimiento de mltiples capas de
clulas sobre un soporte slido
Tambin se pueden emplear reactores de membrana, generalmente
tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor de
carcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable. Las
clulas se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los
tubos, a los cuales difunde el producto.
Un buen soporte debe ser rgido y qumicamente inerte; debe
contener a las clulas firmemente y tener alta capacidad.
-
Esquema de una columna de burbujeo
Fermentadores: Equipos comnmente empleados Tanques agitados
Columnas de burbujeoAir-lift o reactor de arrastreLechos
rellenos
Esquema de un tanque agitado
H/D~12
H/D~36
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Tanques agitados de escala laboratorio
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Tanques agitados de escala laboratorio con clulas
inmobilizadas
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Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~
2Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2--20
litros)20 litros)
Global Medical Instrumentation http://www.gmi-inc.com
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Fermentadores de escala bancoFermentadores de escala
banco--piloto (V ~ 15piloto (V ~ 15--75 litros)75 litros)
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Fermentadores de Fermentadores de escala pilotoescala piloto
V ~ 100V ~ 100--1000 litros1000 litros
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Biorreactor de escala piloto
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Planta piloto de bioprocesos
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Esquema de un tanque Esquema de un tanque agitado de mayor
escala agitado de mayor escala
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Variables que se controlan en un Variables que se controlan en
un biorreactorbiorreactor industrialindustrial
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Esquema de un fermentador tipo tanque agitado de escala
industrial (100m3).
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
Tiene lneas de vapor para realizar la esterilizacin in situ de
las vlvulas, caeras y sellos. Se debe esterilizar tambin el aire
que ingresa por filtracin o por calentamiento.
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Biorreactor de escala industrial
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Reactor tanque industrial-generalmente de acero inoxidable 316L
SS, puede operar presurizado.-debe minimizar zonas muertas y
permitir la insercin de sensores-relacin de aspecto H/D=2.53.0 para
crecimiento de bacterias porquemejora la transferencia de oxgeno.
Para clulas animales se usan tanquesde baja relacin de aspecto
H/D=1.5 para facilitar el mezclado-se debe poder
vaciartotalmente-si tiene menos de500L pueden ser de vidrio
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Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en
la agitacin que inducen
Agitacin inducida por turbinas radiales del tipo Rushton
Agitacin inducida por turbinas axiales
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Interior de un tanque agitado
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Reactor tanque agitado: efecto de los baffles
Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los
vrtices que se forman por la agitacin. Se los ubica levemente
desplazados de la pared para disminuir la formacin de zonas
estancas.
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Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de
2L
400rpm sin baffles 400rpm con baffles
vrtice
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Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados
La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y el
calor liberado son claves para el diseo de los fermentadores.
La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersin de
gas, que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados,
aumenta al aumentar la velocidad de agitacin.
> RPM
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Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la
dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactor de
laboratorio de 2L.
300 rpm 450 rpm 750 rpm
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Tomografa de una seccin del reactor agitado.
Jets gaseosos de los inyectores de gas
Perfil de velocidades (cm/s) del lquido en un reactor gas-lquido
agitado. Se
observa la formacin del vrtice caracterstico de las turbinas
radiales.
Reactor agitado en suspensin de escala
banco: 20cm de dimetro y de alto (volumen ~ 8L)
Fraccin gaseosa (adimensional)
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Reactor tanque agitado:
Problemas ocasionados por la evolucin de espuma:
-peligro de contaminacin
-complica la circulacin de gases
-complica el mezclado
-cambian las velocidades de transferencia masa y de calor
vrtice
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Columna de burbujeo de escala banco: V~10LConfiguraciones
comunes de fermentadores: columnas de burbujeo
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Columnas de burbujeo
Regmenes de flujo en columnas de burbujeo: depende del caudal de
gas y del distribuidor que se emplee
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Columnas de burbujeo para el cultivo de algas
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Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de
aire Air-lift
Air-lift con insercin de
aire en el tubo central
Air-lift con insercin de aire en el anillo y mezclado en el
tubo
central
Air-lift con insercin de aire en el tubo central y
recirculacin
inducida
Configuraciones comunes de fermentadores
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Reactor air-lift de laboratorio con entrada de aire en el anillo
circular
Riser: zona donde se hace la inyeccin de aire, el flujo es
ascendente y contiene burbujas
Downcomer: zona donde el lquido desciende, a lo sumo tiene
pequeas
burbujas disueltas
Zona donde se produce la separacin entre el gas que se
libera hacia el exterior del reactor y el lquido que
recircula
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Shear Stress Kinetic Energy
Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles de
velocidades, energa cintica y tensin de deformacin
Escala banco
(0,2 x 2)m
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Reactor de tipo air-lift circulante
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Airlifts de forma triangular para el cultivo de algas (planta
piloto de cogeneracin de energa del MIT)
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Configuraciones comunes de fermentadores
Reactores de lecho fijo uso frecuente en tratamiento de
efluentes y en producciones dedicadas
Reactores trickle-beds o de lecho a goteoCocorriente
Contracorriente
Columnas de burbujeo rellenas
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Inmovilizacin pasiva (biofilms):Los biofilms son grupos de
clulas que crecen en multicapas
sobre soportes slidos. El soporte puede ser inerte o
biolgicamente activo. La formacin de biofilms es comn en equipos de
fermentacin industriales (ej: tratamiento de efluentes y
fermentaciones de hongos). La interaccin entre las clulas y el
soporte puede ser muy compleja. Los biofilms presentan ventajas y
desventajas similares a las de los sistemas de microorganismos
inmovilizados en forma activa.Las condiciones dentro de un biofilm
grueso varan con la posicin y afectan la fisiologa de las clulas
porque los nutrientes difunden hacia el interior del film y los
productos hacia fuera.El espesor del biofilm afecta la performance:
biofilms muy finos van a dar baja velocidad de crecimiento por la
baja concentracin de biomasa y los muy gruesos tienen problemas
difusionales, que pueden ser o no un inconveniente, dependiendo de
lo que se quiera lograr. Normalmente existe un espesor de film
optimo para el crecimiento de biomasa y otro para la formacin de
productos.
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Estrategias de escalado:
-Multiplicacin
-Reglas de uso-Anlisis del rgimen y escalado hacia menor
tamao
La multiplicacin implica replicar muchas veces el resultado que
se obtiene en un reactor de escala relativamente pequea, en lugar
de llevar a cabo el proceso en un reactor de mayor tamao.
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Produccin de cido glucnico
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Produccin de gluconato de sodio con A. niger
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Produccin de antibitico
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Produccin de lisina (10000 ton/ao) en 20 fermentadores de 250
m3
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Drogas medicinales
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% de uso en la industria Criterio de escalado
30 Potencia/Volumen
30 kLaLG
20 Velocidad en la punta del agitador
20 Concentracin de oxgeno
Reglas de uso : basadas en anlisis dimensional y criterios de
similaridad de algunos parmetros
Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; dimetro del
agitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado por
el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds
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La concentracin de oxgeno es diferente en distintas zonas del
reactor. Se puede simular considerando varios reactores con
distinta alimentacin de oxgeno
Anlisis del rgimen y escalado hacia menor tamao
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Modelo del sistema que supone dos compartimientos con distinta
concentracin de oxigeno
