i

CONTENIDO Pág.

I. INTRODUCCIÓN 1

1.1 Importancia de la lombriz 1

1.2 Clasificación taxonómica 3

1.3 Sistema digestivo 4

1.4 Nitrificación 5

II. ANTECEDENTES 6 III. JUSTIFICACIÓN 8 IV. OBJETIVO GENERAL 7 V. OBJETIVOS PARTICULARES 8

VI. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Aislamiento Primario 9

6.2 Aislamiento Secundario 9

6.2.1 Pruebas bioquímicas 10

6.2.2 Tinción de Gram 12

6.3 Pruebas Moleculares

6.3.1 Extracción de DNA genómico 12

6.3.2 Preparación de la reacción de PCR 13

6.3.3 PCR de ADN genómico de cepas puras 13

6.3.4 Programa para la PCR 14

6.3.5 Primers 15

6.3.6 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR mediante

electroforesis 15

6.3.7 Purificación de los fragmentos amplificados por PCR 15

6.3.8 Obtención de secuencias del gen 16s 16

6.3.9 Análisis filogenético 16

VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Aislamiento 16

7.1 Morfología Colonial 17

7.2 Resultados Pruebas Bioquímica 18

7.2.1 Identificación de género 19 7.2.2 Identificación de especie 20

7.2.3 Pruebas comparativas 20

7.3 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR

mediante electroforesis 23

7.3.1 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR mediante

electroforesis 23

8.3.2 Verificación de la purificación de los productos de PCR ( DNA extraído)

mediante electroforesis 24

8.3.3 Verificación de la purificación de los productos de PCR (directo de cepa)

mediante electroforesis. 25

8.4 Árboles filogenético cepas 20 ,Con I,13 y 26 26

VIII. CONCLUSIONES 30

X. REFERENCIAS 31

ANEXO A 35

ANEXO B 36

ANEXO C 40

ANEXO D 46

ANEXO E 48

ii

ÍNDICE DE TABLAS Pág.

Tabla1. Lectura de pruebas bioquímicas 10

Tabla 2. Concentraciones y volúmenes de los reactivos utilizados en la PCR 14

Tabla 3. Morfología Colonial para las 16 cepas aisladas 17

Tabla 4. Pruebas bioquímicas básicas para identificación de género 18

Tabla 5. Identificación de género 19

Tabla 6. Reacciones para identificación de especie 20

Tabla 7. Pruebas bioquímicas adicionales para comparación de métodos 21

Tabla 8. Resultados pruebas bioquímicas basados en porcentajes 22

Tabla 9. Identidad de las cepas 20, ConI, 13 y 26 referentes a el GenBank de la NCBI 30

iii

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Esquema de la morfología para la lombriz Eisenia fetida 4 Figura 2. Ciclo del Nitrógeno 6 Figura 3. Programación del Termociclador 14 Figura 4. Extracción de DNA 23 Figura 5. Perfil de amplificación de DNA 23 Figura 6.Perfil de concentración de la purificación de los productos de PCR 24 Figura 7. Perfil de concentración de la purificación de los productos de PCR 25 Figura 8.Posición filogenética de las cepas 20, ConI 27 Figura 9.Posición filogenética de la cepas I3 28 Figura 10. Posición filogenética de la cepas 27 29 Figura 11. Análisis de la cepa 20 en la base de datos Ribosomal Project Database 48 Figura 12. Análisis de la cepa 20 en BLAST 48 Figura 13. Análisis de la cepa I3 en la base de datos Ribosomal Project Database 49 Figura 14. Análisis de la cepa I3 en BLAST 49 Figura 15.Análisis de la cepa 27 en la base de datos Ribosomal Project Database 50 Figura 16.Análisis de la cepa 27 en BLAST 50 Figura 17. Análisis de la cepa Con 1 en la base de datos Ribosomal Project Database 51 Figura 18.Análisis de la cepa Con 1 en BLAST 51

I. Introducción

Los residuos orgánicos se han usado desde tiempos remotos en la agricultura ya que

proporcionan micro y macronutrientes como nitrógeno y fósforo necesarios para el

desarrollo de las plantas, además mejoran la estructura, textura y porosidad del suelo10.

Dentro de los residuos orgánicos utilizados como fertilizantes se encuentran los biosólidos

generados en las plantas tratadoras de aguas residuales, y la vermicomposta, la cuál es

producida por la lombriz Eisenia fetida mediante el uso de materia orgánica en

descomposición, como son los estiércoles, plantas, animales, bagazo de caña, bagazo de

maguey, residuos de cultivos y jardinería, etc.

1.1 Importancia de la lombriz

La lombriz de tierra es un integrante natural que se encuentra en los suelos contribuyendo

de manera decisiva a su fertilidad, ya que desarrolla una actividad esencial en la aireación

y estructuración de los suelos, radicando su importancia en:

⇒ Mezcla las partículas del suelo con materia orgánica.

⇒ Incrementa la actividad microbiana.

⇒ Incrementa la interacción de la microflora y fauna de protozoos, nemátodos, etc.

⇒ Incrementa la disponibilidad de nutrientes en el suelo y mejora su estructura.

⇒ Incrementa el coeficiente higroscópico, (penetración de oxígeno y agua hacia las

regiones radiculares).

⇒ Incrementa la fertilidad del suelo y aumenta las cosechas.

⇒ Constituye una valiosa fuente de recursos proteicos.

⇒ Acelera la formación de compostas y el ciclo de los nutrientes.

⇒ Mejora el drenaje y favorece la propagación de bacterias nitrificantes.

⇒ Ayuda al intercambio de capas del suelo evitando el encostramiento, y coadyuva a

la recuperación de suelos erosionados.

Los microorganismos que degradan materia orgánica son los que en realidad sirven de

alimento a las lombrices y que son ingeridos junto con el sustrato en que se encuentran;

toda esta mezcla al salir como excremento junto con el suelo, forma un producto ideal

como mejorador del suelo. A dicho producto, que es el abono producido por la lombriz, se

le conoce como lombri-abono o lombri-composta o vermi-compost, el cual contiene los

materiales y nutrientes óptimos para los cultivos agrícolas5,16.

El vermicomposteo es el proceso que incluye una serie de transformaciones bioquímicas

y microbiológicas de la materia orgánica al pasar a través del tracto digestivo de las

lombrices el producto se considera como uno de los abonos orgánicos de fácil manejo y

producción rápida (humus); tiene buenas características físicas, químicas, microbiológicas

y nutrimentales10.

La acción de las lombrices no es aislada, sino que se realiza en múltiples vías, junto con

los microorganismos degradadores aeróbicos a los cuales favorece y multiplica. Durante

el vermicomposteo de la materia orgánica, es posible reconocer muchos mecanismos de

acción, entre los que podemos mencionar los siguientes:

⇒ Las lombrices hacen galerías en la materia orgánica, lo que favorece la aireación y

ventilación, y por tanto la entrada de oxígeno y la salida del bióxido de carbono, de

esta manera se impide la generación de malos olores y se promueve la

degradación aerobia. Mientras se recorren y trasladan dentro de los residuos, las

lombrices recubren las paredes de la galería con un muco gelatinoso, que

favorece el desarrollo de microorganismos, mismo que inician desde ahí la

degradación de la materia orgánica.10

⇒ En el intestino de la lombriz ocurren procesos de fraccionamiento,

desdoblamiento, síntesis y enriquecimiento enzimático y microbiano, lo cual tiene

como consecuencia un aumento significativo en la velocidad de degradación y

mineralización del residuo, obteniéndose un producto de alta calidad. Esta

transformación hace que los niveles de pérdida de nutrientes como nitrógeno,

potasio, fósforo y micro elementos sean mínimos.11

⇒ Reducen, o en algunos casos eliminan microorganismos patógenos de plantas y

animales, favoreciendo en cambio la microflora y micro fauna natural de los

suelos fértiles. El abono sale del intestino de la lombriz con mayor carga

bacteriana mayor que la que ellas mismas ingirieron.31

⇒ Durante el proceso se generan compuestos bioactivos de importancia para los

procesos bioquímicos y reguladores de los suelos, como son enzimas,

antibióticos, vitaminas, hormonas y sustancias húmicas, de gran valor para la

nutrición vegetal.5

El transporte de bacterias benéficas por la lombriz de tierra es un factor importante para el

control biológico .25

Debido a éstas características las lombrices actúan como vector para los

microorganismos dispersos en el suelo a través de zonas laterales y verticales además de

fungir como biorreactores para ciertos tipos de microorganismos.7

Sin embargo, las diferencias entre las condiciones del intestino y las del suelo, ocasionan

que las bacterias se adapten y sobrevivan a través de su paso por el intestino, esas

adaptaciones son a las condiciones anaeróbicas y fisicoquímicas del tracto digestivo, a la

lisis de microbios por enzimas digestivas secretadas por la lombriz y la inhibición de

bacterias por sustancias inhibitorias secretadas por otras bacterias.

1.2 Clasificación taxonómica

Clasifica taxonómicamente a la lombriz de la siguiente manera 35:

Phylum: Annelida

Clase: Oligochaeta

Subclase: Clitaleta

Orden: Haloplaxida

Suborden: Lumbricina

Superfamilia: Lumbricoidea

Familia: Lumbricidae

Subfamilia: Lumbricinae

Género y Especie: Eisenia Fetida

1.3 El sistema digestivo

El sistema digestivo esta formado por la cavidad bucal, la faringe, buche, la molleja, el

esófago, las glándulas calcíferas, el intestino y el ano. Por otra parte la lombriz tiene la

capacidad de neutralizar la acidez del material orgánico que consume mediante las

glándulas calcíferas. Su tracto digestivo genera varias enzimas necesarias para la

conversión de proteínas y carbohidratos en energía, además de enzimas que ayudan a

desdoblar la celulosa.

Las deyecciones salen a través del ano enriquecidas por microorganismos propios de la

flora bacteriana, se plantean que son del orden de 4 x 10 colonias de bacterias por gramo

de humus activo.

Figura 1.- Esquema de la morfología para la lombriz Eisenia fetida, tomada de

www.agroforestalsanremo.com

Estudios recientes han mostrado que la lombriz de tierra puede agrupar bacterias en

diferentes entornos.

La lombriz de tierra emite oxido de nitrógeno (N2O) por la actividad de las bacterias en su

intestino.

1.4 Nitrificación

Las formas predominantes del nitrógeno orgánico en el suelo son proteínas, ácidos

nucleicos, quitina y peptidoglicano, así como aminoazúcares.

La nitrificación es la oxidación microbiana del NH4 + y el nitrógeno orgánico en NO2

– y

NO3 -. Se reconocen dos tipos de nitrificación: la nitrificación autotrófica y la nitrificación

heterotrófica.

La primera es exclusivamente bacteriana y la realiza un selecto grupo de bacterias

litotróficas. Se trata del proceso predominante en los suelos neutros a alcalinos. La

nitrificación heterotrófica es llevada a cabo por un grupo diverso de bacterias heterótrofas

y hongos (predominante en suelos ácidos).

El oxígeno es importante en la nitrificación ya que las bacterias nitrificantes

quimioautotróficas son aerobios obligados. La nitrificación puede producirse en suelos

sumergidos sólo porque tiene lugar una difusión suficiente del oxígeno.

El nitrato es la forma más importante de nitrógeno adquirida por las plantas en los suelos,

puesto que el NH4 + se nitrifica rápidamente y dicho compuesto en el complejo de

intercambios del suelo resulta menos disponible que el NO3 - .No siempre resulta

deseables nitrificaciones rápidas, puesto que la formación de NO3 - se ha vinculado con la

eutrofización, la formación de nitrosamina, así como la enfermedad infantil y animal

metahemoglobinemia.

La mayor parte de N2O emitido por la lombriz es debido a la activación de los

microorganismos desnitrificantes ingeridos y otros que no asimilan el nitrato (bacterias del

intestino).

La presencia de succinato, lactato y acetato en el intestino indica que habitan en éste

microorganismos fermentativos. Muchas especies fermentativas del género Clostridium o

microorganismos facultativos del género Bacillus pueden reducir nitrato o nitritos y

producir N2O.

En efecto tales microorganismos son abundantes en el tracto de la lombriz.

Algunos bacilos formadores de esporas son facultativos anaerobios pueden igualmente

reducir nitrato o nitrito a N2O, y han sido detectados en el tracto de la lombriz.

Figura 2.- Esquema del ciclo del nitrógeno tomada de www.platea.pntic.mec.es

II. Antecedentes

Hyun-Jun et al. (2004) amplificaron 16S rDNA de las bacterias presentes en el tracto

digestivo de Eisenia fetida utilizando dos primers universales, p27F (5’-AGA GTT TCA

TCM TGG CTC AG-3’) y p525R (5’-GYT ACC TTG TTA CGA CTT-3’), utilizaron un kit

para la purificación de las secuencias amplificadas 16S rDNA, la similitud de las

secuencias fue llevada a acabo por el programa BLAST y fueron alineadas por el

programa PHYDIT. Las secuencias de 16S rDNA fueron comparadas en éstos con las

cadenas tipo del Gen Bank database.

Algunas bacterias identificadas fueron:

⇒ Aeromonas media

⇒ Aromyces ulmi

⇒ Bacillus pulmilus

⇒ Bosea thiooxidans

⇒ Microbacterium aurum

⇒ Nocardia asteroides

⇒ Rhodococcus opacus

⇒ Streptomyces setonill

Horn et al., 2002 determinaron que la producción de N2 O in vivo por la lombriz de tierra

esta asociada con los microorganismos contenidos en su intestino.

Blazejak et al., 2004 analizaron la población de simbiontes de Olavius crassitunicatus

mediante la amplificación con primers específicos para los genes bacterianos 16S rRNA

(primers 8F y 1492R),los productos de PCR fueron clonados separadamente usando un

kit de clonación TA (Invitrogen, Breda, The Netherlands), para la correcta inserción

utilizaron vectores M13F y M13R.Las secuencias de 16S rRNA de simbiontes fueron

revisadas en el banco de datos GenBank usando BLAST. Las secuencias de 16S rRNA

fueron analizadas por el software ARB (www.arb-home.de). El árbol genealógico fue

armado con 1400 pb.

Dubilier et al., 1995, caracterizaron bacterias simbiontes quimiautotrófos de Oligochaeta,

Annelida comparando las secuencias para el análisis genético en el editor de secuencias

Genetic Data Environment, utilizaron las secuencias de simbiontes de RDP (Ribosomal

Database Project), obteniéndose algunos de los siguientes resultados:

⇒ Laxus sp.

⇒ Solemya reidi

⇒ Vesicomya cordata

⇒ Bathymodiolus thermophilus

III. Justificación

El vermicomposteo es el proceso que incluye una serie de transformaciones bioquímicas

y microbiológicas de la materia orgánica al pasar a través del tracto digestivo de las

lombrices, el producto se considera como uno de los abonos orgánicos de fácil manejo y

producción rápida; tiene buenas características físicas, químicas, microbiológicas y

nutrimentales. La acción de las lombrices no es aislada, sino que se realiza en múltiples

vías, junto con los microorganismos degradadores a los cuales favorece y multiplica.

En el aparato digestivo trituran y muelen la materia orgánica, incrementando en miles de

veces la superficie de exposición a los microorganismos, lo que facilita también su acceso

y degradación. Éstos microorganismos han sido motivo de diferentes estudios, existen

diferentes consorcios microbianos (microorganismos nitrificantes), los cuáles se buscan

sean identificados y conocido su mecanismo de trabajo.

IV. Objetivo General

⇒ Identificar las poblaciones microbianas en el tracto digestivo de Eisenia sp por

técnicas convencionales y moleculares.

V. Objetivos Particulares

⇒ Aislar y purificar por técnicas convencionales los microorganismos presentes en el

tracto digestivo de Eisenia sp.

⇒ Identificar el género de los microorganismos aislados presentes en el tracto

digestivo de Eisenia sp.

VI. Materiales y Métodos

6.1 Aislamiento Primario Se obtuvieron diez muestras de la lombriz roja californiana de la vermicomposta tratada

con desechos orgánicos del mercado de Ticomán, se procedió a la realización del lavado

y posteriormente a la inmovilización de las lombrices con alcohol etílico desnaturalizado.

Para la extracción de los consorcios microbianos se extrajo el contenido del intestino

mediante una incisión transversal al tracto de la lombriz, en tubos conteniendo solución

salina estéril se realizaron diluciones hasta 10-5 y 10-6 , mismas que fueron sembradas en

medio infusión cerebro corazón (BHI) por la técnica de extensión por varilla por duplicado.

La incubación se dio a 35°C durante 24 horas, trascurrido ese tiempo se procedió a la

selección de cepas con morfología colonial diferente entre ellas, siendo sembradas en

tubos de 13 X 100 mm con medio BHI.

Las cepas resembradas fueron incubadas en las condiciones anteriores, a las 24 horas de

incubación se realizó la técnica de Gram para cada una de ellas.

Las cepas puras fueron almacenadas a 4°C y los consorcios fueron resembrados en agar

cuenta estándar por la técnica de estría cruzada siendo incubadas a 35°C durante

24 horas.

Las cepas de tamaño entre 1 y 2 mm fueron resembradas en agar nutritivo para promover

su crecimiento y poder realizar la técnica de Gram.

6.2 Aislamiento Secundario

El protocolo anterior fue repetido pero la siembra se realizó en medios diferenciales y

selectivos:

⇒ Agar Sellers

⇒ Agar Mac Conkey

⇒ Agar EMB

⇒ Agar Columbia

⇒ Agar Sanders

Tanto para el aislamiento primario como para el secundario se tomaron en cuenta las

siguientes características:

Tamaño

Forma

Borde

Elevación

Luz reflejada

Luz transmitida

Color

6.2.1 Pruebas bioquímicas

Para la realización de las pruebas bioquímicas se resembraron las cepas aisladas durante

24 horas. Las pruebas fueron realizadas por triplicado.

En tubos de 13X100 mm se realizó una suspensión para cada cepa en solución salina y

se procedió a la siembra en las pruebas bioquímicas (ver anexo B).

La lectura de las pruebas se realizó según la tabla 1.

Tabla 1.- Lectura de pruebas bioquímicas

Fermentación de

azúcares

Lectura Pruebas Bioquímicas

Hidrólisis de almidón

Agregar lugol sobre la estría + Positiva- Si se forma un halo claro alrededor de la estría. - Negativa- No se forma un halo claro alrededor de la estría.

Fermentación de manitol

+Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana esta llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.

Fermentación de TSI Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa con producción de H2S

Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo. Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla Lactosa positivo:Color amarillo en el pico de flauta, Producción de H2S positivo: Coloración negra en el medio. Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio. Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo. Producción de H2S ( - ): sin coloración. Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.

Prueba de rojo de metilo

Agregar 2 gotas de rojo de metilo + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetil-metil-carbinol). -Negativa: No hay cambio en el color

Prueba de Voges-Proskauer

agregar 6 gotas de α naftol y 2 gotas de KOH +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo. - Negativa: El cultivo no cambia de color

Utilización de citrato de sodio

+ Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intenso - Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.

Hidrólisis de urea Producción de ureasa + Positiva: Color rosa fucsia en el medio. - Negativa: Sin cambio de color en el medio

Licuefacción de la gelatina

Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco minutos. + Positivo: licuefacción de la gelatina. - Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar, descartar la prueba negativa hasta los 14 días.

MIO (movilidad, indol y ornitina)

Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura. Descarboxilación de la ornitina: + Positiva: Color púrpura del medio. - Negativa: Color amarillo del medio. Después de leer las dos pruebas se agregan 3 ó 4 gotas de reactivo de kovacs y se observa: - Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo. - Negativo: No se forma el anillo.

SIM (producción de H2S, indol y movilidad)

Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor de la picadura o en todo el tubo Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s. Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura. Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro.

LIA (Desaminación y descarboxilación de aminoácidos)

Desaminación de aminoácidos: + Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino. - Negativa: La superficie no tiene cambios. Descarboxilación de aminoácidos + Positiva: El fondo del tubo es de color purpura. - Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.

Reducción de nitratos a nitritos

Agregar 3 gotas de α naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico. + Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos - Negativa: Sin cambio de color.

Determinación de metab. oxidativo y/o fermentativo de la glucosa (OF)

TUBO SIN SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios. TUBO CON SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin

cambios Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.

Prueba de citocromo oxidasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina). + Positiva: aparición de un color azul violeta. - Negativa: No hay cambio de color.

Prueba de la catalasa

Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.+ Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno. - Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.

6.2.2 Tinción de Gram

De una cepa de 24 horas de incubación se tomó una asada a un portaobjetos (con una

gota de agua), haciendo frotis se fijó a la flama.

Se cubrió el frotis con solución cristal violeta por un minuto, transcurrido el tiempo se

procedió a un lavado y se adicionó lugol por un minuto, se lavó y se decoloro con alcohol-

cetona, lavado inmediatamente, seguido se adicionó safranina por treinta segundos, se

lavó, se dejó secar la muestra y posteriormente se observo al microscopio en el objetivo

100X.

6.3 Pruebas Moleculares

6.3.1 Extracción de DNA genómico

Se cultivaron las cepas en caldo nutritivo durante 12 horas a 37ºC en agitación, se tomó 1

mL, el cuál se pasó a un tubo ependorf para ser centrifugado a 14000 rpm por 15 minutos.

Se pesó la enzima lisozima de manera que se obtuviera una concentración de 10µg/mL y

se mezcló con la solución de lisis 1, se le agregó 50µL a cada tubo siendo incubados a

37ºC por 30 minutos.

Se adicionaron 500µL de la solución de lisis 2 y 3 g de arena estéril a cada tubo, se agitó

en vortex por 10 minutos, y se centrifugó por 10 minutos a 13000 rpm, se recuperó el

sobrenadante a esté se le agregó 1/5 parte de EDTA y 1/10 parte de ácido acético, se

almacenó 30 minutos a -80ºC.

Se centrifugaron los tubos a 14 000 rpm por 5 minutos y se recuperó el sobrenadante, se

agregó 200µL de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico procediendo a centrifugar por 5

minutos a 13 000 rpm.

Se recuperó la capa superior, a ella se añadió 200µL de alcohol etílico puro, se incubó 60

min a -80ºC, transcurrida la incubación se centrifugó a 13 000 rpm desechando el

sobrenadante, se adicionaron 100µL de alcohol etílico al 70% frío posteriormente se

centrifugó a 13000 rpm por 15 minutos a 4ºC, se desechó el sobrenadante, se decantó y

se adicionarón 40 µL de agua inyectable estéril a cada tubo.

6.3.2 Preparación de la reacción de PCR

La mezcla de reacción (mix) se realizó sobre hielo y posteriormente se le adicionó la

enzima Taq polimerasa (almacenada a -20°C). Se colocaron alícuotas de 24 µL de la

mezcla en tubos de microcentrífuga.

A cada tubo se le adicionó 1 µL de muestra de ADN, se les dio un pulso de centrífuga y

posteriormente los tubos se colocaron en el termociclador previamente programado.

6.3.3 PCR de ADN genómico de cepas puras.

Cada cepa se sembró en cajas petri por estría cruzada y se dejó incubar por 24 h a 35°C,

posteriormente se almacenaron a 4°C.

La mezcla de reacción (mix) se realizó sobre hielo y posteriormente se le adicionó la

enzima Taq polimerasa (almacenada a -20°C). Se colocaron alícuotas de 24 µL de la

mezcla en tubos de microcentrífuga.

Se tomó una muestra de la cepa por picadura, la cuál se homogenizó con el resto de la

mezcla de cada tubo por medio de pipeteo, se les dio un pulso de centrifuga y después se

colocaron en el termociclador previamente programado. 42

Tabla 2.- Concentraciones y volúmenes de los reactivos utilizados en la PCR

Reactivo Concentración de

almacenamiento

Concentración final

Buffer de PCR 10X 1X dNTPs 10Mm 0.1 Mm MgCl 50Mm 0.2 Mm Primer mix 10Mm c/u 0.5Mm c/u DNA templado - - Taq Polimerasa 5U/µL 2.5 U/µL dH2O - - BSA 10 mg/mL 1 mg/mL

6.3.4 Programa para la PCR

La distribución de temperaturas se llevó a cabo de la siguiente manera:

Temperatura de primera desnaturalización del DNA 94°C.

Temperatura de segunda desnaturalización del DNA 94°C

Temperatura de hibridación 55°C

Temperatura de polimerización 68°C

Y el programa de tiempos y temperaturas usados para la PCR se realizó de acuerdo a la

figura 3.

Figura 3.- Programación del termociclador.

6.3.5 Primers

Los iniciadores utilizados fueron los reportados por Kwang-Hee et al.,2004 los cuáles

fueron utilizados para la amplificación del DNA de los microorganismos del tracto digestivo

de Eisenia fetida de los suelos de Korea.

p27F(5’AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3’)

p1525R(5’GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3’)

6.3.6 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis

Terminado el tiempo de la programación del termociclador, se procedió a tomar 2µL de

cada tubo y a mezclarlos con 2µL de Buffer de corrimiento y se cargó en gel de agarosa al

1%, con TAE.

La electroforesis se corrió a 130mV por 10 minutos el marcador utilizado fue de 100 pb.

Transcurrido el tiempo se retiró el gel de la cámara de electroforesis y se pasó a un

contenedor con bromuro de etidio durante 15 minutos, después se lavó y se reveló en el

equipo.

6.3.7 Purificación de los fragmentos amplificados por PCR

La purificación se realizó con el kit de purificación QuiaGen.

Se realizó una corrida de electroforesis cargando los pozos con 50µL de la muestra, se

reveló en luz UV, se cortaron los fragmentos de gel de agarosa donde se encontraban los

fragmentos amplificados y se depositaron en tubos ependorf estériles y previamente

pesados.

Cada tubo que contenía un fragmento de gel fue pesado y por diferencia de pesos se

obtuvo el peso de la banda. Se adicionó tres volumenes del buffer QG (buffer de

solubilización de banda. Solución 1), se calentó a 55ºC durante 15 minutos con vortex

cada 2 minutos.

Se pasó la solución a un tubo con membrana, se centrifugó 1 minuto a 10 000 rpm, se

adicionó 500µL de la solución 1 y se centrifugó 1 minuto a 4000 rpm, se desechó la

solución.

Se adicionó 600 µL de la solución 2 (Buffer PE, buffer de lavado), se centrifugó por 1

minuto a 10 000 rpm y se desechó la solución, se volvió a centrifugar para quitar el

remanente y el tubo con membrana se pasó a un tubo ependorf estéril, se agregaron 15

µL de agua inyectable estéril caliente a cada vial, se centrifugó y se volvió a agregar 15 µL

de agua inyectable y se procedió a centrifugar.

Se realizó una corrida de electroforesis para verificar la obtención de DNA.

6.3.8 Obtención de secuencias del gen 16s

Los productos purificados de los amplificados de PCR fueron llevados al Centro de

Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV) Irapuato, en el laboratorio nacional

de genómica, para que fuese llevada a cabo su secuenciación, además de éste centro

también se recurrió al Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Autónoma de

México (UNAM), en el departamento de Biología Molecular.

6.3.9 Análisis filogenético

La búsqueda de secuencias similares a la obtenida por medio secuenciación fue hecha en

el programa BLAST1, la búsqueda de secuencias en el orden de familia fue realizada en el

programa Tax Browser, tomando dos o tres especies de cada género.

Para obtener la secuencia reversa complementaria de las bacterias aisladas (secuencias

con la que se realizaron los alineamientos) se utilizó el programa DNAMAN (2).Las

alineaciones se realizaron en el programa CLUSTAX41.

Los árboles filogenéticos fueron construidos con el programa Mega 3.124.

VII. Resultados y Discusión

7.1 Aislamiento

En total se aislaron 400 cepas de las cuales sólo se trabajo con 16 ya que resultaron ser

éstas las que no presentaron crecimiento en simbiosis, además de presentar morfología

microscópica uniforme.

Las cepas que no se aislaron por completo mostraron aparente pureza en su morfología

colonial, pero no así en su morfología microscópica, hecho por el cuál se procedió a

realizar subsecuentes aislamientos resultando solo en la obtención de cepas que

presentaron crecimiento conjunto.

7.2 Morfología Colonial

En la tabla 3 se pueden observar los elementos que fueron considerados para poder

llevar a cabo el aislamiento primario, tomando como base las diferencias entre las cepas

obtenidas. La mayoría resultó translúcida y de forma circular y con tamaños de radio,

menores a los 0.5 cm.

Tabla 3.- Morfología Colonial para las 16 cepas aisladas.

Cepa Tamaño

cm

Forma Elevación Borde Luz

Reflejada

Luz

Transmitida

Ais con 0.5 Irregular Convexa Entero Mate Translúcida Ais 221 0.1 circular Plana Entero Brillante Translúcida 20 0.2 Circular Elevada Ondulado Mate Translúcida 27 0.3 Circular Plana Ondulado Brillante Translúcida 32- 0.5 Circular Pulvinada Ondulado Brillante Translúcida 60 0.1 Circular Plana Enteros Mate Translúcida 3 0.2 Circular Convexa Ondulado Mate Translúcida 28 0.1 Circular Plana Entero Mate Translúcida 55 1 Circular Convexa Entero Brillante Translúcida I3 0.3 Circular Elevada Entero Mate Translúcida 46I 0.2 Irregular Umbonada Ondulado Mate Transparente I2 0.2 Circular Plana Entero Brillante Translúcida 35 0.5 Circular Elevada Entero Brillante Transparente ConII 1 Irregular Umbilicada Ondulado Brillante Translúcida Col2 0.5 Circular Convexa Rizado Brillante Translúcida 34I 1 Circular Convexa Entero Mate Translúcida 14I 1 Irregular Pulvinada Ondulado Brillante Translúcida EMB A2 0.5 Irregular Plana Ondulado Brillante Translúcida

7.2 Resultados Pruebas Bioquímicas

Como se puede observar en la tabla 4, todas las cepas aisladas son y catalasa +,

oxidativas-fermentativas. El crecimiento del 100% de las cepas fue facultativo, lo cuál nos

dice que el ambiente de la vermicomposta ofrece las características apropiadas para el

desarrollo de microorganismos capaces de adaptarse al medio. En la prueba de reducción

de nitratos se observa que el 82% de las bacterias son capaces de llevar a cabo la

desnitrificación dado a que los microorganismos desnitrificantes son los más variados y

más fáciles de aislar ya que crecen en muchos sustratos.

La nitrificación en este caso puede ser uno de los controles de la desnitrificación esto nos

indicaría que existe una interacción entre los dos procesos, estableciendo un equilibrio

entre ellos.

Tabla 4.-Pruebas bioquímicas básicas para identificación de género

Cepa. Gra

m

Forma

M CA Canae Catalasa Oxidasa PA

F/O/-

RN

Ais con - B + + D - + - - +

Ais 22 1 - B + + D - + - F +

20 + B - + + + + + F + 27 - C + + D + - - O/- - 32- - B - + D - + - O/F + 60 + C D + + + + - F - 3 - C - + + + - - - + 28 - C + + D + + - - + 55 + B D + + - + + F + I3 + C - + + + - + F + 46I + B + + D V V + O/- + I2 + C D + + - - + - + 35 + B D + + + - - - + ConII + B + + + + + + F + Col2 + B - + + + - - F - 34I + B + + + + - - O/F + 14I + B + + D + - + F + EMB A2 + B + + + + + - F +

B=forma de bacilos, C=forma de cocos,M=movilidad,CA=crecimiento aerobio,

Canae=crecimiento anaerobio,PA=producción de ácido, F/O/-=Huhg-Leiifson,

RN=reducción de nitratos, V=variable, O=oxidativo,F=fermentativo,D=reacción débil.

7.2.1 Identificación de género.

Con el análisis microbiológico se logró identificar uno o dos géneros por cepa, con los

análisis de biología molecular, se comprobaron las identificaciones previas. Géneros

Neisseria, el cuál produce acidez a partir de la glucosa, producen lactosa y reduce los

nitritos. Algunas especies de Alcaligenes convierten el arsénico en su forma más sencilla

el arseniato, así se han reportado especies que degradan policlorodifenil (PBC)14. El

género de Listeria tiene varias rutas para la fermentación, lo cuál es factible que sea un

factor de enriquecimiento del suelo20. Las enterobacterias contienen un gen tipo 1

nitroreductasas que son capaces de reducir trinitrotolueno (2,4,6 TNT)22.Se ha reportado

el género Staphylococcus degrada dibencenofluorano (DBF),tomándolo como su fuente

de energía29. El género Kurthia es capaz de neutralizar las aguas residuales alcalinas,

esta característica puede ayudar a la conservación de la alcalinidad del suelo.

El género Corynebacterium secreta una sustancia antimicrobiana frente a bacterias,

filamentos de hongos y bacterias, propiedad que elimina los microorganismos patógenos

para el suelo.30

Tabla 5.-Identificación de género

Cepa Género

Ais con Alcaligenes Ais 22 1 Listeria, Bacillus

20 Bacillus 27 Neisseria, Planococcus

32- Cardiobacterium 60 Staphylococcus 3 Branhamella

28 Branhamella 55 Lactobacillus I3 Staphylococcus,Streptococcus

46I Bacillus I2 Aerococcus, Streptococcus 35 Kurthia

ConII Bacillus Col2 Corynebacterium 34I Bacillus polymyzs 14I Kurtía, Listeria

EMB A2 Enterobacteria

8.2.2 Identificación de especie

En la tabla 6 se observa la identificación de la bacteria Bacillus polyzs, por medio de los

diferentes medios de pruebas realizados.

Tabla 6.-Reacciones para identificación de especie

MEDIOS DE

PRUEBA

Bacillus polyzs

Reac. Coloración Gram

V

Cápsula +

Reducción de nitrato

+

OF glucosa

+

Indol

-

Licuefacción de la

gelatina 22°C

+

Citrato de Simmnons -

Voges-Proskauer

+

Manitol

-

Cl Na 7.5%

-

Hidrólisis del almidón

+

Ureasa

-

V=reacción variable

7.2.3 Pruebas comparativas

En la tabla 7 se muestran 10 pruebas bioquímicas que además de servir como sistema de

comparación entre métodos nos indican características propias de las cepas aisladas .El

58% de ellas presentan resistencia a condiciones extremas de concentración de NaCl

7%, el 68.75% presenta facilidad para obtener utilizar diferentes fuentes de carbono, el

76.47% facilita la degradación de la materia por medio de enzimas proteolíticas.

Dichas propiedades pueden ser utilizadas para aplicaciones directas tales como

tratamiento de desechos de la industria de alimentos, así como la presencia de enzimas

proteolíticas para poder llevar a cabo la degradación de la materia sin la necesidad de la

presencia de la lombriz.

Tabla 7_Pruebas bioquímicas adicionales para comparación de método.

Cepa CRFM TSI Gel.

Nut.

Citrato Caldo

Urea

LIA Indol Desc.

ornitina

VP NaCl

7%

Ais con - + H2S, CO2

+ - - - + - V +

Ais 22 1 + + H2

- + + Des:V Desa:-

+ NR + -

20 V - + + - Des:V DesaV

- - - +

27 V + - V - Des:- Desa+

+ + - -

32- V - + + - + - + - 60 - Glu - + + - Des:-

Desa:- - - - +

3 - Glu - V - - Des:+ Desa:-

+ + - -

28 - + - - - - - - V + 55 + + + + - - V - - - I3 - - + - + - - + - + 46I V V + - - Des:-

DesaV - - - +

I2 V + + - V Des:- Desa+

- - - +

35 - + + - - - - + - V ConII + + + - - + - - V + Col2 - - + - - - - + + - 34I + + + - - - - - + + 14I + + + - - - - - - + EMB A2 + + H2 - + - Des:V

Desa:- + - + -

V =variable, Glu =glucosa, Des =descarboxilación, Desa = desaminación, NR =no reacciona

La tabla 8 nos muestra un panorama general de las pruebas bioquímicas realizadas para

cada uno de los aislados.

Considerando que todas las reacciones fuesen positivas se tomó el total de bacterias

aisladas como el 100%, de ahí se procedió a realizar el análisis matemático.

Tabla 8_ Resultados pruebas bioquímicas basados en porcentajes

%

Crecimiento Aerobio 100

Crecimiento Anaerobio 58.82

Catalasa 52.94

Oxidasa 47.05

Producción Ácido 41.17

F/O/- F= 41.17, O/F=11.76,O/-=11.76

CRFM 58.82

TSI 64.70

Gelatina Nutritiva 76.47

Citrato 29.41

LIA 48

Indol 35.29

Descarboxilaxión

Ornitina

35.29

VP 41.17

NaCl

7%

58.82

Reducción Nitratos 82.35

7.3 Verificación de ADN purificado mediante electroforesis

En la siguiente figura se observan los resultados para la técnica de obtención de ADN,

los resultados fueron positivos para 6 de 14 cepas, de las cepas negativas el

procedimiento para la amplificación se realizó del ADN genómico directo de la cepas

tomando.

Figura 4.- Extracción de DNA. Los carriles corresponden a 1_ cepa 34I, 3_ cepa col2,5_ cepa 32-,8_cepa 3,9_ cepa 28,10_cepa 60,11_cepa Ais Con.

8.3.1 Verificación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis

1489 pb

Figura 5.-Perfil de amplificación de DNA de 14 cepas con respecto a el marcador de pares

de bases Sty I .Los carriles corresponden a 1.- blanco, 2.- testigo positivo, (DNA Bacillus

megaterium) carril 3_cepa Ais 22 1, carril 4_cepa 20,carril 5_cepa 27,carril 6_cepa 32-,

carril 7_cepa 60,carril 8_cepa 3,carril 9_cepa 28,carril 10_cepa 34I, carril 11_cepa I3,carril

12_cepa 46I, carril 13_cepa I2, carril 14_cepa 35, carril 15_cepa Con1I, carril 16_cepa

Col2.

En la figura 5 se puede observar la amplificación 1489 pb de DNA por PCR convencional

respecto al marcador de pares de bases (Sty I), dicho proceso resultó satisfactorio para

13 de 14 cepas, se observa que todo el DNA obtenido mediante purificación amplifico

excepto para la cepa 34I. De las cepas positivas se procedió a la purificación del producto

e identificación.

7.3.2 Verificación de la purificación de los productos de PCR (DNA extraído) mediante

electroforesis

En la figura 6 se aprecian los productos purificados de PCR con el kit QiaGen, se aprecia

perdida de ADN amplificado, por causa del tratamiento de purificación, en los carriles 5, 6

y 7 se perdió todo el producto de PCR de manera que se procedió a la repetición de todo

el procedimiento para esas cepas.

1500 pb

Fig 6.-Perfil de concentración de la purificación de los productos de PCR respecto al

marcador de 100 pb. Carril 1_cepa col2, carril 2_cepa 28, carril 3_cepa 60, carril 8_cepa

3, carril 9_cepa 35, carril 10_cepa 32-.

7.3.4 Verificación de la purificación de los productos de PCR (directo de cepa) mediante

electroforesis.

En la figura 7 se aprecian los purificados con el kit QiaGen, se observa que los productos

sufren menor decadencia en su concentración en referencia con los productos de la

extracción de ADN, los carriles 3 y 5 muestran perdida en el producto purificado.

1500 pb

Figura 7.- Perfil de concentración de la purificación de los productos de PCR respecto al

marcador de 100 pb. Carril 1_cepa ConI, carril 2_cepa 20, carril 3_ cepa I3, carril 8_cepa

27, carril 9_ cepa 46I, carril 10_cepa Ais 221.

De las dos metodologías realizadas, como se aprecia en la figura 4, los productos de PCR

para la técnica de ADN genómico directo de la cepa presenta mejores resultados, además

de que se sufren menos perdidas de producto en la purificación de los amplificados.

Las bandas obtenidas que se aprecian en las figuras 5 y 6, son del valor esperado de

1500 pb, con esta cantidad de nucleótidos es posible realizar la identificación de las

bacterias, ya que esta es la región del gen 16s, misma que mediante la reacción de PCR

fue flanqueada por los primers en sus regiones constantes permitiendo la amplificación de

las regiones variables.

7.4 Árboles filogenético de las cepas 20 ,Con I, 27 y I3

Para llevar acabo la identificación de los aislados a nivel género, el árbol filogenético fue

construido a nivel de familia basado en la secuencia del gen 16S rDNA. La cepa Con 1 es

es miembro de la familia Bacillaceae perteneciente al género Bacillus resultando como la

especie mas cercana Bacillus sonorensis EF433411 con el 98% de similitud. (Figura 8),

de la misma manera se analizó la cepa 20, resultando ser miembro de la familia

Bacillaceae perteneciente a el género Bacillus resultando como la especie mas cercana

Bacillus pumillus EF203211 como se muestra en la figura 7, con el 96% de similitud

(Tabla 9).

En la figura 8 se muestra el árbol filogenético de la cepa I3, construido a nivel de familia

basado en la secuencia del gen 16S rDNA. La cepa es miembro de la familia

Staphylococcaceae perteneciente a el género Sthaphylococcus resultando como la

especie mas cercana Sthaphylococcus warneri L37603 con el 98% de similitud (Tabla 9).

En la figura 9 se muestra el árbol filogenético de la cepa 27. La cepa es miembro de la

familia Planococcaceae perteneciente a el género Planococcus resultando como la

especie mas cercana Planococcus citreus AM180768, con el 58% de similitud (Tabla 9).

Los árboles filogenéticos fueron construidos utilizando la técnica de “NeighborJoining”,

método estadístico contenido en MEGA, que se basa en el cálculo de distancias

evolutivas entre las secuencias analizadas, en las ramas se muestra una descripción de la

evolución causada por las sustituciones de aminoácidos de secuencias individuales.

Una forma analítica de realizar estos análisis es mediante el uso del algoritmo de

Tamura38 (se eligió éste bajo la hipótesis de que todos los nucleótidos están en

proporciones iguales).

Figura 8.- Posición filogenética de las cepas 20, ConI, basado en la secuencia del gen

16S rDNA, usando la técnica de “neighborjoining”, con el algoritmo de nucleótido Tamura.

Se realizaron 1000 bootstraps, se muestran solo los valores mayores a 50. La escala

representa el número de cambios por la posición de secuencia. Grupo externo

Escherichia coli.

Figura 9.- Posición filogenética de la cepas I3, basado en la secuencia del gen 16S rDNA,

usando la técnica de “neighborjoining”, con el algoritmo de nucleótido Tamura. Se

realizaron 1000 bootstraps, se muestran solo los valores mayores a 50.La escala

representa el número de cambios por la posición de secuencia. Grupo externo

Escherichia coli.

Figura 10.- Posición filogenética de la cepas 27, basado en la secuencia del gen 16S

rDNA, usando la técnica de “neighborjoining”, con el algoritmo de nucleótido Tamura. Se

realizaron 1000 bootstraps, se muestran solo los valores mayores a 50.La escala

representa el número de cambios por la posición de secuencia. Grupo externo

Escherichia coli.

En la tabla 9 se muestra el porcentaje de identidad que se obtuvo usando la base de

datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), alternativamente se

corroboraron estos resultados en la base de datos Ribosomal Database Projet II.

Planococcus citreus posee la característica de ser biosurfactante , además de encontrarse

en las frutas descompuestas desarrollando un pigmento que favorece su descomposición,

acelerando el proceso40.

Realizando la comparación con las pruebas bioquímicas resultó tener similitud en la

puebas de catalasa +, oxidasa -, reducción de nitratos -, NaCl 7% +, gelatina +, urea -,

indol -, producción de H2S -, VP -,ornitina descarboxilasa -3.

Bacillus pumilus es usado por la producción de proteasas alcalinas en la biorremediación

de suelos, así como también posee la propiedad de degradar bisfenol.17

En comparación con las pruebas bioquímicas específicas de Bacillus pumilus se encontró

similitud en: urea -, manitol +, catalasa +, crecimiento anaerobio -, VP +, hidrólisis de la

gelatina +, citrato +, reducción de nitratos -, indol -, NaCl 7% -3.

La cepa I3 mostró similitud respecto al género Staphylococcus en las pruebas

bioquímicas de catalasa +, NaCl 7% +, Fermentativo +3.

Tabla 9_ Identidad de las cepas 20, ConI, 13 y 27 referentes a el GenBank de la NCBI

Cepa Identidad %

20 Bacillus pumilus AM237349 96 ConI Bacillus sonorensis EF433411 98 27 Planococcus citreus AF500008 99 I3 Staphylococcus warneri L37603 98

IX.Conclusiones

⇒ Los microorganismos del tracto digestivo identificados fueron Bacillus polyzs,

Bacillus sonorensis, Planococcus citreus, Bacillus pumilus y Staphylococcus warneri.

⇒ De los géneros identificados por estudios microbiológicos Neisseria, Alcaligenes,

Enterobacteria, Kurthia, Corynebacterium, poseen propiedades benéficas para la

bioremediación del ambiente.

⇒ 82% de las bacterias aisladas son desnitrificantes proceso que ayuda a la

recuperación del N2 que se pierde en la atmósfera.

⇒ El metabolismo de las bacterias aisladas fue identificado por medio de pruebas

bioquímicas.

⇒ De las bacterias aisladas el 41% presenta producción de ácido, favoreciendo el

proceso de nitrificación heterotrófica.

⇒ Los métodos de identificación molecular y convencional son complementarios.

⇒ La extracción de PCR de ADN genómico de cepas puras mejora los resultados de la

reacción de PCR de ADN extraído.

X. Referencias

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Anexo A

Aislamiento

El aislamiento es un proceso que nos permite separar microorganismos, forzándolos a

crecer en un sustrato, mediante la siembra por las técnicas de estría cruzada y vaciado

en placa .La separación de microorganismos presentes en una población mixta puede

lograrse de varias maneras4:

⇒ Separación física de los microorganismos mediante diluciones

⇒ Por agotamiento de inóculo en un medio de cultivo sólido.

⇒ Mediante la utilización de medios de cultivo selectivos.

⇒ Aprovechamiento de características particulares de ellos.

Tinción de Gram

Desarrollada empíricamente por Christian Gram (1884), es un método de doble tinción

diferenciando a las bacterias en Gram (+) y Gram (-), la diferencia de la reacción se basa

en la composición y estructura de la pared celular4.

Las bacterias Gram positivas presentan una pared celular relativamente gruesa, con un

mayor contenido de peptidoglucano (20 a 80%) y con numerosos enlaces transversales

entra las cadenas de N-acetil-murámico y N-acetil-glucosamina. En este grupo bacteriano,

el decolorante deshidrata y reduce la permeabilidad de la pared, por lo que al ser tratadas

con alcohol acetona no pierden el complejo cristal violeta-yodo.

En tanto que en las bacterias Gram negativas, la pared celular es mas delgada y contiene

poco peptidoglucano (5 a 10%) con pocos enlaces transversales, estas bacterias

presentan una capa externa constituida por lipopolisacáridos; en éstas el alcohol-acetona

disuelve los abundantes lípidos (20 a 35%) de la pared abriendo los poros facilitando la

salida del complejo cristal violeta-yodo y la decoloración, por lo que las bacterias se

tornan invisibles, y reaccionan con la safranina4.

Anexo B

Métodos Fenotípicos y Genotípicos

Los métodos usados en la identificación de bacterias son los fenotípicos, los cuáles ponen

en evidencia los productos de los genes (pruebas bioquímicas) y los genotípicos (estudio

de ácidos nucleicos)8.

Pruebas Bioquímica

Fermentación de carbohidratos en tubos con caldo Rojo de Fenol

Determina la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un

medio, produciendo ácido y/o gas29.

Fermentación de azucares en medio TSI

Determina la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de

gas a partir de la glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro

férrico al reaccionar con el hierro, la liberación de ácido sulfhídrico se libera por acción

enzimático, de los aminoácidos que contiene azufre produciendo una reacción visible

color negro29.

Rojo de Metilo

Prueba cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos que produzcan

ácidos lácticos, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por vía de la fermentación mixta.

Solo se considera positivos aquellos organismos que puedan mantener pH bajo por largo

tiempo29.

Voges-Proskauer

Se utiliza para identificar bacterias que al degradar la glucosa por la vía de la

fermentación ácido-mixta, producen acetoína como principal subproducto y menor

cantidad de ácidos fuertes29.

Citrato de Simmons

Identifica bacterias que utilizan como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo

del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para

entrar al ciclo de Krebs. Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen

del pH del medio si es alcalino se produce mas acetato y formato con una disminución del

lactato y CO2. Por enzima del pH de 7 no hay producción de lactato y los productos son

CO2 ácido formica y acético.

Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de

utilización del lactato29.

Hidrólisis de la Urea

La urea es una diamida del ácido carbónico y ésta es fácilmente hidrolizada con la

liberación de amoníaco y dióxido de carbono reaccionando en solución y formando

carbonato de amonio como producto final.

La enzima ureasa que posee un microorganismo puede hidrolizar a la urea presente en el

medio de cultivo29.

Licuefacción de la Gelatina

Identifica bacterias con la capacidad de producir enzimas proteolíticas. Las proteínas que

se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser

metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes mas pequeños, las enzimas

exocelulares de tipo proteolítico, gelatinazas, son secretadas por ciertas bacterias para

desdoblar a las proteínas29.

Medio SIM

Mas sensible que el medio TSI y KIA, por que carece de carbohidratos que inhiban la

formación de H2S y al uso de hiero peptonado como indicador29.

Medio MIO

Medio que sirve para la lectura de movilidad, producción de Indol y descarboxilación de la

ornitina.

Movilidad: Determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos.

Indol: Capacidad de un organismo de desdoblar el indol de la molécula de triptófano,

siendo oxidado para formar indol, escatol e indolacético por medio del complejo

enzimático triptofanasa.

Descarboxilación de la ornitina: Capacidad enzimática de un microorganismo de

descarboxilarla para formar una amina29.

LIA

Determina la descarboboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.

La descarboxilación de la lisina determina la capacidad enzimática de un microorganismo

de descaboxilarla para formar una amina y alcalinizar el medio (proceso realizado por la

enzima lisina descarboxilasa).

La desaminación puede ser oxidativa o reductiva; en el primer caso, se obtiene cetoácido

y amoníaco. La desaminación reductiva se da con frecuencia en microorganismos

anaerobios como los clostridios, los que dan origen a un ácido graso saturado y

amoníaco29.

Reducción de Nitratos a Nitritos

Los microorganismos facultativos, durante la respiración utilizan como aceptor final de

electrones al oxigeno y, en ausencia, de éste a los nitratos, los que son reducidos a

nitritos, óxido de nitrógeno o a nitrógeno molecular.

Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa fermentativa u oxidativamente, los

subproductos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes. Los ácidos

formados por degradación oxidativa de la glucosa son sumamente débiles capacidad

detectada por el medio OF29.

Citocromo Oxidasa

El sistema citocromo oxidasa se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios

facultativos, sistema que contiene a la enzima citocromo oxidasa, la cuál activa la

oxidación del citocromo que es reducido por el oxigeno molecular que produce agua o

peroxido de hidrógeno según la especie.El oxigeno actúa por tanto como aceptor final de

electrones en la cadena transportadora de electrones29.

Producción de Catalasa

Determina la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra tanto en bacterias

aerobias como anaerobias facultativas que contiene citicromo.

La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno y agua.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo

oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono29.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), inventada por Kary B. Mullis, en el Cetus

Corporation, es una de las técnicas mas usadas en la actualidad para la identificación, de

nuevos genes, en estudios taxonómicos y evolutivos, y es estudio de genética de

poblaciones, se emplean regiones altamente variables, o polimorfitas, como las regiones

repetidas en tandem en número variable (VNTR), que constituyen las regiones mini y

microsatélites, y los resultados se conocen como huella genética (DNA fingerprint).

Consiste en una amplificación (aumento en el número de copias), de secuencias o

fragmentos específicos del DNA genómico o clonado (DNA molde), mediante el uso de

oligonucleotidos o primers, dNTP´s (los cuatro desoxinucleotidos trifosfato) y una DNA

polimerasa.

El DNA molde contiene las secuencias objetivo o blanco que pueden ser de unas

decenas, hasta miles de nucleótidos de longitud, y los primers- que actúan como

iniciadores- se unen a los extremos (3’ de una cadena y 5’ de la otra) de estas

secuencias, para que después la DNA polimerasa copie en DNA molde, empleando para

ello a los dNTP´s y se obtenga una nueva copia de ese fragmento. Ya que la unión de los

primers requiere que el DNA molde separe sus dos cadenas, se debe aumentar la

temperatura, hasta 90°C, (desnaturalización), sin embargo debe bajarse hasta 50-60°C,

para permitir la unión (hibridación) de los oligonucleótidos con su secuencia

complementaria en el DNA molde, después se vulva a subir la temperatura hasta 70°C

para permitir la copia del fragmento o polimerización por la DNA polimerasa. Estos

eventos se repiten varias veces en ciclos, que resumidos son23.

⇒ Desnaturalización del DNA molde a alta temperatura (90°C)

⇒ Alineamiento de los primers a su secuencia complementaria

⇒ Polimerización del fragmento para producir copias de DNA de doble cadena de

las secuencias objetivo

⇒ Verificación de los fragmentos obtenidos mediante electroforesis

Anexo C

Medios de Cultivo

AGAR NUTRITIVO

Extracto de carne..................................... 3 g.

Peptona de carne...................................... 5 g.

Agar………………………………………15 g.

Agua destilada c.s.p. .................................. 1 L.

pH = 7,0 ± 0,2

AGAR MAC CONKEY

Peptona de caseína................................ 20 g.

Lactosa................................................. 10g.

Bilis de Buey desecada............................ 5 g.

Púrpura de Bromocresol....................... 0,01 g.

Agar………………………………………15 g.

Agua destilada c.s.p. ................................. 1 L.

pH = 7,1 ± 0,1

AGAR SELLERS

NaCl……………………………………… 2 g.

Nitrato de sodio…………………………. 1 g.

Nitrito de sodio ………………………….. 0.3 g.

D-Manitol ………………………………… 2 g.

L-Arginina ………………………………. 2 g.

Extracto de Levadura ………………….. 1 g.

Sulfato de Magnesio …………………… 1.5 g.

Fosfato dipotásico …………………….. 1 g.

Peptona de Gelisato…………………… 20 g.

Rojo de Fenol ………………………….. 0.008 g.

Agar…………………………………….. 13.5 g.

Agua destilada c.s.p. ................................. 1 L.

pH = 7,1 ± 0,1

AGAR COLUMBIA

Peptona …………………………….. 5 g.

Tripteína …………………………….. 12 g.

Extracto de Levadura ………………. 3 g.

Extracto de Corazón ………………. 3 g.

Almodón soluble …………………….. 1 g.

Cloruro de Sodio ……………………. 5 g.

Agar ………………………………….13.5 g.

Agua destilada c.s.p. ................................. 1 L.

pH = 7,3 ± 0,2

AGAR INFUSIÓN CEREBRO-CORAZÓN

Infusión de cerebro............................... 12,5 g.

Infusion de corazón................................ 5 g.

Proteosa-peptona.................................. 10 g.

D(+) glucosa........................................... 2 g.

Cloruro de sodio..................................... 5 g.

Di-sodio hidrógeno fosfato..................... 2,5 g.

Agar………………………………………15 g.

Agua destilada c.s.p. ................................. 1 L.

pH = 7,4 ± 0,2

AGAR NUTRITIVO

Extracto de carne..................................... 3 g.

Peptona de carne...................................... 5 g.

Agar....................................................... 15 g.

Agua destilada c.s.p. .................................. 1 L.

AGAR EMB (LEVINE)

Peptona de carne............................................ 10 g.

Di-potasio hidrógeno fosfato............................ 2 g.

Lactosa.......................................................... 10 g.

Eosina yellow................................................... 0,4 g.

Azul de metileno........................................... 0,065 g.

Agar............................................................... 15 g.

Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 L.

pH = 7,0 ± 0,2

AGAR SOYA TRIPTICASEÍNA

Peptona de caseína ………….. 15 g.

Peptona de saya……………… 5 g.

Cloruro de Sodio…………….. 5 g.

Agar………………………….15 g.

Agua destilada c.s.p. ................1 L.

AGAR PARA MÉTODO ESTANDAR

Peptona de caseína ………. 5 g.

Extracto de Levadura……. 2,5 g

Dextrosa…………………. 1g.

Agar.....................................15 g.

Agua destilada c.s.p. ............ 1 L.

pH = 7,0 ± 0,2

AGAR CITRATO DE SIMMONS

Fosfato dihidrogenado de amonio….. 1 g.

Fosfato dipotásico…………………….. 1 g.

Cloruro de Sodio………………………. 5 g.

Sufato de magnesio…………………… 0,20 g.

Agar............................................................15 g.

Azul de bromotinol………………………. 0,8 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 7,0 ± 0,2

AGAR DE HIERRO TRIPLE AZÚCAR

Peptona de caseína…………. 10 g.

Peptona de carne……………. 10 g.

Cloruro de Sodio……………... 5 g.

Lactosa………………………... 10 g.

Sacarosa……………………… 10 g.

Glucosa……………………….. 1 g.

Sulfato de hierro y amonio ….. 0,2 g.

Tiosulfato e sodio……………... 0,2 g.

Rogo de fenol…………………. 0,025 g.

Agar............................................................13 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 7,0 ± 0,2

AGAR MIO

Peptona de gelatina…………10 g.

Extracto de Levadura………. 3 g.

Peptona de caseína…………. 10 g.

L-ornitina…………………... 5 g.

Glucosa…………………….. 1 g.

Agar......................................... 15 g.

Agua destilada c.s.p. ............ …1 L.

Púrpura de bromocresol …….. 0,05 g.

pH = 7,0 ± 0,2

AGAR LIA

Peptona de gelatina……… 5 g.

Extracto de levadura…….. 3 g.

Glucosa………………….. 1 g.

L-lisina…………………... 10 g.

Citrato férrico de amonio .. 0,5 g.

Tiosulfato de sodio ……… 0,4 g.

Púrpura de bromocresol…..0,02 g.

Agar............................................................13,5 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 6,7 ± 0,2

CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)

Peptona especial No.1…….. 7 g.

Glucosa…………………… 5 g.

Fosfato dipotásico………… 5 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 6,9 ± 0,2

CALDO NITRATO

Peptona de gelatina………… 5 g.

Extracto de carne de res……. 3 g.

Nitrato de potasio…………… 1 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 7 ± 0,2

MEDIO SIM

Peptona de caseína ………….. 20g.

Extracto de carne…………….. 6,1 g.

Sufato de hierro y amonio…… 0,2 g.

Tiosulfato de sodio………… 3,5 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 7,3 ± 0,2

MEDIO BASAL

Caseína digerida por enzimas pancreáticas…… 2g.

Cloruro de sodio………………………………. 5 g.

Fosfato dipotásico…………………………….. 0,3 g.

Agar............................................................2,5 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

pH = 6,8 ± 0,2

PRUEBA DE ROJO DE METILO

Rojo de metilo ……….. 0,1 g.

Alcohol etílico……….. 300 mL.

Agua destilada c.s.p. ......200 mL.

AGAR SANDERS

Peptons Tripticaseína………………….. 10 g.

Cloruro de Sodio………………………… 5 g.

Trisulfato de Sodio……………………… 0.6 g.

Sulfato de Amonio Férrico…………….. 0.4 g.

Rojo de Fenol…………………………… 0.185 g.

Agar. …………………………………….. 15 g.

Agua destilada c.s.p. ............ ……………1 L.

Anexo D

Secuencias

>Cepa 27

ATCATCTGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCCGCTAAGGGTTACCCCACCGACTTCGG

GTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTC

ACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCTTCATGCAGGCGAGTTGC

AGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGTTTTCTGGGATTGGCTCCCCCTCGCGGGTTTG

CAGCCCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGA

TGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGC

CCAACTGAATGCTGGCAACTAAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCC

AACATCTCACGACACTAGCTGACGACAACCWTGCACCACCTGTCACCGCTGTCCC

>Cepa_con1

CAGGTGAACAAACCGGTGGAAGGTGGGGATGACGTTAAATCATCATGCCCCTTATGA

CCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGAACAAAGGGCAGCGAAGCCGCGAGGC

TAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTTGACTGCGT

GAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGG

GCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAG

GTAACCTAATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGACA

>Cepa20

TCTGCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCAATTGCGGTTACCTTACCGACTTCGGGTGTT

GCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCG

CGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCRAGTTGCAGAC

TGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGTTAAACCTTGCGGTCTC

>Cepa I3

AAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAG

GGCAGCTAAACCGMGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGT

AGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTA

CGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTA

ACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCGAAGGTGGGACAA

ATGA

Anexo E Análisis de secuencias en los programas BLAST y en Ribosomal Project Database

II

Figura 11.- Análisis de la cepa 20 en la base de datos Ribosomal Project Database

Figura 12.- Análisis de la cepa 20 en BLAST

Figura 13.- Análisis de la cepa I3 en la base de datos Ribosomal Project Database

Figura 14.- Análisis de la cepa I3 en BLAST

Figura 15.-Análisis de la cepa 27 en la base de datos Ribosomal Project Database.

Figura 16.-Análisis de la cepa 27 en BLAST

Figura 17.- Análisis de la cepa Con 1 en la base de datos Ribosomal Project Database.

Figura 18.-Análisis de la cepa Con 1 en BLAST.