Contamination des milieux aquatiques par les composés chimiques : lien entre présence et

effets

H. Budzinski

LPTC – EPOC- UMR 5805 CNRS - Université Bordeaux I

Importance de préserver la ressource en eau (moins de 1% eau douce) de la pollution

(pollution : dégradation de la qualité de l’eau par des substances naturelles, chimiques ou

radioactives, par des bactéries ou par des déchets (industriels ou ménagers).

0

4000

8000

12000

16000

20000

0

2

4

6

8

10

1950 2000 2025

Qua

ntit

é d'

eau

douc

e re

nouv

elab

le

disp

onib

le p

ar h

abit

ant

(m3 )

Popu

lati

on m

ondi

ale

(mill

iard

s) 8 milliards d’habitants

5 100 m3

5 100 m3

QUANTITE

QUALITE

60 000 substances sont communément utilisées

95 % contiennent au moins 1 atome de C (composés

organique)

Produits Chimiques – Contaminants Chimiques?

La production mondiale de substances chimiques est passée

d’1 million de tonnes en 1930 à 400 millions aujourd’hui.

Développement des activités humaines= milliers de substances chimiques libéréesdans l’environnement

Sources et origines des contaminants

Origine naturelle

Métaux

HAP

Origine Agricole

Pesticides

Nitrates

Exposition

via le milieu

(air, eau…)

Exposition

trophique

via l’alimentation

Origine Urbaine

Alkylphénols

Pharmaceutiques

HAP

Origine Industrielle

COV

Chloroalcanes

Alkylphénols

Métaux Alkylphénols

HAP

Chloroalcanes

Ressource

Milieu de vie

Usage - rejet Dégradation

incomplète - rejet

Présence -

Impact ?

Mil

lier

s d

e m

olé

cule

s

Focazio et al. (2008)

On analyse bien ce que l’on connait bien : danger des coincidences Impossible d’analyser tout Nouveaux composés Composés inconnus (transformations, …)

Quels composés et pourquoi? - Lien Présence - Effet ?

Contaminants émergents - hydrophiles

Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)

Composés organo-chlorés

• Pesticides, Polychlorobiphényles, Dioxines, Furanes

Retardateurs de flamme (Diphényl-éther-polybromés (PBDE), …)

Substances pharmaceutiques, cosmétiques

PFOS, PFOAS

Alkylphénols polyéthoxylates (détergents)

Pesticides

Phtalates

Bisphénol A

BTEX, Solvents chlorés, MTEBE/ETBE, ….

Composés analysés ciblés

#moléc pos neg pos+neg tot 8936 1328 10264

unique entrée 5015 849 5864 unique sortie 2085 408 2493

#moléc 10000cps pos neg pos+neg

tot 1431 260 1691 unique aq 2 T0 699 142 841

unique aq2 T0+2s 87 33 120

#moléc 5000cps pos neg pos+neg

tot 2513 562 3075 unique aq 2 T0 1220 313 1533

unique aq2 T0+2s 192 73 265

Analyse non ciblée

Screening STEP

7771

5864

1907 + 2493

Composé Famille Entrée O3 Sortie O3 / entrée CA Sortie CA Probabilité formule

= molécule

Venlafaxine antidépresseur 99

verapamil antiarythmique 78

Tropine 83 ; 86

spartéine antiarythmique 80 ; 83

Rimantadine Antiviral 86 ; 85

Punctaporine B Métabo. 85 ; 85

Propafenone Médicament 84 ; 84

Prometryne Pesticide 96

Hydroxydextroamphetamine 86 ; 87

Oxprenolol Médicament 85

Oxazepam Médicament 92; 92

Norverapamil médicament 77

Acide niflumique Médicament 87

Mexiletine anti-arythmique 85 ; 87; 86

Metoprolol beta-bloquant 85

methadone analgésique 84 ; 84

Meperidine analgésique 85

maprotiline antidépresseur 85

lamotrigine anticonvulsifiant 98 ; 97

kobusone 70

gliclazide Médicament 96

gabapentine Médicament 87 ; 87

fexofenadine Médicament 99 ; 97

estradiol hormone 86 ; 98

ecgonine Médicament 84

doxylamine Médicament 86 ; 84

dihydrolevobunolol Métabo. Beta-bloquant 85

diéthyltoluamide insecticide 87 ; 87

crotamiton médicament 87

benztropine Médicament (Parkinson) 98

acide aphyllique 83

tetradecadienal 87 ; 87 ; 87

4-hydroxyropivacaine métabolite méd. 80 ; 84

dodecatrien-1-ol 87

3-pinanone oxime 87

Contaminations Environnementales

• Faibles niveaux (ex : ng/L) (sensibilité – traces et ultra-traces) – Cas des hormones stéroïdiennes : effets toxiques au ng/L – NQE : endosulfan 0,5 ng/L!!!

• Matrices complexes • Multi-contaminants - Mélanges

• Sources • Lien présence - effets ? • Variabilité / Représentativité (spatiale / temporelle)?

(spécificité / multi-résidus)

Amélioration de la

Qualification de la présence -

Quantification

De l’échantillonnage ponctuel, image instantanée de l’état d’un milieu

Temps

Concentration

A l’échantillonnage intégratif, image moyennée de l’état d’un milieu

Echantillonneurs passifs

Accumulation

pseudo-linéaire

Temps

Rs

T 1/2

tR

MC

S

POCISPOCISw

C

Temps

Calibration en laboratoire

Echantillonneurs passifs : principes

Application à l’estuaire de la Gironde

Evaluation des impacts anthropiques et pressures sur l’estuaire de la

Gironde : ce système aquatique est caractérisé par une forte

variabilité (forts/faibles débits, marée, particules variables, …) ce qui

complique l’évaluation des pressions chimiques

Deux classes de contaminants :

pharmaceutiques et pesticides

Echantillonneurs passifs

Pauillac

Bordeaux

Libourne

Cadaujac

Contaminants étudiés : Sites d’échantillonnage 2010 -2011

Fongicides; 5

Insecticides; 4

Herbicides; 28

Pesticide metabolites; 12

Analgesicss ; 7

Antidepressants; 4

Anxiolitics ; 4

Bronchodilatators; 4

Lipid lowerings ; 1

Alcaloids ; 1

Atrazine-2-hydroxy

Atrazine déséthyl

ThiamethoxamImidacloprid Carbendazim

Métolachlore OA

Métholachlore ESA

S-MétolachloreIbuprofene

Naproxene

Ketoprofene

Diclofenac

Carbamazépine

others

Distribution globale des composés quantifiés dans l’estuaire n=40

(2010-2011)

Application aux pesticides S-métolachlore et ses métabolites

Application post emergence pour le maïs

Le fipronil

• Usage agricole récemment interdit • Utilisation vétérinaire • Utilisation traitement des sols

• PNEC = 0.77 ng/ L = forte toxicité

= concentrations environnementales attendues faibles

Enjeu écologique Estuaire de la Gironde

Étude du fipronil

Composé d’origine majoritairement urbaine

= détecté en entrée et sortie de station d’épuration

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

fipronil sulfide fipronil fipronil sulfone

Moyenne eaux d'entrée février

2011

Moyenne eaux de sortie février

2011

Concentrations (ng/L) en fipronil et ses métabolites Clos de Hilde - Février 2011

Étude du fipronil

Composé non détecté en milieu naturel

< 2 ng/L

PNEC = 0.77 ng/L

intérêt d’utiliser les capteurs passifs

Étude du fipronil

C moy à Bordeaux > 0.77 ng/L (PNEC) enjeu du suivi environnemental du fipronil

Concentrations moyennes (ng/L) – 9 au 23 mai 2011

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

Pauillac Port Autonome Bordeaux Libourne Cadaujac

Fipronil desulfinyl

Fipronil sulfide

Fipronil

Filpronil sulfone

Fipronil carboxamide

S = 0,9 S = 1,5

S = 1

Etude spécifique pour des antibiotiques, antiviraux, b-bloquants, anti-cancéreux

• POCIS exposés en amont (Cadaujac) et

en aval de la station d’épuration

principale de Bordeaux durant 15 jours

et échantillonnage ponctuel

• Echantillonnage ponctuel

• Pas de composé détecté en amont

• 5 composés détectés en aval

• Echantillonnage POCIS

• 11 composés détectés en amont et en

aval

Impact de la ville de Bordeaux (effluent traité de la station d’épuration principale) sur la qualité de l’eau de la Garonne

Échantillonnage passif en estuaire de Gironde

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Cw

(n

g/

L)

Concentrations moyennées dans les eaux (TWA) (ng/L)

Cadaujac Bordeaux

*

* *

*

*

Auby et al. 2011

Variation des surfaces de Zostera noltii entre

1989 et 2007

CONTEXTE

Régression dans les zones

les plus orientales du Bassin Impact des polluants majeurs ?

Concentration moyenne (ng.L-1) bassin d’Arcachon & tributaires entre

28/01/09 and 19/09/2011 (n=514 échantillons)

Bassin d’Arcachon : empreinte pesticides

Antifouling : Irgarol, diuron, DMST, DMSA

Metolachlor et cmetabo : s-metolachlore + metolachlore OA and ESA

Acetolachlor et metabo : Acetochlor + acetochlor OA and ESA

Atrazine et metabo : Atrazine + hydroxy-atrazine + DEA and DIA

4

ports

POCIS Nylon : cas de

l’Irgarol

Limite de Détection

de l’échantillonnage

ponctuel : 1 ng/L

Ostréiculture

Bassin d’Arcachon : Irgarol Détecté en intra-bassin

4

Ponctuel

POCIS Variabilité POCIS

2009 2010 2011

Lien avec l’impact

Zostères; approche en laboratoire

Mesure de la croissance foliaire des zostères

Effet mélange et Exacerbation de l’effet des contaminants en mélange aux hautes

températures

EDA : Lien présence / effet

Approche chimique

Tests in vitro

CONTAMINATION CHIMIQUE?

Approche biologique

Approche bio-analytique

Contaminants

? Effets

Détection de composés ciblés

Sensibles, sélectives

Couteuses

Composés inconnus, produits de

transformation, effets de mélange?

Détection de composés actifs

Sensibles, spécifiques, intégratifs, rapides,

quantitatifs

Identification des composés actifs à l’origine

des réponses mesurées?

Contexte

Sanchez, W. et al. Adverse effects in wild fish living downstream from pharmaceutical manufacture discharges.

Environ. Int. 37, 1342–1348 (2011)

Rivière ayant une industrie pharmaceutique et une station

d’épuration urbaine

Présence hypertrophie des gonades, insuffisance de frais

associée une intersexualité et l'induction de VTG

Contamination par des perturbateurs endocriniens

Recherche des composés responsables des effets observés

Echantillonneur

passif = POCIS Tests in vitro

Pas les bonnes

molécules ciblées

Concentrations <

LD

Aucune molécules

trouvées

Analyses chimiques ciblées

sur l’eau

Etude préliminaire

Campagne d’échantillonnage de la colonne d’eau

3 points de prélèvement: Amont, Entre et Aval

Echantillonnage passif : POCIS

(Thèse, N. Creusot 2011)

Etude préliminaire

Amont Aval

STEP

Industrie

Pharmaceutique X X

X

POCIS monté

Membrane PES Anneau acier inoxidable

Phase adsorbante Phase OASIS-HLB

[Poly(divinylbenzene)-co-N-vinylpyrrolidone

Membrane PES (polyethersulfone)

Anneau acier inoxidable

Co

nce

ntr

atio

n d

ans

le P

OC

IS

Temps

Régime d’équilibre

Régime linéaire

TEQ-Bio = CE 20 Composé de référence

CE 20 de l’extrait

Récepteurs Lignée Ligands

environmentaux Références

Récep

teu

rs s

téro

ïdie

ns

Estrogène (ER) MELN

E1,E2, EE2,

alkylphénols, BPA,

pharmaceutiques

Balaguer et al.

2001

Androgène (AR)

Glucocorticoïde (GR) MDA-kb2

DHT, BPA,

vinclozoline

pharmaceutiques

Wilson et al.

2002

Progestérone (PR) HG5LN-hMR Stéroïdes

pharmaceutiques Molina-Molina

et al.2006

Minéralocorticoïde

(MR) HG5LN-hPR

Stéroïdes

pharmaceutiques Molina-Molina

et al.2006

Récep

teu

rs d

es

xén

ob

ioti

qu

es

Dioxin (AhR) PLHC-1 / H4IIE HAP, PCB, PCDD/F... Louiz et al.

2008

Pregnane (PXR) HG5LN-hPXR E2, alkylphénols,

pharmaceutiques

Lemaire et al.

2006

Cette étude

Act

ivit

é en

zym

ati

qu

e (%

)

Etude préliminaire

Amont Aval

STEP

Industrie

Pharmaceutique X X

X

(Thèse, N. Creusot 2011)

0

50

100

150

200

250

300

350

Amont Entre Aval

So

mm

e d

es a

ctiv

ités

in

vit

ro

(µg E

Q-s

tand

ard

/g d

e p

has

e)

Etude préliminaire

(Thèse, N. Creusot 2011)

Etude préliminaire

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

ER PR GR anti-MR PXR

TE

Q-B

io

(µ

g S

tan

dard

/ g H

LB

)

Activité in vitro de l’extrait de POCIS

Stéroïdes et composés pharmaceutiques suspectés

Analyses chimiques ciblées « de façon plus intelligente »

TEQ-Chem= ΣCi x TEFi

TEF = CE20 composés de référence

CE 20 composé standard

0

20

40

60

80

100

120

ER PR GR anti-MR PXR

TE

Q-C

hem

/TE

Q-B

io (

%)

(Thèse, N. Creusot 2011)

113 composés recherchés

61 composés détectés :

16 stéroïdes

45 composés pharmaceutiques

Analyses chimiques ciblées (LC MS/MS)

Etude préliminaire

Canrénone

Dexaméthasone

6α méthyl Prednisolone

EDA pour la recherche des composés actifs non identifiés

(inspiré Brack 2003)

Démarche expérimentale

Analyses

biologiques Fractionnement

Analyses

chimiques

Echantillon brut

Confirmation

Caractérisation

Liste de

composés

1 2

3

4

5

6

Identification

RP-HPLC

40 fractions collectées

Analyses ciblées (LC MS/MS)

Analyses non ciblées (LC QTOF) A

ctiv

ité

enzy

mati

que

(%)

Résultats

Profil biologique

MRERPXRPRa.MRGR

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Act

ivit

é

(% p

ar

rap

po

rt a

u c

on

trô

le p

osi

tif)

MR ER PXR PR a.MR GR

Focalisation sur la recherche de composés:

• Glucocortico-mimétiques

• Antagonistes des récepteurs minéralocorticoïques

Résultats

Analyses ciblées

a.MRGR

0

20

40

60

80

100

120

140

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

Act

ivit

é

(%

par

rap

port

au c

ontr

ôle

posi

tif)

a.MR GR

Canrénone

30% a.MR

Dexaméthasone +

6α méthyl Prednisolone

35% GR

63% a.MR

6α méthyl Prednisolone

34% GR

124% a.MR

?

2-Hydroxyméthyl-

progesterone 342,2197Da diff -0,57ppm

Score MS: 98,18%

Score MSMS: 79,01%

Cicaprost 374.21Da diff -1,68ppm

Score MS: 98,42%

Score MSMS: 93,25%

Pregn-4-ene-3,20-dione,

6a,17-dihydroxy-6-méthyl- 360,2301 Da diff -0,09ppm

Score MS: 98,43%

Score MSMS: 71,62%

Résultats

Analyses non ciblées

Agilent® LC-QTOF

Formyldienolone 344,1989 Da diff -0,39ppm

Score MS: 99,36%

Score MSMS: 79,13%

Simvastatin-6'-carboxylic acid 448.2462 Da diff -0,2ppm

Score MS: 96,53%

Score MSMS: 94,17%

Fraction HPLC F15 F20

Nb de composés 168 109

Nb de spectre MSMS 11 18

CONCLUSION

• Besoin de screening ciblé quantitatif (ex : NQE) : MS/MS (QqQ) – Sensibilité : Accumulateurs (capteurs

passifs)

• Besoin d’identification – QTOF, ITMS

• Lien Présence/Effet

EDA

Etude - Gestion intégrée

Quantité

Usages (qualitatifs – quantitatifs)

Qualité

Sources Voies et mécanismes

Contaminant Impact ?

Air

Eau

Sédiment

Organismes

• Bioaccumulation

• Biotransformation

• Perturbations Fonctionnelles

• Génotoxicité

• Génomique – Protéomique

• …

• Sources - Introduction - Présence - Transformation

• Biodisponibilité

• Transfert

= Devenir - Exposition ?

PEC

PNEC

Couplage Chimie/Biologie

Merci pour

votre attention