66
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE "GRIGORE T. POPA" IAŞI FACULTATEA DE MEDICINĂ REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT INFECȚIA MENINGOCOCICĂ Considerații, clinice, diagnostice, terapeutice și particularități evolutive Conducător de doctorat Prof. Univ. Dr. Doina MIHALACHE Doctorand Elena Roxana NEMESCU IAŞI 2014

consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

"GRIGORE T. POPA" IAŞI

FACULTATEA DE MEDICINĂ

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

INFECȚIA MENINGOCOCICĂ

Considerații, clinice, diagnostice, terapeutice și

particularități evolutive

Conducător de doctorat

Prof. Univ. Dr. Doina MIHALACHE

Doctorand

Elena Roxana NEMESCU

IAŞI

2014

Page 2: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive
Page 3: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive
Page 4: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

Cuprins

Partea generală

I. Infecţiameningococică: note introductive, scurt istoric……………………………….1

II. Infecţiameningococică – definiţii……………………………………………………...2

III. Etiologie.........................................................................................................................3

IV. Epidemiologie................................................................................................................9

V. Patogenie......................................................................................................................14

VI. Anatomie patologică....................................................................................................21

VII. Tabloul clinic................................................................................................................22

VIII. Diagnostic.....................................................................................................................32

IX. Tratament.....................................................................................................................41

X. Profilaxie......................................................................................................................53

Partea personală

XI. Importanţa temei. Obiective.........................................................................................57

XII. Studiul I - studiu retrospectiv al cazurilor de infecţie meningococică diagnosticate în Spitalul

Clinic Universitar de Boli Infecţioase „Sf. Parascheva” Iaşi, în perioada 1994-

2011.....................................................................................................................58

XII.1. Obiective........................................................................................................................58

XII.2. Material şi metodă.........................................................................................................58

XII.3. Rezultate........................................................................................................................61

XII.3.1. Caracteristici epidemiologice.....................................................................................61

XII.3.1.1. Distribuţia anuală a internărilor...............................................................................62

XII.3.1.2. Distribuţia sezonieră a bolii.....................................................................................63

XII.3.1.3. Mediul de provenienţă al bolnavilor........................................................................65

XII.3.1.4. Distribuţia pe sexe a bolnavilor...............................................................................66

XII.3.1.5. Repartiţia pe grupe de vârstă a bolnavilor...............................................................67

XII.3.2. Analiza datelor clinice................................................................................................68

XII.3.2.1. Forma de debut a bolii.............................................................................................68

XII.3.2.2. Simptome şi semne clinice la internare...................................................................69

XII.3.2.2.1. Simptome clinice subiective la internare..............................................................69

XII.3.2.2.2. Semne clinice obiective la internare.....................................................................72

XII.3.3. Diagnosticul pozitiv şi etiologic.................................................................................73

XII.3.3.1. Diagnosticul pozitiv.................................................................................................74

XII.3.3.1.1. Examenul LCR la internare..................................................................................74

XII.3.3.1.2. Testele de inflamaţie la internare..........................................................................79

XII.3.3.2. Diagnosticul etiologic..............................................................................................82

XII. 3.3.2.1. Evidenţierea N. meningitidis în lichidul cefalo-rahidian (LCR)..........................82

XII.3.3.2.2. Evidenţierea N. meningitidis din sânge ................................................................87

XII.3.3.2.3. Evidenţierea N. meningitidis din exsudatul faringian...........................................88

XII.3.3.2.4. Serogrupurile de meningococ...............................................................................89

XII.3.4. Consideraţii terapeutice în lotul studiat......................................................................90

XII.3.4.1. Tratamentul etiologic...............................................................................................90

XII.3.4.1.1. Tratamentul de primă intenţie...............................................................................90

XII.3.4.1.2. Remanierea tratamentului etiologic......................................................................92

XII.3.4.1.3. Dozele principalelor antibiotice utilizate în tratamentul infecţiei meningococice

..................................................................................................................................................94

XII.3.4.1.4. Calea de administrare a principalelor antibiotice utilizate în tratamentul infecţiei

meningococice..........................................................................................................................96

XII.3.4.1.5. Durata tratamentului etiologic..............................................................................96

Page 5: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

XII.3.4.1.6. Sensibilitatea N. meningitidis la antibiotice..........................................................97

XII.3.4.2. Tratamentul patogenic.............................................................................................99

XII.3.4.2.1. Corticoterapia........................................................................................................99

XII.3.4.2.2.Tratamentul cu antiedematoase cerebrale............................................................103

XII.3.4.2.3. Tratamentul patogenic în cazurile cu şoc...........................................................104

XII.3.4.3. Tratamentul simptomatic şi regimul igieno-dietetic..............................................106

XII.3.5. Evoluţie şi consideraţii prognostice în lotul studiat..................................................106

XII.3.5.1. Forme clinice de boală...........................................................................................106

XII.3.5.2. Complicaţii şi sechele............................................................................................106

XII.3.5.3. Analiza LCR II (a doua puncţie lombară).............................................................108

XII.3.5.4. Analiza LCR III (puncţia lombară la externare)....................................................109

XII.3.5.5. Starea bolnavilor la externare................................................................................111

XII.3.5.6. Analiza deceselor...................................................................................................111

XII.3.6.Influenţa antibioterapiei administrate anterior internării asupra eficienţei metodelor clasice de

diagnostic a infecţiei meningococice.....................................................................121

XII.3.6.1. Influenţa antibioterapiei administarată anterior internării asupra LCR.................122

XII.3.6.2. Influenţa antibioterapiei administarată anterior internării asupra rezultatelor

hemoculturii...........................................................................................................................129

XII.3.6.3. Influenţa antibioterapiei administarată anterior internării asupra rezultatelor exsudatului

faringian..............................................................................................................129

XII.3.6.4. Analiza comparativă a efectelor Penicilinei G şi C3G administrate anterior internării asupra

metodelor de diagnostic etiologic a infecţiei meningococice.....................130

XII.3.6.5. Influenţa antibioterapiei administarată anterior internării asupra mortalităţii.......131

XII. 4. Discuţii........................................................................................................................132

XII.5. Concluzii......................................................................................................................145

XIII. Studiul II....................................................................................................................147

XIII.1. Obiective....................................................................................................................147

XIII.2. Material şi metodă......................................................................................................147

XIII.2.1. Pacienţi şi probe......................................................................................................147

XIII.2.2. Diagnosticul infecţiei meningococice prin qPCR...................................................148

XIII.2.2.1. Detecţia ADN-ului meningococic........................................................................148

XIII.2.2.2. Cuantificarea încărcăturii meningococice............................................................148

XIII.2.3. Analiza statistică......................................................................................................149

XIII.2.4. Etica cercetării.........................................................................................................149

XIII.3. Rezultate.....................................................................................................................149

XIII.3.1.Diagnosticul infecţiei meningococice prin tehnica qPCR........................................149

XIII.3.2.Studiul eficienţei qPCR-TaqMan utilizând gena sodC/N.meningitidis în comparaţie cu

metodele clasice pentru diagnosticul infecţiei meningococice..........................................152

XIII.3.3. Cuantificarea încărcăturii bacteriene meningococice la internare......................161

XIII.4. Discuţii.......................................................................................................................187

XIII.5. Concluzii....................................................................................................................190

XIV. Concluzii generale.....................................................................................................192

XV. Elemente de originalitate ale tezei.............................................................................194

XVI. Perspective pe care le deschide teza..........................................................................194

Bibliografie.............................................................................................................................195

Anexe.....................................................................................................................................217

Page 6: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive
Page 7: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

1

Motivația, scopul și obiectivele studiului doctoral

Tema aleasă pentru realizarea tezei de doctorat

abordează un subiect de mare actualitate și anume, infecția

meningococică invazivă (meningita și/sau septicemia). Prin

aspectul său epidemic, gravitate, sechelele care îi urmează și

implicațiile sociale pe care le prezintă (îmbolnăvirile cele mai

frecvente survenind la copii, adolescenți și adulții tineri),

precum și prin emergența de tulpini de meningococ rezistente

la Penicilină, infecția meningococică invazivă reprezintă un

capitol deosebit de important în cadrul patologiei infecțioase.

Diagnosticul rapid şi precis al infecţiilor bacteriene

este de importanţă vitală în zilele noastre, identificarea

agentului etiologic fiind esenţială pentru instituirea precoce a

unei scheme terapeutice ţintite. Pentru aceasta, în cazul în

care pacientul este suspectat de o infecţie, cunoaşterea şi

accesul la anumite metode de investigare paraclinică, capabile

să stabilească în cel mai scurt timp etiologia, sunt necesare

pentru a le putea utiliza, stabili diagnosticul şi alege apoi

tratamentul antibiotic adecvat.

Infecţia meningococică invazivă cu culturi negative

reprezintă o adevărată provocare pentru clinician, în special

atunci când acesta se confruntă cu administrarea de antibiotice

anterior internării în spital şi obţinerea de rezultate pozitive în

identificarea bacteriană devine mai complicată.

În cele ce urmează, descriem preocuparea principală a

cercetării de faţă, desfăşurată pe parcursul a două studii și

redăm obiectivele specifice fiecărui studiu.

Deoarece infecţia meningococică rămâne o problemă

demnă de luat în considerare în special la copii, dar nu este de

neglijat nici la vârstă adultă, iar factorii implicaţi sunt din ce

în ce mai frecvent întâlniţi, ne-am dorim o abordare

Page 8: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

2

îndeaproape, cu scopul de a reliefa aspectele clinice şi

biologice frecvent întâlnite, pentru o mai bună cunoaştere a

bolii şi o intervenţie terapeutică rapidă. Subiectul este cu atât

mai important, cu cât datele din literatura de specialitate sunt

insuficiente pentru zona noastră.

Necesitatea majoră a utilizării unor metode specifice

de diagnosticare şi identificare rapidă a bacteriei implicate în

etiologia infecţiei meningococice (N. meningitidis), ne-a

motivat să comparăm metodele clasice de detectare bacteriană

cu cele moderne, cu scopul de a evidenţia eficacitatea,

rapiditatea şi specificitatea fiecăreia dintre ele.

Vom integra abordarea propriu-zisă a metodelor de

biologie moleculară (qPCR), care au ameliorat mult

sensibilitatea diagnosticului bacteriologic, chiar şi peste

sensibilitatea izolării microorganismelor, având în vedere

varietatea tipurilor de ADN şi a primerilor pentru amplificarea

genică (PCR) care sunt în creştere.

Ne-am propus de asemenea, să stabilim şi să validăm

o metodă de diagnostic reprezentată de qPCR (quantitative

real-time PCR) pentru detectarea încărcăturii bacteriene în

lichidul cefalo-rahidian şi sânge.

Toate acestea, au ca scop principal posibilitatea

stabilirii rapide a diagnosticului în vederea instituirii unei

antibioterapii ţintite, cu impact direct asupra evoluţiei şi

prognosticului pacienţilor în cadrul acestei patologii.

Realizarea acestui studiu a fost posibilă cu ajutorul

grantului intern de cercetare nr. 17205/2011, finanţat de

U.M.F “Grigore T. Popa”, Iaşi

Page 9: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

3

PARTEA PERSONALĂ

Cuprinde capitolele XII, XII şi XIV, respectiv, Studiul I,

Studiul II şi Concluzii generale

.

Capitolul XII. Studiul I

XII.1. Obiective

- prezentarea într-o manieră realistică a cazurilor de

infecţie meningococică internate în Spitalul Clinic

Universitar de Boli Infecţioase „Sf. Parascheva” Iaşi

în intervalul de timp 1994-2011;

- stabilirea profilului pacientului cu infecţie

meningococică în funcţie de caracteristicile

epidemiologice, clinice, evolutive şi terapeutice;

- realizarea unui algoritm de diagnostic rapid în

practica curentă;

- evaluarea influenţei antibioterapiei administrate

anterior internării asupra rezultatelor metodelor

clasice de confirmare bacteriologică a infecţiei

meningococice în lichidul cefalo-rahidian (LCR)

(examen direct, cultură, latex-aglutinare), sânge

(hemocultură) şi faringe (exsudatul faringian);

- stabilirea factorilor de prognostic nefavorabil.

XII.2. Material şi metodă

Am realizat un studiu retrospectiv al cazurilor de

infecţie meningococică diagnosticate în Spitalul Clinic

Universitar de Boli Infecţioase „Sf. Parascheva” Iaşi, în

perioada 1994-2011. Protocolul de studiu a presupus analiza

retrospectivă a cazurilor de infecţie meningococică din punct

de vedere al datelor epidemiologice, clinice (mod debut, febra

la internare, simptome clinice subiective la internare, semne

clinice obiective la internare), diagnosticului pozitiv şi

Page 10: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

4

etiologic [evidenţierea N. meningitidis în LCR (examen direct,

cultură, latex-aglutinare), sânge (hemocultură) şi faringe

(exsudat faringian)], tratamentului, evoluţiei şi prognosticului.

Informaţiile necesare analizei retrospective a cazurilor au fost

obţinute din datele consemnate în foile de observaţie ale

pacienţilor.

Analiza statistică

Analiza statistică a datelor a fost realizată în SPSS 20.

Parametrul de referinţă p calculat în cadrul analizei reprezintă

nivelul de semnificaţie al testelor, care s-a comparat cu

valoarea pragului critic p=0.05, corespunzătoare unei

încrederi de 95%. Rezultatele au fost considerate modificate

semnificativ statistic pentru pcalculat<0.05.

XII.3 Rezultate

XII.3.1. Caracteristici epidemiologice

În perioada studiată (1994–2011) s-au înregistrat 323

cazuri de infecţie meningococică: 79.6% - meningită

meningococică și 20.4% - meningococcemie.

Evaluând frecvenţa anuală a internărilor pentru infecţia

meningococică, s-a constatat o reducere semnificativă,

progresivă a numărului de cazuri, după un maxim atins în anii

1998-2000. În ultimii patru ani ai intervalului studiat (2008-

2011), incidenţa infecţiei meningococice s-a redus până la sub

10 cazuri pe an.

Distribuţia sezonieră a infecţiei meningococice a relevat

faptul că majoritatea îmbolnăvirilor (66.3%) au survenit în

anotimpul rece: 35% iarna şi 31.3% primăvara,

După mediul de provenienţă al bolnavilor, mai mult de

jumătate din cazuri (65.33%) au fost din mediul rural

Analizând repartiţia pe grupe de vârstă a pacienţilor cu

infecţie meningococică, s-a constatat faptul că majoritatea

îmbolnăvirilor (86.2% ) au survenit la copii. Frecvenţa cea

mai mare a cazurilor a fost înregistrată la grupa de vârstă 1-5

Page 11: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

5

ani (36.8%). Un număr mult mai mic de cazuri 13.7% au

survenit la adulţi, frecvenţa scăzând progresiv pe măsura

înaintării în vârstă. S-a constatat o asociere semnificativă

(χ2=23.68, df=10, p=0.008), între vârsta pacienţilor şi tipul

infecţiei meningococice. Astfel, vârsta medie a pacienţilor cu

meningită meningococică a fost semnificativ mai mare (10.3

ani) comparativ cu cea a pacienţilor cu meningococcemie (5.0

ani) (Kruskal-Wallis H=8.12, p=0.004).

XII.3.2. Analiza datelor clinice Infecţia meningococică a debutat brusc la 95.67% din

cazuri La 31.5% din pacienți boala a fost precedată sau a

survenit pe fondul unei infecții acute de căi respiratorii

superioare. Frecvenţa principalelor semne şi simptome la

internare a fost următoarea: febră (88%), vărsături (81.4%),

cefalee (50.8%), fotofobie (18%), convulsii (13.6%),

somnolență (56.7%), obnubilare (9.3%), comă (12.1%),

agitaţie psiho-motorie (38.7%); şocul a fost semnalat la 18.6%

din bolnavi și rash hemoragic au prezentat 60.4%. Contractura

musculară latentă, evidenţiată prin semnele de contractură

meningiană, a fost prezentă la internare la toţi bolnavii cu

infecţie meningococică.

XII.3.3. Diagnosticul pozitiv şi etiologic

XII.3.3.1. Diagnosticul pozitiv

XII.3.3.1.1. Examenul LCR la internare

Examenul LCR la internare a reprezentat principala

metodă de diagnostic. Etiologia bacteriană al bolii a fost

sugerată de aspectul tulbure/purulent al LCR (57.81%), număr

de elemente > 1000/mmc (70.8%), predominanţa PMN în

sediment (91.2%), albuminorahia crescută (90%), glicorahia

scăzută (70.4%) [14].

LCR a fost purulent la 18.5% din pacienţii cu

meningococcemie, datorită interesării meningiene asociate.

Page 12: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

6

Doar 18.64% din cazurile de meningococcemie au

avut nr. elemente > 1000/mmc în sedimentul LCR la

internare, aceasta reprezentând un factor de prognostic bun

XII.3.3.1.2 Testele de inflamaţie la internare Pentru stabilirea orientativă a caracterului bacterian al

bolii au fost efectuate şi testele de inflamaţie (leucograma,

VSH). Acestea au fost pozitive, majoritatea pacienţilor

prezentând leucocitoză cu polinucleoză neutrofilă (83.85%) şi

VSH accelerat (96.62%).

Meningococcemia a fost mai frecvent asociată cu

leucopenia comparativ cu meningita meningococică (Fisher’s

test, p=0.03). Astfel, prezenţa leucopeniei a fost puternic

asociată cu meningococemia, existând un risc relativ de 2.7

ori mai mare (CI 95%: 1-4.7). De asemenea, o valoare scăzută

a VSH-ului (<8mm/1h), în condiţiile infecţiei meningococice,

a fost semnificativ asociată cu meningococcemia (Fisher’s

test, p=0.03), existând un risc relativ de 3.2 ori mai mare

(CI95%: 1.1 – 5.6).

XII.3.3.2. Diagnosticul etiologic

XII.3.3.2.1. Evidenţierea N. meningitidis în lichidul cefalo-

rahidian

În infecţia meningocococă, diagnosticul etiologic a

fost stabilit prin evidenţierea N.meningitidis în LCR în 71.9%

din cazuri. Meningococul a fost evidenţiat prin examenul

direct al LCR în 56.3% din cazuri şi prin cultura LCR la

44.7% din bolnavi. Utilizarea reacţiei de latex-aglutinare în

LCR a permis stabilirea diagnosticului etiologic la 76.8% din

pacienţii la care acest test a fost efectuat. N. meningitidis a

fost evidenţiat în LCR prin una din metodele clasice de

diagnostic în 28.4% din cazuri. La 30.9% din bolnavi

Page 13: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

7

evidenţierea meningococului s-a făcut prin două metode. Prin

toate cele trei metode au fost evidenţiate 12.5% din cazuri.

XII.3.3.2.2. Evidenţierea N. meningitidis din sânge

(hemocultura)

Hemocultura (Hc) s-a realizat la 77% din pacienţii cu

infecţie meningococică, În total, meningococul a fost

evidenţiat prin hemocultură la 11% din cazuri.

XII.3.3.2.3. Evidenţierea N. meningitidis din exsudatul

faringian

Examenul exsudatului faringian a fost realizat la 89%

din pacienţi. În total, meningococul a fost evidenţiat în

exsudatul faringian la 17.4% din pacienţi

XII.3.3.2.4 Serogrupurile de meningococ

Prin cultură şi reacţia de latex-aglutinare în LCR au

fost determinate serogrupurile de meningococ la 43% din

bolnavii cu infecţie meningococică. . S-a constatat faptul că

cel mai mare număr de cazuri a fost determinat de serogrupul

B (53.28%), urmat de serogrupul C (31.39%) şi de serogrupul

A (15.33%). Analizând distribuţia anuală a serogrupurilor s-a

remarcat o creştere evidentă a incidenţei serogrupului B în

ultimii ani, comparativ cu prima jumătate a intervalului

studiat.

XII.3.4. Consideraţii terapeutice în lotul studiat

XII.3.4.1 Tratamentul etiologic

În infecţia meningococică, Penicilina G a fost utilizată

la mai mult de jumătate din cazuri (54.8%), cefalosporinele

din generaţia a III-a (C3G) la 24.15% şi Ampicilina la 16.1%.

Page 14: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

8

Analiza distribuţiei anuale a antibioticelor folosite în

tratamentul infecţiei meningococice, a remarcat că, dacă în

prima jumătate a intervalului studiat, cea mai frecvent folosită

a fost Penicilina G (45.5% - 84.2%), în a doua jumătate s-a

constatat o creştere evidentă a utilizării C3G ca terapie de

primă intenţie (14.3% - 75%).

Studiind sensibilitatea Neisseria meningitidis la

antibiotice, am constatat că din cele 92 de tulpini testate la

Penicilina G, 87 au fost sensibile (94.6%), 4 moderat sensibile

(4.3%) şi una singură (1,1%) rezistentă (1.1%). În cazul

Ampicilinei s-au înregistrat 61 tulpini sensibile (89.7%), 5

moderat sensibile (7.4%) şi 2 rezistente (2.9%). Toate

tulpinile testate la Amoxicilină (4, 100%), C3G (68, 100%) şi

Meropenem (11, 100%) au fost sensibile la aceste antibiotice.

Figura 12.53. Distribuţia anuală a sensibilităţii la

Penicilină G

Distribuţia anuală a sensibilităţii meningococului la

Penicilină este redată în figura. 12.53. S-a constatat că

sensibilitatea la Penicilină s-a menţinut constantă de-a lungul

perioadei studiate până în anul 2011, când toate tulpinile

testate au avut rezistenţă intermediară la Penicilină. De

Page 15: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

9

menţionat că singura tulpină rezistentă la Penicilină s-a

înregistrat în anul 2001.

XII.3.4.2 Tratamentul patogenic

XII.3.4.2.1. Corticoterapia

Corticoterapia a fost utilizată la 47.4% din cazurile de

infecţie meningococică. Am constatat o tendinţă la creştere a

utilizării corticoterapiei în ultimii 10 ani comparativ cu prima

parte a intervalului studiat (34.3% vs. 68%) (χ2=34.8, df=1,

p<0.0001).

Figura 12.58. Influenţa corticoterapiei asupra supravieţuirii în

infecţia meningococică.

În infecţia meningococică, rata supravieţuirii a fost

mai bună la pacienţii care nu au primit corticoterapie

comparativ cu cei care au primit tratament cu cortizon (98%

vs. 84%) (figura 12.58). Astfel, frecvenţa deceselor în grupul

cu corticoterapie a fost de 15.69%, valoare semnificativ mai

mare comparativ cu frecvenţa acestora în cazul absenţei

corticoterapiei (1.76%) (Pearson χ2=20.4, df=1, p=0.00001).

Riscul de deces (odds ratio) în cazul administrării

corticoterapiei în infecţia meningococică a fost de 10.36 ori

Page 16: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

10

mai mare (95% IC: 2.88 - 44.19) decât în cazul

neadministrării corticoterapiei. Şi în meningita

meningococică, rata supravieţuirii pacienţilor a fost de

asemenea mai bună la cei fără corticoterapie comparativ cu

cei care au primit acest tratament (99.3% vs. 97.1%), dar

această diferenţă nu a fost semnificativă statistic (Pearson

2=1.96, df=1, p=0.161, NS). În meningococcemie, rata

supravieţuirii a fost semnificativ mai mare la cei netrataţi cu

cortizon comparativ cu cei ce au primit acest tratament (89%

vs. 56%) (χ2=6.14, df=1, p=0.013). Riscul de deces (odds

ratio) în cazul administrării corticoterapiei a fost de 6.22 ori

mai mare pentru meningococcemie (95% IC: 1.16 – 44.11) şi

respectiv de 4.44 ori mai mare pentru meningita

meningococică (95% IC: 0.41 – 42.37).

XII.3.5.2.3. Tratamentul patogenic în cazurile cu şoc

Tratamentul şocului a fost necesar la 20% din

pacienţii cu infecţie meningococică. În meningococcemie,

63.6% din pacienţi au fost trataţi pentru şoc comparativ cu

doar 8.9% în meningita meningococică (χ2=97.7, df=1,

p<0.0001). 55.8% din pacienţii cu şoc care au primit

corticoterapie au supravieţuit, comparativ cu 76.9% din cei cu

şoc dar care nu au primit corticoterapie. Deşi s-a constatat că

în cazul neadministrării corticoterapiei în terapia şocului

supravieţuirea a fost mai bună, diferenţele nu au fost

semnificative statistic (χ2=1.93, df=1, p=0.163).

XII.3.5. Evoluţie şi consideraţii prognostice în lotul studiat

XII.3.5.1. Forme clinice de boală

Formele severe au fost semnificativ mai frecvente în

meningococcemie faţă de meningita meningococică (41% vs.

16%). Calculul riscului a arătat că meningococcemia prezintă

un risc relativ de 2.6 ori mai mare (CI95%: 1.76 – 3.96) de a

Page 17: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

11

dezvolta o formă severă comparativ cu meningita

meningococică.

XII.3.6.2. Complicaţii şi sechele

Complicaţii au prezentat 6.8% din cazurile de infecţie

meningococică. Sechelele au fost prezente în proporţie mică

la pacienţii cu infecţie meningococică.

XII.3.5.6. Analiza deceselor

Rata deceselor în infecţia meningococică a fost de

8.4%. Rata deceselor în cazul meningococcemiei (34.8%) a

fost semnificativ mai mare comparativ cu rata deceselor

înregistrate în cazul meningitei meningococice (1.6%)

(χ2=75.98, df=1, p<<0.01).

Analiza corelaţională a deceselor în funcţie de vârstă

Decesele au survenit predominant la vârste tinere, şi

anume la copii până la 5 ani, iar în meningococcemie, şi la

adolescenţi şi adulţii tineri. Nu a existat o diferenţă

semnificativă statistic din punct de vedere al vârstei

pacienţilor decedaţi (Mann-Whitney test, p=0.3) şi nici între

vârsta supravieţuitorilor şi a decedaţilor, pentru cele două

forme ale infecţiei meningococice (1.1 ani, mediana în

meningita meningococică vs. 2.5 ani, mediana în

meningococcemie).

Analiza corelaţională a deceselor în funcţie de intervalul

debut-internare

În meningita meningococică nu a existat o diferență

semnificativă statistic între intervalul de timp de la debutul

bolii până la internare în cazul pacienţilor decedaţi (24h),

comparativ cu intervalul de timp înregistrat la cazurile care au

supravieţuit (29h) (Mann-Whitney test, p=0.46). În cazul

meningococcemiei, intervalul de timp de la debutul bolii până

la internare a fost semnificativ mai mic în cazul pacienţilor

Page 18: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

12

decedaţi (15h), comparativ cu intervalul de timp înregistrat la

cazurile care au supravieţuit (24h) (Mann-Whitney test,

p=0.003).

Analiza corelaţională a deceselor în funcţie de forma clinică

de boală

Forma clinică de boală a fost gravă la toate cazurile

de infecţie meningococică care au decedat. În meningita

meningococică din 40 forme grave de boală, 10% au decedat

(forme comatoase). În meningococcemie, din 27 de forme

grave, 85.2% au decedat (forme supraacute). Frecvenţa

deceselor a prezentat diferenţe semnificative în funcţie de

diagnostic şi forma clinică de boală (χ2=22.04, df=2,

p=0.00002).

Analiza corelaţională a deceselor în funcţie de aspectul LCR

La toate cazurile cu meningită meningococică care au

decedat, aspectul macroscopic al LCR a fost purulent.

Prezenţa aspectului purulent al LCR în meningita

meningococică nu a reprezentat un factor cu diferenţă

semnificativă (Fisher exact test, df=1, p=0.5). În

meningococcemie, majoritatea cazurilor care au decedat au

avut LCR clar (86.4%). Prezenţa aspectului clar al LCR în

meningoccocemie a reprezentat un factor semnificativ statistic

pentru supravieţuire (Fisher exact test, df=1, p=0.046), în

condiţiile unui LCR clar, în meningococcemie, riscul relativ

de deces fiind de 2.8 ori mai mare (CI95%: 0.9 – 8.4).

Analiza corelaţională a deceselor în funcţie de serogrupul

de meningococ

Evaluarea serogrupurilor a fost posibilă la 137

pacienţi, dintre care 7 au decedat. În meningita

meningococică, pacientul decedat a prezentat serogrup B. În

meningococcemie, din cele 6 cazuri decedate, 66.7% au fost

de serogrup B (4/6) şi 33.3% de serogrup C (2/6). Numărul

Page 19: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

13

mic de cazuri evaluat nu a permis o estimare statistică

comparativă între tipurile de serogrup, diagnostic şi deces.

Analiza corelaţională a deceselor în funcţie de interval

debut – externare/deces. (durata bolii)

La toate cazurile de infecţie meningococică, decesul a

survenit rapid, în medie în jur de 2 zile de la debut. Intervalul

de timp de la debut până la deces a fost semnificativ mai redus

la cazurile cu meningococcemie (1.2 zile) comparativ cu cele

cu meningita meningococică (1.8 zile) (Mann-Whitney U test,

p=0.04).

XII.3.6. Influenţa antibioterapiei administrată anterior

internării asupra eficienţei metodelor clasice de diagnostic

a infecţiei meningococice

Antibioterapie anterior internării au primit 38.7% din

pacienţii cu infecţie meningococică.

XII.3.6.1. Influenţa antibioterapiei administrată anterior

internării asupra LCR

Studiind influenţa antibioterapiei administrată anterior

internării asupra LCR, am constatat că aspectul macroscopic

al LCR (χ2=2.61, df=3, p=0.454), numărul de elemente

(χ2=4.47, df=3, p=0.214) și proporția polimorfonuclearelor

(χ2=2.14, df=3, p=0.541) la internare nu au prezentat diferenţe

semnificative în funcţie de administrarea anterioară a

antibioticelor. Valorile albuminorahiei la internare au fost

semnificativ (F=5.94, p=0.0154, 95%CI) mai mari în cazul

pacienţilor care nu au primit tratament antibiotic anterior

internării (2.74±2.17DS) comparativ cu valorile înregistrate la

pacienţii care au primit antibioterapie anterior internării

(2.09±2.14DS). Valorile glicorahiei la internare au fost

semnificativ mai mici (F=8.89, p=0.0031, 95%CI) în cazul

Page 20: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

14

pacienţilor care nu au primit tratament antibiotic anterior

internării (0.36±0.2DS) comparativ cu valorile înregistrate în

cazul pacienţilor ce au primit antibioterapie anterior internării

(0.44±0.23DS). Valorile clorurorahiei la internare nu au

prezentat diferenţe semnificative (F=1.84, p=0.174, 95%CI)

în cazul pacienţilor care nu au primit tratament antibiotic

anterior internării comparativ cu valorile înregistrate în cazul

pacienţilor care au primit antibioterapie anterior internării.

Efectele antibioterapiei administrate anterior internării

asupra metodelor clasice de diagnostic etiologic ale infecţiei

meningococice (examen direct, cultură și latex-aglutinare) au

fost modificate semnificativ statistic. Astfel, proporţia

examenului direct pozitiv din LCR s-a redus de la 64.6% la

43.2% prin utilizarea antibioterapiei anterior internării (χ2 =

14.195, p < 0.001). Prin utilizarea antibioterapiei anterior

internării şi proporţia culturilor LCR pozitive s-a redus

semnificativ de la 55.9% la 27.2% (χ2=25.379, p<0.001)

(figura 12.92).

Figura 12.92. Infecţia meningococică – influenţa

antibioterapiei anterioară internării asupra culturii LCR.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Da Nu

27,20%55,90%

72,80%44,10%

Clu

tura

LC

R

Negativa

Pozitiva

Page 21: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

15

Proporţia latex-aglutinării LCR pozitive s-a redus de

la 84.6% la cazurile care nu au primit antibiotic anterior

internării la 58.8% la cazurile cu antibioterapie anterioară

(χ2=8.84, p=0.003).

Proporţia rezultatelor pozitive ale metodelor de

analiză din LCR considerate împreună (examen direct, cultură

şi latex-aglutinare) s-a redus semnificativ de la 82.1% la 56%

prin utilizarea antibioterapiei anterior internării (χ2=25.57,

p<0.001). Ca urmare a administrării de antibiotice anterior

internării, am constatat o creştere semnificativă a proporţiei

cazurilor la care meningococul nu a putut fi evidenţiat în LCR

prin nici una din metodele clasice: 44% comparativ cu 17.9%

la cazurile care nu au primit tratament anterior internării. În

schimb nu s-au înregistrat diferenţe semnificative la cazurile

la care meningococul a fost evidenţiat printr-o singură

metodă. Proporţia cazurilor la care evidenţierea

meningococului s-a făcut prin două metode s-a redus

semnificativ ca urmare a utilizării antibioterapiei anterioare de

la 38.5% la 19.2%. La fel şi proporţia cazurilor la care

meningococul a fost evidenţiat prin toate cele trei metode (de

la 16.9% fără antibioterapie anterioară la 5.6% în urma

administrării de tratament antibiotic anterior internării) (χ2=

35.88, df=3, p<0.001).

XII.3.6.2. Influenţa antibioterapiei administrată anterior

internării asupra rezultatelor hemoculturii

Am constatat de asemenea reducerea proporţiei

hemoculturii pozitive de la 14.7% la 3.5% prin utilizarea

antibioterapiei anterior internării (Fisher’s exact test, p=0.009)

(figura 12.96).

Page 22: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

16

Figura 12.96. Infecţia meningococică – influenţa

antibioterapiei anterioară internării asupra hemoculturii.

XII.3.6.3. Influenţa antibioterapiei administrată anterior

internării asupra rezultatelor exsudatului faringian

Antibioterapia anterioară internării nu a avut efect

semnificativ statistic asupra evaluării exsudatului faringian

(18.9% vs. 15%) (χ2=0.7, df=1, p=0.4).

XII.3.6.4. Analiza comparativă a efectelor Penicilinei G şi

C3G administrate anterior internării asupra metodelor de

diagnostic etiologic a infecţiei meningococice

Nu au existat diferenţe semnificative statistic între

efectele Penicilinei G si cefalosporinelor din generaţia a III-a

(C3G) administrate anterior internării asupra metodelor de

diagnostic etiologic a infecţiei meningococice.

XII.3.6.5. Influenţa antibioterapiei administrată anterior

internării asupra rezultatelor mortalităţii

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Da Nu

3,50%14,70%

96,50%85,30%

Hem

ocu

ltu

raSterila

Pozitiva

Page 23: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

17

Studiul influenţei antibioterapiei administrată anterior

internării asupra mortalităţii, a arătat că rata deceselor nu a

fost influenţată semnificativ de administrarea antibioticelor

(χ2=0.034, df=1, p=0.853).

XII.4. Discuții

În perioada studiată (1994-2011) boala a survenit

sporadic, incidenţa anuală înregistrând un trend descendent,

cu scăderea progresivă a numărului de cazuri. Similar datelor

din literatură, incidenţa meningitei meningococice a fost

evident mai mare (79.6%) decât cea a meningococcemiei

(20.4%). După cum remarcă și alți autori, morbiditatea prin

infecția meningococică a fost favorizată de vârstă (infecțiile

meningococice fiind apanajul copilăriei), sezonul rece

(majoritatea cazurilor au survenit iarna şi primăvara devreme)

și condițiile socio-economice precare (mediul rural).

Diagnosticul pozitiv, bazat pe examenul clinic şi

de laborator, poate fi dificil datorită variabilităţii simptomelor

la debut. Tabloul clinic a fost cel clasic, dar ca particularitate,

semnalăm prezenţa erupţiei la mai mult de jumătate (60.4%)

din cazurile de infecţie meningococică, a formelor fulminante

la 34.8% şi a celor comatoase la 12.1% din cazuri.

Diagnosticul etiologic a fost stabilit prin izolarea

meningococului prin metodele clasice, în special din LCR

(cultură şi examen direct) şi mai puţin din sânge prin

hemocultură; utilizarea reacţiei de latex-aglutinare în LCR, la

pacienţii la care acest test s-a efectuat, a permis stabilirea

diagnosticului etiologic într-un procent ridicat de cazuri

(76.8%), precum şi determinarea serogrupului de meningococ.

S-a remarcat o creştere evidentă a incidenţei serogrupului B în

ultimii ani, comparativ cu prima jumătate a intervalului

studiat;

Antibiograma a arătat că în continuare

meningococul este sensibil la Penicilina G, cefalosporinele

Page 24: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

18

din generaţia a III-a şi Ampicilină. Deşi numeroase studii din

alte ţări au semnalat apariţia de tulpini de meningococ cu

sensibilitate redusă (intermediară) şi rezistente la Penicilina G,

în cazuistica noastră acest fenomen a fost rar semnalat.

Pentru tratamentul etiologic al cazurilor de

infecţie meningococică, recomandăm utilizarea

cefalosporinelor din generaţia a III-a, pe o durată de 7-10 zile.

Deşi meningococul şi-a menţinut sensibilitatea la Penicilină în

zona noastră geografică în procent de 94.6%, semnalarea chiar

şi a unui procent mic de tulpini moderat sensibile (4.3%) sau

rezistente (1.1%), ne determină să ne abţinem de la

recomandarea sa ca tratament de primă intenţie al infecţiilor

meningococice, ea urmând a fi utilizată doar în caz de

confirmare atât a etiologiei meningococice cât şi a

sensibilităţii germenelui la Penicilină;

Tratamentul cu cortizon nedovedindu-şi eficienţa

în infecţia meningococică, utilitatea administrării steroizilor

rămâne controversată;

Evoluţia a fost evident mai severă în

meningococcemie decât în meningita meningococică datorită

frecvenţei formelor supraacute. Meningococcemia fără

meningită are un prognostic mai sever comparativ cu

meningococcemia cu meningită. Prognosticul în meningita

meningococică a fost mai bun (letalitate - 1.6%) faţă de

meningococcemie (letalitate - 34.8%). Letalitatea în toate

cazurile de infecţie meningococică a fost de 8.4%, similară cu

alte studii. Letalitatea a fost grevată de: forma clinică de boală

[supraacută (purpura fulminans)/comatoasă], internarea şi

instituirea tardivă a terapiei etiologice (intervalul scurt de la

debut la internare), vârstă și serogrup (majoritatea deceselor

au fost determinate de serogrupul B). Factorii de laborator

indicatori de prognostic grav au fost: absenţa leucocitozei,

valorile scăzute ale VSH-ului, trombocitopenia și prezenţa

LCR clar. Complicaţii și sechele s-au semnalat la un număr

redus de cazuri.

Page 25: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

19

Tratamentul antibiotic administrat anterior

internării nu a redus semnificativ mortalitatea dar a redus

semnificativ proporţia pacienţilor cu infecţie meningococică

de la care N. meningitidis a putut fi evidenţiată prin tehnicile

microbiologice standard. Tratamentul antibiotic administrat

anterior internării a scăzut semnificativ şi proporţia cazurilor

identificate prin latex-aglutinare, contrar datelor din literatură

care recomandă efectuarea acestui test în special la cazurile

pretratate.

Pentru ameliorarea prognosticului în infecţia

meningococică, principalul obiectiv este diagnosticul rapid în

vederea instituirii în primele ore a terapiei etiologice şi

asocierii terapiei patogenice în formele supraacute. Deoarece

cultura necesită un interval relativ mare de timp până la

pozitivare este necesară utilizarea unei noi metode de

diagnostic, mai rapidă şi mult mai sensibilă decât testele

microbiologice standard folosite în practica uzuală (qPCR).

Capitolul XIII. Studiul II

XIII.1. Obiective

1. Diagnosticul infecţiei meningococice prin tehnica

qPCR;

2. Studiul eficienţei qPCR-TaqMan utilizând gena

sodC/N.meningitidis în comparaţie cu metodele

clasice pentru diagnosticul infecţiei meningococice;

3. Cuantificarea încărcăturii bacteriene meningococice

la internare şi corelarea acesteia cu date clinice şi

microbiologice, pentru determinarea asocierii acesteia

cu: severitatea bolii, durata de spitalizare și factorii de

risc asociaţi cu mortalitatea crescută (vârsta,

serogrupul).

Page 26: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

20

XIII.2. Material şi metodă

XIII.2.1. Pacienţi şi probe Am realizat un studiu prospectiv de cohortă, care s-a

desfăşurat în cadrul Spitalului Clinic Universitar de Boli

Infecţioase „Sf. Parascheva” Iaşi, în perioada 1 ianuarie 2012

– 30 iunie 2014. Pentru a putea evalua performanţa qPCR în

diagnosticul infecţiilor determinate de Neisseria meningitidis,

pe baza semnelor clinice, am clasificat fiecare pacient la

internare, drept caz probabil sau posibil de infecţie

meningococică (septicemie şi/sau meningită) [1]. Cazurile

probabile au fost definite acele cazuri care prezentau semnele

clinice tipice de infecţie meningococică (debut brutal cu febră,

erupţie peteşial-purpurică/necrotică şi prezenţa simptomelor

de sepsis/şoc septic şi/sau meningită) [2], fără confirmare

etiologică, la care clinicianul a considerat infecţia

meningococică ca cel mai probabil diagnostic. Cazurile

posibile au fost definite acele cazuri la care clinicianul a

considerat ca posibile şi alte diagnostice decât infecţia

meningococică. Acestea au inclus cazurile cu suspiciune

clinică de meningită bacteriană primară, la care diagnosticul

clinic a fost stabilit pe baza semnelor clasice: debut brusc prin

triada simptomatică (febră, cefalee, vărsături de tip central),

agitaţie/somnolenţă, obnubilare/comă şi prezenţa sindromului

de contractură meningiană (redoare de ceafă, Kernig I/II,

Brudzinski I/II sau semnul Lesage) [3].

Conform protocolului actual utilizat în Spitalul Clinic

Universitar de Boli Infecţioase „Sf. Parascheva” Iaşi, pentru

diagnosticul pozitiv şi etiologic, la internare s-a efectuat

puncţia lombară pentru recoltare de LCR şi puncţie venoasă

pentru realizarea hemoculturilor şi pentru hemoleucogramă.

De asemenea, s-a realizat identificarea rapidă – ”clasică” - a

meningococului din LCR prin examen bacteriologic direct şi

prin latex-aglutinare (LA). Ulterior, s-a realizat diagnosticul

Page 27: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

21

microbiologic standard (care include însămânţarea LCR pe

medii de cultură adecvate) şi antibiograma în cadrul

laboratorului Spitalului Clinic Universitar de Boli Infecţioase

„Sf. Parascheva” Iaşi.

După examinarea primară a LCR, au fost incluşi în studiu

pacienţii care au îndeplinit următoarele criterii: (1) simptome

clinice tipice de infecţie meningococică şi examen

microscopic direct pozitiv sau latex-aglutinare (LA) pozitivă,

sau (2) simptome clinice tipice de infecţie meningococică şi

nici un alt agent etiologic confirmat, sau (3) izolarea prin

cultură a Neisseria meningitidis dintr-un situs normal steril

(LCR/sânge), sau (4) LCR purulent, tulbure sau opalescent

(cu predominanţă de PMN în sediment, hiperalbuminorahie şi

hipoglicorahie) şi nici un alt agent etiologic confirmat, sau (5)

LCR clar şi predominanţă limfocitară (în cazul pacienţilor

trataţi cu antibiotice anterior internării în spital) şi nici un alt

agent etiologic confirmat. Au fost excluşi din studiu: (1)

pacienţii cu suspiciune clinică de meningită bacteriană la care

la examinarea primară a LCR (examen bacteriologic direct,

cultură şi/sau latex-aglutinare) s-a evidenţiat un alt agent

etiologic decât meningococul, (2) pacienţii cu meningită

secundară (TBC, tumori, procese înlocuitoare de spaţiu).

Probele de sânge recoltate pe EDTA şi LCR recoltate

la internare au fost apoi trimise la Laboratorul Disciplinei de

Microbiologie al UMF „Gr. T. Popa” Iaşi, pentru diagnosticul

infecţiei meningococice şi măsurarea încărcăturii bacteriene

meningococice prin tehnica qPCR.

XIII.2.2. Diagnosticul infecţiei meningococice prin qPCR [4]

Purificarea ADN/Neisseria meningitidis a fost

realizată cu ajutorul kitului Primer Design PrecisionTM

Gram Negative Bacterial DNA extraction. Kitul are avantajul

procesării rapide (o probă de ADN poate fi purificată în 16

minute); etapa a necesitat utilizarea microcentrifugei

Page 28: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

22

BeckmanCoulter şi a termoblokului Biosan din dotarea

laboratorului. Puritatea şi concentraţia ADN au fost analizate

cu nanodropul NanoDrop Pearl, iar amplificarea qPCR a

utilizat termociclorul Mx3005P Stratagene.

XIII.2.2.1. Detecţia ADN-ului meningococic

Prima etapă a analizei qPCR a avut la bază

identificarea secvenţei ctrA din ADN-ul N. meningitidis prin

metoda PCR calitativă - end point. Aceasta a presupus, pe

lângă probele pacienţilor, includerea în plăcuţa qPCR a unui

control pozitiv şi a controalelor negative (între 1 şi 3), pentru

a elimina orice sursă de contaminare care poate duce la

obţinerea de rezultate eronate. Dacă se obţine fluorescenţă

detectabilă pentru controalele pozitive, se certifică faptul că

toate rezultatele detectate ca fiind negative, sunt cu adevărat

negative, şi nu sunt doar rezultatul unui experiment PCR eşuat

din cauza primeri-lor, a calităţii probelor sau a calităţii

polimerazei. În cazul metodei PCR end point, rezultatele

finale se bazează pe valoarea finală a fluorescenţei, iar analiza

rezultatelor a fost realizată în cadrul experimentului

Quantitative Analysis Plate Read, care permite marcarea

probelor pozitive şi negative cu “+”, respectiv “-”. Softul

permite calcularea testului t, pe baza valorii finale a

fluorescenţei.

XIII.2.2.2. Cuantificarea încărcăturii meningococice

A doua etapă a presupus testarea ADN/N.

meningitidis prin metoda qPCR – cuantificarea absolută, care

utilizează curba standard. Kitul PrimerDesign™ genesig kit

for N .meningitidis utilizează principiul TaqMan. Pregătirea

curbei standard a fost realizată prin diluţia controlului pozitiv

(de la 2 x 106/µl până la 2 copii/μl). Mixul de reacţie pentru

detecţia meningococului a conţinut un volum final de 15 μl:

10 µl 2 x PrecisionTM Mastermix, 1 µl Primer/Probe

N.meningitidis, 1 µl primeri pentru controlul intern de

extracţie şi 3 µl RNAse/DNAse apă de uz molecular. În

fiecare godeu a fost adăugat 5 µl de ADN diluat. Pentru a

Page 29: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

23

confirma extracţia unui produs patologic calitativ, s-a testat în

paralel gena endogenă beta actina (ACTB), de asemenea prin

canalul FAM. Protocolul de amplificare a inclus un prim ciclu

de 10 minute la 95°C şi 50 cicluri formate din: 10 secunde

denaturare la 95°C, 60 secunde hibridizare şi extensia la 60°C.

Primerii specifici pentru N. meningitidis au fost detectaţi prin

canalul FAM, iar controlul intern de reacţie prin canalul VIC.

Calitatea curbei standard obţinute a fost analizată de soft-ul

MX 3005P, iar parametrii urmăriţi au fost eficienţa, înclinarea

pantei.

XIII.3. Rezultate

XIII.3.1.Diagnosticul infecţiei meningococice prin tehnica

qPCR

În perioada menţionată, au fost eligibili pentru studiu 65

de pacienţi. Din cele 65 de cazuri, 38 (58.46%) au fost

identificate cu infecţie meningococică, toate confirmate cu N.

meningitidis prin qPCR. Tratament antibiotic anterior

internării au primit 39 din cei 65 de pacienţi (60%).

Prin metoda nou introdusă (qPCR), au fost identificate cu

infecţie meningococică 30.8% din cazurile cu suspiciune

clinică de meningită bacteriană primară la internare, şi astfel,

frecvenţa cazurilor confirmate prin qPCR la cazurile cu

suspiciune clinică de infecţie meningococică la internare

(27.7%) a ajuns la 58.5%. Din grupul pacienţilor clasificaţi la

internare drept cazuri posibile (cu suspiciune clinică de

meningită bacteriană primară), în LCR, 95% din cazuri au fost

confirmate cu infecţie meningococică prin qPCR comparativ

cu 20% prin examenul direct şi respectiv, cultură şi 10% prin

latex-aglutinare, în timp ce în sânge, 30% din cazuri au fost

confirmate prin qPCR faţă de 10% doar, prin hemocultură.

Din grupul pacienţilor clasificaţi la internare drept cazuri

probabile (cei cu suspiciune clinică de infecţie

meningococică) prin qPCR au fost confirmate 83.33% din

Page 30: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

24

cazuri în LCR, şi 94.44% în sânge. La acest grup, au fost

identificate cu infecţie meningococică 38.89% din cazuri prin

cultura LCR, 27.78% prin examenul direct LCR, 11.11% prin

latex-aglutinarea din LCR iar prin hemocultură - 27.78%

(figura 13.2).

Figura 13.2. Infecţia meningococică: rezultatele metodelor clasice

de diagnostic comparativ cu diagnosticul prin qPCR raportat la

suspiciunea clinică la internare.

XIII.3.2. Studiul eficienţei qPCR-TaqMan utilizând gena

sodC/N.meningitidis în comparaţie cu metodele clasice

pentru diagnosticul infecţiei meningococice

Am studiat eficienţa diagnosticului prin qPCR

comparativ cu metodele clasice în LCR (examen direct,

cultură, latex-aglutinare) şi sânge (hemocultură).

Un criteriu analizat a fost cel legat de administrarea

sau nu a antibioticelor anterior recoltării probelor de laborator.

Am remarcat că la pacienţii cu antibioterapie

anterioară, proporţia cazurilor confirmate prin tehnicile de

laborator standard a fost semnificativ mai scăzută comparativ

cu cele care nu au primit tratament anterior. Astfel, în LCR,

proporţia cazurilor confirmate prin examen direct s-a redus de

Page 31: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

25

la 46.15% la 12% (YATES-χ2=9.10, p=0.01785, 95%CI), iar

a celor identificate prin cultură a scăzut de la 76.92% la 4%

(YATES-χ2=18.71, p=0.0000152, 95%CI), în timp ce prin

hemocultură, proporţia cazurilor confirmate a scăzut de la

53.85% la cei fără tratament anterior la 0% la cei pretrataţi

(YATES-χ2=5.38, p=0.00536, 95%CI). Şi proporţia latex-

aglutinării din LCR s-a redus semnificativ, de la 30.77% la cei

fără tratament antibiotic anterior internării la 0% la cei

pretrataţi (YATES-χ2=5.48, p=0.0192, 95%CI) (figura 13.3).

Figura 13.3. Infecţia meningococică: rezultatele metodelor clasice

de diagnostic comparativ cu diagnosticul prin qPCR raportat la

antibioterapia anterioară internării.

În schimb, pentru qPCR, s-a constatat că, dacă în LCR

rezultatele testului nu au fost semnificativ influenţate de

antibioterapia anterioară administrată [proporţia cazurilor

identificate crescând de la 76.92% la cei netrataţi la 96% la

cei pretrataţi (YATES-χ2=3.3, p=0.069, 95%CI)], în sânge

proporţia cazurilor identificate a fost semnificativ influenţată

de antibioterapia anterioară [scăzând de la 84.62% la cei

netrataţi la 48% la cei pretrataţi (YATES-χ2=9.89, p=0.0344,

95%CI)] (figura 13.3).

Page 32: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

26

Pentru evaluarea completă a performanţelor testelor

utilizate în diagnosticul infecţiei meningococice, am calculat

valoarea lor predictivă. Valoarea predictiv pozitivă (VPP)

apreciază proporţia rezultatelor adevărat pozitive confirmate

prin qPCR din numărul total de rezultate pozitive ale testului

clasic [5]. Calculând valoarea predictiv pozitivă (VPP) a

testelor utilizate, am remarcat faptul că aceasta a fost de 100%

pentru toate testele diagnostice. Acest aspect a demonstrat

faptul că probabilitatea ca pacienţii să prezinte infecţie

meningococică în condiţiile unui test pozitiv a fost de 100%,

adică toţi pacienţii pentru care testul diagnostic folosit a fost

pozitiv au prezentat boala. Valoarea predictiv negativă (VPN)

apreciază proporţia rezultatelor adevărat negative confirmate

prin qPCR din numărul total de rezultate negative ale testului

clasic [5]. Valorile crescute ale VPN indică deci proporţia

rezultatelor cu adevărat negative confirmate prin qPCR.

Studiind VPN a testelor utilizate, am constatat faptul că în

cazul pacienţilor care nu au primit antibiotice anterior

internării s-au înregistrat valori ridicate ale VPN pentru toate

testele diagnostice, cele mai mari valori fiind corespunzătoare

qPCR-sânge (86.67%), aceasta fiind urmată de qPCR-LCR

(81.25%) şi cultura-LCR (81.25%). La pacienţii cu

antibioterapie înainte de internare, cele mai ridicate valori

pentru VPN au fost înregistrate pentru qPCR-LCR (93.33%)

şi qPCR-sânge (51.85%).

Sensibilitatea unei metode indică proporţia bolnavilor

pe care testul este în măsură să îi identifice din întreg

efectivul, ca urmare a rezultatelor pozitive ale testului. Studiul

valorilor sensibilităţii (Se) testelor analizate a evidenţiat valori

mari ale sensibilităţii pentru qPCR-LCR (96%) şi qPCR-sânge

(48%) în cazul pacienţilor cu tratament antibiotic înainte de

internare, iar în cazul pacienţilor fără tratament antibiotic

anterior internării, valori semnificative au fost înregistrate

pentru qPCR-sânge (84.62%), qPCR-LCR (76.92%) şi

cultura-LCR (76.92%). O valoare a sensibilităţii uşor scăzută,

Page 33: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

27

care însă nu poate fi neglijată a fost calculată, la pacienţii fără

antibioterapie anterioară, pentru hemocultură (Se=53.85%)

(figura 13.5).

Figura 13.5. Sensibilitatea testelor diagnostice utilizate în infecţia

meningococică.

Ratele probabilităţilor (LR) reprezintă modalitatea de

a uni sensibilitatea şi specificitatea unui test într-o singură

unitate de măsură; acestea sunt independente de prevalenţa

unei boli în cadrul populaţiei. În studiul de faţă a fost posibil

calculul ratei probabilităţii unui test negativ (LR–) care ne

arată performanţa testului, prin compararea situaţiei când

boala este absentă, cu situaţia când boala este prezentă. Cel

mai bun test pentru a exclude o boală în urma unui test

diagnostic cu rezultat negativ este cel cu valoarea cea mai

mică a LR– [5]. Rezultatele analizei au indicat faptul că la

pacienţii fără tratament antibiotic înainte de internare cele mai

bune teste diagnostice sunt qPCR-sânge [LR(–) = 15.38%],

qPCR-LCR [LR(–) = 23.08%], cultura-LCR [LR(–) =

23.08%] şi hemocultura [LR(–) = 46.15%]. La pacienţii cu

tratament antibiotic anterior internării valorile LR(-) indică

Page 34: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

28

performanţe crescute în cazul testului qPCR-LCR [LR(-) =

4%] şi qPCR-sânge [LR(-) = 52%].

Studiul curbei ROC şi a valorilor ariei de sub curbă

(AUC), au demonstrat faptul că în cazul pacienţilor care au

primit tratament antibiotic înainte de internare, cele mai

eficiente metode de diagnostic ale infecţiei meningococice au

fost qPCR–LCR (AUC=0.947, p<<0.001) şi q-PCR-sânge

(AUC=0.842, p<<0.001). La pacienţii fără tratament

antibiotic anterior internării, testele diagnostice cu o putere

discriminatorie semnificativă au fost qPCR-LCR

(AUC=0.947, p=0.001) şi qPCR-sânge (AUC=0.763,

p=0.043).

XIII.3.3. Cuantificarea încărcăturii bacteriene

meningococice la internare

La cei 38 de pacienţi confirmaţi cu infecţie

meningococică prin qPCR, valoarea medie a încărcăturii

bacteriene meningococice la internare a fost în sânge de 8.95

x 108 copii ADN/µl iar în LCR a fost de 1.54 x 108 copii

ADN/µl. Analiza statistică a arătat o diferenţă semnificativă

între încărcătura bacteriană din sânge comparativ cu cea din

LCR, încărcătura bacteriană din sânge fiind semnificativ mai

mare (F=7.92, p=0.0215).

XIII.3.3.1. Compararea valorilor încărcăturii bacteriene

în funcţie de diagnostic (meningita meningococică şi

meningococcemia)

Valorile încărcăturii bacteriene la internare au fost

semnificativ mai mari în meningococcemie comparativ cu

meningita meningococică (Mann-Whitney U Test, Z=16.65,

p=0.000136).

Page 35: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

29

XIII.3.3.3. Corelarea valorilor încărcăturii bacteriene

meningococice în sânge şi LCR la internare cu severitatea

bolii

După cum am constatat în studiul I din lucrarea de

faţă, letalitatea în infecţia meningococică a fost grevată de (1)

forma clinică de boală, (2) de internarea şi instituirea tardivă a

terapiei etiologice (intervalul scurt de la debut la internare),

(3) de vârstă şi (4) de serogrup. În cele ce urmează, pentru o

mai bună înţelegere a mecanismelor care conduc la deces în

infecţia meningococică, am analizat corelaţia dintre valorile

încărcăturii bacteriene la internare (în sânge şi LCR) şi aceşti

factori. Severitatea infecţiei meningococice a fost evaluată

conform scorului prognostic Stiehm/Damrosch-Niklasson, ca

formă medie (pacienţii cu scor prognostic ≤ 3) şi severă

(pacienţii cu scor pronostic ≥4).

XIII.3.3.3.1 Corelaţia dintre nivelul încărcăturii

bacteriene la internare şi forma clinică de boală

(medie/severă)

Analizând valorile încărcăturii bacteriene în infecţia

meningococică la internare în funcţie de severitatea bolii, am

constatat că în formele medii de boală, valorile medii ale

încărcăturii bacteriene au fost în sânge de 4.308 x 105 copii

ADN/µl, în timp ce în formele grave de boală, valorile medii

au fost de 2.942 x 109 copii ADN/µl. Testul Mann-Whitney U

a indicat în formele grave valori semnificativ mai mari ale

încărcăturii bacteriene comparativ cu valorile înregistrate în

formele medii (Z = -3.47, p=0.000512). În LCR, în formele

medii de boală, valorile medii ale încărcăturii bacteriene au

fost de 18.63 x 106 copii ADN/µl, iar în formele grave valorile

medii au fost de 676.17 x 106 copii ADN/µl. Compararea

valorilor încărcăturii bacteriene din LCR în infecţia

meningococică în funcţie de severitatea bolii, a indicat că

valorile au fost semnificativ mai mari în formele grave de

Page 36: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

30

boală comparativ cu cele înregistrate în formele medii (Mann-

Whitney U Test - Z = -4.149, p=0.00881).

Corelaţia dintre severitatea bolii şi nivelul încărcăturii

bacteriene a fost realizată pe baza rezultatelor testului de

corelaţie neparametrică (Spearman’s Rank). Deoarece

severitatea bolii este o variabilă de tip ordinal cu o varianţă

foarte mică, a fost necesară aplicarea unui test neparametric

de analiză corelaţională. Rezultatele au indicat o asociere

semnificativă între încărcătura bacteriană la internare şi

severitatea bolii.

Astfel, a fost remarcată o corelaţie pozitivă, adică cu

cât scorul prognostic la internare a fost mai mare, adică forma

de boală mai severă, cu atât încărcătura bacteriană

meningococică la internare a fost mai mare atât în sânge

(Spearman’s rank correlation r=0.809, p<0.001) cât şi în LCR

(Spearman’s rank correlation r=0.669, p=0.006) (figura 13.18

şi figura 13.19).

Figura 13.18. Dreapta de regresie în corelaţia scorului prognostic cu

încărcătura bacteriană din sânge la internare.

Scatterplot: Scor prognostic vs. qPCR sange (Casewise MD deletion)

qPCR sange = -142E7 + 7397E5 * Scor_prognostic

Correlation: r = 0.809977

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Scor prognostic

-2E9

0

2E9

4E9

6E9

8E9

1E10

qP

CR

sa

ng

e

95% confidence

Page 37: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

31

Figura 13.19. Dreapta de regresie în corelaţia scorului prognostic cu

încărcătura bacteriană din LCR.

XIII.3.3.3.2 Corelaţia dintre nivelul încărcăturii

bacteriene la internare şi statusul supravieţuitor/decedat

Analiza valorilor încărcăturii bacteriene

meningococice la internare în funcţie de supravieţuire, a arătat

că la supravieţuitori valorile medii ale încărcăturii bacteriene

au fost în LCR de 4.084 x 107 copii ADN/µl, iar la decedaţi

valorile medii au fost de 1.323 x 109 copii ADN/µl. Analiza

statistică a indicat o diferenţă semnificativă între încărcătura

bacteriană meningococică din LCR la internare la pacienţii

care au supravieţuit comparativ cu cei decedaţi, aceasta fiind

semnificativ mai mare la cazurile care au decedat (Mann-

Whitney U Test, Z=12.87, p=0.0011). În sânge, la

supraviețuitori valorile medii ale încărcăturii bacteriene au

fost de 2.39 x 107 copii ADN/µl, iar la decedaţi valorile medii

au fost de 4.035 x 109 copii ADN/µl. Analiza statistică a arătat

Scatterplot: Scor prognostic vs. qPCR LCR (Casewise MD deletion)

qPCR LCR= -142E7 + 8240E5 * Scor_prognostic

Correlation: r = 0.66955

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5

Scor prognostic

-5E8

0

5E8

1E9

1.5E9

2E9

2.5E9

3E9

3.5E9

4E9

4.5E9

qP

CR

LC

R

95% confidence

Page 38: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

32

o diferenţă semnificativă între încărcătura bacteriană

meningococică din LCR la internare la supravieţuitori

comparativ cu cei decedaţi, încărcătura bacteriană în sânge la

cei decedaţi fiind semnificativ mai mare (Mann-Whitney U

Test, Z= -3.205, p=0.0013).

XIII.3.3.4. Corelarea duratei simptomelor clinice

anterioare internării (de la debutul bolii până la

internare) cu nivelul încărcăturii bacteriene

Valoarea mediană a duratei simptomelor clinice

anterioare internării (de la debutul bolii până la internarea în

spital) a fost de 24 ore (variaţie 3–96h).

Analiza corelaţională a valorilor încărcăturii

bacteriene meningococice la internare cu durata simptomelor

clinice anterioare internării, a indicat pentru qPCR din sânge o

corelaţie inversă (r=0.184, p=0.0106) (cu cât durata

simptomelor anterioare internării a fost mai lungă, cu atât

valorile încărcăturii bacteriene meningococice la internare în

sânge au fost mai mici) iar pentru qPCR din LCR o corelaţie

directă, dar nesemnificativă statistic (r=0.125, p=0.479).

Valoarea medie a duratei simptomelor clinice

anterioare internării în spital a fost de 33.6 ore în formele

medii de boală şi 21.1 ore în cele severe. Durata simptomelor

clinice anterioare internării a fost mai mică de 24 ore la 75%

din pacienţii cu forme grave de boală (Q75=24h), comparativ

cu doar la 50% dintre cei cu forme medii de boală

(medianaforma clinică medie = 24h) (tabelul XIII.26).

Tabelul XIII.26. Durata simptomelor clinice anterioare internării

vs. forma clinică.

Formă

clinică

Media

Durata ore Dev.std Er.std Min Max Q25 Mediana Q75

Medie 33.6 25.5 4.8 5.0 96.0 19.0 24.0 48.0

Gravă 21.1 16.2 5.1 3.0 48.0 6.0 19.5 24.0

Page 39: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

33

Analiza neparametrică (Mann-Whitney U Test) a

demonstrat că nu a existat o diferenţă semnificativă între

durata simptomelor în funcţie de forma clinică (medie şi

gravă) de boală (Mann–Whitney, Z=1.45, p = 0.158).

Valoarea medie a duratei simptomelor clinice

anterioare internării în spital a fost de 35.8 ore la pacienţii

care au supravieţuit şi 16.7 ore la decedaţi. Valorile medianei

au indicat faptul că la 50% dintre pacienţii supravieţuitori

durata simptomelor clinice anterioare internării a fost mai

mare de 24 ore, în timp ce la 50% din pacienţii decedaţi,

aceasta a fost mai mică de 9.5 ore (tabelul XIII.27). Analiza

statistică a arătata că durata simptomelor clinice anterioare

internării a fost semnificativ mai mică în cazul pacienţilor

decedaţi (H=4.55, p=0.032, 95%CI).

Tabelul XIII.27. Durata simptomelor clinice anterioare internării

vs.supravieţuire.

Formă

clinică

Media

Durata ore Dev.std Min Max Mediana

Supravieţuire 35.8 26.7 5.0 96.0 24.0

Decese 16.7 17.1 3.0 48.0 9.5

XIII.3.3.5. Corelaţia dintre nivelul încărcăturii

bacteriene la internare şi serogrupul de meningococ

Analiza corelaţiei dintre încărcătura bacteriană

meningococică la internare şi serogrupul de meningococ a

arătat că în sânge valorile medii ale încărcăturii bacteriene

pentru serogrupul A au fost de 4.24 x 108 copii ADN/µl,

pentru serogrupul B – valori medii de 2.24 x 109 copii

ADN/µl şi pentru serogrupul C – 1.26 x 101 copii ADN/µl.

Analiza statistică a arătat o diferenţă semnificativă între

valorile încărcăturii bacteriene din sânge pentru serogrupurile

A, B şi C, încărcătura bacteriană fiind semnificativ mai mare

la serogrupul B (Mann-Whitney U Test, Z= 5.47, p=0.0406 ).

Page 40: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

34

Analizând corelaţia dintre valorile încărcăturii

bacteriene meningococice la internare şi serogrupul de

meningococ am constatat că în LCR, valorile medii ale

încărcăturii bacteriene pentru serogrupul A au fost de 2.12

x106 copii ADN/µl, pentru serogrupul B – valori medii de

18.9 x 106 copii ADN/µl și pentru serogrupul C – valori medii

de 12.4 x 107 copii ADN/µl. Analiza statistică a arătat o

diferenţă semnificativă între încărcătura bacteriană în LCR

pentru serogrupurile A, B şi C, încărcătura bacteriană fiind

semnificativ mai mare la serogrupul C comparativ cu

serogrupul A, dar s-au remarcat valori ale încărcăturii

bacteriene mai mari pentru serogrupul C faţă de B (Mann-

Whitney U Test, Z=11.01, p=0.0392).

XIII.3.3.6. Corelaţia dintre nivelul încărcăturii

bacteriene la internare şi serogrupul de meningococ în

funcţie de supravieţuire

Analiza corelaţională a valorilor încărcăturii

bacteriene meningococice la internare în funcţie de serogrupul

de N. meningitidis şi statusul supravieţuitor/decedat, a indicat

faptul că toate decesele au fost determinate de serogrupul B.

Aceşti pacienţi au prezentat valori medii ale încărcăturii

bacteriene semnificativ mai mari în sânge (de ordinul a 109),

însă nesemnificative pentru qPCR în LCR. Pentru serogrupul

C, valori medii ale încărcăturii bacteriene mai mari

comparativ cu serogrupul B, au fost înregistrate în LCR la un

supravieţuitor cu meningită meningococică, formă medie.

XIII.3.3.7. Corelaţia dintre nivelul încărcăturii bacteriene

la internare şi vârstă

Corelarea valorilor încărcăturii bacteriene

meningococice la internare cu vârsta pacienţilor nu a indicat o

corelaţie semnificativă a vârstei cu nivelul încărcăturii

bacteriene în sânge (r=0.3683, p=0.084) sau LCR (r=0.442,

p=0.804).

Page 41: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

35

XIII.3.3.8. Corelaţia dintre nivelul încărcăturii bacteriene

la internare şi vârsta în funcţie de supravieţuire

Analiza corelaţională a valorilor încărcăturii

bacteriene meningococice la internare cu vârsta pacienţilor în

funcţie de supravieţuire, a remarcat o corelaţie semnificativă

(r=0.79, p=0.01) în sânge a valorilor încărcăturii bacteriene cu

vârsta la pacienţii decedaţi, aspect care nu s-a menţinut valabil

în cazul pacienţilor supravieţuitori, la care am regăsit o

corelaţie directă cu valorile încărcăturii bacteriene din LCR

(r=0.687, p<<0.01).

XIII.3.3.9. Corelaţia dintre nivelul încărcăturii bacteriene

la internare şi numărul zilelor de spitalizare

Analiza valorilor încărcăturii bacteriene

meningococice la internare în funcţie de numărul zilelelor de

spitalizare, a indicat o corelaţie inversă. Astfel, pacienţii care

au prezentat o valoare mai mică a încărcăturii bacteriene la

internare au beneficiat de un număr mai mare de zile de

spitalizare. Acest aspect a fost regăsit în cazul încărcăturii

bacteriene din sânge (r=-0.63, p=0.001). În cazul încărcăturii

bacteriene din LCR corelaţia inversă a fost de intensitate mai

mică însă semnificativă statistic (r= -0.31, p=0.40, 95%CI).

XIII.3.3.10. Corelaţia dintre nivelul încărcăturii

bacteriene la internare şi numărul zilelor de spitalizare în

funcţie de supravieţuire

Analiza valorilor încărcăturii bacteriene

meningococice la internare în funcţie de numărul zilelelor de

spitalizare la supravieţuitori şi decedaţi, a arătat faptul că la

supravieţuitori a existat o corelaţie directă (la supravieţuitorii

care la internare au prezentat valori crescute ale încărcăturii

bacteriene şi numărul zilelor de spitalizare a fost mai crescut)

în timp ce la decedaţi a existat o corelaţie inversă ( la pacienţii

care au decedat, numărul zilelor de spitalizare a fost mai

scăzut în cazul pacienţilor care la internare au prezentat valori

Page 42: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

36

crescute ale încărcăturii bacteriene; probabil a survenit

decesul).

XIII.4. Discuţii

Infecţia invazivă (sepsis şi/sau meningită) cauzată de

N. meningitidis continuă să fie o cauză importantă de deces în

întreaga lume. Diagnosticul rapid este important pentru

administrarea precoce a tratamentului adecvat. Infecţia

meningococică este suspectată normal pe baze clinice şi

confirmată prin examenele clasice de laborator: în special din

LCR prin cultură şi examenul direct, din sânge prin

hemocultură şi mai puţin din faringe, prin exsudatul faringian

[6,7]. Totuşi, diagnosticul clinic de infecţie meningococică

poate fi dificil, datorită variabilităţii simptomelor. În plus,

pentru îmbunătăţirea prognosticului, la cazurile suspectate de

infecţie meningococică, ghidurile actuale recomandă

administrarea cât mai rapidă a unui antibiotic, uneori chiar

înainte de a ajunge la spital [8]. Astfel, procentul pacienţilor

cu infecţie meningococică invazivă de la care N. meningitidis

poate fi izolat prin tehnicile microbiologice standard s-a

redus. Utilizarea reacţiei de latex-aglutinare (LA) utilizând ca

produs patologic LCR permite stabilirea diagnosticului

etiologic în special la cazurile pretratate cu antibiotice [9].

Examenul direct şi cultura LCR sunt pozitive în 80-90% din

cazurile de infecţie meningococică netratate, rata reducându-

se semnificativ ca urmare a administrării anterioare de

antibiotice. Studiile arată un procent de 50% al pozitivităţii

hemoculturilor la pacienţii cu infecţie meningococică

netrataţi. Această rată se reduce la doar 5% în urma

administrării de antibiotice anterior internării [10]. Acest fapt

a fost constatat şi la cazurile de infecţie meningococică

internate în Clinica de Boli Infecţioase Iaşi, în perioada

ianuarie 2012 - iunie 2014 (n=65), la care prin utilizarea

antibioterapiei anterior internării (60% din cazuri) s-a

Page 43: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

37

constatat reducerea semnificativă a proporţiei examenului

direct LCR pozitiv de la 46.15% la 12% (p=0.017), a

culturilor LCR pozitive de la 79.62% la 4% (p<<0.001), a

latex-aglutinării LCR pozitive de la 30.77% la 0% (p=0.0192)

precum şi a hemoculturilor pozitive de la 58.35% la 0%

(p=0.0053). O altă limitare a metodelor de diagnostic

convenţional este intervalul relativ mare de timp pentru

obţinerea rezultatelor pe baza culturii, precum şi sensibilitatea

şi specificitatea scăzută a testului de latex-aglutinare [11,12].

Referitor la sensibilitatea scăzută a latex-aglutinării,

rezultatele studiului nostru au fost în concordanţă cu datele

din literatură, dar contrar altor autori [9], puterea de

diagnostic a acestei metode a fost mai scăzută la pacienţii care

au primit antibiotice anterior internării comparativ cu cei

netrataţi.

Prin urmare, se impune utilizarea unei metode de

diagnostic mai rapide şi mult mai sensibilă. Astfel, qPCR are

o înaltă sensibilitate şi specificitate comparativ cu cultura

(90% în LCR pentru N. meningitidis). Studii recente au arătat

că în ser, deşi destul de specific, qPCR nu este atât de sensibil,

deoarece acesta conţine inhibitori pentru PCR, iar ADN

polimeraza utilizată este sensibilă la această acţiune

inhibitorie. Din acest motiv se preferă recoltarea sângelui pe

EDTA, deoarece acesta inhibă activitatea de degradare a ADN

supus extracţiei [13]. Introducerea qPCR a îmbunătăţit

considerabil frecvenţa confirmării cazurilor, în special la

pacienţii pretrataţi, cu culturi negative. Astfel, qPCR are o

sensibilitate net superioară culturii, infecţia meningococică

fiind confirmată la 63% dintre pacienţii diagnosticaţi prin

cultură, la 88% prin PCR şi la 96% prin qPCR [14, 15]. Şi

rezultatele studiului nostru au demonstrat faptul că prin

metoda nou introdusă (qPCR) a crescut cu 30.8% proporţia

cazurilor de infecţie meningococică identificate. Astfel, qPCR

a prezentat cel mai mare procent de rezultate pozitive atât

pentru LCR (95%, respectiv 83.33%) cât şi pentru sânge

Page 44: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

38

(30%, respectiv 94.44%), rezultat care s-a menţinut atât în

grupul pacienţilor clasificaţi la internare drept cazuri posibile

de infecţie meningococică, cât şi în grupul celor clasificaţi

drept cazuri probabile. Am constatat de asemenea, că metoda

qPCR este o tehnică foarte utilă pentru detectarea ADN-ului

bacterian în probele de LCR şi sânge de la cazurile suspectate

de infecţie meningococică. În cazul pacienţilor care nu au

primit tratament antibiotic înaintea internării, sensibilitatea

qPCR în LCR a fost de 76.92% , similar cu cultura LCR, iar

sensibilitatea qPCR în sânge a fost de 84.62%, comparativ cu

sensibilitatea hemoculturii de doar 53.85%. La pacienţii cu

antibioterapie anterioară internării sensibilitatea qPCR a fost

de 96% în LCR, comparativ cu metodele clasice care

presupun cultivarea (Se=4%), iar în sânge, sensibilitatea

qPCR a fost de 48% comparativ cu sensibilitatea hemoculturii

care a scăzut la 0%. Am constatat astfel şi noi, la pacienţii

pretrataţi cu antibiotice o sensibilitate a qPCR mai bună decât

a culturii. O altă constatare importantă a studiului nostru a fost

aceea că, deşi au primit tratament antibiotic anterior, procentul

pacienţilor cu infecţie meningococică confirmată pentru care

proba qPCR din LCR a fost pozitivă a crescut la 96% de la

76.92% la cei fără tratament antibiotic anterior, ceea ce

demonstrează puterea crescută de diagnostic a qPCR în LCR

chiar şi în cazul administrării de antibiotice anterior recoltării

probei. În schimb, puterea de diagnostic a qPCR din sânge a

fost mai crescută pentru pacienţii fără antibioterapie

anterioară (84.62%, netrataţi vs. 48%, pretrataţi).

Numeroşi pacienţi cu infecţie meningococică au

contraindicaţii pentru efectuarea puncţiei lombare, reducând

astfel accesibilitatea la diagnosticul convenţional prin cultură,

examenul bacterioscopic direct şi LA din LCR. Metodele de

diagnostic molecular utilizând probe de sânge, deşi mai puţin

sensibile decât LCR în cazul administrării anterioare de

antibiotice, ar constitui în aceste cazuri o metodă utilă pentru

diagnostic, cu evitarea prelevării LCR [16].

Page 45: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

39

Avantajul real al qPCR faţă de cultură este rapiditatea

cu care rezultatele pot fi disponibile, respectiv la aproximativ

2,5 ore de la trimiterea probelor în laborator, după cum am

constatat în studiul nostru. Şi alte studii arată că rezultatele

qPCR au fost disponibile chiar în ziua internării, comparativ

cu rezultatele culturii care necesită minimum 24-48h pentru

confirmare, permiţând astfel clinicienilor sa instituie terapia

ţintit, să limiteze investigaţiile pentru alte diagnostice şi să

instituie măsurile de profilaxie specifice pentru contacţi [17,

18,19]. Un alt avantaj al qPCR faţă de cultură, este acela că

prin cultură, fiind detectate doar microorganismele viabile,

încărcătura bacteriană reală, adesea este subestimată. În

schimb, ADN-ul detectat prin qPCR, reprezentând atât

meningococi omorâţi cât şi viabili, este direct legat de

încărcătura bacteriană. [19]. În consecinţă, încărcătura

bacteriană este semnificativ mai mare atunci când este

determinată prin qPCR, comparativ cu metodele cantitative de

cultură [20].

În infecţia meningococică, severitatea bolii a fost

direct corelată cu concentraţiile serice ale citokinelor,

endotoxinei (LOS) şi antigenului polizaharidic meningococic

[21,22]. Recent, a fost demonstrat că in vitro, eliberarea

citokinelor creşte la valori ale încărcăturii bacteriene

meningococice cuprinse între 105-108 bacterii/ml [23,24]. S-a

observat însă, că la valori ale încărcăturii bacteriene de 108

eliberarea citokinelor din monocitele stimulate de

meningococii care exprimă LOS cât şi de cei LOS deficienţi a

fost identică. Acest fapt a indicat o cale de stimulare a

monocitelor independentă de LOS. Nu a fost încă studiat dacă

încărcăturile bacteriene meningococice mai mari de 108 induc

un răspuns mai înalt al citokinelor, independent de

endotoxină, care ar putea influenţa evoluţia. Studii anterioare

au demonstrat asocierea încărcăturii bacteriene înalte cu

severitatea bolii. Astfel, în infecţiile cu S. pneumoniae şi H.

influenzae a fost demonstrată o corelaţie clară între severitatea

Page 46: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

40

bolii şi valorile încărcăturii bacteriene din sânge: la valori ale

încărcăturii bacteriene mai mari de 103 UFC/ml pacienţii au

prezentat mai frecvent forme severe de boală (meningită sau

epiglotită) comparativ cu cei ale căror valori erau mai mici de

102 UFC/ml de sânge (92% vs. 9.5%) [20]. Brandtzaeg şi

colab. [25], au arătat corelaţia dintre concentraţiile

endotoxinei din sânge şi LCR şi severitatea bolii în infecţia

meningococică, precum şi corelaţia cu nivelele markerilor

proinflamatori din plasmă. Astfel, concentraţiile endotoxinei

din plasmă au fost corelate cu încărcătura bacteriană [26].

Rezultatele studiului nostru au fost în concordanţă cu datele

din literatură, confirmând asocierea dintre încărcătura

bacteriană meningococică înaltă şi severitatea bolii. Astfel,

valorile medii ale încărcăturii bacteriene la internare au fost

semnificativ mai mari în formele severe de boală, (de ordinul

a 109 în sânge, şi 106 în LCR) comparativ cu cele înregistrate

în formele medii (de ordinul a 105 în sânge, şi 106 în LCR).

Valorile medii ale încărcăturii bacteriene la internare au fost

de asemenea semnificativ mai mari la pacienţii care au

decedat (de ordinul a 109) comparativ cu cei care au

supravieţuit (de ordinul a 107).

Pe lângă polimorfismele gazdei [27], în creşterea

probabilităţii deceselor datorate infecţiei meningococice au

fost incriminaţi şi alţi factori, precum vârsta şi infecţia cu

serogrupul C. Studiul asocierii acestor factori cu o încărcătură

bacteriană înaltă este util pentru o mai bună înţelegere a

mecanismelor care conduc la deces. Similar datelor din

literatură care au arătat că influenţa vârstei asupra mortalităţii

este independentă de un efect asupra intensităţii bacteriemiei,

nici rezultatele studiului nostru nu au stabilit o corelaţie clară

a încărcăturii bacteriene meningococice cu vârsta. Astfel, la

vârste mai mari, s-au constatat valori crescute ale încărcăturii

bacteriene la internare în sânge la pacienţii decedaţi şi

respectiv în LCR, la supravieţuitori. Vârsta pare a fi deci un

factor de risc direct şi independent pentru deces.

Page 47: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

41

Deşi mai mulţi autori au asociat infecţia cu serogrupul

C de N. meningitidis cu rate mai înalte ale morbidităţii şi

mortalităţii, în special la populaţia adultă [28, 29], rezultatele

studiului nostru au indicat faptul că infecţia cu serogrupul B

de meningococ a fost prevalentă în perioada studiată şi a fost

asociată cu un risc crescut de deces datorită încărcăturii

bacteriene mai mari (de ordinul a 109).

Analiza corelaţiei dintre încărcătura bacteriană la

internare şi durata spitalizării a indicat faptul că, la pacienţii

din studiul nostru, care au prezentat la internare valori mici

ale încărcăturii bacteriene, durata spitalizării a fost mai mare.

Similar altor autori, şi rezultatele noastre au arătat că, atunci

când s-a făcut corelaţia încărcăturii bacteriene la internare cu

durata spitalizării în funcţie de supravieţuire, încărcătura

bacteriană înaltă a fost asociată cu spitalizarea prelungită la

pacienţii care au supravieţuit, în timp ce la decedaţi, durata

spitalizării a fost mai scurtă (probabil pacienţii au decedat).

Majoritatea cazurilor de infecţie meningococică

invazivă debutează brusc. Neexistând un prodrom prelungit al

bolii, până la apariţia primelor simptome, pacienţii pot părea

perfect sănătoşi. Aceasta probabil semnifică faptul că

simptomele bolii apar brusc ca urmare a bacteriemiei iniţiale

[30]. Pentru N. meningitidis, dublarea timpului în mediul de

cultură este de aproximativ 20-30 de minute. Totuşi, în

condiţii ideale, încărcăturile bacteriene măsurate la pacienţii

cu forme severe de boală (cu valori de la 108 la 109) pot fi

atinse în 10-15 ore, interval care corespunde îndeaproape

duratei simptomelor anterior internării. Deci, probabil

componenta majoră care determină rata de multiplicare a N.

meningitidis este constituită răspunsul gazdei la infecţie [30].

Deşi alte studii au arătat că severitatea bolii şi încărcătura

bacteriană iniţială la internare au fost independente de durata

simptomelor clinice anterioare internării [26], studiul nostru a

relevat faptul că încărcătura bacteriană la internare a fost cu

Page 48: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

42

atât mai scăzută cu cât durata simptomelor anterioare

internării a fost mai mare, deci probabil că încărcătura

bacteriană fiind mai mică, forma de boală a fost mai puţin

severă şi astfel pacientul a tolerat (suportat) simptomele mai

mult timp până la internare. Nu s-a constatat o diferenţă

semnificativă între încărcătura bacteriană la internare în

formele medii şi grave de boală în funcţie de durata

simptomelor anterioare internării. Durata simptomelor

anterioare internării a fost semnificativ mai scăzută la decedaţi

comparativ cu supravieţuitorii (9.5h vs. 24h, mediana), dar

numărul deceselor din lotul nostru fiind prea mic, nu s-a putut

realiza corelaţia cu încărcătura bacteriană la internare.

XIII.5. Concluzii

În concluzie, qPCR este un test rapid, sensibil şi

specific pentru diagnosticul infecţiilor meningococice; qPCR

este util chiar şi pentru probele de sânge, care sunt mai uşor

de recoltat, comparativ cu LCR;

Prin asocierea cu evoluţia nefavorabilă, măsurarea

încărcăturii bacteriene meningococice la internare poate

furniza informaţii utile pentru prognostic.

Capitolul XIV. Concluzii generale

Infecţia meningococică este recunoscută pentru

formele clinice severe pe care le poate îmbrăca, Neisseria

meningitidis fiind principala cauză de meningită bacteriană şi

septicemie la copiii şi tinerii adulţi din întreaga lume.

Peste jumătate din cazurile de infecţie meningococică

din cazuistica noastră au survenit la sugari şi la copii până la

vârsta de 5 ani.

Variabilitatea simptomelor la debut face dificil

diagnosticul clinic în stadiile iniţiale ale bolii, mai ales până la

apariţia rash-ului cutanat specific.

Infecţiile meningococice sunt apanajul sezonului rece.

Page 49: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

43

Tendinţa descrescătoare a incidenţei acestora semnalată în

special în ultimii ani, atât în zona noastră cât şi la nivel

mondial, ne-a pus însă în faţa unei duble dileme: se datorează

acest fapt doar fenomenului de încălzire globală sau este şi

consecinţa directă a administrării din ce în ce mai frecvente a

antibioterapiei anterior internării în spital?

Gold-standard-ul pentru confirmarea etiologiei

infecţiilor meningococice era considerată, până nu demult,

cultura din lichidul cefalo-rahidian (LCR) şi/sau sânge.

Creşterea rapidă a frecvenţei utilizării tratamentului

antibiotic anterior spitalizării la pacienţii suspectaţi de infecţie

meningococică, a făcut însă ca un număr din ce în ce mai

mare de cazuri să nu poată fi confirmat prin această metodă.

Pe lângă efectul negativ al administrării anterioare de

antibiotice asupra sensibilităţii sale, cultura are şi dezavantajul

obţinerii tardive a rezultatelor, într-un interval de 24-48h de la

recoltare.

Latex-aglutinarea, recomandată de majoritatea

autorilor pentru identificarea etiologiei în special în cazurile

pretratate cu antibiotice, s-a dovedit a fi un test cu sensibilitate

foarte scăzută în aceste situaţii în cazuistica noastră.

Aceste constatări, alături de morbiditatea crescută şi

rata înaltă a fatalităţii cazurilor înregistrată la vârstele tinere,

precum şi creşterea semnificativă în ultimii ani a incidenţei

serogrupului B pentru care nu există încă un vaccin eficient şi

care a fost implicat în majoritatea cazurilor soldate cu deces,

ne-au întărit convingerea că pentru diagnosticul rapid şi precis

al infecţiei meningococice este necesară utilizarea unei tehnici

moderne care să nu implice cultivarea.

Prin introducerea qPCR, proporţia cazurilor

confirmate a crescut considerabil, în special la pacienţii

pretrataţi, cu culturi negative.

Sensibilitatea qPCR a fost mai bună decât a culturii,

la pacienţii care au primit tratament antibiotic anterior

internării.

Page 50: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

44

Sensibilitatea qPCR din LCR a fost mai bună

comparativ cu sensibilitatea qPCR din sânge, la pacienţii care

au primit tratament antibiotic anterior internării

Sensibilitatea qPCR din sânge a fost mai bună

comparativ cu sensibilitatea qPCR din LCR, la pacienţii care

nu au primit tratament anterior

Pentru pacienţii la care puncţia lombară este

contraindicată la internare sau cei care refuză efectuarea ei,

deşi mai puţin sensibil decât qPCR din LCR în cazul

administrării anterioare de antibiotice, qPCR din sânge devine

astfel o alternativă utilă pentru diagnostic, cu menţiunea că

probele de sânge sunt şi mai uşor de recoltat decât LCR

Apariţia şi în zona noastră de tulpini de

meningocococ cu rezistenţă de nivel înalt sau scăzut la

Penicilină, fac obligatorie efectuarea antibiogramei.

Aceasta fiind însă dificil de realizat prin tehnica PCR,

combinaţia cultură şi qPCR rămâne esenţială pentru orientarea

antibioterapiei.

Cefalosporinele din generaţia a III-a sunt recomandate

în prezent ca tratament de primă intenţie al infecţiilor

meningococice, până la aflarea rezultatelor antibiogramei.

În ciuda tendinţei crescătoare a utilizării cortizonului

în ultimii 10 ani, acesta nu şi-a dovedit utilitatea în

îmbunătăţirea ratei supravieţuirii în nici una din formele

clinice ale infecţiei meningococice.

Analiza corelaţională a valorilor încărcăturii

bacteriene măsurate la internare cu factorii care grevează

letalitatea identificaţi în primul studiu a demonstrat faptul că

aceasta a fost influenţată de serogrupul tulpinii infectante (B),

a fost mai sensibilă la variaţiile anumitor parametri (durata

Page 51: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

45

spitalizării), dar a fost independentă de influenţa vârstei

asupra probabilităţii deceselor.

Măsurarea încărcăturii bacteriene poate furniza deci

informaţii prognostice utile pentru evoluţia bolii.

Prin rapiditatea furnizării rezultatelor, sensibilitatea şi

specificitatea crescută, qPCR poate fi deci utilizat pentru

diagnosticul infecţiilor meningococice invazive în cazurile în

care antibioterapia administrată anterior poate inhiba creşterea

bacteriană.

Fără qPCR, un număr substanţial de cazuri de infecţie

meningococică ar fi rămas nediagnosticat.

Prin cuantificarea încărcăturii bacteriene la internare,

qPCR, ar putea fi utilizată ca marker de prognostic atât pentru

evoluţia bolii cât şi pentru selecţia pacienţilor cu încărcături

bacteriene înalte în vederea aplicării noilor terapii (anti-

endotoxină sau anti-citokină).

Altă variantă posibilă în viitor, ar fi secvenţierea

materialului amplificat în vederea decelării genelor de

rezistenţă.

Studii viitoare pe un număr mai mare de probe/cazuri

ar putea fi un prilej de aplicare a acestei strategii.

Capitolul XV. Elemente de originalitate ale tezei

Lucrarea de faţă se remarcă prin abordarea concretă a

patologiei infecţioase în ceea ce priveşte infecţia

meningococică invazivă, atât din perspectiva tipologiei

pacientului, cât şi a evoluţiei în timp a acestei boli, prin

discuţii comparative pe loturi de pacienţi urmăriţi atât

retrospectiv cât şi prospectiv, precum şi încercarea de a

experimenta şi propune noi metode specifice de identificare

bacteriană, care ulterior, aplicate în practica medicală, să

îndeplinească dorinţa de a veni în ajutorul pacienţilor, cu

Page 52: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

46

stabilirea unui diagnostic rapid şi corect, în vederea instituirii

tratamentului optim. Elementul de noutate, în mod

deosebit, este reprezentat de abordarea noilor metode de

identificare a ADN-ului bacterian în studiul experimental

prospectiv privind testarea probelor de LCR şi sânge prin

metode de detecţie bacteriană rapidă, realizat în cadrul

Departamentului de Microbiologie al UMF “Gr.T.Popa”, Iaşi.

Capitolul XVI. Perspective pe care le deschide teza

Perspectivele tezei surprind dorinţa de a aduce un plus

de cunoaştere al patologiei infecţioase în ceea ce priveşte

infecţiile invazive determinate de N. meningitidis, precum şi

posibilitatea cât mai multor unităţi medicale de diagnostic şi

tratament de a avea acces la metode noi şi de mare

sensibilitate, în scopul diagnosticării rapide şi precise a acestei

patologii complexe, pentru ca terapia ţintită şi precoce

instituită să fie urmată de succes terapeutic (vindecare).

Această metodă modernă de diagnostic, descrisă şi

utilizată în studiul II din prezenta lucrare, necesită urmărirea

în timp, pentru o mai bună optimizare şi aducerea la un

standard comun, spre a fi acceptată în protocolul de diagnostic

rapid al pacientului cu infecţie meningococică invazivă şi nu

numai. Această atitudine vine în întâmpinarea medicilor din

diverse specialităţi (infecţionist, terapie intensivă, pediatru,

urgentist şi generalist) implicate în evaluarea şi monitorizarea

acestei patologii, pentru o mai bună colaborare şi ulterior

îmbunătăţire a calităţii actului medical.

Sensibilitatea metodelor de diagnostic trebuie

continuu îmbunătăţită şi în viitor, aplicarea lor trebuie

introdusă în practica medicală.

Page 53: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

47

Bibliografie selectivă

1. Stuart JM, Monk PN, Lewis DA et al. Management of

clusters of meningococcal disease. PHLS Meningococcus

Working Group and Public Health Medicine Environmental

Group. Commun Dis Rep CDR Rev 1997; 7: R3-5.

2. E.Pilly. Infections a meningocoque.Maladies Infectieuses et

Tropicales, ed.22e, 2010, 258-261.

3. Matthijs C Brouwer, Allan R Tunkel and Diederik van de

Beek. Epidemiology, diagnosis and antimicrobial treatment of

acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews

2010; 467-492.

4. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J,

Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL,

Vandesompele J, Wittwer CT. The MIQE guidelines:

minimum information for publication of quantitative real-time

PCR experiments. Clin Chem 2009; 55(4): 611-22.

5. Boiculese LV, Dimitriu G, Moscalu M. Calitatea

examenului diagnostic. În: Biostatistica, Iaşi, Ed. Pim, 2007:

183-189.

6. Branco RG, Amoretti CF, Tasker RC. Meningococcal

disease and meningitis. J Pediatr (Rio J) 2007; 83 (2 Suppl):

S46-53.

7. Stephens DS. Conquering the meningococcus. FEMS

Microbiol Rev 2007; 31(1): 3-14.

8. Jolly K, Stewart G. Epidemiology and diagnosis of

meningitis: results of a five-year prospective, population-

based study. Commun Dis Public Health 2001; 4(2): 124-9.

Page 54: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

48

9. Carrol ED, Thomson AP, Riordan FA, et al. Increasing

microbiological confirmation and changing epidemiology of

meningococcal disease on Merseyside, England. Clin

Microbiol Infect 2000; 6: 259-62.

10. Cartwright K, Reilly S, White D, Stuart J. Early treatment

with parenteral penicillin in meningococcal disease. Br. Med.

J 1992. 305(6846): 143–147.

11. Gray SJ, Sobanski MA, Kaczmarski EB, Guiver M, Marsh

WJ, Borrow R, Barnes RA, Coakley WT. Ultrasound-

enhanced latex immuno agglutination and PCR as

complementary methods for non-culture-based confirmation

of meningococcal disease. J Clin Microbiol 1999; 37(6):

1797-801.

12. Reza Ghotaslou, Safar Farajnia, Fatemeh Yeganeh,

Shahram Abdoli-Oskouei, Mohammad Ahangarzadeh

Rezaee, Mohammad Barzegar. Detection of Acute Childhood

Meningitis by PCR, Culture and Agglutination Tests in

Tabriz, Iran. Acta Medica Iranica 2012; 50(3): 192-196.

13. Saunders NB, Shoemaker DR, Brandt BL, Zollinger WD.

Confirmation of suspicious cases of meningococcal

meningitis by PCR and enzyme-linked immunosorbent assay.

J Clin Microbiol 1997; 35(12): 3215-9.

14. Sacchi CT, Fukasawa LO, Gonçalves MG, Salgado MM,

Shutt KA, Carvalhanas TR, Ribeiro AF, Kemp B, Gorla MC,

Albernaz RK, Marques EG, Cruciano A, Waldman EA,

Brandileone MC, Harrison LH. São Paulo RT-PCR

Surveillance Project Team. Incorporation of real-time PCR

into routine public health surveillance of culture negative

Page 55: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

49

bacterial meningitis in São Paulo, Brazil. PLoSOne 2011;

6(6): e20675.

15. M Qurbanalizadegan1, R Ranjbar1, RA Ataee, M Hajia, Z

Goodarzi, S Farshad, N JonaidiJafari, Y Panahi, H Kohanzad,

M Rahbar, H Ghadimi, M Izadi. Specific PCR Assay for

Rapid and Direct Detection of Neisseria meningitidis in

Cerebrospinal Fluid Specimens. Iranian J PublHealth 2010;

39(4): 45-50.

16. Hackett SJ, Carrol ED, Guiver M, Marsh J, Sills JA,

Thomson AP, Kaczmarski EB, Hart CA. Improved case

confirmation in meningococcal disease with whole blood

Taqman PCR. Arch Dis Child 2002; 86(6): 449-52.

17. Bryant PA, Li HY, Zaia A, Griffith J, Hogg G, Curtis N,

Carapetis JR. Prospective study of a real-time PCR that is

highly sensitive, specific, and clinically useful for diagnosis of

meningococcal disease in children. J Clin Microbiol 2004;

42(7): 2919-25.

18. Tuyama M, Boente RF, Rebelo MC, Igreja RP, Barroso

DE. The utility of the polymerase chain reaction assay for

aetiologic definition of unspecified bacterial meningitis cases.

Mem Inst Oswaldo Cruz 2008; 103(2): 138-42.

19. Guiver M, Borrow R, Marsh J, Gray SJ, Kaczmarski EB,

Howells D, Boseley P, Fox AJ. Evaluation of the Applied

Biosystems automated Taqman polymerase chain reaction

system for the detection of meningococcal DNA. FEMS

Immunol Med Microbiol 2000; 28(2):173-9.

Page 56: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

50

20. Sullivan TD, LaScolea LJ Jr, Neter E. Relationship

between the magnitude of bacteriaemia in children and the

clinical disease. Pediatrics 1982; 69: 699–702.

21. van Deuren M, van der Ven-Jongekrijg J, Bartelink AK et

al. Correlation between pro-inflammatory cytokines and anti-

inflammatory mediators and the severity of disease in

meningococcal infections. J Infect Dis 1995; 172: 433–9.

22. Sobanski MA, Barnes RA, Gray SJ, et al. Measurement of

serum antigen concentration by ultrasound-enhanced

immunoassay and correlation with clinical outcome in

meningococcal disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;

19: 260–6.

23. Øvstebø R, Brandtzaeg P, Brusletto B, Haug KB, Lande

K, Høiby EA, Kierulf P. Use of robotized DNA isolation and

real-time PCR to quantify and identify close correlation

between levels of Neisseria meningitidis DNA and

lipopolysaccharides in plasma and cerebrospinal fluid from

patients with systemic meningococcal disease. J Clin

Microbiol 2004; 42(7): 2980-7.

24. Uronen H, Williams AJ, Dixon G, et al. Gram-negative

bacteria induce proinflammatory cytokine production by

monocytes in the absence of lipopolysaccharide (LPS). Clin

Exp Immunol 2000; 122: 312–15.

25. Brandtzaeg P, Bjerre A, Ovstebo R, Brusletto B, Joo GB,

Kierulf P. Neisseria meningitidis lipopolysaccharides in

human pathology. J Endotoxin Res 2001; 7: 401–20.

26. SJ Hackett, M Guiver, J Marsh, JA Sills, APJ Thomson,

EB Kaczmarski, CA Hart. Meningococcal bacterial DNA load

Page 57: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

51

at presentation correlates with disease severity. Arch Dis

Child 2002;86:44–46.

27. Read RC, Cannings C, Naylor SC et al. Variation within

genes encoding interleukin-1 and the interleukin-1 receptor

antagonist influence the severity of meningococcal disease.

Ann Intern Med 2003; 138: 534–4.

28. Trotter CL, Fox AJ, Ramsay ME, et al. Fatal outcome

from meningococcal disease—an association with

meningococcal phenotype but not with reduced susceptibility

to benzylpenicillin. J Med Microbiol 2002; 51: 855–60.

29. Erickson L, De Wals P. Complications and sequelae of

meningococcal disease in Quebec, Canada, 1990–1994. Clin

Infect Dis 1998; 26: 1159–64.

30. Vanessa L. Strelow, Jose E. Vidal. Invasive

meningococcal disease. Doença meningocócica invasive.

ArqNeuropsiquiatr 2013; 71(9-B): 653-658.

Teza cuprinde: 143 de figuri, 80 de tabele şi 362 titluri

bibliografice.

Page 58: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

52

Page 59: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

Abrevieri și acronime

AB – antibiotic

ADN – acidul dezoxiribonucleic

ANOVA – analiza dispersională de varianță (analysis of variance)

AUC – Area Under the Curve (aria de sub curbă)

Canalul FAM – canal de fluorescență cu o anumită lungime de undă (494-518 nm)

Canalul VIC - canal de fluorescență cu o anumită lungime de undă (538-554 nm)

C3G – cefalosporine din generația a III-a

Curba ROC – Receiver Operator Characteristic Curve (curba caracteristică performanțelor unui test)

Hc – hemocultura

LA – latex-aglutinarea

LA-LCR – latex aglutinarea din LCR

LCR – lichidul cefalo-rahidian

OR (Odds Ratio) – raport de șansă

PCR (Polymerase Chain Reaction) – reacția de polimerizare în lanț (reacția de amplificare genică)

PMN – polimorfonucleare neutrofile

qPCR – quantitative Polymerase Chain Reaction

qPCR-sânge – qPCR din sânge

qPCR-LCR – qPCR din LCR

RD – diferența riscurilor

RR – raportul de risc (riscul relativ)

RT-PCR – real-time PCR

Se – sensibilitate

Sp – specificitate

SPSS - Statistical Package for the Social Sciences

Testul χ2 – testul chi pătrat (chi-square test)

VPP – valoare predictiv pozitivă

VPN – valoare predictiv negativă

vs. – versus

VSH – viteza de sedimentare a eritrocitelor

Page 60: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive
Page 61: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

ANEXĂ

Lista de articole din tematica tezei de doctorat

LUCRĂRI ÎN EXTENSO PUBLICATE CA PRIM AUTOR

ÎN REVISTE INDEXATE BDI:

1. Roxana Elena Nemescu, Ramona Gabriela Ursu,

Carmen Mihaela Dorobăț, Luminița Smaranda

Iancu. DIAGNOSIS OF MENINGOCOCCAL

INFECTION BY QPCR: DETECTION AND

QUANTIFICATION OF DNA/Neisseria

meningitidis, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iași

– 2012 – vol. 116, nr. 3, 888-892. ISSN 0048-

7848

http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722

076/40_mpl_ao_8_nemescu_roxana_c_888-

892.pdf

2. Roxana Elena Nemescu, Luminița Smaranda

Iancu, Olivia Simona Dorneanu, Ramona

Gabriela Ursu, Carmen Mihaela Dorobăț.

INFLUENCE OF ANTIBIOTIC THERAPY

PRIOR TO ADMISSION ON THE EFFICACY

OF CLASSICAL METHODS FOR THE

DIAGNOSIS OF MENINGOCOCCAL

DISEASE, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iași –

2014 – vol. 118, nr. 2, 497-502. ISSN 0048-7848

http://www.revmedchir.ro/uploads/1/5/7/2/15722

076/final_34_nemescu_roxana_mpl_ao.pdf

Page 62: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

LUCRĂRI ÎN EXTENSO PUBLICATE CA PRIM AUTOR

ÎN REVISTE INDEXATE ISI:

1. Roxana Elena Nemescu, Ramona Gabriela Ursu,

Carmen Mihaela Dorobăț, Luminița Smaranda

Iancu. THE EFFICIENCY OF RTPCR -TaqMan

USING sodC GENE / N.meningitidis IN

COMPARISON WITH THE CLASSICAL

METHODS FOR THE DIAGNOSIS OF

MENINGOCOCCAL INFECTION.

(se află în procedura de publicare în volumul 22,

din 2014 al Revistei Române de Medicină de

Laborator)

Grant intern UMF “Gr. T. Popa” Iași (17205/2011):

„Corelarea severității infecției meningococice cu

încărcătura genomică bacteriană determinată prin qPCR”,

grant intern UMF “Gr. T. Popa” Iași (17205/2011), director de

proiect

Alte lucrări ale autorului în legătură cu tema

doctoratului:

Participări la manifestări internaționale

1.Roxana Elena Nemescu, Ramona Gabriela Ursu, Carmen

Dorobăț, Luminița Smaranda Iancu. „Clinical utility of qPCR

diagnosis for meningococcemia”. Summer School Innsbruck,

Austria, july 21-27, 2012 (prezentare orală).

2.R. Nemescu, D. Mihalache, C. Dorobăț. Meningococcal

Sepsis in Children – a 15 year review. 20th

Page 63: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

Eur.Congr.Clin.Microb.Infect.Dis., Vienna, Austria, april 10-

13,2010 (publicată în rezumat).

3. R. Nemescu, D. Mihalache, C. Luca, C. Dorobat. Invasive

meningococcal disease in children. 19th

Eur.Congr.Clin.Microb.Infect.Dis., Helsinki, may 16-19,2009

(poster, publicată în rezumat).

Participări la manifestări naționale

1.Roxana Nemescu, Doina Mihalache, Carmen Dorobăţ,

Olivia Dorneanu, Egidia Miftode, V. Luca. Infecţia

meningococică: consideraţii clinice şi terapeutice pe 225 de

cazuri. A IV-a ediție a Conferintei Nationale de Patologie

Infecțioasă‚”Controverse in patologia infecțioasă”, Iasi, 27-29

nov 2008.

2. Roxana Nemescu, Șt.M.Dimitriu, Cătălina Mihaela Luca,

Carmen Dorobăț, E. Năstase, V. Luca. Infecția

meningococică: considerații epidemiologice, clinico-

terapeutice și evolutive. Conferința Zilele Spitalului Clinic de

Recuperare, ediția a IV-a, Iași, 6-8 aprilie 2006.

Rev.Med.Chir.Soc.Med.Iași, 2006, vol.110, nr.2, supl.1.

3.Roxana Nemescu, Doina Mihalache, C. Scurtu, Carmen

Manciuc, Egidia Miftode, Cătălina Luca. Purpura fulminans:

entitate anatomo-clinică a septicemiilor supraacute.

Conferinţa de Dermatologie “Zilele Gh. Năstase”, Iaşi, 26-27

mai 2005.

4. Roxana Nemescu, Doina Mihalache, V.Luca, Carmen

Dorobăţ, Egidia Miftode, Cătălina Luca. Aspecte

clinico-evolutive şi terapeutice actuale ale sepsisului

meningococic. Simpozionul Naţional de Patologie Infecţioasă,

Gura Humorului, Suceava, 19-21 mai 2005.

Page 64: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive

5. Roxana Scurtu, Doina Mihalache, Carmen Manciuc,

Cătălina Luca, Egidia Miftode, V. Luca. Meningococcemia:

consideraţii asupra cazurilor internate în Clinica de Boli

Infecţioase Iaşi în perioada 1998 – 2003. 125 de ani de

învăţământ medical superior la Iaşi, 15 – 20 noiembrie 2004.

6. Doina Mihalache, Roxana Scurtu, Carmen Corcaci, Egidia

Miftode,Cătălina Luca, V.Luca. Meningococcemia –

consideraţii clinico-terapeutice pe 75 cazuri (1995-2001).

Conferinţa Regională de Dermatologie Zilele Gh.,Nastase

Iaşi,mai 23-24, 2002, p.14;

XXVIIeme Semaine de l’Union Medicale Balkanique Chişinău,

19-21 iunie 2002, p.167.

7. Doina Mihalache, Carmen Corcaci, Roxana Scurtu,

Tatiana Turcu, V. Luca, Cătălina Luca, Egidia Miftode.

Infecţia meningococică: consideraţii pe 176 cazuri. Rev.

Buletin Informativ pentru Medicii de Familie, 2001, v.4,nr.7-

8, p.122-123.

8. Doina Mihalache, V. Luca, Egidia Miftode, Florica Dănilă,

V. Mănucă, Roxana Scurtu, Carmen Dorobăț. Infecția

meningococică: considerații asupra cazurilor internate în

Clinica de Boli Infecțioase Iași în ultimii 5 ani. Consfătuirea

Regională de Dermatologie Zilele “Gh. Năstase”, Iași, 20-22

mai, 1999.

9. Carmen Corcaci, V. Luca, Doina Mihalache, Egidia

Miftode, Cătălina Luca, Dana Leca, Roxana Scurtu, Tatiana

Turcu, Șt. Dimitriu. The Dynamic of Meningococcal

Meningitis in the Infectious Diseases Hospital of Iași in Ten

Years Period (1.01.1988-31.12.1997). A 15-a Sesiune a

Zilelor Medicale Balcanice, Iași, 28-30 aprilie, 1999, p.20.

Page 65: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive
Page 66: consideraţii clinice, diagnostice, terapeutice şi particularităţi evolutive