com

e se

para

re q

uesti o

ggetti

1 2 3

9 10 11 12

6

4 85

7

4

5

8

lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone

cotone

lana

pietra

FormaGrandezzaDensità

forma

Densità

grandezza

Diversa grandezza Differente sedimentazioneDifferente velocitàdi rotolamento

4 6 7 85

1 3 4 6 7 8 9 10 11 122 5

Juang RH (2004) BCbasics

Basic Principles of Protein Purification

Ammonium sulfate fractionation

Cell OrganelleHomogenization

MacromoleculeNucleic

acid Carbohydrate (Lipid)

Size Charge Polarity Affinity

Small molecule Cell DebrisProtein

Amino acid, Sugar,

Nucleotides, etc

Gel filtration,SDS-PAGE,Ultrafiltration

Ion exchange,Chromatofocusing,

Disc-PAGE,Isoelectric focusing

Reverse phasechromatography,

HIC,Salting-out

Affinitychromatography,Hydroxyapatite

Juang RH (2004) BCbasics

Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico

RIVELATORE

colonna

pompa

Collettore di frazioniSoluzione di eluizione

Scambio ionico: separazione in funzione della carica

Importanza del pI

• -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico (SCAMBIO

ANIONICO).

• -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).

Eluizione:

-Variazione di pH-Variazione forza ionica-ioni competitivi

Scambiatrice di anioni:

-pH decrescente-forza ionica crescente-anioni competitivi

Scambiatrice di cationi:

-pH crescente-forza ionica crescente-cationi competitivi

Cromatografia di scambio ionico• VANTAGGI

– Per grandi volumi,– Grandi quantità di proteina

(1-5 g proteina per 100 ml),

– Matrice molto robusta,– Condizioni molto flessibili,

possibili molte variazioni.

• SVANTAGGI– Proteine allo stesso pH e

concentrazioni di sali della colonna.

– Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

GEL FILTRAZIONE

Gel filtrazione

Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL:

40,000 Da (40KDa)

Cromatografia di affinità

OH

OH

OH

OOHO

OH

OH

OOH

Resina

Braccio spaziatore Ligando

Cromatografia di affinità

• Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice

• La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna

• Le altre proteine vengono “lavate” via.

• La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

Cromatografia di affinità

• VANTAGGI• Alta affinità, costanti

di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM.

• Legame tutto o nulla:• Possibili molte

variazioni (affinity tags)

• SVANTAGGI• L’ingombro sterico spesso

abbassa la capacità• Il braccio spaziatore può

avere influenza sul legame• L’eluizione può richiedere un

eluente specifico

Affinity tags• Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine

ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando:

• TAG– GST – MBP– biotina– Poli-His– Proteina A

• LIGANDO– Glutatione – Maltosio– Avidina– Nichel, Zinco– Anticorpi

• Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna.

• Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

Cromatografia di affinità con anticorpi

Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

Protocollo generale di purificazione proteine

Obiettivi:

• Cattura– Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio

• Purificazione intermedia– Eliminare la maggior parte dei contaminanti

• Polishing– Ottenere la massima purezza possibile

CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI

Gas cromatografia(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)

Schema a blocchi di un gascromatografo

Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di

paziente con elevata aciduria