come separare questi oggetti 1 2 3 9 10 11 12 6 4 8 5 7 4 5 8 lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone cotone lana

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  • come separare questi oggetti 1 2 3 9 10 11 12 6 4 8 5 7 4 5 8 lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone cotone lana pietra Forma Grandezza Densit forma Densit grandezza Diversa grandezza Differente sedimentazione Differente velocit di rotolamento 4 6 7 8 5 1 3 4 6 7 8 9 10 11 12 2 5 Juang RH (2004) BCbasics
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  • Basic Principles of Protein Purification Ammonium sulfate fractionation Cell Organelle Homogenization Macromolecule Nucleic acid Carbohydrate (Lipid) SizeChargePolarityAffinity Small molecule Cell Debris Protein Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics
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  • Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico RIVELATORE colonna pompa Collettore di frazioni Soluzione di eluizione
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  • Scambio ionico: separazione in funzione della carica
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  • Importanza del pI -A pH > pI (almeno una unit) la proteina carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico ( SCAMBIO ANIONICO ). -A pH < pI (almeno una unit) la proteina carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico ( SCAMBIO CATIONICO ).
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  • Eluizione: -Variazione di pH -Variazione forza ionica -ioni competitivi Scambiatrice di anioni: -pH decrescente -forza ionica crescente -anioni competitivi Scambiatrice di cationi: -pH crescente -forza ionica crescente -cationi competitivi
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  • Cromatografia di scambio ionico VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantit di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. SVANTAGGI Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. Ci pu essere scomodo poich poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.
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  • GEL FILTRAZIONE
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  • Gel filtrazione
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  • Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)
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  • Cromatografia di affinit Resina Braccio spaziatore Ligando
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  • Cromatografia di affinit Un ligando ad alta affinit per la proteina legato alla matrice La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna Le altre proteine vengono lavate via. La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.
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  • Cromatografia di affinit VANTAGGI Alta affinit, costanti di dissociazione nellordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) SVANTAGGI Lingombro sterico spesso abbassa la capacit Il braccio spaziatore pu avere influenza sul legame Leluizione pu richiedere un eluente specifico
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  • Affinity tags Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse legato un tag che presenta affinit con un ligando: TAG GST MBP biotina Poli-His Proteina A LIGANDO Glutatione Maltosio Avidina Nichel, Zinco Anticorpi Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinit con i ligandi legati alla colonna. Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.
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  • Cromatografia di affinit con anticorpi
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  • Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando
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  • Protocollo generale di purificazione proteine
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  • Obiettivi: Cattura Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio Purificazione intermedia Eliminare la maggior parte dei contaminanti Polishing Ottenere la massima purezza possibile
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  • CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI
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  • Gas cromatografia (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)
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  • Schema a blocchi di un gascromatografo
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  • Esempio separazione gas- cromatografica di urina di paziente con elevata aciduria