Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae da ... Dayane... · AgNO3; (d), (h), (l) e (p) em destaque o par portador do sítio de DNAr 18S (vermelho) e cromossomos

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA

Programa de Pós Graduação em Genética, Conservação e Biologia

Evolutiva

NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO

Manaus - Amazonas

Setembro - 2015

Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae da

Amazônia

ii

NATÁLIA DAYANE MOURA CARVALHO

Orientadora: Dra. Maria Claudia Gross – UFAM

Coorientador: Dr. Carlos Henrique Schneider - UFAM

Manaus – Amazonas

Setembro - 2015

Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae

da Amazônia

Tese apresentada ao Programa de Pós-

graduação do Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia, como parte dos requisitos para

obtenção do título de doutor em Genética,

Conservação e Biologia Evolutiva.

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

C331c Carvalho, Natalia Dayane Moura

Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae da Amazônia /

Natalia Dayane Moura Carvalho. --- Manaus: [s.n.], 2015.

xix, 146 f.. : il. color.

Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2015.

Orientador : Maria Claudia Gross.

Coorientador: Carlos Henrique Scheneider.

Área de concentração : Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

1. DNAs repetitivos. 2. I Heterocromatina. 3. Macroteiidae.

I.Título

CDD 597.09

Sinopse:

Cinco espécies de macroteídeos foram estudadas mediante análises de citogenética

clássica (coloração convencional, detecção da heterocromatina e regiões organizadoras

de nucléolo) e moleculares (hibridização fluorescente in situ de DNA repetitivo em

tandem e disperso, Cot1-DNA, clonagem e sequenciamento). Os resultados obtidos

demonstraram que DNAs repetitivos estão normalmente associados à heterocromatina e

diferenças na composição desta fração repetitiva entre os teídeos são evidentes. Esta

possui papel importante na organização funcional e estrutural do centrômero e telômero

destas espécies.

Palavras-chave: Macroteiidae, Heterocromatina, DNAs repetitivos, Centrômero,

Telômero.

iv

Dedico esta tese a minha família e

ao meu marido Rogério Neves.

v

ESTRESSEEE nãããooo!!! EINSTRESEEE!!

Quando alguém o crítica ou algo não dá certo, você fica irritadíssimo? Se você tem esse

sintoma, você está estressado. E se está estressado, bom, você é NORMAL.

Augusto Cury

vi

A realização deste estudo foi possível devido:

Ao Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

(GCBEV).

Ao Laboratório de Citogenômica Animal (LACA) onde todas as análises foram

realizadas.

Aos financiamentos fornecidos pelo projeto Rede BioPHAM (CNPq/FAPEAM

Processo: 563348/2010-0), Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento

Tecnológico (Processo: 474617/2013-0), CAPES (Processo: 23038.009447/2013-45),

Programa Pro-Amazonia Biodiversidade e Sustentabilidade (Processo: 047/2012) e

FAPEAM (PN. 020/2013).

À Fundação de Amparo a Pesquisas do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela

concessão da bolsa de estudo durante a realização deste trabalho.

callto:23038.009447

vii

Agradecimentos

Desde já agradeço a todos, que de forma direta ou indiretamente, contribuíram

para a realização deste trabalho.

À minha orientadora Dra. Profa. Maria Claudia Gross por ter me aceitado como

orientada, pelos conhecimentos, conselhos, puxões de orelha, sugestões, apoio,

confiança e pelo exemplo de profissional. À Maria Claudia Gross por tantas coisas que

nem sei por onde começar..... mas quero agradecer principalmente pela sua amizade, por

estar sempre disponível as minhas aflições e angústias pessoais, por tantos momentos de

“desentedimentos, desavenças” (olha que não foram poucos) mas você tão preocupada

em me proteger de tantas coisas que eu nem imaginava que estivesse acontecendo.

Muito abrigada por tudo de coração. Serei eternamente grata por todos os momentos

que me incentivou a crescer tanto o pessoal quanto o profissional. Agradeço por tudo e

muito mais!!

Ao meu coorientador Dr. Carlos Henrique Schneider pela sua coorientação,

ensinamentos, discussões, críticas e sugestões. Ao “Carlão” pela amizade, pelos bons

momentos no laboratório, nas coletas (lembra “Eu não quero comer”, hahaha) e

principalmente por ter me aguentado desde o mestrado até o doutorado. Afinal, sempre

serei “Papagaio de pirata”.

Aos professores Dr. Roberto Artoni, Dra. Mara Almeida, Dr. Marcelo Vicari, Dra.

Viviane Nogaroto, Miguel e aos colegas do Laboratório de Citogenética Animal da

Universidade Estadual de Ponta Grossa, pela ajuda durante o período que fiquei no

laboratório da UEPG.

Aos meus professores da graduação e pós-graduação pelos inúmeros ensinamentos

durante toda a minha vida acadêmica.

Aos amigos do Laboratório de Citogenômica Animal (LACA) pelo companheirismo,

amizade e principalmente por todos os momentos que passamos juntos: Francijara

Araújo, Erika Milena, Sabrina Mitozo (Sassá), Sabrina Araújo, Vanessa Pinheiro,

Leonardo Goll e tantos os outros que passaram pelo LACA (Camila, Rafael, Marília,

viii

Karol, Mariah, Renan, Jéssica, Thaís, Ana Carolina, Vanessa Salles e Dayane).

Obrigada pela agradável convivência diária, é claro sem ABRAÇOS!!! Essa é a

Família LACA...amável!!

À minha família, meu motivo de orgulho, exemplo de vida. Obrigada por tudo e por

acreditarem em mim durante toda a minha vida. Aos meus pequenos sobrinhos por me

mostrar que vale a pena viver. Amo vocês mais que tudo nessa vida.

Ao meu marido (namorido) Rogério de Oliveira Neves por mostrar-me que é

maravilhoso estar ao seu lado... Neguinho, te amo!!!

Aos amigos Edson, João, Julia, Thatianna, Camila, Leila e Maria Leandra por estarem

sempre presentes na minha vida, alguns quilômetros de distância porém tão próximos de

coração!!

Obrigada a todos!

ix

Resumo

Macroteídeos são lagartos Neotropicais da família Teiidae, a qual apresenta variação

cariotípica quanto ao número diploide e diferenças nos padrões de distribuição da

heterocromatina. Contudo, o mapeamento físico cromossômico de DNAs repetitivos

bem como análises comparativas destes elementos são incipientes no grupo, sendo

fundamentais para o entendimento da dinâmica, organização e a carioevolução destes

lagartos. Diante disto, o presente estudo isolou e mapeou diferentes classes de

sequências de DNAs repetitivos, tais como fração repetitiva Cot1-DNA, DNAr 5S,

sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE em

cromossomos mitóticos de cinco espécies de teídeos amazônicos: Ameiva ameiva,

Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin.

O mapeamento das sequências repetitivas revelou um padrão diferenciado em

Cnemidophorus sp.1, enquanto que as demais espécies apresentaram todas as

sequências associadas entre si na região heterocromática. O mapeamento físico

cromossômico do gene da tropomiosina 1 foi realizado pela primeira vez em lagartos e

revelou que, além de ser funcional, este possui função estrutural semelhante aos demais

elementos repetitivos mapeados, estando localizados preferencialmente nas regiões

centroméricas e terminais dos cromossomos. A FISH com Cot1-DNA isoladas tanto de

Ameiva ameiva quanto de Cnemidophorus sp.1 evidenciou que estas sequências estão

localizadas principalmente nas regiões heterocromáticas centroméricas e teloméricas

dos cromossomos de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e

Tupinambis teguixin. Em Cnemidophorus sp.1 a sonda de Cot1-DNA isolada de Ameiva

ameiva apresentou múltiplas marcações intersticiais nos cromossomos, enquanto que o

mapeamento do Cot1-DNA isolado da própria espécie marcou regiões centroméricas de

alguns cromossomos, ressaltando a composição centromérica diferencial nesta espécie.

A clonagem e o sequenciamento do Cot1-DNA evidenciou que diferentes

microssatélites, transposons, retrotransposons e algumas famílias gênicas também

compõe a fração de DNA moderada e altamente repetitiva nas espécies de teídeos.

Assim, os resultados obtidos neste estudo demonstraram que diversas classes de DNAs

repetitivos fazem parte do genoma das espécies analisadas, estando estes intercalados e

alocados na heterocromatina, especialmente em regiões centroméricas e teloméricas,

x

indicando que estes desempenham papel importante na organização funcional e

estrutural.

xi

Abstract

Macroteiids Neotropical lizards Teiidae family. Classical cytogenetic approaches in this

group revealed karyotype variation with diploid numbers ranging 34-52 chromosomes,

as well as differences in the distribution patterns of heterochromatin and composition

thereof. However, the physical chromosomal mapping of repetitive DNA and

comparative analysis of these elements is incipient fundamental to the understanding of

the dynamics, organization and carioevolution this group of lizards. In that sense, this

study mapped different classes of sequences of repetitive DNA, such as 5S rDNA,

telomeric sequences, genes of tropomyosin 1 and retrotransposons Rex 1 and SINE and

repetitive fraction Cot1-DNA in chromosomes of five species of Ameiva ameiva,

Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps and Tupinambis

teguixin. The mapping of repetitive sequences revealed a distinct pattern in

Cnemidophorus sp.1, while the remaining species showed all sequences associated with

each other in the heterochromatic region. The chromosomal physical mapping of

tropomyosin 1 gene was first performed in lizards and revealed that in addition to being

functional, has a structural function similar to the other mapped repetitive elements

(rDNA 5S, telomeric sequences, retrotransposons Rex 1 and SINE) being located

preferably in the centromeric regions of chromosomes and terminals. The FISH Cot1-

DNA isolated from both Ameiva ameiva much Cnemidophorus sp.1 showed that these

sequences are mainly located in the regions heterochromatic centromeric and telomeric

chromosome of Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps and

Tupinambis teguixin. In Cnemidophorus sp.1 the Cot1-DNA probe isolated from

Ameiva ameiva had multiple interstitial markings on chromosomes, while the mapping

Cot1-DNA isolated from the species itself marked centromeric regions of some

chromosomes, highlighting the centromeric differential composition in this species. The

cloning and sequencing oh the repetitive fraction showed that different microsatellites,

transposons, retrotransposons and some gene families also make up the fraction of

moderately and highly repetitive DNA in the species teídeos. The results of this study

demonstrated that different classes of repetitive DNA are part of the genome of Ameiva

ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps and

Tupinambis teguixin, being interspersed heterochromatin and differences in the

composition of this repetitive fraction between teideos are evident. These sequences

xii

plays an important role in the functional and structural organization of the centromere

and telomere these species.

xiii

Sumário

1 Introdução .................................................................................................................... 20

1.1 Considerações sobre os teídeos ................................................................................ 20

1.2 Citogenética de teídeos ............................................................................................. 22

1.3 DNAs repetitivos ...................................................................................................... 24

3 Objetivos ...................................................................................................................... 28

3.1 Geral ......................................................................................................................... 28

3.2 Específicos ................................................................................................................ 28

4 Material e Métodos ...................................................................................................... 29

4.1 Material ..................................................................................................................... 29

4.2 Métodos .................................................................................................................... 31

4.2.1 Indução de mitoses ................................................................................................ 31

4.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos a partir de colchicina in vitro (Ford e

Hamerton, 1956) ............................................................................................................. 31

4.2.3 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C) ........................................... 32

4.2.4 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) ..................................... 32

4.2.5 Extração de DNA................................................................................................... 33

4.2.6 Isolamento de sequências repetitivas através da técnica de Cot- DNA (DNA

enriquecido com sequências alta e moderadamente repetitivas) .................................... 34

4.2.7 Isolamento de sequências repetitivas via PCR (Polymerase Chain Reaction) e

marcação da sonda por nick translation ......................................................................... 34

4.2.8 Marcação das sondas ............................................................................................. 36

4.2.9 Hibridização in situ por fluorescência – FISH ...................................................... 36

4.2.10 Análise cariotípica ............................................................................................... 38

4.2.11 Clonagem ............................................................................................................. 38

4.2.12 Sequenciamento dos fragmentos de DNA repetitivo .......................................... 39

4.2.13 Análise das Sequências ........................................................................................ 39

5. Resultados e discussão ............................................................................................... 41

5.1 Artigo 1 - Análises citogenéticas de cinco espécies de lagartos amazônicos das

subfamílias Teiinae e Tupinambinae e revisão da diversidade cariotípica a família

Teiidae. ........................................................................................................................... 42

5.1.2 Introdução .............................................................................................................. 44

5.1.3 Material e Métodos ................................................................................................ 45

xiv

5.1.4 Resultados .............................................................................................................. 48

5.1.5 Discussão ............................................................................................................... 50

5.2 Artigo 2 - DNAs repetitivos na organizacao do genoma de especies de lagartos

amazonicos da família Teiidae ....................................................................................... 66

5.2.2 Introdução .............................................................................................................. 68

5.2.3 Material e Métodos ................................................................................................ 70

5.2.4 Resultados .............................................................................................................. 73

5.2.5 Discussão ............................................................................................................... 94

5.3 Artigo 3 – Composição diferencial de DNAs repetitivos na região centromérica em

espécies de lagartos amazônicos..................................................................................... 99

5.3.2 Introdução ............................................................................................................ 101

5.3.3 Material e Métodos .............................................................................................. 102

5.3.4 Resultados ............................................................................................................ 105

5.3.5 Discussão ............................................................................................................. 111

6 Conclusão .................................................................................................................. 122

7 Referências Bibliográficas ......................................................................................... 123

xv

Lista de figuras

Introdução

Figura 1. Filogenia entre os gêneros das subfamílias Tupinambini (a, b, c) e Teiinae (d,

e, f). (a) Hipótese de Vanzolini e Valencia, 1965; Gorman, 1970; (b, e) Hipótese de

Presch, 1974; (c, f) Hipótese de Teixeira, 2003; (d) Hipótese de Gorman, 1970.

Figura 2. Mapa mostrado a área geográfica, onde os pontos amarelos representam os

locais de coleta.

Capítulo 1

Figura 1. Cariótipos de espécies pertencentes subfamília Teiinae: (a), (e), (i) e (m)

Coloração convencional; (b), (f), (j) e (n) Regiões de heterocromatina evidenciada pela

técnica de banda C; (c), (g), (k) e (o) em destaque o par nucleolar impregnado com

AgNO3; (d), (h), (l) e (p) em destaque o par portador do sítio de DNAr 18S (vermelho)

e cromossomos contracorados com DAPI. Barra de escala representam 10 µm.

Figura 2. Cariótipos de Tupinambis teguixin: (a) Coloração convencional; (b) Regiões

de heterocromatina evidenciada pela técnica de banda C; (c) em destaque o par

nucleolar impregnado com AgNO3; (d) em destaque o par portador do sítio de DNAr

18S (vermelho) e cromossomos contracorados com DAPI. m=Macrocromossomo,

mi=microcromossomo. Barra de escala representa 10 µm.

Capítulo 2

Figura 1. Cariótipos evidenciando o DNAr 5S (sítios vermelhos) das espécies

pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c)

Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae: (e)

Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série

gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.

Barra de escala representam 10 µm.

Figura 2. Cariótipos evidenciando as sequências teloméricas (sítios vermelhos) das

espécies pertencentes a subfamília Teiinae: (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus

sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d) Kentropyx pelviceps e da subfamília Tupinambinae:

(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contra corados com DAPI. a=série

xvi



Figura 3. Cariótipos evidenciando o gene da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) das



(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados com DAPI. a=série



Figura 4. Cariótipos evidenciando o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos) das






Figura 5. Cariótipos evidenciando o retroelemento SINE (sítios vermelhos) das espécies






Figura 6. Double fiber-FISH em fibras cromatínicas estendidas de Kentropyx calcarata

utilizando sondas de DNAr 5s (sítios verdes), sequências teloméricas (sítios verdes),

genes da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) e o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos).

(a) DNAr 5s (b) genes da tropomiosina 1 (c) DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 (d)

DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 + DAPI (e) sequência telomérica (f) Rex 1 (g)

sequência telomérica + Rex 1 (h) sequência telomérica + Rex 1 + DAPI. O mesmo

padrão foi observado para as demais espécies analisadas no presente estudo. Barra de

escala representam 10 µm.

Capítulo 3

xvii

Figura 1. FISH com a sonda homóloga de Cot1-DNA de Ameiva ameiva (a), e de

Cnemidophorus sp.1 (b). Os cromossomos foram contracorados com DAPI. Barra de

escala: 10 µm.

Figura 2. Cariótipos com a sonda de Cot1-DNA5 de Ameiva ameiva hibridizada

(vermelho). (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d)

Kentropyx pelviceps e (e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados

com DAPI. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo,

mi=microcromossomo. Barra de escalas: 10 µm.

Figura 3. Idiograma de Ameiva ameiva. Em preto, heterocromatina; em verde claro,

genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências

teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em

verde escuro, Cot1-DNA da própria espécie. a=série gradual de cromossomos

acrocêntricos.

Figura 4. Idiograma de Cnemidophorus sp.1. Em preto, heterocromatina; em verde

claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em amarelo, sequências


verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva.

Figura 5. Idiograma de Kentropyx calcarata. Em preto, heterocromatina; em verde



verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva. a=série gradual de cromossomos

acrocêntricos.

Figura 6. Idiograma de Kentropyx pelviceps. Em preto, heterocromatina; em verde



xviii

verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva. a=série gradual de cromossomos

acrocêntricos.

Figura 7. Idiograma de Tupinambis teguixin. Em preto, heterocromatina; em verde



verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva. m=Macrocromossomo,

mi=microcromossomo.

xix

Lista de tabelas

Capítulo 1

Tabela 1. Espécies das subfamílias Teinae e Tupinambinae: Local de coleta, número e

sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes) são listados. AM: Amazonas.

Tabela 2. Compilação da literatura dos dados citogenéticos básicos para a família

Teiidae. Na tabela apresenta o número diploide (2n), fórmula cariotípica (FC), número

fundamental (NF). Três descrições de formulas cariotípicas: (a) número de

cromossomos de dois braços, número de cromossomos de braço único e número de

microcromossomos; (b) série gradual de cromossomos do tipo acrocêntricos; (c)

cromossomos macrocromossomos (M) e microcromossomos (mi). Para dados não

indicados nas publicações foi utilizada a simbologia “--”.

Tabela 3. Dados citogenéticos de bandamentos diferenciais compilados da literatura

para a família Teiidae. Na tabela apresenta o local da coleta, regoes organizadoras de

nucléolos (RONs), heterocromatina constitutiva (HC), hibridização in situ fluorescente

(FISH). Localidade: Amazonas (AM), Bahia (BA), Estados Unidos (USA), Espírito

Santo (ES), Goiás (GO), Mato Grosso (MT), Minas Gerais (MG), Pará (PA), Rio de

Janeiro (RJ), Rio Grande do Sul (RS), Rondônia (RO), São Paulo (SP), Sergipe (SE),

Tocantins (TO). Para dados não indicados nas publicações foi utilizada a simbologia “--

”.

Capítulo 3

Tabela 1. Espécies das subfamílias Teinae e Tupinambinae: Local de coleta, número e

sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes) são listados. AM: Amazonas.

Tabela 2. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Ameiva ameiva e

similaridade das sequências conhecidas em banco de dados públicos.

Tabela 3. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Cnemidophorus sp.1

e similaridade das sequências conhecidas em banco de dados públicos.

20

1 Introdução

1.1 Considerações sobre os teídeos

A biodiversidade é a medida da diversidade de organismos numa região,

incluindo a variação genética, a unidade taxonômica, o endemismo e os complexos

ecológicos nos quais inclui a diversidade dentro de espécies, entre espécies e em nível

de ecossistemas (Ricklefs, 2003). Baseado neste contexto, estima-se que existem

atualmente 15 milhões de espécies no mundo e 1,8 milhões destas seriam encontradas

no Brasil, país considerado o principal dentre os portadores de megadiversidade (Aguiar

et al., 2004; Lewinsohn e Prado, 2005). Destas espécies brasileiras, 760 espécies, mais

48 subespécies, totalizando 808 táxons, pertencentes às ordens Crocodylia (6 espécies),

Testudines (36 espécies) e Squamata (72 espécies de anfisbênias, 386 espécies + 40

subespecies de serpentes e 260 espécies + 8 subespecies de lagartos) (SBH, 2014),

destacando-se que 281 espécies deste último grupo são encontrados na Amazônia

brasileira e, destes, 85 são espécies de lagartos alocados nas famílias Anguidae,

Gekkonidae, Gymnophthalmidae, Iguanidae, Scincidae e Teiidae (Ávila - Pires, 1995;

Ávila - Pires et al., 2007).

A família Teiidae pertence à infraordem Scincomorpha e são conhecidos

popularmente como macroteídeos devido à contraposição ao seu grupo irmão, a família

Gymnophthalmidae, conhecidos como microteídeos. Teiidae compreende 151 espécies

válidas restritas ao Novo Mundo, ocorrendo desde o nordeste dos Estados Unidos até a

Argentina, as quais estão distribuídas em três subfamílias: Teiinae composto pelos

gêneros Ameiva, Ameivula, Aurivela, Aspidoscelis, Contomastix, Cnemidophorus,

Dicrodon, Holcosus, Kentropyx, Medopheos e Teius; Tupinambinae composto pelos

gêneros Crocodilurus, Dracaena, Salvator e Tupinambis; e Callopistinae composto pelo

gênero Callopistes (Harvey et al., 2012). Os gêneros Aspidoscelis, Ameiva, Holcosus,

Kentropyx e Cnemidophorus apresentam um complexo de espécies e são considerados

os mais diversos dentre os teídeos. Aspidoscelis é composto por cinco grupos: grupo

cozumela, deppei, sexlineatus, tigris e tesselatus; Ameiva é composto por cinco grupos:

ameiva, bifrontata, dorsalis, erythrocephala e incertae; Holcosus é composto por três

grupos: grupo orcesi, septemlineatus e undulatus; Kentropyx é composto por 3 grupos:

grupo calcarata, striata e paulensis; Cnemidophorus possui quatro grupos: grupo

lemniscatus, nigricolor, murinus e vanzoi (Harvey et al., 2012). Na Amazônia são

21

encontradas 13 espécies de lagartos distribuídas nos gêneros Ameiva, Cnemidophorus,

Crocodilurus, Dracaena, Kentropyx e Tupinambis (Ávila - Pires et al., 2007).

As espécies de Teiidae morfologicamente apresentam corpo relativamente

esquios, com caudas longas em formato de chicote, a cabeça terminando em focinhos

estreitos. A língua é bífida e são lagartos de grande porte, alguns atingindo mais de um

metro de comprimento (Vitt et al., 2008). A maioria das espécies são forrageadoras

ativas, heliotérmicas mantendo a temperatura corpórea relativamente alta durante o

período de atividade e estão presentes em uma variedade de ambientes, incluindo semi-

arborícolas, semi-aquáticas e terrestres (Silva e Araújo, 2008). A reprodução é sempre

ovípara e as ninhadas podem ser grandes, frequentemente proporcionais ao tamanho das

fêmeas (Silva e Araújo, 2008). Várias espécies são partenogenéticas, como algumas do

gênero Aspidoscelis (Lowe e Wright, 1966; Wright, 1967; Fritts, 1969; Neaves, 1969;

Lowe et al., 1970; Mckimey et al., 1973; Scudday, 1973; Maringuez-Moran et al.,

2000), Cnemidophorus (Peccinini, 1971; Cole e Dessauer, 1993; Rocha et al., 1997) e

Kentropyx (Cole et al., 1995).

A determinação do sexo em lagartos pode ter influência ambiental ou ser

genotípica (Deeming et al., 1988; Crews, 2003; Janzen e Phillips, 2006; Gamble, 2010).

A determinação genotípica está relacionada a fatores genéticos durante a fertilização

dos ovócitos, com a presença de genes específicos envolvidos na determinação sexual

(Kasahara et al., 1996; Janzen e Phillips, 2006). Já a determinação ambiental ocorre em

principalmente em função de diferentes temperaturas de incubação de ovos, que

influenciam a diferenciação gonadal, sendo observado em algumas espécies da família

Anguidae e Gekkonidae (Wagner, 1980; Langerwerf, 1984; Tokunaga, 1985). Com

relação à teídeos, não há estudos sobre a influência da temperatura na determinação

sexual, porém nas espécies Aspidocelis tigres tigres e Ameivula littoralis foi observado

um sistema cromossômico sexual do tipo XX:XY, sendo o macho heterogamético (Bull,

1978; Peccinini-Seale et al., 2004).

Com relação à importância ecológica dos teídeos, estes constituem elementos

essenciais para a dinâmica ecológica dos sistemas naturais, uma vez que ocupam

posições específicas dentro da organização trófica dos ecossistemas, sejam eles como

predadores ou presas, o que pode influenciar outras populações de seres vivos. Ainda,

os lagartos têm sido amplamente utilizados como organismos modelo de estudos

ecológicos, morfológicos, sistemáticos, genéticos e citogenéticos visando conhecer os

22

padrões de distribuição das espécies, as relações entre a variabilidade ambiental,

identificação taxonômica, conhecimento da filogenia e da diversidade genética e

composição cariotípica, fornecendo informações relevantes sobre a biologia destas

espécies (Pinka e Vitt, 2003; Camargo et al., 2010).

1.2 Citogenética de teídeos

Dentre os teídeos, cerca de 70% das espécies já possuem seu cariótipo descrito,

revelando uma alta taxa de evolução cromossômica e genomas maiores devido ao

acúmulo de sequências repetitivas de DNA, sendo que a maioria das espécies apresenta

ausência de cromossomos sexuais diferenciados, onde machos e fêmeas possuem

constituição cromossômica idêntica (Kasahara et al., 1996, Reeder et al., 2002; Olmo et

al., 2005). Ainda, análises cromossômicas permitiram o reconhecimento de dois grupos

citogenéticos na família Teiidae: a) grupo Dracaena (atual subfamília Tupinambinae),

composto por cariótipo apresentando de 34 a 38 cromossomos e clara distinção entre

macrocromossomos e microcromossomos; b) grupo Ameiva (atual subfamília Teiinae)

com o número diploide de 46 a 56 cromossomos e sem uma clara distinção entre os

macros e microcromossomos (Gorman, 1970). Caracteres osteológicos corroboraram os

dados cromossômicos e foi proposta a existência de duas tribos para os teídeos: Teiini

(grupo Dracaena) e Tupinambini (grupo Ameiva) (Presch, 1974; 1983). Mais tarde, ao

serem analisados numerosos caracteres osteológicos e de tecidos moles estas tribos

foram elevadas a categoria de subfamília: Teiinae e Tupinambinae. Ainda, análises com

caracteres morfológicos na família Teiidae propuseram a presença de três subfamílias:

Teiinae, Tupinambinae e Callopistinae (Harvey et al., 2012). Recentemente, analises

baseadas em caracteres moleculares indicaram que Teiidae é composto por duas

subfamílias, Teiinae e Tupinanambinae (Pyron et al., 2013). Estas duas subfamílias

formam o grupo monofilético Teiioidea, restrito ao Novo Mundo, e grupo-irmão dos

Lacertidae do Velho Mundo (Estes et al., 1988). Apesar do monofiletismo das

subfamílias Teiinae e Tupinambinae, as relações filogenéticas entre os gêneros de

teídeos são controversas, não havendo consenso entre as árvores filogenéticas propostas

(Gorman, 1970; Vanzolini e Valencia, 1965; Presch, 1974; Teixeira, 2003; Giugliano et

al. 2007). Na subfamília Tupinambinae, dados cromossômicos (Gorman, 1970) e

morfológicos (Vanzolini e Valencia, 1965) indicam que Tupinambis e Dracaena são

23

grupos-irmãos (Figura 1a), enquanto que dados osteológicos suportam Tupinambis e

Crocodilurus como gêneros irmãos (Figura 1b- Presch, 1974). Porém, a combinação de

análises morfológicas com a ultra-estrutura de espermatozóide favoreceu o agrupamento

irmão de Crocodilurus e Dracaena (Figura 1c - Teixeira, 2003). Na subfamília Teiinae,

análises filogenéticas indica um grupo monofilético englobando Ameiva, Kentropyx,

Aspidoscelis e Cnemidophorus e a posição dos gêneros Dicrodon e Teius é incerta na

árvore filogenética (Gorman, 1970; Presch, 1974; Teixeira, 2003- Figura 1d, e, f).

Figura 1. Filogenia entre os gêneros das subfamílias Tupinambini (a, b, c) e Teiinae (d,

e, f). (a) Hipótese de Vanzolini e Valencia, 1965; Gorman, 1970; (b, e) Hipótese de

Presch, 1974; (c, f) Hipótese de Teixeira, 2003; (d) Hipótese de Gorman, 1970.

Número diploide igual a 36 cromossomos, composto por 12 macrocromossomos

(M) e 24 microcromossomos (m) é considerado o cariótipo ancestral para a subfamília

Tupinambinae (Gorman, 1973) e também para a ordem Squamata (Gorman e Atkins,

1967; Paull et al., 1976; Bickham, 1984). Para a subfamília Teiinae, o cariótipo com 50

cromossomos seria o ancestral e teria se originado por rearranjos cromossômicos do

tipo fissão envolvendo os macrocromossomos de um cariótipo ancestral da subfamília

Tupinambinae (Gorman, 1973). Porém, estas proposições estão baseadas em

informações citogenéticas referentes à coloração convencional, com a determinação do

24

número diploide e número fundamental de braços, que são as mais abundantes para os

teideos. Ainda, poliploidia foi observada em algumas espécies de teídeos, onde ocorre

sempre em forma triploide (Lowe e Wright, 1966; Wright, 1967; Fritts, 1969; Neaves,

1969; Lowe et al., 1970; Mckimey et al., 1973; Scudday, 1973; Maringuez-Moran et

al., 2000).

Algumas espécies da família Teiidae possuem análises pormenorizadas da

estrutura e organização dos cromossomos revelada através de técnicas de coloração

diferencial, como a detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) por

impregnação de nitrato de prata e a caracterização dos padrões de heterocromatina

constitutiva pela banda C. Estas técnicas diferenciais têm se revelado um caráter útil e

informativo para a taxonomia e a sistemática, muitas vezes apresentando padrões

espécie-específicos (Porter et al., 1991; Rocha et al., 1997; Peccinini-Seale et al., 2004;

Santos et al., 2007; 2008). Com relação às regiões organizadoras de nucléolos foi

evidenciado RON simples com uma variação na localização das RONs em algumas

espécies dos gêneros Ameiva, Ameivula, Cnemidophorus, Crocodilurus, Kentropryx,

Salvator e Tupinambis. Enquanto que Ameivula nativo e Teius oculatus apresentam

RONs múltiplas (Rocha et al., 1997; Veronese et al., 2003).

Grande quantidade de heterocromatina, localizadas nas regiões centromérica,

pericentromérica e telomérica da maioria dos cromossomos foram observadas em

algumas espécies dos gêneros Ameiva, Ameivula, Aspidoscelis, Cnemidophorus,

Crocodilurus, Kentropryx e Tupinambis. Estes blocos de heterocromatina constitutiva

podem abrigar sequências repetitivas de DNA, que compreendem uma grande parte do

genoma dos eucariotos.

1.3 DNAs repetitivos

Os DNAs repetitivos fazem parte do genoma dos eucariotos e podem estar

organizados in tandem ou podem ser encontrados dispersos no genoma (Charlesworth et

al., 1994). As sequências repetitivas in tandem como as sequências satélites,

minissatélites, microssatélites e famílias multigênicas, enquanto que as sequências

repetitivas dispersas englobam os elementos transponíveis (Nei e Rooney, 2005).

Os elementos transponíveis são encontrados geralmente dispersos no genoma e

podem ser de dois tipos: retrotransposons e os transposons, que são classificados de

acordo com sua organização estrutural e mecanismo de transposição destas sequências

25

(Charlesworth et al., 1994; Kidwell, 2002; Martins, 2007; Böhne et al., 2008). Os que

são do primeiro tipo também são chamados de elementos de classe I e transpõem via

transcrição reversa do seu RNA, sendo três tipos: elementos longos intercalados (long

interspersed elements-LINEs), elementos curtos intercalados (short intersperser

elements-SINEs) e os que possuem longas repetições terminais (long terminal repeats-

LTRs). O segundo tipo são os transposons ou elementos de classe II que se

movimentam-se pelo genoma através de cópias de DNA (Kidwell, 2002; Martins,

2007). Diversas famílias de elementos transponíveis estão presentes no genoma de

lagartos, como LINE (L1, RTE, jockey e R2), LTR retrotransposons (Metaviridae,

Pseudoviridae, Retroviridae - class I e BEL retroelements) e transposons (cut and paste,

hAT, PIF/Harbinger, Tc1/mariner, rolling circle - Helitrons e self-syntheizing -

Polintons/Mavericks) (Kordis, 2009). Porém, a organização genômica destes elementos

transponíveis nos cromossomos ainda não está elucidada.

Os genes da tropomiosina constituem uma família gênica, altamente conservadas

no genoma, que codificam quatro genes distintos, sendo eles TPM 1 (TPMα), TPM 2

(TPMβ), TPM 3 (TPMγ) e TPM 4 (TPMδ) e essas apresentam várias isoformas que são

produzidas através do processo de splicing alternativo ou promotores alternativos

(Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013; Janco et al., 2013). Esta família gênica parece

exercer diversas funções celulares, tais como a migração celular, citocinese, transporte

intracelular e contração muscular (Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013). Contudo, até o

momento não é conhecido o padrão de distribuição destas sequências em cromossomos

de lagartos e este marcador é interessante para estudos evolutivos. Para este grupo, as

informações relativas à organização do genoma restrigem-se a mapeamento físico

cromossômicos de genes ribossomais, DNA telomérico e DNA satélite.

Os DNAs ribossomais estão organizados em duas famílias multigênicas

distintas, o DNAr 45S e DNAr 5S, composta por um número variável de repetições em

diferentes genomas. O DNA ribossomal 45S consiste de uma unidade transcricional que

codifica os RNAs ribossomais 28S, 18S e 5,8S e um espaçador intergênico não

transcrito (IGS) (Martins, 2007). Estas sequências correspondem às regiões

organizadoras de nucléolo, que podem ser detectadas indiretamente pela impregnação

de proteínas ribossomais com nitrato de prata quanto diretamente por hibridização in

situ fluorescente (FISH) utilizando sondas de genes da família RNAr 45S (Martins et

al., 2011). Já o DNAr 5S consiste em sequências codificantes de 120 pb que são

26

separadas uma das outras por um DNA espaçador não transcrito (NTS) de tamanho

variável, cuja variação relaciona-se com a ocorrência de deleções ou inserções, presença

de pseudogenes ou pequenas repetições (Martins et al., 2000; 2002; Wasko et al., 2001;

Galetti Jr e Martins, 2004; Martins, 2007). Os sítios de DNAr 5S apresentam uma só

sequência repetida in tanden, geralmente em um único par cromossômico, mas podem

ocorrer em dois ou mais pares e só podem ser observados com a FISH (Guerra, 2004).

Para espécies da família Teiidae, a localização física cromossômica com sonda

de DNAr 28S evidenciou marcação em um par de microcromossomos em Ameiva

auberi, enquanto que Aspidoscelis marmorata foi localizado em um par de

macrocromossomos (Porter et al., 1991). Para outra família de lagartos (Agamidae)

sondas de DNAr 45S (18 e 28S) estavam localizadas no primeiro par cromossômico

para Leiolepis belliana belliana (2n=36), Leiolepis reevesii rubritaeniata (2n=36) e

Leiolepis boehmei (2n=34). Com relação ao sítio de DNAr 5S este foi mapeado no sexto

par nas três espécies de Leiolepis, sugerindo uma conservação na localização física

cromossômica deste gene. Contudo, autores que sugerem fusões reposionando o DNAr

45 provavelmente ocorreram em algumas espécies de Leiolepinae (Srikulnath et al.,

2009a, b; 2011).

Rearranjos cromossômicos têm sido evidenciados, na maioria das vezes, com a

localização física cromossômica de sequências teloméricas, que consistem de repetições

curtas ricas em guanina (TTAGGG)n, normalmente presentes nos extremidades dos

cromossomos. Estas sequências são amplamente conservadas nos genomas de

vertebrados, sendo regiões de extrema importância na estabilidade aos cromossomos,

uma vez que estão associadas à multiproteínas que formam o complexo Shelterin,

protegendo-os da degradação, além de permitirem a replicação completa do DNA e

integridade dos cromossomos (Nanda et al., 2002; Guerra, 2004; Multani et al., 2006;

Monagham, 2010). Assim, o aparecimento de sítios teloméricos intersticiais tem sido

relacionado com o processo evolutivo envolvendo telômeros, tais como fusões,

inversões e translocações a partir de uma condição ancestral, durante a evolução

cariotípica em várias espécies. Para espécies de teídeos do gênero Aspidoscelis, a

hibridização com sondas teloméricas evidenciou ITSs em seus cromossomos, indicando

ter surgido a partir de eventos de amplificações dos ITS por meio dos DNAs satélites

(Meyne et al., 1990; Rovatsos et al., 2015). Já em espécies de outras famílias, gêneros

Lepossoma e Polychrus, a hibridização com sondas teloméricas evidenciou sítios

27

teloméricos intersticiais, o que sugere resquícios de eventos de fusão/fissão ocorridos

durante a evolução cariotípica (Pellegrino et al., 1999; Bertolotto et al., 2001). No

entanto, muitos cromossomos rearranjados podem não mostrar estes sítios teloméricos

insterticiais devido à processos moleculares de erosão de sequências de DNA repetitivos

e a proteção desses ITS (sequências similares àquelas presentes nos telômeros) pelo

complexo Shelterin durante o reparo do DNA (Mandrioli et al., 1999; Wood et al.,

2015). Estudos recentes têm mostrado que sítios teloméricos intersticiais (ITSs) são

bastante comuns em espécies de Squamata (anfisbênias, serpentes e lagartos), onde

estão localizados em regiões pericentroméricas, regiões centroméricas e/ou intersticial

(Rovatsos et al., 2015).

Tanto os elementos transponíveis como os DNAs satélites/microssatélites podem

estar relacionadas com o surgimento de cromossomos sexuais heteromórficos

(Giovannotti et al., 2009; Martins et al., 2011). Por exemplo, em Eremias velox

(Lacertidae) certas sequências de microssatélites foram extensivamente acumuladas no

genoma e encontram-se alocadas em parte do cromossomo W, favorecendo a

heterocromatinização ou adição de heterocromatina promovendo um heteromorfismo

dos cromossomos sexuais (Porkoná et al., 2011).

Assim, o mapeamento físico cromossômico de diferentes classes de DNAs

repetitivos nas espécies de teídeos amazônicas Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1,

Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin são imprescindíveis

para a compreensão da organização do genoma deste grupo de lagartos. A comparação

da localização física cromossômica destas sequências de DNA entre as diferentes

espécies pode proporcionar melhor visão do genoma das espécies e de como ocorreu à

evolução deste grupo. Ainda, a análise cariotípica de indivíduos provenientes de regiões

de possível endemismo e que até o momento foram pouco amostradas pode favorecer a

elucidação da diversidade oculta, permitindo o reconhecimento citogenético dos táxons.

28

2 Objetivos

2.1 Geral

Caracterizar citogenomicamente as espécies de teídeos Ameiva ameiva,

Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin

provenientes da Amazônia, visando contribuir na diferenciação dos táxons, melhor

entendimento da organização genômica e sua carioevolução dos mesmos.

2.2 Específicos

Comparar o cariótipo das espécies de teídeos coletados em diferentes localidades

da Amazônia com os descritos na literatura para cada táxon.

Estabelecer os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva (Banda

C) e da região organizadora de nucléolo (RONs) em cromossomos mitóticos.

Mapear sequências de DNA repetitivo, visando compreender como estes

elementos se comportam entre as espécies de teídeos.

Comparar a organização do genoma destas espécies, utilizando as sequências de

DNA repetitivas isoladas para o mapeamento cromossômico.

29

3 Material e Métodos

3.1 Material

Foram analisadas citogenomicamente as espécies de lagartos Ameiva ameiva,

Cnemidophorus sp.1 (em processo de descrição pelo Dr Federico Arias – Universidade

de São Paulo), Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin

coletadas no estado do Amazonas, Brasil, nas seguintes localidades:

1) Florestas nas margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã.

2) Florestas nas margens dos Rios Darahá e Ayuanã, ambos no município de

Santa Isabel do Rio Negro.

3) Floresta na margem do Rio Purus, município de Tapauá.

4) Floresta na margem do rio Cuieiras, no município de Manaus.

5) Floresta da Reserva Florestal Adolpho Ducke, no município de Manaus.

6) Área urbana do município Manaus – Bairro Parque 10 de Novembro.

Figura 2. Mapa mostrado a área geográfica, onde os pontos amarelos representam os

locais de coleta.

30

Excetuando os pontos de coleta 5 e 6, em todas as áreas foram estabelecidas

grades de amostragem padronizadas. Para cada ponto de amostragem foi formado por

um conjunto de seis trilhas de 2 km cada, sendo três de cada margem do rio. Cada trilha

foi distanciada 1 km uma da outra. Em cada trilha foram abertas 6 picadas em curva de

nível, distribuídas nas seguintes posições: ponto zero (início da trilha), 500 m, 1000 m,

2000 m. As trilhas partiram da margem do rio de referência para o interior da floresta.

Para a amostragem das espécies de lagartos foram utilizados três métodos mais

eficientes para inventários de herpetofauna em floresta de terra firme na Amazônia

(Pinto, 2006; Moraes, 2008).

No primeiro método foi efetuado o transecto de amostragem visual, que é uma

combinação do método de levantamento por encontros visuais (visual encounter

surveys, Crump e Scott, 1994) e do método de contagem pontual (usado principalmente

por ornitólogos). Três pessoas percorreram a linha central da parcela (250 m),

registrando todos os indivíduos avistados durante o percurso, que deve durar, no

mínimo, 1 hora. A cada 25 ou 50 m ocorre uma parada de 5 minutos, durante os quais

serão registrados todos os animais avistados.

No segundo método foi efetuada busca ativa, onde os animais foram amostrados

por busca ativa visual, a qualquer hora do dia, sem limitação de tempo para a atividade

(este foi o único método utilizado para os pontos de coleta 5 e 6).

E no último método foi utilizado armadilhas do tipo pitfall que consistiram em

uma série de baldes de 62L enterrados no solo ao nível do chão e com 8 m equidistantes

entre si. Os baldes foram ligados por uma cerca-guia com aproximadamente 1 m de

altura, de forma que o animal seja guiado para cair no balde. Cada unidade amostral de

pitfalls consistiu em uma linha de 11 baldes enterrados no chão e conectados pela cerca-

guia. Essa disposição resulta em uma amostragem de um trecho de 80 m na floresta. Em

cada expedição, foram instaladas um total de 18 unidades amostrais, três em cada trilha

de 2 km, e os baldes serão vistoriados uma vez ao dia.

Ressalta-se que estes três métodos de amostragem foram utilizados em função do

desenho amostral adotado no projeto Sistema Nacional de Pesquisa em Biodiversidade-

Diversidade filogenética da Amazônia (SISBIOTA-BioPham/CNPq-FAPEAM). Os

animais foram levados vivos para o laboratório, de campo ou laboratório de

Citogenômica Animal da UFAM, onde foram eutanaziados com dose letal de anestésico

para a retirada da medula óssea para a preparação das suspensões celulares e amostras

31

de tecido muscular ou cauda foram armazenadas em tubo de eppendorf com álcool

absoluto para análise molecular. Os exemplares testemunhos foram fixados em

formaldeído 10% (injetados na cavidade celomática e trato digestório), armazenados em

álcool 70%. Os espécimes testemunhos foram depositados na Coleção Herpetológica do

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Lotes: INPA H31712, 33213, 34791,

34841, 35018). A identificação das espécies foi efetuada pelo pesquisar Federico Arias,

da Universidade de São Paulo.

3.2 Métodos

3.2.1 Indução de mitoses

Para estimular a divisão celular e a resposta imunológica, foi utilizada a técnica

descrita por Oliveira et al. (1988), que consistiu em preparar uma solução de fermento

biológico na seguinte proporção: 0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 20 mL de água

destilada. Esta solução foi incubada em estufa a 37°C por cerca de 20 minutos, e

posteriormente foi injetada no animal intraperitonealmente na proporção de 1 mL para

cada 100 g do peso do animal vivo. Os lagartos foram mantidos à temperatura

aproximada a 30 °C por um período de 24 a 48 horas antes da coleta das amostras para

análise citogenética.

3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos a partir de colchicina in vitro (Ford e

Hamerton, 1956)

Após o tempo da aplicação da solução de fermento biológico, o animal foi

eutanaziado com dose letal de anestésico Tiopental sódico. Em seguida foram retirados

os fêmures e cortada as epífises. O canal ósseo foi lavado sucessivas vezes em solução

hipotônica de KCl a 0,075M e transferido para outro recipiente de vidro contendo cerca

de 10 mL da solução hipotônica de KCl, onde foi dissociado com seringas. Foi

acrescentado 0,5 mL de solução de colchicina 0,025% e a suspensão celular obtida foi

colocada em estufa a 37 °C por 30 minutos. Em seguida o material foi ressuspendido

cuidadosamente com o auxílio de uma seringa desprovida de agulha e transferido para

um tubo de centrífuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. Foram adicionadas 1 mL de

fixador Carnoy 3:1 (metanol: ácido acético), recém preparado e gelado e a amostra foi

centrifugada por 10 minutos a 900 rpm, descartando-se o sobrenadante. Posteriormente,

32

foi adicionado com cuidado 8 mL de fixador Carnoy 3:1, ressuspendendo o material

cuidadosamente com o auxílio de uma pipeta Pasteur e esta lavagem foi repetida por

mais duas vezes. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante foram

adicionados 1,5 mL de fixador e o material foi ressuspendido com cuidado. Esta

suspensão celular foi guardada em tubos eppendorf e mantida em freezer para posterior

utilização.

Para a preparação das lâminas, as mesmas foram colocadas em solução

sulfocrômica por 24 horas. Após este período, foram retiradas, lavadas em água corrente

e destilada e armazenadas em álcool 100%. As lâminas foram imersas em água destilada

a 45 °C, em banho-maria. Após 5 minutos, foram retiradas da água e a suspensão

celular foi gotejada sobre três pontos diferentes da lâmina, que foi seca diretamente ao

ar. Em seguida, as amostras foram coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato

0,06M e pH 6,8, por 10 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar.

3.2.3 Detecção da heterocromatina constitutiva (Banda C)

Para a detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica descrita

por Sumner (1972), com algumas modificações. As lâminas com a suspensão celular

foram tratadas em solução de HCl 0,2N a 45 °C, por 2 minutos, lavadas rapidamente em

água destilada à temperatura ambiente e secas ao ar. Após isso as lâminas foram

incubadas por cerca de 30 segundos em solução de hidróxido de bário a 5%, recém

preparada e filtrada a 42 °C. Posteriormente, a ação do hidróxido de bário foi

interrompida imergindo-se rapidamente a lâmina em solução de HCl 0,2N (temperatura

ambiente), lavada em água destilada e deixada secar ao ar. Após secas, as lâminas foram

incubadas em solução 2xSSC (cloreto de sódio 0,3M e citrato trisódico 0,03M, pH 6,8)

em banho-maria a 60 °C, por 15 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas várias

vezes em água destilada e secas ao ar. As lâminas foram coradas com solução de

Giemsa (diluída a 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8) durante 10 minutos, lavadas

em água destilada e secas.

3.2.4 Detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs)

Para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foi utilizada a

técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Sobre as lâminas com a

suspensão foram adicionadas 2 gotas de uma solução coloidal de gelatina (2 g de

33

gelatina comercial sem sabor, dissolvida em 100 mL de água destilada, acrescida de

1mL de acido fórmico) e, sobre cada gota de gelatina, duas gotas de solução aquosa de

nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, agitando-se levemente a lâmina, que foi coberta com

lamínula. A lâmina foi colocada em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C, durante 3

a 8 minutos. Após esse tempo, quando a lâmina adquiriu uma coloração marrom

dourada, a mesma foi lavada em água destilada, permitindo que a lamínula seja retirada

naturalmente pela própria água e seca ao ar.

3.2.5 Extração de DNA

A extração de DNA foi realizada a partir do tecido muscular da coxa ou cauda,

utilizando o protocolo básico de Sambrook e Russel (2001) com algumas modificações.

Foram macerados aproximadamente 20 mg de tecido muscular e transferidos para um

tubo de volume de 1,5 mL. Em seguida foram adicionados 500 µL de tampão de lise

(Tris-HCl 10 mM em pH 8,0, NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, SDS 1%) conforme Estoup

et al. (1993). Posteriormente foram acrescentados: 15 L de proteinase K (10 mg/mL) e

6 L de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas a 60 ºC por

aproximadamente 2 horas para que o tecido seja totalmente digerido. Foram adicionados

100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de fenol-clorofórmio (1:1) e

agitado por inversão, por alguns minutos. Após isso as amostras foram centrifugadas

por 30 minutos a 14.000 rpm em temperatura ambiente. O sobrenadante foi transferido

para um novo tubo, adicionados 600 µL de clorofórmio e misturado, cuidadosamente,

por alguns minutos, por inversão. Em seguida, a mistura foi centrifugada por 20

minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e foram

acrescentados 100 µL de acetato de amônio 3M, 1 volume (600 µL) de isopropanol

gelado e misturado gentilmente por inversão. O precipitado foi deixado a -20 °C por

cerca de 14 horas. O material foi retirado do freezer e centrifugado por 30 minutos a

14.000 rpm, descartando-se o sobrenadante. O pellet foi lavado com 1 mL de etanol

70% e centrifugado por 20 minutos a 14.000 rpm. Novamente, o sobrenadante foi

descartado, o pellet foi seco em estufa a 55 °C, ressuspendido em 100 μl de TE 0,2X ou

água milli-Q e deixado eluindo por 14 horas. Para possibilitar a análise da quantidade e

integridade do material, o DNA extraído foi quantificado em espectrofotômetro

NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).

34

3.2.6 Isolamento de sequências repetitivas através da técnica de Cot1- DNA (DNA

enriquecido com sequências alta e moderadamente repetitivas)

O isolamento de sequências repetitivas foi baseado na cinética de reassociação

do DNA (Zwick et al., 1997; Ferreira e Martins, 2008). O DNA genômico foi diluído a

100-500 ng/µl em 0,3 M NaCl. Em tubos de 1,5 ml foi colocado 50 µl de amostras de

DNA de Ameiva ameiva e Cnemidophorus sp.1 (50 μl de 100-500 ng/μl de DNA em

0,3 M NaCl) Em seguida, em tubos com os DNAs foram autoclavados por 5 minutos

a 1,4 atm/120 oC. Foi aplicado 3 µl do DNA autoclavado em gel de agarose 1% para

checar o tamanho dos fragmentos obtidos (ideal obter fragmentos entre 100 e 1.000 pb).

Após, o material foi desnaturado 3 alíquotas (tubos 0, 1 e 5) com 50 µl do DNA

autoclavado em banho a 95 oC por 10 minutos. Os tubos foram colocados em gelo por

10 segundos: tratar imediatamente o tubo 0 com enzima S1 nuclease e colocar os tubos

1 e 5 em banho a 65 oC para renaturação. Após 1 minuto, foi retirado o tubo 1 e tratado

com S1 nuclease e após 5 minutos, foi retirado o tubo 5 e tratado com S1 nuclease. Para

o tratamento com S1 nuclease, foi utilizado 1U da enzima para cada 1 µg de DNA (5,5

µl tampão 10× para o volume final de 50 µl). Foi incubado a 37 oC por 8 minutos.

Posteriormente as amostras foram congeladas imediatamente em nitrogênio líquido. Foi

adicionado volume igual de fenol/clorofórmio (1:1) e centrífugado por 5 minutos a

13.000 rpm. Foi transferida para um novo tubo a fase aquosa e foi precipitado o DNA

com 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. O material foi deixado no freezer a 75 oC

negativos por 30 minutos. Após o tempo, foi centrifugado por 15 minutos a 15.000 rpm

a 4 oC e deixado secar. Em seguida, o material foi ressuspendido em 50 µl de água ultra-

pura estéril autoclavada. Posteriormente o tamanho do fragmento foi checado por

comparação com marcador de Low Mass DNA 1 Kb, em eletroforese padrão (com

tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose

0,8%, corado com GelRed Acid Gel Stain (Biotium 1:500). A visualização e análise do

DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual

possui acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260 nM).

3.2.7 Isolamento de sequências repetitivas via PCR (Polymerase Chain Reaction) e

marcação da sonda por nick translation

Sequências repetitivas em tandem já identificadas e caracterizadas como

conservadas em outros vertebrados foram estudadas, tais como DNAr 18S, DNAr 5S,

35

genes da tropomiosina 1 e sequências teloméricas. Para a obtenção das sondas de DNAr

18S, DNAr 5S e genes da tropomiosina 1 foram utilizados o DNA genômico extraído do

músculo ou cauda de um exemplar de teídeos. As sondas foram obtidas por amplificação

por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), conforme Saiki et al. (1988) utilizando os

primers: DNAr 5S F (5’- CGA GGTCGGGCCTGGTTAGTA-3’) e 5S R (5’-

CTTCYGAGATCAGACGAGATC-3’) desenhados a partir de uma sequência consenso

entre diversas classes de vertebrados (mamíferos, reptéis, anfíbios e peixes); DNAr 18S

(IpF 5’CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e IpR 5’CCGAGGACCTCACTAAACCA)

(Gross et al., 2010); Tropomiosina 1 F (5’- GAGTTGGATCGGGCTCAGGAGCG-3’) e

TROP 1 R (5’-CGGTCAGCCTCTTCAGCA ATGTGCTT-3’) (Friesen et al., 1999).

Para sequências teloméricas as amplificações foram feitas sem DNA com os seguintes

primers: (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al., 1991).

Os ciclos de amplificação seguiram as seguintes etapas:

a) 5S: 1 minutos a 94 ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C

(desnaturação), 1 minuto a 59 °C (ligação dos primers), 1 minuto e 30 segundos a 72 °C

(extensão), e 5 minutos a 72 °C (extensão final).

b) 18S: 2 minutos a 94 ºC (desnaturação inicial); 35 ciclos de 1 minuto a 95 ºC

(desnaturação), 1 minuto a 55 ºC (ligação dos primers), 1 minuto e 40 segundos a 72 ºC

(extensão); 7 minutos a 72 ºC (extensão final).

c) TROP 1: 3 minutos a 95 °C (desnaturação inicial); 35 ciclos de 30 segundos a

95 °C, 30 segundos a 58 °C (ligação dos primers), e 1 minuto e 20 segundos a 72 °C

(extensão); de 5 minutos a 72 °C (extensão final).

d) Telomérica: a primeira parte da amplificação é feita em baixa estringência: 4

minutos a 94 °C (desnaturação inicial), 12 ciclos de 1 min at 94 °C (desnaturação), 45

segundos a 52 °C (ligação dos primers) e 1 minutos e 30 segundos a 72 °C (extensão);

seguida por 35 ciclos de alta estringência: 1 minuto a 94 °C (desnaturação), 1 minuto e 30

segundos a 60 °C (ligação dos primers) e 1 minuto e 30 segundos a 72 °C(extensão); 7

minutos a 72 ºC (extensão final).

Elementos transponíveis já identificadas e caracterizadas como conservadas em

outros vertebrados, tais como Rex 1 e SINE também foram testado utilizando os

seguintes primes: a) Rex1 (RTX1-F1 5’TTCTCCAGTGCCTTCAACACC e RTX1-R3

5’TCCCTCAGCAGAAAGAGTCTGCTC) (Volff et al., 1999, 2000, 2001a); b) SINE

36

SAURIA (SQ1F 5’CCCWGCTCCTGCCAACCTAGC e SQ1R 5’TAG

TCATGCTGGCCACATGACC) (Piskurek et al., 2006).

As reações de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf - Mastercycler

Gradient, para volume final de 15 μL (1 μL de DNA genômico (100 ng); 1,5 μL de

Tampão 10X com cloreto de magnésio (1,5 mM); 0,15 μL de Taq DNA polimerase

(5U/µl); 3,0 μL de dNTP (1 mM); 0,6 μL de cada primer (5 mM); água milli-Q para

completar o volume).

3.2.8 Marcação das sondas

As sondas isoladas (Cot1-DNA e PCR) foram marcadas pelo método de nick

translation utilizando biotina 14-dATP (Bionick labeling system-Invitrogen) e/ou

digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix Roche). Para tanto, em um tubo de

eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparada uma solução contendo 1 μL de

Mix dNTP 10x; 1 μL de sonda de DNA (200 ng/ μL); 1 μL de Mix de enzima 10x; 6 μL

de água milli-Q, totalizando 9 μL, para cada lâmina que foi hibridizada. Esta solução foi

homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 ºC por 90 minutos no

termociclador. Em seguida, para interromper a reação, foi adicionado 1 μL de stop

buffer (EDTA 0,5 M) e após isso foi mantida em freezer para posterior utilização.

3.2.9 Hibridização in situ fluorescente – FISH

Foi utilizada a técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH) descrita

por Pinkel et al. (1986). Foram utilizadas como sondas sequências teloméricas, genes da

tropomiosina 1, DNAs ribossomais e elementos transponíveis obtidos por PCR e as

sequências repetitivas obtidas pelo Cot1-DNA.

Tratamento das lâminas

As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x por 5 minutos em temperatura

ambiente. As lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%)

durante 5 minutos cada. Em seguida foram tratadas com 90 µl de RNase 10 µg/mL (5

µL de RNase 10 mg/mL e 975 µL de 2XSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. As

lâminas foram lavadas três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada. Após isso, as

lâminas foram lavadas em PBS 1x durante 5 minutos.

Fixação

37

As lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1X/50mM MgCl2 durante

10 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente lavadas em PBS 1x por 5 minutos.

Após, as lâminas foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%)

durante 5 minutos cada.

Pré-hibridização

As lâminas foram desnaturadas em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5

minutos e novamente desidratadas em etanol gelado 70%, 85% e 100% por 5 minutos

cada.

Solução de hibridização

Em um tubo eppendorf, foram adicionados 2,5 µl de sonda (produto de PCR), 25

µl de formamida, 10 µl de sulfato de dextrano 50%, 5 µl de 20Xssc e 7,5 µl de água

milliQ . A sonda foi desnaturada a 99 °C por 10 minutos e passada imediatamente ao

gelo.

Hibridização

Foram colocados 40 µl de solução de hibridização sobre uma lamínula e a

lâmina foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material

voltado para baixo em câmara úmida (H20 destilada) a 37 °C por cerca de 14 horas.

Lavagens

As lamínulas foram removidas das lâminas. Em seguida foram lavadas duas

vezes em formamida 15% a 42°C durante 10 minutos cada. Em seguida, foi lavada em

solução Tween 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Detecção

As lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos. Após foram

lavadas duas vezes com solução Tween 5% por 5 minutos a temperatura ambiente.

Foram colocadas sobre cada lâmina 20 µL de anti digoxigenina-rodamina e/ou 100 µL

de streptavidina Alexa Fluor 488/NFDM. Em seguida foram cobertas com lamínula e

deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Posteriormente as

lamínulas foram removidas e as lâminas foram lavadas três vezes em solução Tween

38

5% por 2 minutos a temperatura ambiente cada. As lâminas foram desidratadas em série

alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada. Ao final, esperar secar.

Montagem das lâminas

Foi adicionado a cada lâmina solução de DAPI diluído em antifade VectaShield

Vector (20 µL de antifade e 1 µL de DAPI).

3.2.10 Análise cariotípica

Após a análise e contagem dos cromossomos ao microscópio óptico foi

estabelecido o número diploide modal e suas frequências relativas para cada indivíduo.

As melhores metáfases obtidas com as técnicas clássicas (convencional, RON e banda

C) foram analisadas e capturadas em um microscópio óptico Zeiss AX10. As metáfases

submetidas a técnicas moleculares (FISH) foram analisadas e capturadas em

fotomicroscópio de epifluorescência LEICA ou em fotomicroscópio de epifluorescência

Olympus BX51, em objetiva de imersão. Para a montagem dos cariótipos foi utilizado o

programa Adobe Photoshop 7.0, versão CS5, a partir de cromossomos metafásicos

mitóticos, os quais foram recortados e tentativamente emparelhados. Os cromossomos

foram medidos, utilizando o programa livre ImageJ e organizados em ordem

decrescente de tamanho. A morfologia cromossômica foi determinada de acordo com os

critérios de relação de braços (RB=BM/Bm, onde BM = braço maior e Bm = braço

menor) segundo Levan et al. (1964). Os cromossomos foram organizados em ordem

decrescente de tamanho e a morfologia foi determinada baseada na razão entre os

braços como cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocentricos

(st) e acrocêntricos (a). Dependendo da espécie, a fórmula cariotípica foi determinada

de acordo com a série gradual de cromossomos acrocêntricos ou número de

cromossomos portadores de dois braços, braço único e microcromossomos ou número

de macrocromossomos (M) e micromossomos (mi), para ser possível a comparação com

os dados descritos na literatura (Lowe e Wright 1966, Peccinini-Seale, 1981). Ressalta-

se que foram considerados microcromossomos aqueles com tamanho de até 2.5 μm,

puntiformes e não tem qualquer morfologia específica.

3.2.11 Clonagem

Os fragmentos de DNA isolados por Cot-1 e os produtos de PCR foram inseridos

independentemente nos vetores plasmidiais pMOSBlue blunt ended e pGEM-T

39

(Promega), respectivamente e foram utilizados para transformar bactérias competentes

Escherichia coli, linhagem DH5 preparadas no próprio laboratório.

Transformação de bactérias competentes Escherichia coli DH5 com os vetores

plasmidiais recombinantes:

Foi pipetado 50 µL de células de células competentes em um tubo eppendorf,

adicionado 10 µL do produto obtido na ligação às células competentes e foi misturado

suavemente. Em seguida, as células foram incubadas em gelo por 30 minutos e após, foi

dado um choque térmico nas células por exatos 5 minutos no banho-maria a 37 ºC.

Posteriormente, foi colocado em gelo por 10 minutos e adicionado 500 µL de meio LB

liquido em cada tubo. Foi colocado para agitar a 150 rpm por uma hora a 37 ºC.

Enquanto isso foi preparado o meio solido onde foi espalhado 30 µL de X-gal 2% e 20

µL IPTG 0,1 M em cada placa de meio de cultura sólido contendo ampicilina (50

µL/mL), para a seleção dos clones recombinantes, passado a uma hora as bactérias foi

plaqueadas e incubadas a 37 ºC durante uma noite (aproximadamente 16 horas).

3.2.12 Sequenciamento dos fragmentos de DNA repetitivo

Os fragmentos foram sequenciados pelo método de Sanger et al. (1977), com

terminadores marcados com fluorescência. Para a realização do sequenciamento, foi

feito um mix contendo 150 e 300 ng de DNA, 5 pmol de cada primer em reações

separadas; 4 L do premix (kit) e água mili-Q para completar o volume de 10 L. Essas

reações foram processadas em um termociclador em 30 ciclos sendo: desnaturação a 95

°C por 20 segundos, anelamento a 50 °C por 15 segundos e extensão a 72 °C por 1

minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no sequenciamento foram primers

universais que se anelam nos plasmídios pMOS e pGEM-T utilizados como vetores de

clonagem. Depois de sequenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de

precipitação para a eliminação do produto não incorporado durante a reação de

sequenciamento e logo após foi realizada a leitura automática do fragmento no

sequenciador automático de ABI 3130 XL (Applied Biosystem) nas condições de

injeção e corrida recomendadas pelo fabricante.

3.2.13 Análise das Sequências

As amostras sequenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do

sequenciador para outro computador. Todas as sequências foram alinhadas utilizando-se

40

o programa de alinhamento múltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que está

incluso no BioEdit v. 7.05.3 (Hall, 1999). O alinhamento gerado foi manualmente

conferido no mesmo programa.

Para identificação de possíveis homologias, as sequências nucleotídicas obtidas

foram submetidas a buscas online BLAST (“Basic Local Alignment Search Tool”)

(Altschul et al., 1990) através do National Center for Biotechnology Information

(NCBI) (USA), “website” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Para sequências de

elementos transponíveis foram submetidas buscas na base de dados Repbase do Genetic

Information Research Institute (http://www.girinst.org/censor/) utilizando o programa

on-line Censor (Kohany et al., 2006). As sequências geradas foram depositadas nestes

mesmos bancos de dados.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

http://www.girinst.org/censor/

41

4 Resultados e discussão

Os resultados e discussão dos dados são apresentados na forma de três artigos

científicos:

4.1 Artigo 1- Análises citogenéticas de cinco espécies de lagartos amazônicos das

subfamílias Teiinae e Tupinambinae e revisão da diversidade cariotípica da família

Teiidae. Artigo aceito no periódico Comparative Cytogenetics. doi:

10.3897/CompCytogen.v9i4.5371.

4.2 Artigo 2 – DNAs repetitivos na organização do genoma de espécies de lagartos

amazônicos da família Teiidae. Submetido para publicação no periódico Cytogenetics

and Genome Research.


espécies de lagartos amazônicos. Submetido para publicação no periódico Molecular

Cytogenetics.

42

5.1 Artigo 1 - Análises citogenéticas de cinco espécies de lagartos amazônicos das

subfamílias Teiinae e Tupinambinae e revisão da diversidade cariotípica da família

Teiidae

43

5.1.1 Resumo

Lagartos da família Teiidae (infraordem Scincomorpha) são conhecidos popularmente

como macroteídeos. Na região Amazônica, são encontradas 13 espécies destes lagartos

distribuídas nos gêneros Ameiva, Cnemidophorus, Crocodilurus, Dracaena, Kentropyx

e Tupinambis. Os estudos citogenéticos neste grupo restringem-se apenas a

macroestrutura cariotípica. Deste modo, foram realizadas uma compilação de dados

citogenéticos para a família Teiidae, além da inclusão de análises citogenéticas clássicas

(coloração convencional, Banda C e RON) e moleculares (FISH com sondas de DNAr

18S) de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx

pelviceps e Tupinambis teguixin, coletados no estado do Amazonas, Brasil. Para Ameiva

ameiva, K. calcarata e K. pelviceps foi encontrado 2n=50 cromossomos, sendo

classificados por uma série gradual de cromossomos acrocêntricos. Cnemidophorus sp.1

apresenta 2n=48 cromossomos, sendo 2 cromossomos portadores de dois braços, 24

cromossomos de braço único e 22 microcromossomos. Tupinambis teguixin apresenta

2n=36 cromossomos, sendo 12 macrocromossomos (M) e 24 microcromossomos (m). A

heterocromatina constitutiva apresentou-se distribuída nas regiões centroméricas e

terminais da maioria dos cromossomos. A região organizadora de nucléolo (RON),

apresentou-se simples, com uma variação na localização das mesmas entre as espécies,

evidenciada tanto por impregnação com AgNO3 como pela hibridização de sondas

DNAr 18S. Os dados obtidos revelaram uma variação cariotípica em relação ao número

diploide, número fundamental e fórmula cariotípica, o que reforça a importância no

aumento de análises cromossômicas na família Teiidae.

Palavras-chave: Macroteiids, Cromossomo, Heterocromatina, Coloração diferencial,

DNAr-FISH

44

5.1.2 Introdução

A família Teiidae é composta por lagartos conhecidos popularmente como

macroteídeos e são restritos ao Novo Mundo (Giugliano et al., 2007; Harley et al.,

2012). Harvey et al. (2012) recentemente dividiu Teiidae em três subfamílias: Teiinae

incluindo os gêneros Ameiva (Meyer, 1795), Ameivula (Spix, 1825), Aurivela (Bell,

1843), Aspidoscelis (Fitzinger, 1843), Contomastix (Dumésil e Bibron, 1839),

Cnemidophorus (Wagler 1830), Dicrodon (Dumésil e Bibron, 1839), Holcosus (Cope,

1862), Kentropyx (Spix, 1825), Medopheos (Bocourt, 1874) e Teius (Merrem, 1820);

(2) Tupinambinae, incluindo os gêneros Crocodilurus (Spix, 1825), Dracaena (Daudin,

1801), Salvator (Dumésil e Bibron, 1839) e Tupinambis (Daudin, 1802); e (3)

Callopistinae, composto por um único gênero Callopistes (Gravenhorst, 1837).

Contudo, a hipótese filogenética de Teiidae baseada em caracteres morfológicos

(Reeder et al., 2002; Giugliano et al., 2007) difere substancialmente de hipóteses

baseadas em DNA mitocondrial. A filogenia com base na morfologia é consistente com

padrões biogeográficos bem estabelecidos entre os vertebrados neotropicais (Harvey et

al., 2012).

A maioria dos dados cromossômicos para as espécies de teídeos referem-se à

determinação do número diploide e fórmula cariotípica (Fritts, 1969; Gorman, 1970;

Lowe et al., 1970; Robinson, 1973; Cole et al., 1979; de Smet et al., 1981; Navarro et

al., 1981; Ward and Cole, 1986; Cole et al., 1995; Markezich et al., 1997; Rocha et

al., 1997; Walker et al., 1997; Manriquen-Moran et al., 2000; Veronese et al., 2003).

Porém, apesar de incipientes, algumas espécies desta família possuem análises

pormenorizadas da estrutura e organização dos cromossomos revelada através de

técnicas de coloração diferencial, como as detecções de heterocromatina e as regiões

organizadoras de nucléolo (RONs), bem como mapeamento físico cromossômico de

sequências de DNA de interesse (Bickhan et al., 1976; Bull, 1978; Peccinini-Seale e

Almeida, 1986; Porter et al., 1991; Rocha et al., 1997; Veronese et al., 2003;

Peccinini-Seale et al., 2004; Santos et al., 2007; Santos et al., 2008).

De acordo com as análises citogenéticas, desde 1970 esta família encontra-se

dividida em dois grupos: o grupo Dracaena (atual subfamília Tupinambinae) com

cariótipo apresentando 34 a 38 cromossomos com distinção entre os

macrocromossomos (M) e microcromossomos (m); e o grupo Ameiva (atual subfamília

45

Teiinae) com número diploide de 46 a 56 cromossomos, sem distinção entre os macros

e microcromossomos (Gorman, 1970).

Deste modo, o objetivo do presente estudo foi caracterizar citogeneticamente

cinco espécies da família Teiidae: Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758), Cnemidophorus

sp.1, Kentropyx calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e

Tupinambis teguixin (Linnaeus, 1758) utilizando marcadores citogenéticos clássicos e

moleculares (coloração convencional, padrão de heterocromatina, localização das

regiões organizadoras de nucléolo e mapeamento físico cromossômico de sequências de

DNAr 18S). Ainda, a organização cariotípica desta família foi discutida.

5.1.3 Material e Métodos

Trinta e três espécimes pertencentes às subfamílias Teiinae e Tupinambinae

foram coletados no estado do Amazonas, Brasil, nas seguintes localidades: florestas nas

margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã (0º50' e 01º55'S; 58º50' e

60º10'W); rio Darahá e Ayuanã, ambos no município de Santa Isabel do Rio Negro

(0°24′24″N; 65°1′1″W); rio Purus, no município de Tapauá (5º42'115'' S; 63º13'684''

W); perímetro urbano de Manaus (3º07'13.03'' S; 60º01'440'' W). Todas as coletas foram

conduzidas com a licença do ICMBio/SISBIO 41825-1. Os locais de coleta estão

localizados em terras públicas (Tabela 1). Os animais foram eutanaziados logo após a

captura com uma dose letal de anestésico Tiopental sódico do anestésico onde foram

desprovidos de alimentos ou água. Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal da Fundação Universidade do Amazonas / Universidade

Federal do Amazonas (UFAM) (número 041/2013). Nenhuma espécie ameaçada de

extinção ou protegida foi utilizada neste estudo. Os animais foram submetidos aos

procedimentos citogenéticos, sendo posteriormente fixados com formaldeído 10%

(injetados na cavidade celomática e trato digestório) (Franco e Salomão, 2002) e

conservados em álcool 70%. Os espécimes testemunhos foram depositados na Coleção

Herpetológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA H31712, 33213,

34791, 34841, 35018).

46

Tabela 1. Espécies das subfamílias Teiinae e Tupinambinae: Local de coleta, numero e sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes)

são listados. AM: Amazonas

Subfamília Espécies Local de coleta Número e sexo dos animais

analisados

Voucher (lotes)

Ameiva ameiva São Sebastião do Uatumã, AM

Santa Isabel do Rio Negro, AM

Tapauá, AM

11 (quatro machos;

três fêmeas;

quatro sem identificação do sexo)

INPA H33213

Cnemidophorus sp.1 Manaus, AM 13 (cinco machos; oito fêmeas) INPA H 35018

Teiinae Kentropyx calcarata São Sebastião do Uatumã, AM

4 (três machos;

uma fêmea)

INPA H31712

Kentropyx pelviceps Tapauá, AM

3 (três fêmeas)

INPA H34841

Tupinambinae Tupinambis teguixin São Sebastião do Uatumã, AM

Tapauá, AM

3 (duas fêmeas;

um sem identificação do sexo)

INPA H34791

47

As suspensões celulares foram obtidas a partir de medula óssea utilizando

colchicina in vitro segundo a técnica descrita por Ford e Hamerton (1956). A

heterocromatina constitutiva (HC) foi detectada utilizando o protocolo descrito por

Sumner (1972) e a região organizadora de nucléolo (RONs) foi detectada utilizando a

técnica de impregnação por nitrato de prata descrita por Howell e Black (1980).

O DNA genômico foi extraído a partir de tecido muscular utilizando o protocolo

de fenol-clorofórmio descrito por Sambrook e Russel (2001) e quantificado em

espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). O DNAr 18S foi amplificado

por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando os primers 18Sf (5’-CCG CTT

TGG TGA CTC TTG AT-3’) e 18Sr (5’-CCG AGGACC TCA CTA AAC CA-3’)

(Gross et al., 2010a). As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 15

µL contendo DNA genômico (200 ng), tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, Taq DNA

polimerase (5 U/µL), dNTPs (1 mM), par de primers (5 mM), e água Milli-Q. O ciclo

de amplificação seguiram as seguintes etapas: 1 min 95 °C; 35 ciclos de 1 min a 94 °C,

1 min a 56 °C e 1 min 30 s a 72 °C; seguidos por 5 min a 72 °C. O produto de PCR de

DNAr 18S foi marcado por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Dig- Nick

Translation mix; Roche) segundo o protocolo do fabricante. A detecção da sonda foi

realizada utilizando anti-digoxigenina rodamina (Roche) foi usado para detectar o sinal

da sonda. Hibridizações homólogas e heterólogas foram realizadas de acordo com o

protocolo descrito por Pinkel et al. (1986) em condições de estringência de 77% (2,5

ng/µL de DNAr 18S, 50% formamida, 10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37 °C por

18 h). Os cromossomos foram contra corados com DAPI (2 mg/ml) em meio de

montagem VectaShield (Vector).

Os cromossomos foram analisados usando o microscópio de epifluorescência da

Olympus BX51 e as imagens foram capturadas com a câmera digital (Olympus DP71)

usando o programa Image-Pro MC 6.3 software. As metáfases mitóticas foram

processadas no programa Adobe Photoshop CS5 e os cromossomos foram medidos

usando o Image J. Os cromossomos foram organizados em ordem decrescente de

tamanho e a morfologia foi determinada baseada na razão entre os braços como

cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocentricos (st) e

acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964). Para permitir comparação com o descrito na

literatura, a fórmula cariotípica foi determinada de acordo com a série gradual de

cromossomos acrocêntricos ou número de cromossomos portadores de dois braços,

48

braço único e microcromossomos ou número de macrocromossomos (M) e

micromossomos (mi) (Lowe e Wright, 1966, Peccinini-Seale, 1981). Ressalta-se que

foram considerados microcromossomos aqueles com tamanho de até 2.5 μm,

puntiformes e não tem qualquer morfologia específica.

5.1.4 Resultados

O número diploide para todos os indivíduos de Ameiva ameiva, Kentropyx

calcarata e Kentropyx pelviceps foi igual a 50 cromossomos, com uma série gradual de

cromossomos acrocêntricos (Figuras 1a, 1i e 1m). Cnemidophorus sp.1 apresenta 48

cromossomos com 2 cromossomos de dois braços, 24 cromossomos de braço único e 22

microcromossomos (Figura 1e). Tupinambis teguixin apresenta 36 cromossomos, sendo

12 macrocromossomos (M) e 24 microcromossomos (mi), sendo os pares de

macrocromossomos 1, 3, 4 e 5 metacêntricos e os pares 2 e 6 cromossomos

submetacêntricos (Figura 2a). Foi observado uma constrição secundária localizada na

região distal dos braços longos do par 1 em Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e

Kentropyx pelviceps e do par 2 em Tupinambis teguixin (Figuras 1e, 1i, 1m e 2a).

Nenhum cromossomo sexual diferenciado foi observado nas espécies analisadas.

A heterocromatina constitutiva foi observada nas regiões centromérica e

terminal da maioria dos cromossomos de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1,

Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps (Figura 1b; 1f; 1j e 1n). Em Tupinambis

teguixin, blocos heterocromáticos localizaram-se na região centromérica de todos os

macrocromossomos, além de blocos terminais tênues que foram visualizados nos macro

e microcromossomos (Figura 2b).

A RON apresentou-se como simples em todas as espécies analisadas. Em

Ameiva ameiva a RON foi localizada na região terminal dos braços longos do par 7

(Figura 1c). Em Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps a

RON foi evidenciado na região distal dos braços longos do par 1 e em Tupinambis

teguixin no par 2, coincidente com a constrição secundária presente nos cariótipos

destas espécies (Figuras 1g, 1k, 1o e 2c, respectivamente). A hibridização in situ

fluorescente (FISH) com sonda de DNAr 18S, evidenciou um par cromossômico

portador deste sítio, coincidente com a marcação por nitrato de Prata nas cinco espécies

analisadas (Figuras 1d, 1h, 1l, 1p e 2d).

49

Figura 1. Cariótipos de espécies pertencentes subfamília Teiinae: (a), (e), (i) e (m)

Coloração convencional; (b), (f), (j) e (N) Regiões de heterocromatina evidenciada pela

técnica de banda C; (c), (g), (k) e (o) em destaque o par nucleolar impregnado com

AgNO3; (d), (h), (l) e (p) em destaque o par portador do sítio de DNAr 18S (vermelho)

e cromossomos contracorados com DAPI. Barra de escala representam 10 µm.

50

Figura 2. Cariótipos de Tupinambis teguixin: (a) Coloração convencional; (b) Regiões

de heterocromatina evidenciada pela técnica de banda C; (c) em destaque o par

nucleolar impregnado com AgNO3; (d) em destaque o par portador do sítio de DNAr

18S (vermelho) e cromossomos contracorados com DAPI. m=Macrocromossomo,

mi=microcromossomo. Barra de escala representa 10 µm.

5.1.5 Discussão

Análises citogenéticas conduzidas para família Teiidae na década de 1970

indicavam que as espécies poderiam ser alocados em dois grupos: Ameiva, com número

diploide variando de 46 a 56 cromossomos, sem distinção entre os macros e

microcromossomos; grupo Dracaena, com cariótipo apresentando 34 a 38

cromossomos, com distinção entre os macrocromossomos e microcromossomos

(Gorman, 1970). Até o final da década de 1980, numerosos caracteres osteológicos,

morfológicos e de tecidos moles corroboraram os dados cromossômicos, sendo

considerada a existência destas duas subfamílias para os teídeos, que formavam o grupo

monofilético Teiioidea, restrito ao Novo Mundo, sendo este grupo-irmão dos

Lacertidae, do Velho Mundo (Presch, 1974; 1983; Estes et al., 1988).

O maior número de dados cariotípicos disponíveis refere-se a espécies da

subfamília Teiinae, com descrição do número diploide de 63 espécies (Tabela 2). Os

representantes de Teiinae cariotipados apresentam número diploide variando entre

2n=30 (Ameiva auberi) a 2n=54 (Teius oculatus e Teius teyou), além da presença de

51

cromossomos sexuais do tipo XX/XY em Aspidocelis tigris e Ameivula littoralis e da

presença de triploidia em algumas espécies de Aspidocelis, que apresentam 2n=3x=69

cromossomos. Hibridização interespecífica foi observada em algumas espécies do

gênero Aspidocelis, as quais estavam anteriormente alocadas no gênero Cnemidophorus

(Lowe et al., 1970; Walker et al., 1997; Lutes et al., 2000; Manríquez-Morán et al.,

2000). Se considerado os grupos propostos por Gorman (1970), os representantes da

subfamília Teiinae estariam alocados no grupo Ameiva. Contudo, algumas espécies

apresentam distinção entre macro e microcromossomos, apesar da maioria dos

cromossomos ser acrocêntrico, o que contraria o que foi proposto por Gorman (1970)

como característica citogenética do grupo.

52

Tabela 2. Compilação da literatura dos dados citogenéticos básicos para a família Teiidae. Na tabela apresenta o número diploide (2n), fórmula

cariotípica (FC), número fundamental (NF). Três descrições de formulas cariotípicas: (a) número de cromossomos de dois braços, número de

cromossomos de braço único e número de microcromossomos; (b) série gradual de cromossomos do tipo acrocêntricos; (c) cromossomos

macrocromossomos (M) e microcromossomos (mi). Para dados não indicados nas publicações foi utilizada a simbologia “--”.

Subfamília Gênero Espécie

(Harvey et al., 2012)

Espécie

(Descrição inicial)

2n Tipo de FC e descrição NF Referência

Callopistinae Callopistes Callopistes flavipunctatus Callopistes flavipunctatus 2n=38 c (12M+26m) 50 2

Callopistes maculatus Callopistes maculatus 2n=38 c (12M+26m) 26, 50 2, 8

Teiinae

Ameiva Ameiva ameiva Ameiva ameiva 2n=50 a (0: 26: 24)

b (série gradual de cromossomos acrocêntricos)

50 2, 18

Ameiva auberi Ameiva auberi 2n=30 a (8: 10:12) 38 11

Ameiva chrysolaema Ameiva chrysolaema 2n=50 a (0: 22: 28), (6: 20: 24) 50, 56 2

Ameiva dorsalis Ameiva dorsalis 2n=50 a (4: 22: 24) 54 2

Ameiva exsul Ameiva exsul 2n=50 a (0: 26: 24) 50 2

Ameiva maynardi Ameiva maynardi 2n=50 a (4: 22: 24) 54 2

Ameivula Ameivula nativo

Ameivula litorralis

Ameivula ocellifera

Cnemidophorus nativo

Cnemidophorus littoralis

Cnemidophorus ocellifera

2n=50

2n=46( XX/XY)

2n=50

a (5: 19: 24)

a (5: 19: 22)

b(série gradual de cromossomos acrocêntricos)

53

51

-

14

9

18

Aspidoscelis Aspidoscelis angusticeps Cnemidophorus angusticeps 2n=44, 46 a (6: 20: 18), a (2: 24: 20) 50, 48 3, 16

53

Aspidoscelis burti Cnemidophorus burti 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis calidipes Cnemidophorus calidipes 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis ceralbensis Cnemidophorus ceralbensis 2n=52 - - 4

Aspidoscelis communis Cnemidophorus communis 2n=46 a (2: 24:20) 48 3

Aspidoscelis costatus Cnemidophorus costatus 2n=46 a (2: 24:20) 48 3

Aspidoscelis cozumelae Cnemidophorus cozumelae 2n=49, 50 a (0: 28: 21), a (11: 19: 20) 49, 61 3, 16

Aspidoscelis deppei Cnemidophorus deppei 2n=50, 52 a (0: 26: 24), a (0: 28: 24) 50, 52 3, 16

Aspidoscelis exsanguis Cnemidophorus exsanguis 3n=69* - - 3, 10

Aspidoscelis flagellicaudas Cnemidophorus flagellicaudas 3n=69* - - 3

Aspidoscelis gularis Cnemidophorus gularis 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis guttatus Cnemidophorus guttatus 2n=52 a (0: 28: 24) 52 3

Aspidoscelis hyperythrus Cnemidophorus hyperythrus 2n=52 a (0: 28: 24) 52 3

Aspidoscelis inoratus Cnemidophorus inoratus 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3, 10

Aspidoscelis laredoensis Cnemidophorus laredoensis 2n=46 a (2: 24: 20) 48 4

Aspidoscelis lineatissima Cnemidophorus lineatissima 2n=52 a (0: 28: 24) 52 3

Aspidoscelis marmoratus Cnemidophorus marmoratus 2n=46 a (0: 22: 24) 46 11

Aspidoscelis maslini Cnemidophorus maslini 2n=47 a (14: 13: 20) 49 3

Aspidoscelis mexicana Cnemidophorus mexicana 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis motaguae Cnemidophorus motaguae 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

54

Aspidoscelis neomexicanus Cnemidophorus neomexicanus 2n=46 a (4: 20: 22) 50 3,10

Aspidoscelis opatae Cnemidophorus opatae 3n=69* - - 3

Aspidoscelis parvisocius Cnemidophorus parvisocius 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis rodecki Cnemidophorus rodecki 2n=50 - - 1

Aspidoscelis sacki Cnemidophorus sacki 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis sptemvittatus Cnemidophorus sptemvittatus 2n=46 a (2: 24: 20) 48 3

Aspidoscelis sexlineatus Cnemidophorus sexlineatus 2n=46 a (2: 24: 20), a (8: 18: 20) 48, 54 3, 5

Aspidoscelis sonorae Cnemidophorus sonorae 2n=46, 3n=69* a (4: 20: 22) 48 2, 3, 10

Aspidoscelis tesselatus Cnemidophorus tesselatus 2n=46, 3n=69* a (4: 20: 22) 50 3, 10, 15

Aspidoscelis tigris tigres Cnemidophorus tigris tigris 2n=46(XX/XY) a (6: 16: 24) 52 2, 10

Aspidoscelis tigris aethiops Cnemidophorus tigris aethiops 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3

Aspidoscelis t. estebanensis Cnemidophorus t. estebanensis 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3

Aspidoscelis t. gracilis Cnemidophorus t. gracilis 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3

Aspidoscelis t. marmoratus Cnemidophorus t. marmoratus 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3

Aspidoscelis t. maximus Cnemidophorus t. maximus 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3

Aspidoscelis t. septentrionalis Cnemidophorus t. septentrionalis 2n=46 a (6: 16: 24) 52 3

Aspidoscelis ubiparens Cnemidophorus uniparens 3n=69* - - 3, 10

Aspidoscelis velox Cnemidophorus velox 3n=69* - - 3

Cnemidophorus Cnemidophorus arenivagus Cnemidophorus arenivagus 2n=50 a (2: 24: 24) 52 9, 13

55

Cnemidophorus arubensis Cnemidophorus arubensis 2n=50 a (2: 24: 24) 52 9, 13

Cnemidophorus cryptus Cnemidophorus cryptus 2n=50 - 52 9

Cnemidophorus gramivagus Cnemidophorus gramivagus 2n=50 - 52 9

Cnemidophorus lemniscatus Cnemidophorus lemniscatus 2n=50 a (2: 24: 24) 52 2, 3

Cnemidophorus murinus Cnemidophorus murinus 2n=50 a (2: 24:24) 52 4, 3

Cnemidophorus sp.1 - 2n=48 a (2: 24:22) 50 Presente

trabalho

Contomastix Contomastix lacertoides Cnemidophorus lacertoides 2n=50 a (0: 26: 24) 52 6, 17

Kentropyx Kentropyx borckiana Kentropyx borckiana 2n=50 a (0: 26: 24) 50 12

Kentropyx calcarata Kentropyx calcarata 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 12, 19

Kentropyx striata Kentropyx striata 2n=50 a (0: 26: 24) 50 12

Kentropyx paulensis Kentropyx paulensis 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 18

Kentropyx pelviceps Kentropyx pelviceps 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 Presente

trabalho

Kentropyx vanzoi Kentropyx vanzoi 2n=50 b(série gradual de cromossomos acrocêntricos) 50 18

Teius Teius oculatus Teius oculatus 2n=54 a (8: 28: 18) 62 17

Teius teyou Teius teyou 2n=54 a (8: 22: 24) 62 2

Tupinambinae

Crocodilurus - Crocodilurus lacertinus 2n=34 c (12M+22m) 46 2

Crocodilurus amazonicus Crocodilurus amazonicus 2n=34 c (12M+22m) 46 19

Dracaena Dracaena guianensis Dracaena guianensis 2n=38 a (10:2:26) 48 2

56

Tupinambis - Tupinambis nigropunctatus 2n=36, 38 a (10: 2: 24), c (16M+22m) 46, 54 2, 7

Tupinambis quadrilineatus Tupinambis quadrilineatus 2n=38 c (12M+26m) - 19

Tupinambis teguixin Tupinambis teguixin 2n=38, 36 a (10: 0: 28), (12M+24m) 48 7, 19

Salvator Salvator merianae Tupinambis merianae 2n=36, 38 a (10: 0: 26), c (12M+26m) 48, 50 7, 17, 19

* Poliploidia em forma triploide (3n). 1 – Fritts, 1969; 2 – Gorman, 1970; 3 - Lowe et al., 1970; 4 – Robinson, 1973; 5 - Bickham et al., 1976; 6 -

Cole et al., 1979; 7 - de Smet et al., 1981; 8 - Navarro et al., 1981; 9 - Peccinini-Seale e Almeida, 1986; 10 - Ward e Cole, 1986; 11 - Porter et

al., 1991; 12 - Cole et al., 1995; 13 - Markezich et al., 1997; 14 - Rocha et al., 1997; 15 - Walker et al., 1997; 16 - Manriquen-Moran et al.,

2000; 17 - Veronese et al., 2003; 18 - Santos et al., 2007; 19 - Santos et al., 2008.

57

Ameiva ameiva e Kentropyx calcarata apresentaram 2n=50 cromossomos

(presente estudo), o que corrobora os dados disponíveis na literatura para estas espécies,

provenientes de diferentes localidades (Peccinini-Seale e Almeida 1986; Gorman 1970;

Beçak et al., 1972; Schimid e Guttenbach 1988; Sites et al., 1990; Veronese et al.,

2003; Santos et al., 2007). Contudo, no presente trabalho A. ameiva e K. calcarata

apresentaram série gradual de cromossomos acrocêntricos devido à ausência de uma

separação de tamanhos entre esses cromossomos, similarmente ao descrito por Cole et

al. (1995) e Santos et al. (2007). O mesmo aconteceu em Kentropyx pelviceps, cujas

características citogenéticas foram reveladas pela primeira vez no presente trabalho.

Ainda, fórmulas cariotípicas compostas por cromossomos portadores de dois

braços, cromossomos portadores de braço único e os cromossomos microcromossomos

já foram descritas para Ameiva ameiva e Kentropyx calcarata e nos demais gêneros da

subfamília Teiinae (Lowe e Wright, 1966; Peccinini-Seale e Almeida, 1986; Gorman,

1970; Beçak et al. 1972; Schimid e Guttenbach, 1988; Sites et al., 1990; Veronese et

al., 2003), o que revela que algumas divergências ocorrem devido aos distintos

parâmetros de classificação adotados por vários autores em suas análises

cromossômicas.

Já o gênero Cnemidophorus é reconhecido como complexo, dividido em quatro

grupos:

(1) Cnemidophorus lemniscatus incluindo as espécies Cnemidophorus

arenivagus (Markezich, Cole e Dessauer, 1997), Cnemidophorus arubensis (Lidth de

Jeude, 1887), Cnemidophorus cryptus (Cole e Dessauer, 1993), Cnemidophorus

flavissimus (Ugueto, Harvey e Rivas, 2010), Cnemidophorus gramivagus (Mccrystal e

Dixon, 1987), Cnemidophorus lemniscatus espeuti (Boulenger, 1885), Cnemidophorus

lemniscatus gaigei (Ruthven, 1924), Cnemidophorus lemniscatus lemniscatus

(Linnaeus, 1758), Cnemidophorus lemniscatus splendidus (Markezich, Cole e Dessauer,

1997), Cnemidophorus pseudolemniscatus (Cole e Dessauer, 1993), Cnemidophorus

senectus (Ugueto, Harvey e Rivas, 2010) e Cnemidophorus sp. B.;

(2) Cnemidophorus nigricolor incluindo as espécies Cnemidophorus

leucopsammus (Ugueto e Harvey, 2010), Cnemidophorus nigricolor (Peters, 1873),

Cnemidophorus rostralis (Ugueto e Harvey, 2010) e Cnemidophorus sp. A;

58

(3) Cnemidophorus murinus includindo as espécies Cnemidophorus murinus

(Laurenti, 1768) e Cnemidophorus ruthveni (Burt, 1935).;

(4) Cnemidophorus vanzoi incluindo as espécies Cnemidophorus vanzoi (Baskin

e Williams, 1966) (Harvey et al., 2012).

Vale ressaltar que diversas novas espécies deste gênero têm sido descritas,

revelando que a taxonomia deste gênero ainda não esta elucidada, o que enfatiza a

necessidade de estudos morfológicos neste gênero.

Citogeneticamente, poucas espécies de Cnemidophorus apresentam descrição

cariotípica e as espécies que já possuem seu cariótipo descrito indica o número diploide

igual a 50 cromossomos composto por cromossomos portadores de dois braços,

cromossomos portadores de braço único e os cromossomos microcromossomos (Tabela

2; Peccinini-Seale e Almeida, 1986). No entanto, o cariótipo de Cnemidophorus sp. 1

(considerada como pertencente ao grupo Cnemidophorus gramivagus por Federico

Arias, que está descrevendo a espécie) (Amazonas), difere dos descritos para outras

espécies do gênero. Esta espécie apresenta 2n=48 cromossomos com a ausência de um

par de cromossomos microcromossomos. Isto demonstra a presença de rearranjos

cromossômicos robertsonianos, que podem estar associados à evolução cromossômica

deste gênero, os quais favoreceram mudanças no número diploide (redução do número

diploide). Outra população do estado do Amazonas (cidade de Manacapuru),

identificada como pertencente ao grupo Cnemidophorus lemniscatus possui o número

diploide de 50 cromossomos, com a presença de cromossomos portadores de dois

braços, braços únicos e microcromossomos (0:26:24) (Sites et al., 1990). Nossos

resultados demonstram que os espécimes amostrados de Manaus são cariotipicamente

distintos dos espécimes de Manacapuru, uma vez que Cnemidophorus sp.1 confirmando

que trata-se de nova espécie.

Já na subfamília Tupinambinae, as sete espécies cariotipadas apresentam com

número diploide variando de 2n=34 a 2n=38 cromossomos, com distinção de macro e

microcromossomos (Santos et al., 2008, presente trabalho). Nenhum tipo de sistema de

cromossomo sexual foi evidenciado na subfamília (Gorman, 1970). Tupinambis teguixin

apresentou 2n=36 cromossomos (12M+24m), número e fórmula cariotípica também

encontrado por Gorman (1970), De Smet (1981) e Santos et al. (2008). Por outro lado,

Beçak et al. (1972) descreveram outro número diploide igual a 38 cromossomos

59

(12M+26m) para T. teguixin, com um par adicional de cromossomos

microcromossomos.

No que diz respeito ao padrão de distribuição da heterocromatina em espécies da

família Teiidae, blocos heterocromáticos foram localizados nas regiões centromérica e

terminal de quase todos os cromossomos, sendo que em alguns pares foram também

evidenciados em regiões pericentromérica, intersticial e proximal (Tabela 3). O padrão

heterocromático das espécies Cnemidophorus sp. 1, Kentropyx calcarata, Kentropyx

pelviceps e Tupinambis teguixin são descritos pela primeira vez no presente estudo. As

cinco espécies de teídeos analisadas no presente trabalho apresentaram grande

quantidade de blocos heterocromáticos nas regiões centromérica e terminal da maioria

dos cromossomos, coincidindo com o padrão descrito na literatura. Esse padrão de

distribuição de heterocromatina é similar entre as espécies analisadas, sugerindo um

padrão conservado observado para espécies de teídeos. Porém, três espécies da

subfamília Tupinambinae Crocodilurus amazonicus (Spix, 1825), Salvator merianae

(Duméril e Bibron, 1839) e Tupinambis quadrilineatus (Manzani e Abe, 1997),

apresentam padrões de heterocromatina espécie-específicos, com blocos

heterocromáticos nas regiões centromérica, pericentromérica, intersticial e proximal da

maioria dos cromossomos (Santos et al., 2008). A existência desse padrão distinto de

heterocromatina provavelmente pode ser atribuída a um processo de adição de

heterocromatina ou heterocromatinização durante a evolução dessas espécies.

60

Tabela 3. Dados citogenéticos de bandamentos diferenciais compilados da literatura para a família Teiidae. Na tabela apresenta o local da coleta,

regoes organizadoras de nucléolos (RONs), heterocromatina constitutiva (HC), hibridização in situ fluorescente (FISH). Localidade: Amazonas

(AM), Bahia (BA), Estados Unidos (USA), Espírito Santo (ES), Goiás (GO), Mato Grosso (MT), Minas Gerais (MG), Pará (PA), Rio de Janeiro

(RJ), Rio Grande do Sul (RS), Rondônia (RO), São Paulo (SP), Sergipe (SE), Tocantins (TO). Para dados não indicados nas publicações foi

utilizada a simbologia “--”.

Subfamília Espécie

(Harvey et al., 2012)

Espécie

(Descrição inicial)

Localidade RON HC FISH Referência

Teiinae Ameiva ameiva Ameiva ameiva GO, RO, MT, TO Região terminal do

braço longo do par 7

Regiões centromérica e

terminal

- 8

Ameiva ameiva Ameiva ameiva AM Região terminal do



terminal

DNAr 18S (par 7) Presente

trabalho

Ameiva auberi Ameiva auberi - - - DNAr 45S (par de

microcromosomos)

4

Aspidoscelis gularis Cnemidophorus gularis USA Região centromérica - 1

Aspidoscelis laredoensis Cnemidophorus laredoensis USA - Região centromérica - 1

Aspidoscelis marmoratus Cnemidophorus marmoratus - - - DNAr 45S (par 2) 4

Aspidoscelis sexlineatus Cnemidophorus sexlineatus USA - Região centromérica - 1

Aspidoscelis tigris Cnemidophorus tigriss USA - Região centromérica - 2

61

Ameivula littoralis

Ameivula nativo

Ameivula ocellifera

Cnemidophorus littoralis

Cnemidophorus nativo

Cnemidophorus ocellifera

RJ

ES

BA, SE, MG

Regiao terminal do

braco longo do par 8

RONs múltiplas

(pares não indicados)

Regiao terminal do

braco longo do par 5

-

-


terminal

-

-

-

7

5

8

Cnemidophorus arenivagus Cnemidophorus arenivagus - Região terminal do


- - 3

Cnemidophorus cryptus Cnemidophorus cryptus - Região terminal do


- - 3

Cnemidophorus gramivagus Cnemidophorus gramivagus - Região terminal do


- - 3

Cnemidophorus lemniscatus Cnemidophorus lemniscatus - Região terminal do

braço longo do par 1 - - 3

Cnemidophorus sp.1 - AM Região distal do braço

longo do par 1 Regiões centromérica e

terminal


trabalho

Contomastix larcetoides Cnemidophorus larcetoides RS - Região centromérica - 6

Kentropryx calcarata Kentropryx calcarata BA, TO, MT Região distal do braço

longo do par 1 - - 8

Kentropryx calcarata Kentropryx calcarata AM Região distal do braço


terminal


trabalho

Kentropryx paulensis Kentropryx paulensis SP Região distal do braço Regiões centromérica e - 8

62

longo do par 1 terminal

Kentropyx pelviceps Kentropyx pelviceps AM Região distal do braço


terminal


trabalho

Kentropryx vanzoi Kentropryx vanzoi RO Região distal do braço

longo do par 1 - - 8

Teius oculatus Teius oculatus RS RONs múltiplas (pares

não indicados)

- - 6

Tupinambinae Crocodilurus amazonicus Crocodilurus amazonicus PA Região distal do braço

longo do par 2 Região pericentromérica - 9

Salvator meriane Tupinambis merianae TO, SP, ES Região distal do braço

longo do par 2

Região pericentromérica - 9

Tupinambis quadrilineatus Tupinambis quadrilineatus GO, TO Região distal do braço

longo do par 2

Regiões centromérica,

pericentromérica,

interstitial, proximal e

terminal

- 9

Tupinambis teguixin Tupinambis teguixin GO, TO Região distal do braço

longo do par 2

- - 9

Tupinambis teguixin Tupinambis teguixin AM Região distal do braço

longo do par 2


terminal


trabalho

1 - Bickhan et al., 1976; 2 – Bull, 1978; 3 - Peccinini-Seale e Almeida, 1986; 4 - Porter et al., 1991; 5 - Rocha et al., 1997; 6 - Veronese et al.,

2003; 7 - Peccinini-Seale et al., 2004; 8 - Santos et al., 2007; 9 - Santos et al., 2008.

63

Regiões heterocromáticas são ricas em sequências de DNA repetitivas

geralmente localizadas nas regiões centroméricas ou terminais de cromossomos.

Embora a heterocromatina possa estar localizada na mesma região cromossômica de

espécies diferentes, isto não significa que têm a mesma composição genética, que pode

mudar a quantidade de sequências de DNAs repetitivos nos cromossomos. Portanto, o

mapeamento de sequências repetitivas tem sido considerado importante marcador

espécies específicos ou populacionais (Carvalho et al., 2012, Schneider et al., 2013).

Embora as cinco espécies de teídeos analisadas no presente estudo apresentem

macroestrutura cariotípica conservada, algumas características cromossômicas

distinguem os cariótipos destas espécies. Em Cnemidophorus sp. 1, Kentropyx

calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin foi observado a presença de uma

constrição secundária localizada na região distal do par 1 e par 2, a qual é ausente em

Ameiva ameiva. Essas constrições secundárias geralmente estão presentes em um par

cromossômico e são bastante comuns em diversas espécies de lagartos (Bertolotto et al.,

1996; Kasahara et al., 1996; Bertolotto et al., 2002; Srikulnath et al., 2009a). Nessas

constrições secundárias geralmente estão situadas às regiões organizadoras de nucléolo

(RONs) que são identificadas, de forma indireta, por impregnação dos cromossomos

com nitrato de prata, pois marcam somente proteínas nucleolares envolvidas com a

atividade transcricional dos genes ribossomais da família 45S. Ainda, as RONs podem

estar localizadas em um único par cromossômico, considerada esta uma característica

basal e já relatados em diferentes espécies de lagartos (Porter et al., 1991).

A localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) revelou ser um

excelente marcador para a caracterização das espécies e estudos evolutivos entre os

lagartos teídeos, sendo que essa informação já foi mencionada para alguns gêneros da

família Teiidae (Santos et al. 2007, 2008), como Kentropyx (Kentropyx calcarata,

Kentropyx paulensis (Boettger, 1893) e Kentropyx vanzoi (Gallagher e Dixon, 1980),

Crocodilurus (Crocodilurus amazonicus), Cnemidophorus (Cnemidophorus arenivagus,

Cnemidophorus cryptus, Cnemidophorus gramivagus e Cnemidophorus lemniscatus

lemniscatus), Salvator (Salvator merianae) e Tupinambis (Tupinambis quadrilineatus e

Tupinambis teguixin).

Tupinambis teguixin apresentou RONs simples evidenciada na constrição

secundária no braço longo do par 2. Uma característica comum entre as espécies da

subfamília Tupinambinae é a presença desta constrição secundária localizada no par 2

64

(Gorman, 1970). Já, as quatro espécies da subfamília Teiinae também apresentar RON

simples, porém localizadas em par cromossômico distinto, ou seja, Cnemidophorus

sp.1, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps foi evidenciado na constrição

secundária do par 1 e em Ameiva ameiva no par 7. Para as espécies Cnemidophorus sp.1

e Kentropyx pelviceps os dados são inéditos. Os dados de RONs para Ameiva ameiva e

Kentropyx calcarata analisadas no presente trabalho corroboram os dados prévios

(Schmid e Gutternbach, 1988; Cole et al., 1995; Verosene et al., 2003; Santos et al.,

2007). Entretanto, duas populações da Amazônia oriental de Ameiva ameiva

apresentaram RONs múltiplas envolvendo os pares 1, 2, 6, 16, 18, 19 e alguns

cromossomos pequenos (Peccinini-Seale e Almeida, 1986). Esses autores sugerem que

a variação inter-individual encontrada em Ameiva ameiva pode estar relacionada na

identificação dos sítios ativos de RONs (Miller et al., 1976; Howell e Black 1980;

Boisvert et al., 2007). Além disso, essa variabilidade pode ser devido à impregnação de

regiões de heterocromatina constitutiva ricas em resíduos ácidos, no qual o nitrato

impregna tanto as RONs como regiões heterocromáticas não portadoras de sítios

ribossomais, não revelando o número exato de RONs (Sumner, 2003).

A técnica da hibridização in situ fluorescente (FISH) utilizando sondas de DNA

ribossomal 45S pode elucidar questões relacionadas à organização cromossômica e

carioevolução, sendo uma técnica mais refinada que a impregnação por nitrato de prata,

uma vez que localiza as sequências de DNAr 45S em cromossomos mitóticos (Carvalho

et al., 2012; Terencio et al., 2012; Schneider et al., 2013). Para as espécies analisadas

no presente estudo a hibridização in situ fluorescente do gene ribossomal 18S

corroborou os resultados obtidos com impregnação pelo nitrato de prata, confirmando a

existência deste sítio ribossomal em apenas um par de cromossomos. Este mesmo

padrão foi identificado em outras espécies da família Teiidae, evidenciando marcação

em um par de microcromossomos em Ameiva auberi, enquanto que Cnemidophorus

marmoratus foi localizado em um par de macrocromossomos (Porter et al., 1991). Além

disso, foi possível observar um heteromorfismo de tamanho dos sítios entre os

cromossomos homólogos nas quatro espécies analisadas, fato descrito para outras

espécies de lagartos (O’Meally et al., 2009; Srikulnath et al., 2009; Srikulnath et al.,

2011). Este heteromorfismo de tamanho provavelmente pode estar associado aos

mecanismos de crossing-over desigual, rearranjos como transposições, deleções e/ou

duplicações ou variações no número de cópias do DNAr presentes nestas regiões, o que

65

ocasionariam em alterações nos sítios ribossomais (Ribeiro et al., 2008; Gross et al.,

2010a).

Sendo assim, os dados do presente trabalho aliados aos disponíveis na literatura

indicam que os lagartos da família Teiidae possuem uma variação cariotípica com

relação ao número diploide, número fundamental e formula cariotípica, reforçando a

importância no aumento de análises cromossômicas na família Teidae. Estudos com o

mapeamento físico cromossômico de sequências de DNA repetitivas nas cinco espécies

de teídeos amazônicas são essenciais para a compreensão da organização do genoma,

bem como elucidar a evolução cariotípica deste grupo de lagartos.

66

6.2 Artigo 2 - DNAs repetitivos na organização do genoma de espécies de lagartos

amazônicos da família Teiidae

67

6.2.1 Resumo

Os DNAs repetitivos perfazem a maior fração do genoma eucarioto, que é composta por

sequências in tandem e dispersas. Tais DNAs repetitivos apresentam variações em

relação a sua composição, número de cópias, forma de distribuição, dinâmica e

organização no genoma, podendo contribuir para a diversificação evolutiva de

diferentes espécies de vertebrados. Estas sequências estão normalmente alocadas em

regiões de heterocromatina das regiões centroméricas e teloméricas dos cromossomos,

contribuindo na sua estruturação. Diante disto, o objetivo do presente estudo foi mapear

sequências de DNAs repetitivos DNAr 5S, sequências teloméricas, genes da

tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE em cromossomos mitóticos das

espécies amazônicas de teídeos Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx

calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin visando o entendimento da

organização e a sua carioevolução. O mapeamento das sequências repetitivas revelou

um padrão diferenciado em Cnemidophorus sp.1, enquanto que as demais espécies

apresentaram todas as sequências intercaladas entre si na região heterocromática. O

mapeamento físico cromossômico do gene da tropomiosina foi realizado pela primeira

vez em lagartos e revelou que, além de ser funcional, possui função estrutural

semelhante aos demais elementos repetitivos mapeados (DNAr 5S, sequências

teloméricas, retroelementos Rex 1 e SINE), estando localizados preferencialmente nas

regiões centroméricas e terminais dos cromossomos.

Palavras-chave: FISH, Heterocromatina, sequências teloméricas, DNAr 5S, SINE,

Tropomiosina, Rex 1, centrômero, telômero

68

6.2.2 Introdução

Macroteiideos são lagartos exclusivamente Neotropicais, pertencente à família

Teiidae, abrangendo atualmente cerca de 135 espécies agrupadas em três subfamílias:

Callopistinae (gênero Callopistes), Teiinae (gêneros Ameiva, Ameivula, Aurivela,

Aspidoscelis, Contomastix, Cnemidophorus, Dicrodon, Holcosus, Kentropyx,

Medopheos e Teius) e Tupinambinae (gêneros Crocodilurus, Dracaena, Salvator e

Tupinambis) (Harvey et al., 2012). Citogeneticamente esta família apresenta uma

diversidade cariotípica considerável, com a ocorrência de diferentes números diploides,

fórmulas cariotípicas, padrões de heterocromatina constitutiva, localização das regiões

organizadoras de nucléolo e a localização física cromossômica de sequências de DNAr

18S (Para revisão ver Carvalho et al., 2015a).

Embora as frações genômicas eucromáticas estejam notadamente anotadas em

vários vertebrados, as sequências repetitivas/heterocromáticas são pobremente

conhecidas (Padeken et al., 2015). Contudo, os DNAs repetitivos perfazem a maior

porção do genoma eucarioto e podem estar organizados in tandem como as sequências

satélites, minissatélites, microssatélites e as famílias multigênicas, ou dispersas como os

transposons e retrotransposons (Charlesworth et al., 1994; Nei e Rooney, 2005; Kordis,

2009). Na maioria dos organismos estas estão alocados nas regiões centroméricas e

teloméricas, quando contribuem na estruturação cromossômica (Padeken et al., 2015) e

podem desempenhar papéis importantes na organização estrutural e funcional (Kordis,

2009).

Centrômero é uma região do cromossomo que promove a formação de um

complexo protéico chamado cinetócoro, onde os microtúbulos do fuso responsáveis

pelo movimento dos cromossomos durante a divisão celular se fixam (Westhorpe e

Straight, 2013; Plohl et al., 2014; Padeganeh et al., 2013; He et al., 2015; Steiner e

Henikoff, 2015). Além destas funções, os centrômeros atuam como pontos de checagem

da divisão celular, coesão das cromátides irmãs e citocinese (Tanaka et al., 2013;

Fukagawa e Earnshawm, 2015; He et al., 2015; Steiner e Henikoff, 2015). A região

centromérica é constituída principalmente de DNAs satélites e por outras sequências

repetitivas de DNA, porém as sequências de DNA e a organização das mesmas

normalmente são espécie-específicas e provavelmente estas sequências podem estar

envolvidas na organização estrutural e funcional do centrômero (Padeganeh et al., 2013;

He et al., 2015; Steiner e Henikof, 2015; Padeken et al., 2015).

69

Os DNA repetitivos telométicos, DNAs ribossomais 5S e 18S, bem como

retroelementos têm sido amplamente mapeados por hibridização in situ fluorescente

(FISH) em várias espécies de vertebrados (Schneider et al., 2012; Terencio et al., 2012;

Chaiprasertsri et al., 2013; Rojo et al., 2014; Pokorná et al., 2015). Dentre estes DNAs

repetitivos funcionais destacam-se os DNAs ribossomais da família multigênicas 5S,

que consiste em sequências codificantes de 120 pb, que são separadas por um DNA

espaçador não transcrito (NTS) de tamanho variável. Alguns grupos de vertebrados

possuem ampla variação no mapeamento físico cromossômico e sequências dos NTS e

esta variação é devido à ocorrência de deleções ou inserções, presença de pseudogenes

ou pequenas repetições (Martins et al., 2000; Wasko et al., 2001; Martins, 2007).

Rearranjos cromossômicos têm sido evidenciados a partir do mapeamento de

sequências teloméricas, que consistem de repetições de (TTAGGG)n. Estas sequências

teloméricas associadas à multiproteínas que formam o complexo Shelterin, protegem as

extremidades dos cromossomos contra degradação ou danos do DNA, além de permitir

a replicação completa do DNA e integridade dos cromossomos (Simonet et al., 2011;

Wood et al., 2015). Quando sequências teloméricas aparecem em regiões diferentes nos

cromossomos, tais como em regiões intersticiais (sítios teloméricos intersticiais - ITSs),

têm sido relacionadas com os processos evolutivos envolvendo telômeros, como fusões,

inversões e translocações a partir de uma condição ancestral (Mandrioli et al., 1999;

Wood et al., 2015). Apesar da organização genômica do gene da tropomiosina nos

cromossomos dos vertebrados ainda serem escassos, este marcador também é

interessante em estudos evolutivos, uma vez que o gene da tropomiosina é uma família

de proteínas altamente conservada no genoma dos vertebrados e são responsáveis por

diversas funções celulares, tais como a migração celular, citocinese, transporte

intracelular e contração muscular (Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013). Esta família

gênica codifica quatro genes distintos, sendo eles TPM 1 (TPMα), TPM 2 (TPMβ),

TPM 3 (TPMγ) e TPM 4 (TPMδ) e essas apresentam várias isoformas que são

produzidas através do processo de splicing alternativo ou promotores alternativos

(Vrhoviski et al., 2008; Barua, 2013; Janco et al., 2013).

Com relação aos elementos retrotransponíveis, estes são capazes de se mover

no genoma utilizando molécula de RNA como intermediário de sua transposição. Esse

mecanismo, consequentemente, causa uma duplicação, aumentando do número de

cópias no genoma (Böhne et al., 2008). Dentre eles, o retroelemento SINE pode ser

70

derivado de diferentes classes de RNAs, tais como 7SL RNA (Nishihara et al., 2002),

tRNA (Nishihara et al., 2006), rRNA 5S (Ohshima e Okada, 2005) e rRNA 28S (Longo

et al., 2015) e encontram-se amplamente distribuídos nos genomas da maioria dos

vertebrados (Piskurek et al., 2009). Já o retroelemento Rex está presente nos diversos

organismos com diferentes padrões de organização onde esteve ativo durante a evolução

(Volff et al., 2000).

Diante disto, o objetivo do presente estudo foi mapear as sequências de DNAr 5S,

sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE em

cromossomos mitóticos das espécies de teídeos amazônicos Ameiva ameiva,

Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin,

com o intuito de investigar os padrões de distribuição de cada elemento no genoma,

visando o entendimento da organização e carioevolução deste grupo de lagartos.


Amostras de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758), Cnemidophorus sp.1, Kentropyx

calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e Tupinambis teguixin

(Linnaeus, 1758) foram obtidas em diferentes localidades do estado do Amazonas,

Brasil: florestas nas margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã

(0º50' E 01º55' S; 58º50' E 60º10' W), florestas nas margens dos rios Darahá e Ayuanã,

ambos no município de Santa Isabel do Rio Negro (0°24′24″ N; 65°1′1″ W), florestas

nas margens do rio Purus, no município de Tapauá (5º42'115'' S; 63º13'684'' W),

florestas nas margens do rio Cuieiras, no município de Manaus, floresta da Reserva

Florestal Adolpho Ducke, no município de Manaus (2º56‟0” S; 59º58‟0” W) e

perímetro urbano de Manaus (3º07'13.03'' S; 60º01'440'' W) com a autorização de coleta

(ICMBio/SISBIO 41825-1). Os animais foram eutanaziados logo após a captura com

uma dose letal de anestésico Tiopental sódico do anestésico. Esta pesquisa foi aprovada

pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Fundação Universidade do

Amazonas / Universidade Federal do Amazonas (UFAM) (número 041/2013).

Nenhuma espécie ameaçada de extinção ou protegida foi utilizada neste estudo. Os

animais foram submetidos aos procedimentos citogenéticos, sendo posteriormente

fixados com formaldeído 10% (injetados na cavidade celomática e trato digestório)

(Franco e Salomão 2002) e conservados em álcool 70%. Os espécimes testemunhos

foram depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Nacional de Pesquisas da

71

Amazônia (INPA H31712, 33213, 34791, 34841, 35018). Todos os exemplares foram

identificados pelo pesquisador Dr. Federico Arias.

Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de suspensões celulares de

medula óssea utilizando colchicina in vitro (Ford e Hamerton, 1956). O DNA genômico

foi extraído a partir de tecido muscular utilizando o protocolo de fenol-clorofórmio

descrito por Sambrook et al. (1989) e quantificado em espectrofotômetro NanoDrop

2000 (Thermo Scientific). O DNAr 5S, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos

Rex 1 e SINE foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando

os seguintes primers: DNAr 5S F (5’- CGA GGTCGGGCCTGGTTAGTA-3’) e 5S R

(5’- CTTCYGAGATCAGACGAGATC-3’) desenhados a partir de uma sequência

consenso entre diversas classes de vertebrados disponíveis no GeneBank (mamíferos,

repteis, anfíbios e peixes); Tropomiosina 1F (5’-

GAGTTGGATCGGGCTCAGGAGCG-3’) e TROP 1R (5’-

CGGTCAGCCTCTTCAGCA ATGTGCTT-3’) (Friesen et al., 1999); RTX1- F1 (5’-

TTCTCCAGTGCCTTCAACACC-3’) e RTX1-R1 (5’-

TCCCTCAGCAGAAAGAGTCTGCTC-3’) (Volff et al., 2000); SINE Sauria (SQ1F

5’CCCWGCTCCTGCCAACCTAGC e SQ1R 5’TAG TCATGCTGGCCACATGACC)

(Piskurek et al., 2006). Para sequências teloméricas as amplificações foram feitas sem

DNA com os seguintes primers: (TTAGGG)5 e (CCCTAA)5 (Ijdo et al., 1991).

As reações foram realizadas em um volume final de 15 µL contendo 1 µL de

DNA genômico (100 ng), 1,5 µL de tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, 0,15 µL de

Taq DNA polimerase (5 U/µL), 3,0µL de dNTPs (1 mM), 0,6 µL de cada primer (5

mM) e água Milli-Q. As condições de amplificação foram: (a) DNAr 5s: 2 min 94 °C;

seguidos por 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min 30seg a 57 °C, e 1 min 30 s a 72 °C; e

uma extensão final de 5 min a 72 °C; (b) TROP 1: 3 min 95 °C; seguidos por 35 ciclos

de 30 seg a 95 °C, 30 seg a 58 °C, e 1 min 20 s a 72 °C; e uma extensão final de 5 min a

72 °C; (c) Rex 1: 2 min a 95°C; seguidos por 35 ciclos de 1 min a 95°C, 40 seg a 55°C,

2 min a 72°C e uma extensão final de 5 minutos a 72°C; (d) SINE: 3 min a 94°C;

seguidos por 35 ciclos de 30 seg a 94°C, 50 seg a 50°C, 30seg a 72°C e uma extensão

final de 5 minutos a 72°C; (e) (TTAGGG)n: 1 min a 95°C, 30 seg a 50°C, 1 min a 72°C,

seguidos de 35 ciclos de 1 min a 94°C, 30 seg a 60°C, 2 min a 72°C, e 5 minutos a

72°C.

72

Para confirmar a amplificação das sequências específicas, os elementos

repetitivos foram clonados e sequenciados. Para tanto, os produtos de PCR de DNAr 5s,

genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE foram inseridos no vetor

plasmidial pGEM-T Easy (Promega), foram transformadas em células competentes

DH5α de Escherichia coli (Promega). Os clones foram sequenciados em sequenciador

automático de DNA ABI 3130 XL (Applied Biosystem). O alinhamento das sequências

foi feito através da ferramenta Clustal W (Thompson et al., 1994), incluída no

programa BioEdit 7.0 (Hall, 1999). Cada clone foi identificado por buscas na base de

dados do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com a ferramenta BLASTn e na base do

Repbase (Jurka et al., 2005) no Genetic Information Research Institute (Giri)

(http://www.girinst.org/repbase) utilizando o software CENSOR (Kohany et al., 2006).

As sequências obtidas foram depositadas no GenBank (NCBI).

As sondas de DNAr 5s, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os

retroelementos Rex 1 e SINE foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick

Translation mix; Roche), enquanto que para a fiber-FISH o DNAr 5s e sequências

teloméricas foram marcadas com Biotina-16-dUTP (Bio-Nick Translation mix; Roche),

por reação de nick translation de acordo com instruções do fabricante. A FISH

(Hibridização in situ fluorescente) foi realizada segundo a técnica descrita por Pinkel et

al., (1986), com modificações, enquanto que a fiber-FISH (Hibridização in situ

fluorescente em fibras estendidas) foi realizada de acordo com o protocolo descrito por

Barros et al. (2011) em condições de altas estringência (2,5 ng/µL de produto de PCR,

50% formamida, 10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37 °C por 18 h). Anti-

digoxigenina rodamina (Roche) e streptavidina Alexa fluor 488 (Life Technologies)

foram usados para detectar o sinal. Os cromossomos foram contra corados com DAPI (2

mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).

Os cromossomos mitóticos obtidos foram analisados em microscópio de

epifluorescência (Leica DFC 3000G). As metáfases foram fotografadas, os cariótipos

foram montados no programa Adobe Photoshop CS4 e medidos usando o Image J. Os

cariótipos foram organizados de forma decrescente seguindo a fórmula cariotípica

proposta por Carvalho et al. (2015a), sendo as espécies Ameiva ameiva, K. calcarata e

K. pelviceps portadoras de 2n=50 cromossomos, classificados por uma série gradual de

cromossomos acrocêntricos; Cnemidophorus sp.1 com 2n=48 cromossomos de dois

73

braços, braço único e microcromossomos e Tupinambis teguixin com 2n=36

cromossomos, sendo 12 macrocromossomos (M) e 24 microcromossomos (m).

Os sinais de hibridização das sondas visualmente considerados fracos foram

chamados de tênues e os de sinalização forte de conspícuos. Ainda, em cromossomos

acrocêntricos portadores de DNAs repetitivos, sempre que a localização física

cromossômica do mesmo foi centromérica, o mesmo foi considerado também como

parte do braço curto (p) devido impossibilidade de delimitação das duas porções

cromossômicas.

6.2.4 Resultados

As sequências amplificadas por PCR e sequenciadas estão em processo de

submissão no GenBank (NCBI). A sequência de DNAr 5s apresentou 120 pb referente à

região do transcrito funcional, a de TPM 1 apresentou 310 pb, a de Rex 1 apresentou

433 pb e a sequência de SINE apresentou 293 pb (Anexo I). Estas sequências foram

comparadas com outras disponíveis no banco de dados do NCBI, apresentando

similaridade de 100% com DNAr 5S de Iguana iguana (GenBank: M10817.1|),

similaridade de 75% com genes da tropomiosina 1 de Microlophus quadrivittatus

(GenBank: EF666450.1), similaridade de 100% com Rex 1 de Pterophyllum scalare

(GenBank: JX576340.1) e similaridade 100% com SINE de Darevskia caucasica

caucasica (GenBank: KJ680121.1|).

74

Subfamília Teiinae

a) Ameiva ameiva

Em Ameiva ameiva os sítios de DNAr 5S foram localizados na região

centromérica/ braço curto dos pares 1 a 18, excetuando o par 9 que não possui nenhum

sinal de hibridização destas sequências ribossomais e os pares 16 e 17 que possuem

marcação intersticial (Figura 1a). As localizações físico-cromossômicas do gene da

tropomiosina e dos retroelementos Rex 1 e SINE apresentaram-se semelhante ao do

DNAr 5S, excetuando o par 18 que não apresentou sinais de hibridização (Figura 3a, 4a,

5a, respectivamente). Marcações teloméricas conspícuas foram observadas na

extremidade do braço curto da maioria dos cromossomos e fracos sinais de hibridização,

perceptíveis apenas na ausência de sobreposição com o DAPI, nos braços longos dos

mesmos. Ainda, marcações teloméricas não foram visualizadas nos cromossomos dos

pares 19 a 25. Nos pares 16 e 17 grandes blocos teloméricos intersticiais estavam

presentes (Figuras 2a) (Quadro 1).

75

Quadro 1 – Quadro comparativo do local de distribuição das sequências de DNAs

repetitivos nos pares cromossômicos de Ameiva ameiva: Heterocromatina constitutiva -

HC, DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina, Rex 1 e SINE.

O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo. Todas as

marcações foram conspícuas, excetuando as sinalizadas como tênues no quadro abaixo.

Pares HC

(Carvalho et

al., 2015a)

DNAr 18S

(Carvalho et

al., 2015a)

DNAr 5S

(presente

estudo)

Sequência

telomérica

(presente

estudo)

Tropomiosina

(presente

estudo)

Rex 1

(presente

estudo)

SINE

(presente

estudo)

1 Centromérica p/

terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p

2 Centromérica p/


3 Centromérica p/


4 Centromérica p/

terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Tênue

centromérica p Tênue

centromérica p

5 Centromérica p/

terminal q - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Tênue

Centromérica p Tênue

Centromérica p

6 Centromérica p/


7 Centromérica p/

terminal q Terminal q Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p

8 Centromérica p/


9 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p



12 Centromérica p/

terminal q

- Centromérica p Centromérica p Tênue

centromérica p

Centromérica p Centromérica p




16 Centromérica p - Intersticial q Intersticial q Tênue

intersticial q

Intersticial q Intersticial q

17 Centromérica p - Intersticial q Intersticial q Tênue

intersticial q

Tênue

intersticial q

Intersticial q

18 Centromérica p - Centromérica p Centromérica p - - -

19 Centromérica p - - - - - -


76






77

b) Cnemidophorus sp.1

Cnemidophorus sp.1 apresentou somente um sítio do gene ribossomal 5S

localizado na região intersticial dos braços longos do par 11 (Figura 1b). Marcações

conspícuas de DNA telomérico foram encontradas em diferentes porções

cromossômicas, excetuando os pares 13, 19, 20 a 22 que não apresentaram nenhum

sinal forte de hibridização destas sequências (Figura 2b). O gene da tropomiosina

apresentou múltiplas marcações ao longo de todos os cromossomos, com blocos

compartimentalizados principalmente em regiões intersticiais (Figura 3b). Nos pares

cromossômicos 11, 20, 22 e 23 nenhum sinal de hibridização do retroelemento Rex 1 foi

observado, enquanto nos demais pares blocos compartimentalizados foram evidenciados

em regiões terminais e intersticiais (Figura 4b). O retroelemento SINE foi mapeado em

blocos conspícuos intersticiais, excetuando os pares 8, 9, 10, 12, 13, 15 a 24 que não

apresenta nenhum sinal de hibridização (Figura 5b) (Quadro 2).

78


repetitivos nos pares cromossômicos de Cnemidophorus sp.1: Heterocromatina

constitutiva - HC, DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina,

Rex 1 e SINE. O sinal – indica ausência de marcação, p braço curto e q braço longo.

Todas as marcações foram conspícuas.

Pares HC

(Carvalho et

al., 2015a)

DNAr 18S

(Carvalho

et al.,

2015a)

DNAr 5S

(presente

estudo)

Sequência

telomérica

(presente

estudo)

Tropomiosina

(presente estudo)

Rex 1

(presente

estudo)

SINE

(presente

estudo)

1 Centromérica p/

terminal q Distal q - Múltiplas

marcações

intersticiais

Múltiplas marcações

intersticiais


intersticiais


intersticiais

2 Centromérica p/

terminal q - - Múltiplas

marcações intersticiais


intersticiais Múltiplas

marcações

intersticiais,

terminal q

Múltiplas

marcações intersticiais

3 Centromérica p/


marcações

intersticiais



marcações

intersticiais,

terminal q

Múltiplas

marcações

intersticiais

4 Centromérica p/


marcações

intersticiais


intersticiais,

terminal q

Múltiplas

marcações

intersticiais,

terminal q

Múltiplas

marcações

intersticiais

5 Centromérica p/


marcações

intersticiais


intersticiais,

terminal q

Múltiplas

marcações

intersticiais,

terminal p

Múltiplas

marcações

intersticiais

6 Centromérica p/


marcações

intersticiais


intersticiais,

terminal q

Múltiplas

marcações

intersticiais,

terminal p

Múltiplas

marcações

intersticiais

7 Centromérica p/


marcações

intersticiais


intersticiais,

terminal p

Múltiplas

marcações

intersticiais

Múltiplas

marcações

intersticiais

8 Centromérica p/


marcações

intersticiais



marcações

intersticiais

Múltiplas

marcações

intersticiais

9 Centromérica p/


marcações

intersticiais



marcações

intersticiais

-

10 Centromérica p/


marcações

intersticiais



marcações

intersticiais

-

11 Centromérica p - Intersticial q Múltiplas

marcações

intersticiais


intersticiais - Marcação

intersticial q

79

12 Centromérica p - - Múltiplas

marcações

intersticiais


intersticiais,

terminal q

Intersticial,

terminal q -

13 Centromérica p - - - Múltiplas marcações

intersticiais,

terminal p

Centromérica p/

terminal q -

14 Centromérica p - - Terminal q Múltiplas marcações

intersticiais,

terminal pq

Centromérica p/

terminal q

15 Centromérica p - - Terminal q Disperso/ terminal p Intersticial q Terminal q

16 Centromérica p - - Centromérica p/

terminal q Disperso/ terminal p Centromérica p/

terminal q -


terminal q Disperso/ terminal p Intersticial q -


terminal q Disperso Centromérica p/

terminal q -

19 Centromérica p - - - Terminal q Centromérica p/

terminal q -

20 Centromérica p - - - Centromérica p/

terminal q - -

21 Centromérica p - - - Disperso Centromérica p/ terminal q

-

22 Centromérica p - - - Centromérica p/

terminal q - -


terminal q Centromérica p/

terminal q - -




terminal q

-

80

c) Kentropyx calcarata

Kentropyx calcarata os DNAr 5S foram localizados na região centromérica e

terminal na maioria dos cromossomos, com alguns pares apresentando marcações

terminais e intersticiais (Figura 1c). Marcações teloméricas conspícuas foram

observadas na extremidade do braço curto/centromérica da maioria dos cromossomos e

fracos sinais de hibridização nos braços longos dos mesmos. Nos pares cromossômicos

6, 7, 10 e 11 sítios teloméricos intersticiais estavam presentes, enquanto que nenhuma

marcação foi evidenciada nos pares 15 a 18 e 25 (Figura 2c). As sequências do gene da

tropomiosina foram mapeadas nas regiões centroméricas/ braços curtos dos pares 1 a 7,

12, 14 a 18, 20, 21 e 24 (Figura 3c). O retroelemento Rex 1 foi mapeado de forma

compartimentalizada preferencialmente nas regiões centroméricas/ braços curtos dos

pares 1, 2, 4, e 9 (Figura 4c). O retroelemento SINE foi evidenciado na região

centromérica/braço curto dos pares 1 a 5, 8, 9, 12 e 18 e intersticialmente no par 17

(Figura 5c) (Quadro 3).

81


repetitivos nos pares cromossômicos de Kentropyx calcarata: Heterocromatina

constitutiva (HC), DNAr 18S, DNAr 5S, sequência telomérica, gene da tropomiosina,


Todas as marcações foram conspícuas, excetuando as sinalizadas como tênues no

quadro abaixo.

Pares HC

(Carvalho et

al., 2015a)

DNAr 18S

(Carvalho et al.,

2015a)

DNAr 5S

(presente

estudo)

Sequência

telomérica

(presente

estudo)

Tropomiosina

(presente

estudo)

Rex 1

(presente

estudo)

SINE

(presente

estudo)

1 Centromérica p/

terminal q

Distal/q Centromérica p/

terminal q Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p

2 Centromérica p/

terminal q - Centromérica p/

terminal q Centromérica p Centromérica p Centromérica p Centromérica p

3 Centromérica p/


terminal q Centromérica p Centromérica p - Centromérica p

4 Centromérica p/



terminal q

Centromérica p Centromérica p Centromérica p

5 Centromérica p/


terminal q Centromérica p Centromérica p - Centromérica p

6 Centromérica p/



terminal,

intersticial q

Centromérica p - -

7 Centromérica p/



terminal,

intersticial q

Centromérica p - -

8 Centromérica p/


terminal q Tênue

centromérica p,/ terminal q

- - Tênue

centromérica p

9 Centromérica p/


terminal q Tênue

centromérica p/

terminal q

- Centromérica p Tênue

centromérica p

10 Centromérica p/


terminal q Intersticial - - -

11 Centromérica p/



intersticial q

- - -

12 Centromérica p/


terminal q Tênue

centromérica p/ terminal q

Centromérica p - Tênue

centromérica p

13 Centromérica p/


terminal q Tênue

centromérica p/

terminal q

- - -

14 Centromérica p - Centromérica p/

terminal,

intersticial q

Tênue

centromérica p/

terminal q

Centromérica p - -

82


terminal,

intersticial q

- Centromérica p - -


terminal q - Centromérica p - -


terminal q - Centromérica p - Tênue

intersticial q

18 Centromérica p - Intersticial q - Centromérica p - Tënue

centromérica p

19 Centromérica p - Terminal p/ Intersticial q

Tênue centromérica p

- - -

20 Centromérica/p - Terminal p/

Intersticial q

Tênue

centromérica p

Centromérica p - -

21 Centromérica/p - Terminal p/

Intersticial q

Tênue

centromérica p

Centromérica p - -

22 Centromérica/p - Intersticial q Tênue centromérica p

- - -

23 Centroméricap - Intersticial q Tênue

centromérica p

- - -

24 Centromérica/p - Centromérica p/

terminal q

Tênue

centromérica p

Centromérica p - -

25 Centromérica/p - Centromérica p/ terminal q

- - - -

83

d) Kentropyx pelviceps

Kentropyx pelviceps os DNAr 5S foram localizados na região centromérica e

terminal na maioria dos cromossomos, com alguns pares apresentando marcações

intersticiais ou ao longo do cromossomo (Figura 1d). Sequências teloméricas

(TTAGGG)n foram evidenciadas nos telômeros na maioria dos cromossomos de

Kentropyx pelviceps, com marcações intersticiais nos pares 1, 2, 4 e 6 (Figura 2d). O

gene da tropomiosina apresentou-se distribuído preferencialmente em blocos nas

regiões centroméricas/braços curtos, bem como em regiões terminais, sendo os sinais

conspícuos evidenciados nos pares 1 a 5, 8 a 10, 12, 14 e 15 (Figura 3d). O

retroelemento Rex 1 foi mapeado de forma compartimentalizada preferencialmente nas

regiões terminais da maioria dos cromossomos, com alguns blocos intersticiais e

marcações dispersas em alguns pares (Figura 4d). Nem todos os cromossomos

apresentaram sinais de hibridização de SINE, que apresentou distribuição dispersa nos

cromossomos portadores (Figura 5d) (Quadro 4).

84


repetitivos nos pares cromossômicos de Kentropyx pelviceps: Heterocromatina




Pares HC

(Carvalho et

al., 2015a)

DNAr 18S

(Carvalho

et al.,

2015a)

DNAr 5S

(presente

estudo)

Sequência

telomérica

(presente estudo)

Tropomiosina

(presente estudo)

Rex 1

(presente

estudo)

SINE

(presente

estudo)

1 Centromérica p/

terminal q Distal q Centromérica p/

terminal q Centromérica p

terminal,

intersticial q

Centromérica p/ terminal q

Centromérica p/

terminal q -

2 Centromérica p/



terminal,

intersticial q

Terminal q Centromérica p/

terminal q -

3 Centromérica p/



terminal q Terminal q Centromérica p/

terminal q Marcação dispersa

4 Centromérica p/



terminal,

intersticial q

Centromérica p/

terminal q

Centromérica p/

terminal q Marcação

dispersa

5 Centromérica p/




terminal q

Centromérica p/

terminal q Marcação

dispersa

6 Centromérica p/

terminal q - Tênue

centromérica p,/

terminal q

Centromérica p

terminal,

intersticial q

- Centromérica

p/terminal

intersticial q

-

7 Centromérica p/



terminal q - Centromérica

p/terminal

intersticial q

-

8 Centromérica p/



terminal q Centromérica p Centromérica

p/terminal

intersticial q

Marcação

dispersa

9 Centromérica p/





terminal q

dispersa ao

longo do

cromossomo

Marcação

dispersa

10 Centromérica p/





terminal q

dispersa ao

longo do

cromossomo

Marcação

dispersa

11 Centromérica p/




terminal q

dispersa ao

longo do

cromossomo

Marcação

dispersa

12 Centromérica p/ - Centromérica p/ Centromérica p/ Centromérica p Centromérica p/

terminal q

-

85

terminal q terminal q terminal q dispersa ao

longo do

cromossomo

13 Centromérica p/

terminal q - Centroméricap Centromérica p/


terminal q -

14 Centromérica/p - Ao longo do

cromossomo

Centromérica p/

terminal q Centromérica p Centromérica p/

terminal q

-

15 Centromérica/p - Ao longo do cromossomo

Centromérica p/

terminal q Centromérica p Marcação

dispersa

-


cromossomo

Centromérica p/

terminal q - Intersticial -


Centromérica p/

terminal q - Marcação

dispersa

-


cromossomo

Centromérica p/


dispersa

-


cromossomo

Centromérica p/


terminal q -


Centromérica p/


terminal q -


cromossomo

Centromérica p/


dispersa -


cromossomo

Centromérica p/


dispersa -


Centromérica p/


terminal q

-


cromossomo Centromérica p/


dispersa -


cromossomo

Centromérica p/


dispersa -

86

Subfamília Tupinambinae

a) Tupinambis teguixin

Tupinambis teguixin foi evidenciado marcações de DNAr 5S, gene da tropomiosina,

Rex 1, SINE na região centromérica nos pares 1, 2, 3, 4 e 5 (Figura 1e, 3e, 4e, 5e).

Marcações teloméricas conspícuas foram observadas na extremidade do braço curto da

maioria dos cromossomos e fracos sinais de hibridização nos braços longos dos mesmos

(Figuras 2e) (Quadro 5).


repetitivos nos pares cromossômicos de Tupinambis teguixin: Heterocromatina




Pares HC

(Carvalho et

al., 2015)

DNAr 18s

(Carvalho et

al., 2015)

DNAr 5S

(presente

estudo)

Sequência

telomérica

(presente

estudo)

Tropomiosina

(presente

estudo)

Rex 1

(presente

estudo)

SINE

(presente

estudo)

1 Centromérica p/

terminal q - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica

2 Centromérica p/

terminal q Distal q Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica

3 Centromérica p/

terminal q - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica

4 Centromérica/p - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica

5 Centromérica/p - Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica Centromérica

6 Centromérica/p - - - - - -

7 Centromérica/p - - Centromérica p - - -









87

Fiber-Fish

As fibras cromatínicas estendidas submetidas à técnica da fiber-FISH utilizando sondas

do DNAr 5s e genes da tropomiosina 1 e/ou sequências teloméricas e retroelemento Rex

1 mostraram localização intercaladas entre os elementos repetitivos, sendo este padrão

observado para as cinco espécies de teídeos analisadas no presente trabalho (Figura 6).




88

Figura 1. Cariótipos evidenciando o DNAr 5S (sítios vermelhos) das espécies






89

Figura 2. Cariótipos evidenciando as sequências teloméricas (sítios vermelhos) das






90

Figura 3. Cariótipos evidenciando o gene da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) das



(e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados com DAPI. a=série



91

Figura 4. Cariótipos evidenciando o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos) das






92

Figura 5. Cariótipos evidenciando o retroelemento SINE (sítios vermelhos) das espécies






93

Figura 6. Double fiber-FISH em fibras cromatínicas estendidas de Kentropyx calcarata utilizando sondas de DNAr 5s (sítios verdes), sequências

teloméricas (sítios verdes), genes da tropomiosina 1 (sítios vermelhos) e o retroelemento Rex 1 (sítios vermelhos). (a) DNAr 5s (b) genes da

tropomiosina 1 (c) DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 (d) DNAr 5s + genes da tropomiosina 1 + DAPI (e) sequência telomérica (f) Rex 1 (g)

sequência telomérica + Rex 1 (h) sequência telomérica + Rex 1 + DAPI. O mesmo padrão foi observado para as demais espécies analisadas no

presente estudo. Barra de escala representam 10 µm.

94

6.2.5 Discussão

Mais de 70% das espécies de Teiidae já possui seu cariótipo descrito, com a maior

parte possuindo microcromossomos (para revisão ver Carvalho et al., 2015a). Os

microcromossomos são uma característica universal nos cariótipos de aves e répteis, tendo

um grande valor na evolução adaptativa (Burt, 2002). Estes microcromossomos possuem

genes funcionais, são ricos em GC, hiperacetilados, centrômeros e telômeros funcionais,

alta taxa de recombinação que assegura o emparelhamento correto bem como a segregação

cromossômica durante a divisão celular e se comportam como quaisquer outros

cromossomos (Burt, 2002; Janes et al., 2010). Apesar de muitos autores indicarem uma

conservação na macroestrutura cariotípica dos Squamata, rearranjos cromossômicos entre

os macrocromossomos e/ou entre microcromossomos provavelmente ocorreram em

algumas espécies neste grupo (Rovatsos et al., 2015; Srikulnath et al., 2015).

Rearranjos cromossômicos muitas vezes podem ser detectados pela hibridização de

sequências teloméricas. Estudos recentes têm mostrado que sítios teloméricos intersticiais

(ITSs) são bastante comuns em espécies de Squamata (anfisbênias, serpentes e lagartos),

onde estão localizados em regiões pericentroméricas, regiões centroméricas e/ou

intersticial (Rovatsos et al., 2015). O mapeamento das sequências repetitivas (TTAGGG)n

nas espécies de teídeos analisadas no presente trabalho revelou marcações conspícuas e

tênues em regiões teloméricas, centroméricas e intersticiais, além de ausência de sinais

teloméricos em alguns cromossomos. Essa falta de marcações teloméricas pode ser

explicada por diversos mecanismos que ocasionariam pequenos resíduos dos telômeros e

não poderiam ser detectados pela FISH convencional, tais como a redução do número de

repetições (TTAGGG)n no genoma, inativação dos telômeros e processo de erosão

molecular das sequências teloméricas (Mandrioli et al., 1999; Nanda et al., 2002; Revaud

et al., 2009; DeBaryshe e Pardue, 2011; Bolzán, 2012). Ainda, esses diferentes

mecanismos não implicariam necessariamente na perda total das sequências teloméricas,

ocorrendo somente o encurtamento do telômero (Bolzán, 2012). Este tipo de resultado já

foi descrito para uma espécie de morcego da família Molossidae, onde foi identificada a

ausência de marcações nas extremidades dos cromossomos de Eumops auripendulus (Faria

et al., 2009).

Sítios teloméricos intersticiais (ITS) foram evidenciados em regiões intersticiais e

centromérica dos cromossomos das espécies de teídeos analisadas. Com relação aos ITS,

os mesmos têm sido observados em muitas espécies de vertebrados, incluindo anfíbios,

95

peixes, aves, mamíferos e répteis (Meyne et al., 1990). Ainda, existem dois tipos diferentes

de ITS: os curtos-ITS (s-ITS) e a heterocromatina-ITS (het-ITS). Curtos-ITS são pequenas

repetições teloméricas localizados em posições intracromossômica enquanto que a

heterocromatina-ITS são repetições teloméricas localizadas em blocos heterocromáticos,

preferencialmente em regiões centroméricas e pericentroméricas (Ruiz-Herrera et al.,

2008; Rovatsos et al., 2015). Esses tipos de ITSs (s-ITS e het-ITS) têm sido considerados

indicativos de eventos de rearranjos cromossômicos durante a evolução. Porém, o s-ITS

pode não estar necessariamente associado a rearranjos cromossômicos, sítios frágeis e

hotspots de recombinação, uma vez que podem ter sido inseridos pela enzima telomerase

durante o reparo do DNA (Farré et al., 2009). Entretanto, estes s-ITS parecem estar

associados com a presença de elementos retrotransponíveis, como LTR retrotransposons e

non-LTR retrotransposons (SINE e LINE) (Azzalin et al., 2001). Além disso, os ITSs

podem não aparecer nos cromossomos rearranjados, o que tem sido atribuído a processos

de erosão molecular de DNAs repetitivos bem como a proteção desses ITS (sequências

similares àquelas presentes nos telômeros) pelo complexo Shelterin contra a maquinaria de

reparo do DNA, os quais não poderiam ser detectados pela FISH (Mandrioli et al., 1999;

Wood et al., 2015).

Para espécies de teídeos do gênero Aspidoscelis, a hibridização com sondas

teloméricas evidenciou heterocromatina-ITSs em seus cromossomos e também em outras

espécies de lagartos das famílias Agamidae, Gymnophthalmidae, Phrynosomatidae,

Phyllodactylidae, Polychrotidae e Sphaerodactylidae (Meyne et al., 1990; Schmid et al.,

2014; Rovatsos et al., 2015). Esses autores sugerem que heterocromatina-ITS em regiões

peri/centroméricas podem ter surgido a partir de eventos de amplificações dos het-ITS, os

quais estão colocalizados com outros DNAs repetitivos, os quais são os principais

componentes de heterocromatina (Rovatsos et al., 2015).

DNAs repetitivos acumulam-se preferencialmente em regiões heterocromáticas

devido à baixa densidade gênica e reduzida probabilidade de eliminação através de

recombinação (Szauter, 1984), representando um controle no mecanismo do número de

cópias (Charlesworth e Langley, 1989) e estratégia de adaptação para um grande número

de famílias de DNAs repetitivos (Langdon et al., 2000). Desta forma, a heterocromatina

tende a apresentar uma composição complexa de vários tipos de DNAs repetitivos,

localizadas principalmente em centrômeros, telômeros e posições intersticiais dos

cromossomos eucarióticos (Skipper, 2007; DeBaryshe e Pardue, 2011).

96

Dentre os elementos repetitivos, os retrotransposons vêm sendo mapeados em

vários organismos eucariotos e podem estar envolvidos em processos de inativação de

genes, recombinação e rearranjos cromossômicos (Terencio et al., 2012; Schneider et al.,

2012). Estes retrotransposons estão normalmente compartimentalizados nas regiões

heterocromáticas nos cromossomos de diversos grupos, mas em algumas espécies ocorrem

em regiões eucromáticas no genoma (Supiwong et al., 2013). Para as cinco espécies de

teídeos analisadas, o elemento retrotransponível Rex 1 e SINE apresentaram-se

preferencialmente acumulados em regiões de heterocromatina, preferencialmente nas

regiões centroméricas e terminais dos cromossomos, o que sugere que estas sequências

repetitivas estejam desempenhando um papel importante na estrutura organizacional e

funcional do centrômero e/ou telômero no genoma destas espécies. Ainda, como todos os

elementos retrotransponíveis, tanto o Rex 1 quanto o SINE podem contribuir para

diversidade e plasticidade do genoma através de vários mecanismos ao longo da evolução,

como ativação e inativação de genes, formação de pseudogenes, regulação da atividade

gênica, rearranjos, hotspots, recombinação, transferência de material genético (Longo et

al., 2015; Vigil-Stenman et al., 2015; Kojima et al., 2015).

Os SINE encontrados em genomas eucarióticos são tipicamente derivados de RNAs

celulares, tais como 7SL RNA, RNA de transferência (tRNA), RNA ribossomal 5S (5S

rRNA) e RNA ribossomal 28S (28S rRNA) (Piskurek et al., 2009; Longo et al., 2015).

Análises genéticas dos SINEs de espécies de Sauropsida, mostrou a presença de famílias

exclusivas neste grupo, conhecidos como Sauria SINEs, 5s-Sauria SINE, Anolis SINE 2 e

MIR (Piskurek et al., 2009). Nas espécies de teídeos analisadas, o retroelemento SINE

parece estar associado com o DNAr 5s, estando estas sequências repetitivas intercaladas

também com Rex1, sequências teloméricas e gene da tropomiosina 1, como observados nas

fibras cromatínicas distendidas.

Os genes de RNAs ribossomais estão entre as famílias multigênicas melhor

conhecida em vertebrados e a variabilidade molecular do DNAr 5S tem sido elucidada

frequentemente em função das regiões espaçadoras não transcritas (NTS), as quais

normalmente estão associadas a outros DNAs repetitivos (Campo e Garcia-Vazquez,

2012; Rebordinos et al., 2013; Artoni et al., 2015). Na espécie Cnemidophorus sp.1 os

sítios de DNAr 5s estão presentes em apenas um par cromossômico, o que parece

corresponder a uma condição ancestral para a maioria dos vertebrados (Martins e Wasko,

2004; Galetti Jr e Martins, 2004) e que serviria como estratégia de proteção contra de

97

eventos de transposição e permutação, os quais poderiam agir na dispersão dessas

sequências (Martins e Galetti Jr., 1999). Porém esta é uma espécie que está em processo de

descrição e cuja relação filogenética ainda não está esclarecida, merecendo atenção

especial em função de total discordância dos dados citogenéticos encontrados se

comparado com os demais já descritos para as espécies de teídeos (Carvalho et al., 2015a).

As espécies Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e

Tupinambis teguixin apresentaram múltiplos sítios associados com regiões

heterocromáticas nas regiões centroméricas e teloméricas. Além disso, sítios de DNAr 5s

também estão localizados em regiões intersticiais dos menores pares de cromossomos de

Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps, as quais

são regiões eucromáticas dos cromossomos. Os múltiplos sítios de DNAr 5S não

correspondem a erros durante a hibridização, uma vez que sondas tanto homólogas quanto

heterólogas foram hibridizadas em condições de alta extringência (77%), sendo provável

que nem todos sejam sítios funcionais e correspondam a pseudogenes derivados da

associação destas sequências com os elementos retrotransponíveis. Vale ressaltar que o

sequenciamento do DNAr 5S a região gênica apresentou-se íntegra, sem stop codon ou

deleções que caracterizassem a presença de pseudogenes.

Comparando a localização física cromossômica dos DNAr 5s com as do DNAr 18s

(família DNAr 45S) descritos por Carvalho e colaboradores (2015a) para as mesmas

espécies (vale ressaltar que mesmos indivíduos foram analisados nestes dois estudos), fica

evidente que estes não apresentam posição sintênica em nenhuma das espécies (Quadros 1

a 5). Esta característica evitaria rearranjos cromossômicos entre os cromossomos

portadores dos sítios de DNAr 45s e 5s (Galetti Jr e Martins, 2004; Martins, 2007), bem

como facilitariam a ação das diferentes RNAs polimerases, uma vez que o DNAr 45s é

transcrito pela RNA polimerase I e o DNAr 5s pela RNA polimerase III (Martins, 2007).

Além do DNAr 5S, SINE, Rex 1 e sequências teloméricas serem encontradas

preferencialmente em regiões heterocromáticas de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758),

Kentropyx calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e Tupinambis

teguixin a família multigênica da tropomiosina também é evidenciada nas região

centromérica, terminal e intersticial da maioria dos cromossomos das espécies de teídeos

analisadas. Porém, nem todos os cromossomos apresentaram as sequências de

tropomiosina, o que demonstra diferenças na composição de heterocromatina encontrada

nestas espécies estudadas, bem como na fração eucromática da própria espécie.

98

Mapeamentos físicos cromossômicos de sequências de tropomiosina até o momento

restringem-se a três espécies de peixes do gênero Potamorhina (Curimatidae), estando

localizadas nas regiões centroméricas, sugerindo que a TPM1 desempenham papéis

estruturais no genoma destas espécies (Pinheiro et al., no prelo). Ainda, estes genes são

evolutivamente conservados e atuam em atividades celulares, como migração celular, na

motilidade celular, na transformação celular, na citocinese e na contração muscular

(Vrhoviski et al., 2008; Chase et al., 2013; Janco et al., 2013).

Portanto, tal como sugerido por Eickbush e Eickbush (2007) para DNAr 45S, a

permanência de elementos repetitivos em associação nas espécies de lagartos pode estar

relacionada a eventos de regulação na transcrição dos DNAs ribossomais e do gene da

tropomiosina, além estarem atuando estruturalmente na organização centromérica e

telomérica, bem como na composição da fração heterocromática, especialmente em

Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin.

Entretanto estudos adicionais são necessários para elucidar a função e interação entre as

sequências gênicas e os demais elementos repetitivos. Ainda, é evidente que

Cnemidophorus sp.1 apresenta a região centromérica com composição genômica

diferencial, uma vez que nenhum dos elementos repetitivos mapeados apresentou-se

distribuído nesta região.

99


espécies de lagartos amazônicos

100

7.3.1 Resumo

Diferenças nos padrões de distribuição da heterocromatina e na composição da mesma

foram observadas nas espécies de teídeos amazônicos. Estudos revelaram que estes blocos

heterocromáticos abrigam DNA repetitivos, tais como o DNA ribossomal 5S, sequências

teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE, uma vez que estes

elementos estão localizados nas regiões centroméricas e teloméricas nas espécies Ameiva

ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin. Já em

Cnemidophorus sp.1 estes elementos apresentam múltiplas marcações ao longo de todos os

cromossomos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi caracterizar sequências de DNA

moderada e altamente repetitiva por Cot1-DNA dos genomas de Ameiva ameiva e

Cnemidophorus sp.1 por meio da clonagem e sequenciamento de DNA, bem como mapeá-

los cromossomicamente nos cariótipos das espécies de teídeos amazônicos Ameiva ameiva,

Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin,

visando o entendimento da organização e a dinâmica genômica. Os resultados do

sequenciamento das bibliotecas de DNA obtidas pelo Cot1-DNA evidenciou que diferentes

microssatélites, transposons, retrotransposons e algumas famílias gênicas também compõe

a fração de DNA moderada e altamente repetitiva nas espécies de teídeos. A FISH

utilizando sondas de Cot1-DNA isoladas tanto de Ameiva ameiva quanto de

Cnemidophorus sp.1 evidenciou que estas sequências estão localizadas principalmente nas

regiões heterocromáticas centroméricas e teloméricas dos cromossomos de Ameiva ameiva,

Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin, indicando que

desempenham papéis funcionais e estruturais no genoma destas espécies. Em

contrapartida, em Cnemidophorus sp.1 a sonda de Cot1-DNA isoladas de Ameiva ameiva

apresentou múltiplas marcações intersticiais nos cromossomos, enquanto que o

mapeamento do Cot1-DNA isolado da própria espécie marcou regiões centroméricas de

alguns cromossomos, ressaltando a composição centromérica diferencial nesta espécie.

Assim, os dados obtidos demonstraram que diversas classes de DNAs repetitivos fazem

parte do genoma de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx

pelviceps e Tupinambis teguixin, estando estas sequências compartilhadas entre as espécies

de teídeos analisadas, apesar de nem sempre estarem alocadas na mesma porção

cromossômica.

Palavras-chave: Cot1-DNA, FISH, heterocromatina, centrômero, telômero

101

7.3.2 Introdução

Teiidae constitui uma família de lagartos Neotropicais caracterizada por uma

diversidade cariotípica, com número diploide que varia de 34 a 52 cromossomos, bem

como diferenças nos padrões de distribuição da heterocromatina e composição da mesma

(Carvalho et al., 2015a; b). Nas espécies de teídeos amazônicos grande quantidade de

blocos heterocromáticos estão localizados nas regiões centromérica e terminal da maioria

dos cromossomos de Ameiva ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata e

Kentropyx pelviceps, enquanto que Tupinambis teguixin apresenta poucos blocos

heterocromáticos nas regiões centroméricas dos macrocromossomos, mostrando que a

distribuição da heterocromatina é diferencial entre as espécies de teídeos (Carvalho et al.,

2015a; b).

Estes blocos de heterocromatina normalmente abrigam DNA repetitivos, tais

como o DNA ribossomal 5S, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os

retroelementos Rex 1 e SINE (Carvalho et al., 2015b). Estes elementos repetitivos foram

mapeados nos cromossomos de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps

e Tupinambis teguixin e apresentaram-se localizados principalmente em regiões

heterocromáticas centroméricas e teloméricas, parecendo estar atuando estruturalmente na

organização do centrômero e/ou telômero (Carvalho et al., 2015b). Contudo, a composição

da fração heterocromática no genoma das espécies Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata,

Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin não está restrita a sequências de DNA

ribossomal 5S, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1

e SINE, uma vez que alguns cromossomos possuem blocos heterocromáticos onde não se

observa sinais de hibridização destes elementos repetitivos (Carvalho et al., 2015a; b). Já

em Cnemidophorus sp.1 o padrão de organização cromossômica destas sequências é

diferente dos demais teídeos, apresentando múltiplas marcações ao longo de todos os

cromossomos, com blocos compartimentalizados principalmente em regiões intersticiais

dos cromossomos (Carvalho et al., 2015b), o que indica que a região centromérica desta

espécie apresenta uma composição diferenciada.

DNAs repetitivos podem ser isoladas por várias estratégias, dentre elas o Cot1-

DNA para isolamento da fração total de sequências moderada e altamente repetitiva nos

genomas (Vicari et al., 2010). O Cot1-DNA é baseado na cinética de reassociação do DNA,

cuja a fração repetitiva do genoma tende a se reanelar rapidamente após a desnaturação do

DNA genômico total. Assim, o tempo médio de renaturação de uma sequência em

102

particular dependerá do número de cópias que é encontrado no genoma e, se for dado

tempo suficiente, quase todo DNA de uma amostra desnaturado irá se reassociar

novamente (Zwick et al., 1997; Ferreira e Martins, 2008). Bibliotecas de DNAs repetitivos

de várias espécies têm identificado sequências de microssatélites, satélites, DNA

ribossomais e elementos transponíveis (transposons e retrotransposons) nesta fração

repetitiva do genoma (Hřibová et al., 2007; Zhang et al., 2012; Terencio et al., 2015). Esta

biblioteca de DNA enriquecida com sequências moderada e altamente repetitiva (Cot1-

DNA) pode ser mapeada em cromossomos e sequenciada, o que auxilia na análise da

fração repetitiva e tem auxiliado no entendimento da dinâmica, organização genômica bem

como em processos evolutivos (Ferreira e Martins, 2008; Szinay et al., 2010; Yu et al.,

2013).

Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar sequências de DNA moderada e

altamente repetitivas que compõem os genomas de Ameiva ameiva e Cnemidophorus sp.1,

sendo estas espécies de teídeos com grande quantidade de heterocromatina organizada

diferencialmente. As bibliotecas enriquecidas com DNA repetitivo foram clonadas e

sequenciadas, bem utilizadas como sonda e mapeadas cromossomicamente em Ameiva

ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis

teguixin e revelaram uma composição centromérica diferencial em Cnemidophorus sp.1,

além de auxiliarem no entendimento da organização e dinâmica genômica destas

sequências nos cariótipos destas espécies de teídeos amazônicos.


Exemplares de Ameiva ameiva (Linnaeus, 1758), Cnemidophorus sp.1, Kentropyx

calcarata (Spix, 1825), Kentropyx pelviceps (Cope, 1868) e Tupinambis teguixin

(Linnaeus, 1758) foram coletadas no estado do Amazonas, Brasil, em diferentes

localidades: florestas nas margens do rio Jatapu, município de São Sebastião do Uatumã

(0º50' E 01º55' S; 58º50' e 60º10' W), florestas nas margens dos rios Darahá e Ayuanã,

ambos no município de Santa Isabel do Rio Negro (0°24′24″ N; 65°1′1″ W), florestas nas

margens do rio Purus, no município de Tapauá (5º42'115'' S; 63º13'684'' W), florestas nas

margens do rio Cuieiras, município de Manaus, floresta da Reserva Florestal Adolpho

Ducke, no município de Manaus (2º56‟0” S; 59º58‟0” W) e no perímentro urbano de

Manaus (3º07'13.03'' S; 60º01'440'' W) com a autorização de coleta (ICMBio/SISBIO

41825-1) (Tabela 1).

103

Tabela 1. Espécies das subfamílias Teiinae e Tupinambinae: Local de coleta, número e sexo dos animais analisados e espécimes voucher (lotes)

são listados. AM: Amazonas.

Subfamília Espécie Local de coleta Número e sexo dos animais Voucher

Ameiva ameiva São Sebastião do Uatumã, AM

Santa Isabel do Rio Negro, AM

Tapauá, AM

São Sebastião de Cuieiras, AM

Reserva Adolpho Ducke, AM

30 (treze machos;

treze fêmeas;

quatro sem identificação do sexo)

INPA H33213

Cnemidophorus sp.1 Manaus, AM 13 (cinco machos; oito fêmeas) INPA H35018

Teiinae Kentropyx calcarata São Sebastião do Uatumã, AM

São Sebastião de Cuieiras, AM

7 (três machos;

quatro fêmeas)

INPA H31712

Kentropyx pelviceps Tapauá, AM

3 (três fêmeas)

INPA H34841

Tupinambinae Tupinambis teguixin São Sebastião do Uatumã, AM

Tapauá, AM

Reserva Adolpho Ducke, AM

5 (quatro fêmeas;

um sem identificação do sexo )

INPA H34791

104

Os animais foram eutanaziados logo após a captura com uma dose letal de

anestésico Tiopental sódico do anestésico onde foram desprovidos de alimentos ou água.

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Fundação

Universidade do Amazonas / Universidade Federal do Amazonas (UFAM) (número

041/2013). Nenhuma espécie ameaça de extinção ou protegidas foram utilizados neste

estudo. Os animais foram submetidos aos procedimentos citogenéticos, sendo

posteriormente fixados com formaldeído 10% (injetados na cavidade celomática e trato

digestório) (Franco e Salomão, 2002) e conservados em álcool 70%. Os espécimes

testemunhos foram depositados na Coleção Herpetológica do Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia (INPA H31712, 33213, 34791, 34841, 35018). Todos os

exemplares foram identificados pelo pesquisador Dr. Federico Arias.

As preparações cromossômicas foram obtidas a partir da medula óssea utilizando

colchicina in vitro (Ford e Hamerton, 1956). Em função da maior região heterocromática

ser encontrada em Ameiva ameiva e de Cnemidophorus sp.1 apresentar divergência no

mapeamento físico cromossomômico de diferentes classes de DNAs repetitivos quando

comparado com demais teídeos, estas duas espécies foram utilizadas para a obtenção da

biblioteca genômica enriquecida de DNA moderadamente e altamente repetitivos,

seguindo a técnica de cinética de renaturação Cot1-DNA (Zwick et al., 1997; Ferreira e

Martins, 2008). Amostras de DNA de Ameiva ameiva e Cnemidophorus sp.1 (50 μl de 100-

500 ng/μl de DNA em 0,3 M NaCl) foram autoclavadas (120 ◦C) por 5 minutos para obter

fragmentos entre 100 a 2000 pares de bases. Em seguida as amostras foram desnaturadas a

95 ◦C por 10 minutos, colocadas no gelo por 10 segundos e subsequentemente aquecidas

para reanelamento a 65◦C por 5 minutos. Após isso, as amostras foram incubadas a 37 ◦C

por 8 minutos com uma unidade da enzima S1 nuclease cuja função é digerir o DNA fita

simples. A fração repetitiva destas amostras foi recuperada por congelamento em

nitrogênio líquido e posterior extração de DNA, utilizando fenol-clorofórmio. Os

fragmentos de DNA resultantes foram clonados e sequenciados. Os fragmentos de Cot1-

DNA de Ameiva ameiva e de Cnemidophorus sp. foram ligados no vetor plasmidial

pMOSBlue blunt ended (GE Healthcare). Os clones foram sequenciados em sequenciador

automático de DNA ABI 3130 XL (Applied Biosystem). O alinhamento das sequências foi

feito através da ferramenta Clustal W (Thompson et al., 1994), incluída no programa

BioEdit 7.0 (Hall, 1999). Os clones gerados foram submetidos a um BLASTN para

detectar similaridade com sequências de domínio público contidas no banco de dados do

105

NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), assim como com o banco de dados do Repbase

(Jurka et al., 2005) do Instituto de Pesquisa e Informação Genética (Giri)

(http://www.girinst.org/repbase/) por meio do software CENSOR (Kohany et al., 2006).

As bibliotecas de Cot1-DNA foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP (Dig-

Nick Translation), pela reação de nick translation, seguindo as instruções do fabricante.

Anti-digoxigenina rodamina (Roche) foi usado para detectar o sinal. As bibliotecas de

Cot1-DNA de Ameiva ameiva marcadas com digoxigenina-11-dUTP foram hibridizadas

nos cromossomos da própria espécie, bem como hibridizações homólogas foram efetuadas

com as bibliotecas de Cot1-DNA em Cnemidophorus sp.1. As sondas obtidas a partir do

Cot1-DNA de Ameiva ameiva e Cot1-DNA de Cnemidophorus sp.1 também foram

hibridizadas nos cromossomos das demais espécies de teídeos analisadas.

A FISH foi realizada sob 77% de estringência (2,5 ng/µL sonda, 50% formamida,

10% sulfato de dextrano, e 2x SSC a 37 °C por 18h) (Pinkel et al., 1986). Os cromossomos

foram contra corados com DAPI (2 mg/ml) em meio de montagem VectaShield (Vector).

Os cromossomos foram analisados em microscópio de epifluorescência Leica DFC 3000G,

as metáfases foram fotografadas, montados os cariótipos no programa Adobe Photoshop

CS4 e medidos usando o Image J. Os cariótipos foram organizados seguindo a formula

cariotípica proposta por Carvalho et al. (2015a), sendo para Ameiva ameiva. Kentropyx

calcarata e Kentropyx pelviceps classificados como série gradual de cromossomos

acrocêntricos; Cnemidophorus sp.1 classificados como cromossomos portadores de dois

braços, cromossomos portadores de braço único e microcromossomos; e Tupinambis

teguixin classificados como macrocromossomos e microcromossomos.

7.3.4 Resultados

Um total de 40 clones de Cot1-DNA de Ameiva ameiva foram sequenciados sendo

que 20 sequências corresponderam a microssatélites; 8 a transposons; 6 a retrotransposons

e 6 a genes, todos apresentando alta similaridade com DNAs repetitivos depositadas nos

bancos públicos de DNA (Tabela 2). Para Cnemidophorus sp.1 30 clones de Cot1-DNA

sequenciados corresponderam a microssatélites; 5 a transposons e 5 a genes, todos também

apresentando alta similaridade com DNAs repetitivos depositadas nos bancos públicos de

DNA (Tabela 3).

106

Tabela 2. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Ameiva ameiva e similaridade das sequências conhecidas em banco de dados

públicos.

Clone Homologia Similaridade Identidade

AA 1 DNA Transposons Tc1-like de Labeo rohita (GenBank AY083617.1) 100%

AA 2 Microsatellite Betula platyphylla var. japonica (GenBank AB084484.1) 100%

AA 3 Gene TAP2 mRNA de Oryzias latipes (GenBank AB033382.1) 100%

AA 4 Microsatellite Coffea canephora (GenBank EU526584.1) 100%

AA 5 Microsatellite Salmo salar (GenBank Y11457.1) 96%

AA 6 Microsatellite Serranus cabrilla (GenBank AM049431.1) 95%

AA 7 Microsatellite Hypericum perforatum (GenBank FR732510.1) 93%

AA 8 Microsatellite Apteronemobius asahinai (GenBank AB621739.1) 100%

AA 9 Non-LTR Retrotransposons CR 1 (RepBase/GIRI*) 88%

AA 10 Microsatellite Bos taurus (GenBank AF271953.1) 81%

AA 11 Microsatellite Colias behrii (GenBank FN552755.1) 100%

AA 12 DNA Transposons Tc1/mariner (RepBase/GIRI*) 80%

107

Tabela 3. Sequências repetitivas obtidas pela fração Cot1-DNA de Cnemidophorus sp.1 e similaridade das sequências conhecidas em banco de

dados públicos.

Clone Homologia Similaridade Identidade

Cn 1 Gene TAP2 mRNA de Oryzias latipes (GenBank AB033382.1) 100%

Cn 2 Microssatellites Betula platyphylla var. japonica (GenBank AB084484.1) 100%

Cn 3 DNA Transposons Tc1-like de Labeo rohita (GenBank AY083617.1) 100%

Cn 4 Microsatellite Colias behrii (GenBank FN552755.1) 93%

Cn 5 Microsatellite Glaucosoma hebraicum (GeneNank FJ409080.1) 97%

Cn 6 Microsatellite Colias behrii (GenBank FN552755.1) 99%

Cn 7 Microsatellite Apteronemobius asahinai (GenBank AB621739.1) 90%

Cn 8 Microsatellite Salmo salar (GenBank Y11457.1) 96%

108

Com a sonda homóloga de Cot1-DNA de Ameiva ameiva os sinais de hibridização

foram localizados na região centromérica/braço curto dos pares 1 a 18, excetuando o par 9

que não possui nenhum sinal destas sequências e os pares 16 e 17 que possuem marcação

intersticial (Figura 1a, 2a). Quando efetuada a hibridização homóloga de Cot1-DNA de

Cnemidophorus sp.1 nos cromossomos da própria espécie, marcações foram observados na

região centromérica/braço curto de alguns cromossomos, enquanto que a maioria dos

cromossomos apresentou ausência de marcação nesta região cromossômica (Figura 1b).

A hibridização utilizando sonda heteróloga de Cot1-DNA obtido a partir de Ameiva

ameiva em Cnemidophorus sp.1 apresentou múltiplas marcações ao longo de todos os

cromossomos, com blocos compartimentalizados principalmente em regiões intersticiais

(Figura 2b). Em Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps foram localizados na região

centromérica na maioria dos cromossomos, com alguns pares apresentando marcações

terminais e intersticiais (Figura 2c; 2d, respectivamente) e Tupinambis teguixin

apresentaram marcações na região centromérica nos pares 1, 2, 3, 4 e 5 (Figura 2e).

Padrões similares de marcações foram observadas na hibridização heteróloga do Cot1-

DNA obtido a partir de Cnemidophorus sp.1 nos cromossomos de Ameiva ameiva,

Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin, porém as marcas foram

mais tênues.

109

Figura 1. FISH com a sonda homóloga de Cot1-DNA de Ameiva ameiva (a), e de Cnemidophorus sp.1 (b). Os cromossomos foram

contracorados com DAPI. Barra de escala: 10 µm.

110

Figura 2. Cariótipos com a sonda de Cot1-DNA5 de Ameiva ameiva hibridizada

(vermelho). (a) Ameiva ameiva, (b) Cnemidophorus sp.1, (c) Kentropyx calcarata, (d)

Kentropyx pelviceps e (e) Tupinambis teguixin. Os cromossomos foram contracorados com

DAPI. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos. m=Macrocromossomo,

mi=microcromossomo. Barra de escalas: 10 µm.

111

Figura 3. Idiograma de Ameiva ameiva. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s; em

amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA da própria

espécie. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos.

112

Figura 4. Idiograma de Cnemidophorus sp.1. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;

em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em roxo, Cot1-DNA da própria

espécie; em verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva ameiva.

113

Figura 5. Idiograma de Kentropyx calcarata. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;

em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva

ameiva. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos.

114

Figura 6. Idiograma de Kentropyx pelviceps. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;

em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA de Ameiva

ameiva. a=série gradual de cromossomos acrocêntricos.

115

Figura 7. Idiograma de Tupinambis teguixin. Em preto, heterocromatina; em verde claro, genes de DNAr 5s; em vermelho, genes de DNAr 18s;

em amarelo, sequências teloméricas; em rosa, genes da tropomiosina 1; em laranja, Rex 1; em azul, SINE; em verde escuro, Cot1-DNA de

Ameiva ameiva. m=Macrocromossomo, mi=microcromossomo.

116

7.3.5 Discussão

Diversas classes de DNAs repetitivos compõem o genoma das espécies de

teídeos amazônicos, tais como DNA ribossomal 5S, sequências teloméricas, genes da

tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE. A maior parte destes DNAs

repetitivos estão alocados em regiões de heterocromatina, além de estarem atuando

estruturalmente na organização centromérica e telomérica das espécies Ameiva ameiva,

Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin (Carvalho et al.,

2015b; Figuras 3, 4, 5, 6 e 7). Além destas funções, a heterocromatina pode ter outras

atividades no genoma, como atuar na segregação cromossômica, na organização

nuclear, na regulação da mitose, na progressão do ciclo celular, na proliferação das

células, na regulação da expressão gênica, bem como pode afetar o processo de

recombinação gênica (Grewal e Jia, 2007; Skipper, 2007; Bühler, 2009; Bloom, 2014).

Porém, a heterocromatina dos teídeos não se restringe aos DNAs ribossomais

5S, sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1, retroelementos Rex 1 e SINE,

apresentando uma composição complexa de vários tipos de DNAs repetitivos (Skipper,

2007; DeBaryshe e Pardue, 2011). Pelo sequenciamento das bibliotecas obtidas pelo

Cot1-DNA foi evidenciado que diferentes microssatélites, transposons, retrotransposons

e algumas famílias gênicas também compõe essa fração de DNA moderadamente e

altamente repetitivo, que estes também estão alocados preferencialmente nas regiões

centroméricas e teloméricas de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx

pelviceps e Tupinambis teguixin. Já para Cnemidophorus sp.1 estas sequências também

estão presentes no genoma, porém na região eucromática, similar ao padrão observado

para sequências teloméricas, genes da tropomiosina 1 e os retroelementos Rex 1 e SINE.

As sequências de DNAs repetitivos mais abundantes na fração moderada e

altamente repetitiva do genoma obtidas pelo Cot1-DNA de Ameiva ameiva e

Cnemidophorus sp.1 foram os microssatélites que apresentaram homologias com

sequências de outros organismos depositadas nos bancos de dados públicos, entre elas

Coffea canephora (Rubiaceae), Betula platyphylla var. japonica (Betulaceae),

Hypericum perforatum (Hypericaceae), Salmo salar (Salmonidae), Serranus cabrilla

(Serranidae), Glaucosoma hebraicum (Glaucosomatidae), Bos taurus (Bovidae),

Apteronemobius asahinai (Trigonidiidae) e Colias behrii (Pieridae). Ressalta-se que

existe diferenças nos microssatélites isolados das diferentes espécies. Acúmulos de

117

microssatélites podem estar associados com a diferenciação dos cromossomos sexuais

em algumas espécies de Sauropsida, os quais foram ocasionados por uma elevada

supressão de recombinação, degeneração e heterocromatinização (Porkoná et al., 2011;

Gamble et al., 2014; Matsubara et al., 2015), porém nenhuma das espécies analisadas

no presente estudo apresentaram cromossomos sexuais diferenciados, onde machos e

fêmeas possuem constituição cromossômica idêntica.

Os microssatélites ou repetições de sequências simples (SSRs) são sequências

curtas organizadas em longos segmentos constituídos de unidades de repetições em

tandem e são encontrados tanto em regiões codificantes ou não codificantes no genoma

de diversas espécies (de Oliveira et al., 2015). Em análises genéticas são considerados

bons marcadores moleculares devido a sua elevada abundância no genoma, herança co-

dominante, natureza multi-alélica, boa reprodutibilidade e tem sido empregados em

genética de populações, mapas de ligação e relações de parentesco (Qi et al., 2015;

Čížková et al., 2015).

SSRs auxiliam em papéis funcionais no genoma como na regulação gênica, na

replicação, na transcrição, na função de proteína e organização do genoma (Qi et al.,

2015). Esses SSRs são geralmente localizados nas regiões centroméricas e terminais dos

cromossomos de vários organismos, tais como observado no presente estudo em Ameiva

ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin, o que

corrobora estudos citogenômicos envolvendo os DNAs satélites/microssatélites de

algumas espécies de lagartos (Lacertidae, Scincidae e Varanidae) e cobras (Colubridae,

Pythonidae e Viperidae), que mostraram que estes estão localizados em região de

heterocromatina, especificamente em regiões centroméricas, pericentroméricas e/ou

teloméricas nos cromossomos, sugerindo que existem diferenças na composição dessas

regiões no genoma de Squamata (Singh et al., 1976; Grechko et al., 2005;

Chaiprasertsri et al., 2013; Giovannotti et al., 2013; 2014; Matsubara et al., 2015).

Além dos microssatélites, cerca de 50% das sequências obtidas pelo Cot1-DNA

das duas espécies exibiram similaridades com elementos transponíveis (transposons e

retrotransposons). Uma das características importantes destes elementos transponíveis é

o mecanismo de transposição, uma vez que os retrotransposons transpõem através de

um intermediário de RNA enquanto que os transposons movimentam-se pelo genoma

através de cópias de DNA e podem estar contribuindo para diversidade e plasticidade do

genoma durante a evolução (Kordis, 2009; Kojima et al., 2015). As sequências

118

apresentaram similaridade variando de 80% a 100% com os DNAs transposons Tc1-like

e Tc1/mariner. O transposon Tc1 é encontrado no genoma de diversos eucariotos e se

movimentam dentro e/ou entre genomas. É um elemento que possui cópias defeituosas

que foram acarretadas por diversas mutações causando a inativação do elemento no

genoma (Ivics e Izsvák, 2015; Tellier et al., 2015). Tc1 não são evidenciados, na forma

ativa, em genomas dos vertebrados (Dornan et al., 2015; Ivics e Izsvák, 2015; Tellier et

al., 2015).

Com relação aos retrotranposons, foi identificado o non-LTR retrotransposon

CR1 (Chicken Repeat 1) somente no genoma da espécie Ameiva ameiva, porém, isto

não indica que este não esteja presente no genoma de Cnemidophorus sp.1, uma vez que

o mesmo pode não ter sido identificado neste estudo. O retroelemento CR1 é uma

família de LINE amplamente distribuídos em uma variedade de organismos, incluindo

vertebrados (aves, peixes e repteis) e invertebrados (Thompson et al., 2009). CR1

contém uma região 5ÙTR, duas janelas de leitura (ORFs 1 e 2) e uma região terminal

3ÙTR. A região terminal 3ÙTR possuem pequenas repetições (microssatélites)

relativamente conservadas dentro de cada um dos sete grupos de CR1 (A-G) (Suh,

2015). CR1 são os únicos elementos transponíveis que estavam ativos ao longo da

evolução das aves e repteis e, assim, tem sido amplamente utilizados como marcadores

filogenéticos e na identificação de espécies, visando compreender a evolução do

genoma dentro de Amniota (Suh, 2015; Suh et al., 2015).

Os DNAs repetitivos DNAr 5s, genes da tropomiosina1 e os retrolementos Rex 1

e SINE também já foram mapeados nos cromossomos das espécies de teídeos analisadas

no presente estudo, porém os mesmos não foram evidenciados no sequenciamento dos

DNAs moderada e altamente repetitivos obtidos pela técnica de Cot1-DNA. O Cot1-

DNA é o produto da concentração do DNA genômico (C0), o tempo em segundos de

renaturação (t) e uma constante que depende da concentração de cátions do tampão

(Britten et al., 1974; Britten e Kohne, 1968). Desta forma, se alterar qualquer uma

destas variáveis, o resultado das sequências que são isoladas por esta técnica pode ser

diferente, o que explica não ter sido obtidos os DNAs repetitivos DNAr 5s, genes da

tropomiosina1 e os retrolementos Rex 1 e SINE que também compõem a fração

repetitiva das cinco espécies de teídeos analisadas.

Alguns clones apresentaram similaridade com parte do gene TAP-2 de Oryzias

latipes. A TAP (transportador associado a processamento de antígenos) é codificada

119

pelos genes do MHC de classe I (Complexo Principal de Histocompatibilidade) e

responsável pelo transporte dos peptídeos antigênicos do citoplasma para o retículo

endoplasmático (Zhao et al., 2006; Murata et al., 2009). Este transportador consiste

pelas subunidades TAP-1 e TAP-2, são essenciais nos processamentos antigênicos e

altamente conservadas entre diversas espécies de eucariotos (Zhao et al., 2006; Murata

et al., 2009). Alguns genes podem estar associados com DNAs repetitivos no genoma

de diferentes espécies e podem implicar em diversas funções, tais como a estabilidade

do genoma e regulação da expressão gênica, a formação de cromatina e miRNAs

(Roberts et al., 2014; Liang et al., 2015). Isto já foi encontrado em algumas espécies de

lagartos, peixes e mamíferos (Valente et al., 2011; Porkoná et al., 2011; Terencio et al.,

2015), estando bem evidente também para as espécies analisadas no presente estudo.

O mapeamento físico cromossômico das sondas homólogas e/ou heterólogas

do Cot1-DNA corroborou parcialmente o padrão heterocromático descritos para as

mesmas, mostrando marcações associadas com regiões heterocromáticas nas regiões

centroméricas e teloméricas dos cromossomos de Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata,

Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin. Além disso, marcações intersticiais também

foram localizados em regiões intersticiais dos menores pares de cromossomos de

Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata e Kentropyx pelviceps o que confirma a presença

destas sequências nesta região. Contudo, se compararmos a localização destes DNAs

moderada e altamente repetitivos obtidas a partir de Cot1-DNA com os outros DNAs

repetitivos já mapeados para as mesmas (Carvalho et al., 2015b), o padrão de marcações

são similares, estando alocados em regiões heterocromáticas nas regiões centroméricas

e teloméricas dos cromossomos destas espécies de teídeos (Figuras 3, 4, 5, 6 e 7).

Apesar de diferentes classes de DNAs repetitivos poderem estar localizados na mesma

região cromossômica de espécies diferentes, a quantidade de cópias de cada um dos

elementos pode ser diferente (Chaiprasertsri et al., 2013).

Já em Cnemidophorus sp.1, a hibridização das sequências moderada e altamente

repetitivas obtidas a partir de Cot1-DNA de Ameiva ameiva evidenciou múltiplas

marcações ao longo dos cromossomos, com blocos compartimentalizados em regiões

intersticiais dos cromossomos, as quais estão localizadas em regiões eucromáticas. Este

padrão é semelhante ao padrão de distribuição dos outros DNAs repetitivos (Carvalho et

al., 2015b), evidenciando que o padrão de organização cromossômica dos elementos

120

repetitivos é diferente das demais espécies de teídeos analisadas. Ainda, os DNAs

repetitivos localizados em regiões eucromáticas podem influenciar significativamente

nas regiões reguladoras de uma expressão de um gene, visto que a distribuição dos

elementos repetitivos no genoma, especialmente uma associação de genes com funções

metabólicas, pode ser o resultado de uma seleção positiva destes elementos durante

evolução e implicam em papéis importantes em funções dos genes (Wang et al., 2007;

Liang et al., 2015). Estudos realizados com Cot1-DNA demostraram que embora os

genomas de ratos e humanos possuem famílias similares de elementos repetitivos, as

sequências primárias diferem significativamente entre os genomas, onde o Cot de

humano não hibridiza nos cromossomos de ratos e o mesmo acontece com humanos

(Hall et al., 2014). Além disso, o Cot1-DNA foram hibridizados em todas as regiões

eucromáticas dos cromossomos (Hall et al., 2014).

Em contrapartida a FISH usando sonda homóloga do Cot1-DNA revelou

marcações principalmente nas regiões centroméricas dos cromossomos de

Cnemidophorus sp.1. Assim, a fração heterocromática centromérica de Cnemidophorus

sp.1 parece ser composta pelos microssatélites e elementos transponíveis obtidos pelo

Cot1-DNA da própria espécie e elucidados pelo sequenciamento, sendo as sequências

diferentes das obtidas pelo Cot1-DNA de Ameiva ameiva, apesar de pertencerem às

mesmas categorias. Ainda, outros elementos repetitivos podem estar presentes na fração

heterocromática desta espécie e não terem sido detectados pelo Cot1-DNA. Na região

centromérica existem outros DNAs repetitivos específicos do centrômero (Rošić et al.,

2014), que podem estar alocadas tanto nos macrocromossomos quanto nos

microcromossomos, uma vez que compartilham os mesmos DNAs repetitivos

(Giovannotti et al., 2014; Matsubara et al., 2015; presente estudo).

Embora a sua função e componentes multiprotéicos sejam conservados entre os

organismos, esses DNAs repetitivos são extremamente divergentes com relação a sua

estrutura, organização, dinâmica e mecanismos de propagação, influenciando na

diversificação e evolução dos centrômeros (Plohl et al., 2014). Portanto, é nítido que

vários mecanismos podem estar atuando na diversificação dessas regiões, tais como

crossing-over desigual, genes de conversão, mudanças mediadas por elementos

transponíveis e deslizamento da DNA polimerase na replicação, resultando na

composição diferencial da heterocromatina em espécies estreitamente relacionadas,

entre diferentes cromossomos da mesma espécie ou podem ser espécie-especifica

121

(Chaiprasertsri et al., 2013; Aldrup-MacDonald e Sullivan, 2014; He et al., 2015; Gao

et al., 2015).

Assim, os resultados encontrados neste trabalho contribuíram para a

compreensão acerca da composição da fração heterocromática, bem como estrutura e

organização dos DNAs repetitivos do genoma dos teídeos e indicaram que diferentes

classes de DNAs moderada e altamente repetitivos fazem parte do genoma de Ameiva

ameiva, Cnemidophorus sp.1, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis

teguixin, estando estas sequências compartilhadas entre as espécies de teídeos

analisadas, apesar de nem sempre estarem alocadas na mesma porção cromossômica.

Ainda, o mapeamento físico dos DNAs repetitivos revelou semelhança entre as espécies

Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx pelviceps e Tupinambis teguixin e

demonstrou que a fração centromérica de Cnemidophorus sp.1 é diferente das demais

analisadas.

122

8. Conclusão

o As análises citogenômicas empregadas neste estudo nas espécies de teídeos não

revelaram diferenças genéticas entre indivíduos de uma mesma espécie

provenientes de diferentes localidades amostradas.

o Os genomas das espécies Ameiva ameiva, Kentropyx calcarata, Kentropyx

pelviceps e Tupinambis teguixin apresentam diferentes classes de DNAs

repetitivos estando associadas com regiões heterocromáticas centroméricas e

teloméricas, os quais estão atuando estruturalmente na organização centromérica

e telomérica, bem como na composição da fração heterocromática. Já o genoma

de Cnemidophorus sp.1 estes DNAs repetitivos apresentam múltiplas marcações

ao longo de todos os cromossomos, localizadas em regiões eucromáticas,

provavelmente exercendo papéis funcionais no genoma desta espécie.

o A fração repetitiva heterocromática de Cnemidophorus sp.1 difere das demais

espécies de teídeos.

o Os DNAs repetitivos podem estar alocados tanto nos macrocromossomos quanto

nos microcromossomos, uma vez que compartilham os mesmos DNAs

repetitivos entre as espécies de teideos.

123

9. Referências Bibliográficas

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Anexo I. Sequências obtidas após clonagem e sequencimanento dos DNAs repetitivos

DNA ribossomal 5s, gene da tropomiosina 1 e os retrolementos Rex 1 e SINE de Ameiva

ameiva.

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Citogenômica comparativa de lagartos da família Teiidae da ... Dayane... · AgNO3; (d), (h), (l) e (p) em destaque o par portador do sítio de DNAr 18S (vermelho) e cromossomos