Click here to load reader

Cinetica dezvoltarii

  • View
    220

  • Download
    2

Embed Size (px)

DESCRIPTION

dezvoltare microorganisme

Text of Cinetica dezvoltarii

Curs 13 Cinetica dezvoltrii microorganismelor i a proceselor de biosintezCinetica reprezint studiul schimbrilor fizice i chimice aprute n timp, ntrun proces, n cazul nostru, procesul de cretere al microorganismelor. Schimbrile fizice pot avea loc din cauza schimbrilor de temperatur, presiune i concentraie. Prin fermentaie are loc procesul de cretere al microorganismelor, pe medii de cultur, cu scopul de a biosintetiza diverse substane chimice cu rol n structura i aroma produsului alimentar. Procesul de fermentaie alcoolic, de exemplu, ntlnit n pine, de exemplu, are 3 scopuri: de a produce bioxid de carbon necesar n crearea structurii pinii; de a produce aroma pinii i de a schimba structura proteinelor astfel nct pinea s fie masticabil. Prin inoculare de celule aparinnd unei culturi pure (drojdia n panificaie, bacterii lactice n industria laptelui, mucegaiuri i bacterii n bioreactoare n procesele de biosintez, etc.), ntr-un mediu nutritiv se poate stabili dinamica de cretere a numrului de celule raportat la unitatea de volum a mediului.

Celule de drojdii n aluatul de pine

Curba de cretere a microorganismelor cuprinde mai multe faze: - faza de inoculare; - faza creterii logaritmice a numrului de microorganisme; - faza de retardare; - faza de descretere a numrului de microorganisme. Dup Monod, curba de cretere cuprinde urmtoarele faze: faza de lag sau faza staionar, faza de cretere accelerat, faza de cretere logaritmic sau

exponenial, faza de retardare, faza staionar, faza morii accelerate i faza morii logaritmice. Faza de lag corespunde perioadei de timp n care microorganismele se aclimatizeaz la condiiile de mediu care li se ofer. Nu se constat o cretere a numrului de celule. Aceast perioad depinde de mai muli factori: compoziia mediului, tipul microorganismului, vrsta microorganismului i temperatur. n aceast faz are loc biosinteza de ADN/ARN i o activare a sistemelor enzimatice precum i elaborarea de enzime induse. n cazul drojdiilor, aceast faz poate dura 1-2 ore. Urmeaz faza de cretere accelerat n care au loc reacii metabolice cu vitez mare i constant. n aceast faz se produce o mrire a dimensiunii celulelor prin creterea mai rapid a volumului n raport cu suprafaa celular, ceea ce favorizeaz declanarea procesului de reproducere. n timpul fazei creterii logaritmice are loc cu intensitate, diviziunea celular care se face cu consum mare de substane nutritive din mediu. Creterea masei celulare poate fi determinat cantitativ prin dublarea numrului de celule pe unitatea de timp (pentru drojdii i bacterii) sau ca o dublare a biomasei pe unitatea de timp pentru fungi filamentoi, streptomicete. Prin exprimarea acestor valori pe o scar semilogaritmic rezult o dreapt. Dei celulele schimb compoziia mediului de cultura prin consumarea de nutrieni i eliberarea de metabolii, n faza de log rata de cretere rmne constant. Rata de cretere este dependent de concentraia n nutrieni. Rata de cretere n biomas, X (mg/l), crete ca o funcie a timpului datorit conversiei nutrienilor n biomas:

unde este rata de cretere specific (d-1). Aceasta reprezint masa de celule produs/ masa de celule pe unitatea de timp. Rata de cretere , conform ecuaiei stabilit de Jaques Monod, este dependent de trei parametri: concentraia substratului, S; m (mg/l), rata maxim de cretere; Ks este o constant specific de substrat.

Constanta Ks este concentraia substratului la care se obin din rata specific maxim de cretere ( = m/2) i este echivalent cu constanta Michaelis n cinetica enzimatic. Efectul concentraiei substratului asupra constantei ratei de cretere este curba de mai jos:

Cinetica Monod

Dac exist un exces al tuturor nutrienilor, atunci = m i cultura se afl n faza de log, la rata maxim de cretere. Rata specific de cretere maxim, m, are o importan considerabil n procesele industriale n care se urmrete obinerea de biomas celular i este dependent de natura microorganismului i de condiiile de cultivare. De exemplu, pentru mucegaiuri aceasta poate varia ntre 0,090-0,61 h-1. La cultivarea lui Aspergillus niger pe mediu cu glucoz la 30C s-a obinut m = 0,2 i un timp de dublare al biomasei de 3,46 h. Pe msur ce mediul srcete n substane nutritive, viteza de cretere ncepe s scad i are loc faza de retardare n care se acumuleaz metabolii celulari i n care viabilitatea microorganismelor scade. Urmeaz apoi o faz scurt de staionare a procesului de cretere, cnd se stabilete un echilibru ntre numrul de celule care se formeaz prin reproducere i a celulelor care se autolizeaz. Cantitatea de biomas poate s rmn constant dei se schimb compoziia celulelor. Datorit lizei unor celule se elibereaz noi substraturi care vor servi drept nutrieni pentru celulele viabile. Faza staionar poate fi atins la o concentraie de celule bacteriene de aproximativ 109 celule pe ml. Dimensiunea populaiei va depinde de dimensiunea celulelor, nutrienii disponibili i natura microorganismelor. n faza staionar celulele pot s rmn active din punct de vedere metabolic fr s aib condiii de nmulire. Intrarea n faza staionar a culturilor aerobe, este determinat de limitarea coninutului de oxigen, care este consumat rapid din mediu. Bacteriile anaerobe sunt limitate n cretere din cauza acumulrii de compui de catabolism, toxici pentru celulele care i-au produs. De exemplu, sreptococii lactici sunt inhibai la creterea concentraiei de acid lactic. Faza de declin sau curba de distrugere i inactivare metabolic a celulelor sau fazele morii accelerate sau a morii logaritmice a microorganismelor apare ca urmare a lipsei de surse de nutriie i energie, de denaturare a componenilor celulari n prezena substanelor acumulate (alcooli, acizi, bacteriocine, etc.) de autoliz, nct se poate produce n final sterilizarea mediului (moartea tuturor celulelor) i pierderea culturii. Aceast faz este de obicei logaritmic adic, o proporie constant de celule moare n fiecare unitate de timp (o ora).

Cinetica procesului de fermentaie n sistem nchis (discontinuu) i deschis (continuu) Durata fazelor curbei de cretere a microorganismelor depinde de temperatur, pH, aerarea (intensitatea agitrii i cantitatea de oxigen). Rata de cretere a culturilor este important pentru studiul proprietilor fiziologice a tulpinilor selecionate, pentru stabilirea condiiilor de reproducere cnd acestea sunt utilizate drept culturi starter sau pentru obinerea n condiii avantajoase a unor compui celulari. n timpul fazei logaritmice de cretere, fiecare celul se divide la un interval constant de timp. Timpul mediu de generaie (tg) este timpul necesar unei populaii microbiene de a se dubla (ca numr de celule sau mas celulara). Numrul de generaii la timpul t este: n = (log Nf- log No)/0,301, unde, Nf reprezint numrul de celule la timpul t, No reprezint numrul iniial de celule (al inoculului), Constanta ratei medii de cretere, k, este dat de numrul de generaii pe unitatea de timp (numr de generaii/ ora). De exemplu, pentru o populaie bacterian care a crescut de la 103 (N0) la 109 (Nf) ntr-un timp de 10 ore se obtin urmtoarele valori: K = (log 109 log 103)0,301 x 10h = 2 generaii pe ora tg = 1/k = 1/2generaii/h =0,5h/generaie, sau 30 minute /generaie

(Dan, V., 2001) Timpul de generaie variaz cu specia i cu condiiile de mediu. n tabelul de mai jos se dau valori ale tg pentru unele microorganisme cultivate n condiii optime.

Tabel. Timp de generaie pentru microorganisme Microorganisme Bacterii - Escherichia coli - Bacillus subtilis - Clostridium botulinum - Mycobacterium tuberculosis Fungi - Saccharomyces cerevisiae - Manilia fructicola Dup L.M. Prescott, 1990 Temperatur ( C) 40 40 37 37 Timp de generaie (h) 0,35 0,43 0,58 12

30 25

2 30

Randamentul de cretere exprim cantitatea de biomas rezultat prin consumul unui nutrient. Y = masa celular rezultat prin cretere/masa substratului consumat, g/g Randamentul y creste cu concentraia nutrientului, pan cnd, aceasta atinge o valoare, n care are loc o saturare a sistemelor de transport i rata de cretere rmne constant sau scade. n sistem nchis, fermentaiile se fac ntr-un mediu nutritiv aflat n volum limitat, care se consum repede, astfel c dup cteva generaii se instaleaz repede faza staionar de cretere. n scopul meninerii populaiei microbiene n faza exponenial de cretere se folosesc sisteme de fermentare deschise, care sunt alimentate continuu cu nutrieni i din care sunt ndeprtai produii de catabolism. Celula microbian, avnd masa redus, este puternic influenat de condiiile mediului ambiant i reacioneaz foarte rapid la diferii factori fizicochimici i biologici. Creterea microorganismelor este afectat i controlat prin anumii factori ecologici care pot fi divizai n grupul factorilor intrinseci uneori greu de controlat: pH i capacitatea tampon, potenialul de oxido-reducere, structura biologica i prezena unor constitueni antimicrobieni. Factorii extrinseci mai uor controlabili, includ temperatura i durata de pstrare, efectele unor procese asupra aw prin srare, afumare sau uscare, variaia de pH, tratarea cu radiaii, adugarea de CO2 (de exemplu ambalarea n atmosfer controlata), sau adaos de conservani.

Chemostatul este un rezervor de mediu steril care este adugat culturii la o rat constant. Nutrieni proaspei intr constant n cultur, iar produii de catabolism sunt continuu nlturai. Culturile continui se pot produce prin dou metode. Utiliznd chemostatul, cultura este alimentat cu mediu steril la aceeai rat la care mediul care conine microorganisme este nlturat. Un element cheie al chemostatului este ca rata de cretere i producia total pot fi controlate independent. Al doilea tip de cultur continu este un turbidostat. Aceast metod utilizeaz aceeai ipotez ca i la chemostat cu excepia unei fotocelule care monitorizeaz densitatea optic a culturii. Fluxul de mediu ce intr n cultur este ajustat automat meninnd o turbiditate predeteminat. Chemostatele sunt folositoare n studierea fiziologiei microorganismelor deoarece se poate mo