Curs 13

Cinetica dezvoltării microorganismelor şi a proceselor de biosinteză

Cinetica reprezintă studiul schimbărilor fizice şi chimice apărute în timp, într-un proces, în cazul nostru, procesul de creştere al microorganismelor. Schimbările fizice pot avea loc din cauza schimbărilor de temperatură, presiune şi concentraţie. Prin fermentaţie are loc procesul de creştere al microorganismelor, pe medii de cultură, cu scopul de a biosintetiza diverse substanţe chimice cu rol în structura şi aroma produsului alimentar.

Procesul de fermentaţie alcoolică, de exemplu, întâlnit în pâine, de exemplu, are 3 scopuri: de a produce bioxid de carbon necesar în crearea structurii pâinii; de a produce aroma pâinii şi de a schimba structura proteinelor astfel încât pâinea să fie masticabilă.

Prin inoculare de celule aparţinând unei culturi pure (drojdia în panificaţie, bacterii lactice în industria laptelui, mucegaiuri şi bacterii în bioreactoare în procesele de biosinteză, etc.), într-un mediu nutritiv se poate stabili dinamica de creştere a numărului de celule raportat la unitatea de volum a mediului.

Celule de drojdii în aluatul de pâine

Curba de creştere a microorganismelor cuprinde mai multe faze: - faza de inoculare;- faza creşterii logaritmice a numărului de microorganisme;- faza de retardare;- faza de descreştere a numărului de microorganisme.

După Monod, curba de creştere cuprinde următoarele faze: faza de lag sau faza staţionară, faza de creştere accelerată, faza de creştere logaritmică sau

exponenţială, faza de retardare, faza staţionară, faza morţii accelerate şi faza morţii logaritmice.

Faza de lag corespunde perioadei de timp în care microorganismele se aclimatizează la condiţiile de mediu care li se oferă. Nu se constată o creştere a numărului de celule. Această perioadă depinde de mai mulţi factori: compoziţia mediului, tipul microorganismului, vârsta microorganismului şi temperatură. În această fază are loc biosinteza de ADN/ARN şi o activare a sistemelor enzimatice precum şi elaborarea de enzime induse. În cazul drojdiilor, această fază poate dura 1-2 ore.

Urmează faza de creştere accelerată în care au loc reacţii metabolice cu viteză mare şi constantă. În această fază se produce o mărire a dimensiunii celulelor prin creşterea mai rapidă a volumului în raport cu suprafaţa celulară, ceea ce favorizează declanşarea procesului de reproducere.

În timpul fazei creşterii logaritmice are loc cu intensitate, diviziunea celulară care se face cu consum mare de substanţe nutritive din mediu. Creşterea masei celulare poate fi determinată cantitativ prin dublarea numărului de celule pe unitatea de timp (pentru drojdii şi bacterii) sau ca o dublare a biomasei pe unitatea de timp pentru fungi filamentoşi, streptomicete. Prin exprimarea acestor valori pe o scară semilogaritmică rezultă o dreaptă. Deşi celulele schimbă compoziţia mediului de cultura prin consumarea de nutrienţi şi eliberarea de metaboliţi, în faza de log rata de creştere rămâne constantă.

Rata de creştere este dependentă de concentraţia în nutrienţi. Rata de creştere în biomasă, X (mg/l), creşte ca o funcţie a timpului datorită conversiei nutrienţilor în biomasă:

unde μ este rata de creştere specifică (d-1). Aceasta reprezintă masa de celule produsă/ masa de celule pe unitatea de timp.

Rata de creştere μ, conform ecuaţiei stabilită de Jaques Monod, este dependentă de trei parametri:

- concentraţia substratului, S;

- μ m (mg/l), rata maximă de creştere;

- Ks este o constantă specifică de substrat.

Constanta Ks este concentraţia substratului la care se obţin ½ din rata specifică maximă de creştere (μ = μ m/2) şi este echivalentă cu constanta Michaelis în cinetica enzimatică.

Efectul concentraţiei substratului asupra constantei ratei de creştere este curba de mai jos:

Cinetica Monod

Dacă există un exces al tuturor nutrienţilor, atunci μ = μ m şi cultura se află în faza de log, la rata maximă de creştere. Rata specifică de creştere maximă, μ m, are o importanţă considerabilă în procesele industriale în care se urmăreşte obţinerea de biomasă celulară şi este dependentă de natura microorganismului şi de condiţiile de cultivare. De exemplu, pentru mucegaiuri aceasta poate varia între 0,090-0,61 h-1.

La cultivarea lui Aspergillus niger pe mediu cu glucoză la 30ºC s-a obţinut μ m = 0,2 şi un timp de dublare al biomasei de 3,46 h.

Pe măsură ce mediul sărăceşte în substanţe nutritive, viteza de creştere începe să scadă şi are loc faza de retardare în care se acumulează metaboliţi celulari şi în care viabilitatea microorganismelor scade.

Urmează apoi o fază scurtă de staţionare a procesului de creştere, când se stabileşte un echilibru între numărul de celule care se formează prin reproducere şi a celulelor care se autolizează. Cantitatea de biomasă poate să rămână constantă deşi se schimbă compoziţia celulelor. Datorită lizei unor celule se eliberează noi substraturi care vor servi drept nutrienţi pentru celulele viabile. Faza staţionară poate fi atinsă la o concentraţie de celule bacteriene de aproximativ 109 celule pe ml. Dimensiunea populaţiei va depinde de dimensiunea celulelor, nutrienţii disponibili şi natura microorganismelor.

În faza staţionară celulele pot să rămână active din punct de vedere metabolic fără să aibă condiţii de înmulţire. Intrarea în faza staţionară a culturilor aerobe, este determinată de limitarea conţinutului de oxigen, care este consumat rapid din mediu. Bacteriile anaerobe sunt limitate în creştere din cauza acumulării de compuşi de catabolism, toxici pentru celulele care i-au produs. De exemplu, sreptococii lactici sunt inhibaţi la creşterea concentraţiei de acid lactic.

Faza de declin sau curba de distrugere şi inactivare metabolică a celulelor sau fazele morţii accelerate sau a morţii logaritmice a microorganismelor apare ca urmare a lipsei de surse de nutriţie şi energie, de denaturare a componenţilor celulari în prezenţa substanţelor acumulate (alcooli, acizi, bacteriocine, etc.) de autoliză, încât se poate produce în final sterilizarea mediului (moartea tuturor celulelor) şi pierderea culturii. Această fază este de obicei logaritmică adică, o proporţie constantă de celule moare în fiecare unitate de timp (o ora).

Cinetica procesului de fermentaţie în sistem închis (discontinuu) şi deschis (continuu)

Durata fazelor curbei de creştere a microorganismelor depinde de temperatură, pH, aerarea (intensitatea agitării şi cantitatea de oxigen).

Rata de creştere a culturilor este importantă pentru studiul proprietăţilor fiziologice a tulpinilor selecţionate, pentru stabilirea condiţiilor de reproducere când acestea sunt utilizate drept culturi starter sau pentru obţinerea în condiţii avantajoase a unor compuşi celulari.

În timpul fazei logaritmice de creştere, fiecare celulă se divide la un interval constant de timp. Timpul mediu de generaţie (tg) este timpul necesar unei populaţii microbiene de a se dubla (ca număr de celule sau masă celulara).

Numărul de generaţii la timpul t este:

n = (log Nf- log No)/0,301,

unde, Nf reprezintă numărul de celule la timpul t, No reprezintă numărul iniţial de celule (al inoculului),

Constanta ratei medii de creştere, k, este dată de numărul de generaţii pe unitatea de timp (număr de generaţii/ ora).

De exemplu, pentru o populaţie bacteriană care a crescut de la 103 (N0) la 109 (Nf) într-un timp de 10 ore se obtin următoarele valori:

K = (log 109 – log 103)0,301 x 10h = 2 generaţii pe oratg = 1/k = 1/2generaţii/h =0,5h/generaţie, sau 30 minute /generaţie

(Dan, V., 2001)

Timpul de generaţie variază cu specia şi cu condiţiile de mediu. În tabelul de mai jos se dau valori ale tg pentru unele microorganisme cultivate în condiţii optime.

Tabel.Timp de generaţie pentru microorganisme

Microorganisme Temperatură (º C) Timp de generaţie (h)Bacterii- Escherichia coli- Bacillus subtilis- Clostridium botulinum- Mycobacterium tuberculosis

40403737

0,350,430,5812

Fungi- Saccharomyces cerevisiae- Manilia fructicola

3025

230

După L.M. Prescott, 1990

Randamentul de creştere exprimă cantitatea de biomasă rezultată prin consumul unui nutrient.

Y = masa celulară rezultată prin creştere/masa substratului consumat, g/g

Randamentul y creste cu concentraţia nutrientului, pană când, aceasta atinge o valoare, în care are loc o saturare a sistemelor de transport şi rata de creştere rămâne constantă sau scade.

În sistem închis, fermentaţiile se fac într-un mediu nutritiv aflat în volum limitat, care se consumă repede, astfel că după câteva generaţii se instalează repede faza staţionară de creştere.

În scopul menţinerii populaţiei microbiene în faza exponenţială de creştere se folosesc sisteme de fermentare deschise, care sunt alimentate continuu cu nutrienţi şi din care sunt îndepărtaţi produşii de catabolism.

Celula microbiană, având masa redusă, este puternic influenţată de condiţiile mediului ambiant şi reacţionează foarte rapid la diferiţi factori fizico-chimici şi biologici.

Creşterea microorganismelor este afectată şi controlată prin anumiţi factori ecologici care pot fi divizaţi în grupul factorilor intrinseci uneori greu de controlat: pH şi capacitatea tampon, potenţialul de oxido-reducere, structura biologica şi prezenţa unor constituenţi antimicrobieni. Factorii extrinseci mai uşor controlabili, includ temperatura şi durata de păstrare, efectele unor procese asupra aw prin sărare, afumare sau uscare, variaţia de pH, tratarea cu radiaţii, adăugarea de CO2 (de exemplu ambalarea în atmosferă controlata), sau adaos de conservanţi.

Chemostatul este un rezervor de mediu steril care este adăugat culturii la o rată constantă. Nutrienţi proaspeţi intră constant în cultură, iar produşii de catabolism sunt continuu înlăturaţi.

Culturile continui se pot produce prin două metode. Utilizând chemostatul, cultura este alimentată cu mediu steril la aceeaşi rată la care mediul care conţine microorganisme este înlăturat. Un element cheie al chemostatului este ca rata de creştere şi producţia totală pot fi controlate independent.

Al doilea tip de cultură continuă este un turbidostat. Această metodă utilizează aceeaşi ipoteză ca şi la chemostat cu excepţia unei fotocelule care monitorizează densitatea optică a culturii. Fluxul de mediu ce intră în cultură este ajustat automat menţinând o turbiditate predeteminată.

Chemostatele sunt folositoare în studierea fiziologiei microorganismelor deoarece se poate modifica un nutrient şi se pot observa modificările apărute asupra microorganismului. Astfel este posibil să se studieze cât de eficient utilizează microorganismele nutrienţii. Turbidostatele se utilizează când este dorită obţinerea constantă de celule identic metabolic.

Factori care influenţează creşterea şi dezvoltarea microorganismelor

Temperatura

Nivelul temperaturii stimulează sau inhibă procesele enzimatice. Pentru creşterea microorganismelor sunt importante 3 nivele de temperaturi: temperatura minimă este temperatura la care creşterea celulelor mai poate avea loc, sub aceasta creşterea fiind oprită; temperatura optimă la care rata specifică de creştere este maximă; şi temperatura maximă la care creşterea celulelor încă mai poate fi posibilă, dar peste aceasta, celulele mor.

Intervalul de temperatură pentru microorganismele cu implicaţii în industria alimentară este situat între 0 şi 75ºC .

În funcţie de intervalul de temperatură specific de creştere. microorganismele pot fi împărţite în 4 categorii, după cum se poate observa în tabelul de mai jos:

Tabelul 5.2Categorii de microorganisme funcţie de domeniul de temperatura

Tipuri de microorganisme

T min. ºC

T opt. ºC

T max. ºC

Exemplificări

Psihrofile -10 10-15 20 Bacterii de putrefacţie: Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Alcaligenes

- conţin în membrana plasmatică o concentraţie mare de acizi graşi nesaturaţi (acid linoleic);

- au tendinţa de a produce pigmenţi şi structuri extraparietale (capsule)

Psihrotrofe(facultativ psihrofile)

0 20-30 35-40 Bacterii: Enterobacter, Hafnia, Yersinia, Pseudomonas, Campylobacter, Vibrio, Listeria; Drojdii: Candida, Rhodotorula

Mezofile 15-20 30-40 45 - grupul majoritar ce cuprinde: bacterii, drojdii, mucegaiuri, inclusiv microorganismele patogene pentru om/animale

Termofile

- preferenţial- obligat

45

25-2837

55-65

45-5550-60

90

60-6565-70

Prezintă faza log mai redusă; Timpul de generaţie la temperatură poate fi de 10 minute.g. Candida, mucor, Absidia, Aspergillus fumigatus, Penicillium duponti g. Lactobacillusg Bacillus, g. Clostridium, actinomicete

Fig. 5.3. Rata de creştere funcţie de temperatură

Utilizare a temperaturilor în procesele microbiene industriale

Temperaturi care depăşesc cu 10ºC temperatura maximă de creştere determină în celula microbiană denaturări ireversibile care conduc la moartea fiziologică a celulelor ca rezultat al coagulării proteinelor, al unor procese de oxido-reducere şi al inactivării enzimelor. La creşterea temperaturii se produce desfacerea legaturilor N-glicozidice din ADN cu formare de uracil prin dezaminarea citozinei.

Sterilizarea reprezintă o completă eliminare a tuturor microorganismelor dintr-un spaţiu dat prin folosirea unor temperaturi de 100ºC sau mai mari. Sterilizarea se utilizează pentru tratarea vaselor de fermentare, mediilor de cultură şi a unor alimente.

Un factor biologic important pentru eficienţa sterilizării este concentraţia de celule din produsul supus sterilizării, deoarece denaturarea termică este un proces de prim ordin şi în fiecare fracţiune de timp se distruge o fracţiune din numărul total de celule din produs.

Prima şi încă cea mai utilizată metoda de tratament termic, este pasteurizarea, numită după marele microbiolog Louis Pasteur. Dezvoltată la început pentru a preveni denaturarea vinului, este apoi tot mai utilizată pentru lapte. Pasteurizarea este operaţia care are drept scop distrugerea majorităţii microorganismelor si, în particular, a bacteriilor patogene nesporulate prin utilizarea de temperaturi mai joase decât în cazul sterilizării. Un bun exemplu este tratarea laptelui la 72 ºC timp de 15 secunde sau la 66ºC timp de 30 minute.

Prin acest tratament sunt distruşi bacilii tuberculozei, Escherichia coli şi Salmonella enterica.

Există două metode de utilizare a temperaturilor înalte: căldura uscată (incubare într-un cuptor) şi căldura umedă (utilizarea aburului sub presiune), ultima metodă fiind mult mai eficientă. Căldura umedă este mai eficientă, deoarece creşte rata de penetrare a căldurii în interiorul mediului tratat. Pentru a avea aceeaşi eficienţă cu tratamentul care utilizează căldura umedă, timpul de expunere trebuie prelungit în cazul utilizării căldurii uscate.

Autoclavele sunt camere metalice cu ţevi de intrare şi ieşire a gazului. În timpul sterilizării, autoclavul este umplut cu abur la presiune, rezultând o temperatură de 121ºC.

Un alt factor care influenţează eficacitatea tratamentului termic este compoziţia mediului ce înconjură microorganismele. Concentraţia mare de sare şi aciditatea creşte rata de distrugere a microorganismelor supuse temperaturilor înalte. Invers, pentru a ale proteja, se pot utiliza grăsimi şi proteine.

Un alt tratament termic este tyndalizarea care constă în pasteurizări repetate, alternate cu perioade în care proba este menţinută în condiţii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni care devin vulnerabili şi trecând în stare vegetativă, sunt distruşi la o nouă pasteurizare. Se poate folosi pentru sterilizarea mediilor ce conţin substanţe termolabile.

Dacă se exprimă matematic denaturarea termică a microorganismelor,

dN/dt = -kN

ln N0/N= kdt

2,303 lg N0/N = kt

t= 2,303 lg N0/N, unde,

N0 = număr de microorganisme la începutul sterilizării;

N = număr de celule care mai pot rămâne în produs, fără ca acestea să influenţeze calitatea produsului sterilizat (de la 1 la 100 celule/g)

Raportul 2,303/k, în care k este o constantă specifică determinată practic, se notează cu D şi este numită timp de reducere decimală, respectiv timpul care asigură la o temperatură dată distrugerea unui procent de 90% din totalul celulelor existente iniţial.

Pentru a avea un tratament termic eficient al alimentului sau mediului de cultură este necesar să se determine cantitativ, rata morţii microorganismelor. Una dintre cele mai utilizate metode este determinarea timpului de reducere decimală (valoarea D). Aceasta este o măsură a sensibilităţii microbilor la căldură şi defineşte timpul necesar ca populaţia microbiană să descrească de 10 ori la temperatura dată. Valoarea D poate fi determinată prin incubarea unei culturi la temperatura letală şi determinarea periodică a numărului de microbi viabili.

Determinarea valorii D a unei culturi prin incubarea la o temperatură specifică şi eliminarea unor probe din timp în timp. Se determină populaţia viabilă din fiecare probă. Datele sunt introduse

într-un grafic, cu populaţia pe axa y versus timpul pe axa x. Valoarea D este inversul negativ al pantei.

Tabelul 5.3.Valori D (in secunde) pentru suspensii de spori/temperatură

Bacterii sporogene 105ºC 120ºC 130ºC 140ºC 150ºC 160ºCBacillus cereus 12,1 4,2 2,6 1,3 1 0,7Bacillus subtilis 27,8 4,5 3,1 2,1 1,1 0,5Bacillus sthearothermophillus

2857 38,6 8,8 3,9 2,4 1,4

În stabilirea formelor de sterilizare, în funcţie de raportul de sterilizare dorit şi de valoarea stabilită pentru D, se poate calcula timpul de sterilizare la o temperatură dată.

Determinarea valorii lui D, la un număr mare de temperaturi, pentru anumite probe, conduce la determinarea timpului morţii termice (TDT) şi valorii Z, care permite predicţia în ceea ce priveşte valorile D la o temperatură letală. TDT este timpul necesar pentru ca o populaţie de celule să ajungă la 100 (zero efectiv), la o temperatură dată. Acesta poate fi determinat prin multiplicarea populaţiei iniţiale de log10, prin valoarea D. Odată ce valorile TDT sunt determinate la cel puţin 3 temperaturi, valoarea Z poate fi determinată. Valoarea Z măsoară sensibilitatea microorganismelor la o schimbare de temperatură şi este definită ca o temperatură necesară de a descreşte TDT de 10 ori. Pentru a determina valoarea Z pentru un microorganism, TDT este reprezentat grafic (în scara logaritmică) funcţie de temperatură, şi se duce o linie printre punctele determinate. Valoare Z este reciproca negativă a pantei acestei linii. Cu ajutorul lui Z este posibil să prezicem rata morţii microbilor în mediu specific la orice temperatură letală. Valorile D, TDT şi Z sunt foarte utilizate în industria alimentară, unde dorim tratamente potrivite de a reduce populaţia microbiană cu minimum de efecte negative asupra alimentului.

Determinarea valorii Z a unei culturi se calculează experimental prin determinarea timpilor termici ai morţii microorganismelor la cel puţin 3 temperaturi şi apoi trasarea unui grafic în scară logaritmică funcţie de temperatură. Valoarea Z este inversul negativ al pantei şi măsoară sensibilitatea microorganismelor la schimbările de temperatură.

De exemplu, pentru a elimina riscul de supravieţuire a lui Clostridium botulinum se stabileşte raportul de sterilizare de la 1012 la 10 deci: 12 D = 12 x 0,204 = 2,5 min. la 121ºC (D121 = 0,204 minute, pentru Cl. botulinum ). Dacă presupunem că încălzirea se face la 111ºC în loc de 121ºC şi Z=10, în acest caz D121 = 0,204x10=2,04 iar 12D = 24,5 minute.

Tabel .Rezistenţa termică a microorganismelor

Tipuri de microorganisme

Valori t/T maxim, letal pentru 106 celule la pH 6,8 şi aw 0,98.

Genuri/Specii

Mucegaiuri şi drojdii; Bacterii asporogene

30 minute la 65ºC Penicillium; Aspergillus; Bissochlamys; Microbacterium; Alcaligenes; Enterococcus

Endospori bacterieni cu rezistenţă mică

10 minute la 90ºC Clostridium botulinum tip E; Bacillus macerans; Bacillus megatherium; Bacillus cereus

Endospori bacterieni cu rezistenţă ridicată

10 minute la 115ºC; 4 minute la 120ºC

Bacillus sthearothermophillus Clostridium nigrificans; Clostridium sporogenes

Endospori bacterieni cu rezistenţă de excepţie

45 minute la 120ºC Clostridium thermosaccharolyticum; Xezones

TabelUtilizări ale controlului microorganismelor cu temperatura

Tratament Temperatură Eficacitate

Incinerare >500ºC Vaporizarea materialelor organice de pe suprafeţe neinflamabile cu distrugerea unor substanţe în acest proces.

Fierbere 100ºC 30 minute de fierbere omoară formele vegetative ale bacteriilor dar nu omoară endosporii bacterieni. Sunt astfel toxine care nu sunt inactivate la 100ºC.

Fierberea intermitentă

100ºC Trei intervale de cate 30 minute de fierbere, urmate de perioade de răcire care omoară endosporii bacterieni.

Autoclav (abur şi presiune)

121ºC pentru 15 minute la presiune

Omoară toate formele de viată inclusiv endosporii bacterieni.

Căldura uscată 160ºC , 2 ore Bună pentru sticlă, metale.

Căldura uscată 170ºC, 1 ora Se observă că mărind temperatura cu

10ºC timpul de sterilizare este mai mic cu 50 %.

Pasteurizare 63-66ºC, 30 minute Omoară formele vegetative ale celulelor bacteriene, inclusiv patogeni ca streptococi, staphylococi şi Mycobacterium tuberculosis.

Pasteurizare 72ºC, 15 secunde Efectul asupra celulelor bacteriene este similar ca mai sus. Pentru lapte metoda are câteva efecte nedorite asupra calităţii şi gustului.

Temperaturile joase scad rata reacţiilor chimice, inclusiv a celor catalizate de enzime şi descresc fluiditatea membranei celulare.

Pentru mărirea conservabilităţii produselor alimentare, se folosesc temperaturi sub valorile temperaturilor minime ale microorganismelor. Păstrarea celulelor sub aceste temperaturi, reduce viteza de desfăşurare a metabolizării substanţelor nutritive si, în consecinţă, scăderea producerii de proteine/enzime prin biosinteză. Aceasta încetinire a metabolismului variază în funcţie de temperatură, natura microbiotei şi cea a substratului nutritiv. La temperaturi scăzute are loc o pliere a moleculelor de proteine cu formarea de noi legături între lanţurile peptidice, care conduc la mascarea centrului activ al enzimelor, nemaiputându-se desfăşura reacţiile de anabolism /catabolism, celulele trecând într-o stare latentă de viaţă, starea de psihroanabioză.

Dacă temperaturile scad sub temperatura de îngheţare a apei, celula trece în starea de crioanabioză şi în acest caz pot avea loc modificări ireversibile de natură fizico-chimică care conduc la distrugerea celulelor.

Temperaturile de refrigerare, în jur de 4ºC previn creşterea multor bacterii, în special a celor de alterare, mărind temperatura de valabilitate a multor produse. Congelând o probă la -20ºC creşterea microbiană este stopată. Temperaturile joase, chiar congelarea, nu distrug majoritatea microorganismelor şi, când sunt aduse la temperatura potrivită, microorganismele încep să crească din nou. De fapt microorganismele sunt bine conservate în azot lichid (-196ºC), această metodă fiind utilizată în conservarea şuselor bacteriene în laboratoarele de cercetare.